JP2000506122A - 熱安定化された造影剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は凍結乾燥安定剤を含有しそして２０℃を越える温度で熱安定な凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 熱安定化された造影剤 本発明は熱安定化され凍結乾燥した小胞を含む超音波造影剤及びそれらの製造 方法に関する。 小胞（この用語は本明細書において単ラメラ及び多ラメラ構造体、例えばリポ ソーム、ミセル、微小気泡及び微小気球のような多様な構造体を表すために使用 される）は治療用又は診断用活性剤を送達するための手段としてしばしば使用さ れる。超音波像形成用造影媒質の分野においては、体温で気体である小胞含有物 質（本明細書においては小胞物質と称する）がエコー発生造影剤（echogenic co ntrast agents）として、特に脈管構造中に投与するために使用することができ る。 小胞造影媒質は一般に水性担体媒質に低濃度の小胞を含有する水性分散体の形 で投与される。従ってそのような小胞造影剤の貯蔵及び輸送はもし小胞を乾燥形 態で貯蔵できれば極めて効率的になる。 小胞組成物の凍結乾燥は可能であり、そしてこのため、一般に乾燥技法を助け る配合補助剤が組成物に添加される。そのような補助剤は一般に二つの機能の一 つを果たす。増量剤は機械的により強固な製造物とするため全固体含量を増加さ せるために添加される。安定剤、これは又低温保護剤又は親液保護剤とも称され るが、脱水の際生じるガラス状態の形成を助けるためそして乾燥製造物に物理的 強度を与えるために添加される。このように使用される安定剤の例はマンニトー ル及びグルコースを含む。 凍結乾燥した小胞超音波造影剤は水性のすぐ使用できる分散体に対して容積が 減少する点で輸送及び貯蔵に有利であるが、一方凍結乾燥製造物は輸送及び貯蔵 の間に置かれる通常の周囲温度の範囲で熱安定性でなく、その結果として二次の 造影剤調製より前には、周囲よりも低温（例えば５〜 10℃）の環境に置かなければならないとの問題が生じる。 驚くべきことに凍結乾燥に使用する安定剤を適当に選択することにより、周囲 温度及びそれより高温において、そして実際に輸送及び貯蔵の間に通常遭遇する すべての温度において熱安定である凍結乾燥した小胞超音波造影剤を製造するこ とが可能であることを見いだした。 熱安定な凍結乾燥製造物はその後にその環境を温度制御する必要なしに貯蔵し 輸送することができ、そして特に病院及び医師は特別な貯蔵設備を必要とするこ となく供給を受け、現場で投与可能な分散体に処方することができる。 従って、一つの態様として、本発明は、凍結乾燥安定剤を含有しそして２０℃ を超える温度、好ましくは少なくとも２２℃、特に２２℃、少なくとも２５℃、 より好ましくは少なくとも３０℃そしてとりわけ好ましくは少なくとも４０℃、 例えば６５℃まで又はそれより高温において熱安定である凍結乾燥した小胞含有 超音波造影剤を提供する。又、別の態様により、本発明は凍結乾燥安定剤を含有 しそして２０℃を超え、好ましくは２２℃、特に好ましくは少なくとも２５℃、 より好ましくは少なくとも３０℃そして取り分け好ましくは少なくとも４０℃、 例えば６５℃まで又はそれより高いガラス転移温度(Tg)を有する凍結乾燥した小 胞含有超音波造影剤を提供するものである。 さらに別の態様として、本発明は小胞超音波造影剤及び凍結乾燥安定剤又は安 定剤の混合物からなる水性分散体を凍結乾燥することからなる熱安定な凍結乾燥 した小胞含有超音波造影剤の製造方法を提供するもので、ここで前記安定剤又は 安定剤の混合物は少なくとも２０℃（好ましくは少なくとも22℃、特に少なくと も25℃、より好ましくは少なくとも30℃そしてとりわけ好ましくは少なくとも40 ℃、例えば65℃まで又はそれより高い） のTg値及び−３７℃又はそれより高い（好ましくは−36℃より高く、特に好まし くは−35℃より高く、例えば−10〜−37℃）Tg'値を有することを特徴とする。 さらに別の態様として、本発明は水性担体媒質、凍結乾燥安定剤又は安定剤の 混合物及びエコー発生小胞超音波造影剤からなる超音波造影媒質を提供するもの で、ここで前記安定剤又は安定剤の混合物は少なくとも２０℃（好ましくは少な くとも22℃、特に少なくとも25℃、より好ましくは少なくとも30℃そしてとりわ け好ましくは少なくとも40℃、例えば65℃まで又はそれより高い）のTg値及び− ３７℃又はそれより高い（好ましくは−36℃より高い、特に好ましくは−35℃よ り高い、例えば−10〜−37℃）Tg'値を有することを特徴とする。 さらに別の態様として、本発明は診断用超音波像形成を包含する診断に使用す る小胞含有超音波造影媒質の製造のために、少なくとも２０℃（好ましくは少な くとも22℃、特に少なくとも25℃、より好ましくは少なくとも30℃そしてとりわ け好ましくは少なくとも40℃、例えば65℃まで又はそれより高い）のTg値及び− ３７℃又はそれより高い（好ましくは−36℃より高い、特に好ましくは−35℃よ り高い、例えば−10〜−37℃）Tg'値を有する凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合 物の使用を提供する。 さらに別の態様として、本発明は小胞超音波造影剤の貯蔵及び輸送の方法を提 供するもので、ここで前記剤は凍結乾燥形態であり、凍結乾燥安定剤を含有しそ して少なくとも２０℃（好ましくは少なくとも22℃など）のガラス転移温度を有 し、そして貯蔵及び輸送を冷却なしで実行することを特徴とする。 さらに別の態様として、本発明は小胞含有超音波造影媒質の製造方法を提供す るもので、この方法は本発明の凍結乾燥した造影剤を生理学的に許 容し得る水性分散媒質に分散させることからなる。 任意の物質について、Tgは乾燥物質のガラス転移温度であり、一方、Tg'は物 質の最大限に凍結濃縮した純粋な水溶液のガラス転移温度である。 改良された熱安定性のほかに、本発明の凍結乾燥した小胞造影剤は驚くべきこ とに超音波造影剤に一般に使用されるハロカーボンガス及びガス前駆物質を保持 する能力をも高める。 本発明において、超音波造影剤は任意の生理学的に許容し得るエコー発生小胞 剤でよいが、しかしながら小胞は気体又は気体前駆物質（例えば正常な人間体温 （37℃）において実質的に気体（蒸気を含む）である化合物又は化合物混合物） を含有するのが好ましい。生体許容性の気体、気体前駆物質又は混合物のいずれ も使用することができる。従ってこの気体は、例えば空気；窒素；酸素；二酸化 炭素；水素；亜酸化窒素；不活性ガス例えばヘリウム、アルゴン、キセノン又は クリプトン；フッ化硫黄例えば六フッ化硫黄、十フッ化二硫黄、トリフルオロメ チル硫黄ペンタフルオリド；六フッ化セレニウム；場合によってハロゲン化され たシラン例えばテトラメチルシラン；低分子炭化水素（例えば７個までの炭素原 子を含む）、例えばアルカン例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン又はペン タン、シクロアルカン例えばシクロブタン又はシクロペンタン、アルケン例えば プロペン又はブテン、又はアルキン例えばアセチレン；エーテル；ケトン；エス テル；ハロゲン化低分子炭化水素（例えば７個までの炭素原子を含む）；又は上 記化合物のいずれかの混合物を含むことができる。ハロゲン化ガスのハロゲン原 子の少なくとも幾つかはフッ素原子であるのが有利である。従って生体許容性の ハロゲン化炭化水素ガスは、例えばブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフ ルオロメタン、ジクロロジフルオロメタ ン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフル オロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン及びペルフルオロカーボン、例えば ペルフルオロアルカン例えばペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフ ルオロプロパン、ペルフルオロブタン（例えば、場合によって他の異性体例えば ペルフルオロ−イソ−ブタンとの混合物であるペルフルオロ−ｎ−ブタン）、ペ ルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン及びペルフルオロヘプタン；ペルフ ルオロアルケン例えばペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン（例えばペル フルオロブタ−２−エン）及びペルフルオロブタジエン；ペルフルオロアルキン 例えばペルフルオロブタ−２−イン；及びペルフルオロシクロアルカン例えばペ ルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメ チルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロ ペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペ ンタン、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン及び ペルフルオロシクロヘプタンから選ぶことができる。その他のハロゲン化ガスは フッ素化された、例えば過フッ素化されたケトン例えばペルフルオロアセトン及 びフッ素化された、例えば過フッ素化されたエーテル例えばペルフルオロジエチ ルエーテルを含む。 特に好ましくは、小胞はペルフルオロアルカン、特にペルフルオロブタン、ペ ルフルオロペンタン又はペルフルオロヘキサン、とりわけｎ−ペルフルオロブタ ンを含む。 小胞において、膜は任意の生理学的に許容し得る膜形成物質、特にリン脂質で 形成されてよく、そして橋架けされても又はされなくてもよい。荷電した又は荷 電していないリン脂質の混合物で形成された膜が特に好ましく、そして小胞は正 味の表面電荷（net surface charge）、特に負電荷を 有するのが特に好ましい。そのようなリン脂質小胞は特に好ましい血液滞留時間 を有する。 小胞はさらに血液滞留延長剤を備えるのがよく、例えばそのような物質を膜又 は膜の中に固定されて居る親油性基に結合させる。そのような血液滞留延長剤、 例えばポリエチレングリコールのようなポリアルキレンオキシドはオプソニン化 阻害剤として作用し、細網内皮系による脈管構造からの小胞の摂取を遅らせるこ とができる。 本発明の造影剤のリン脂質物質の望ましくは少なくとも７５％、好ましくは実 質的に全部が製造及び／又は使用条件下で正味の全電荷を個々に担持しており、 この電荷は正であるか、より好ましくは負である分子からなる。代表的な正に荷 電したリン脂質はホスファチジン酸例えばジパルミトイルホスファチジン酸又は ジステアロイルホスファチジン酸のアミノアルコール例えばヒドロキシエチレン ジアミンとのエステルを含む。負に荷電したリン脂質の例は天然に存在する（例 えば大豆又は卵黄由来の）、半合成（例えば一部分又は全部が水素化された）及 び合成のホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル イノシトール、ホスファチジン酸及びカルジオリピンを含む。そのようなリン脂 質の脂肪族アシル基は通常はそれぞれ約１４〜２２個の炭素原子を含み、例えば パルミトイル及びステアロイル基である。そのような荷電したリン脂質のリソ形 態も本発明にとって有用であり、この用語「リソ」は１個の脂肪族アシル基のみ を含むリン脂質を表し、この脂肪族アシル基は好ましくはグリセロール部分の１ 位炭素原子にエステル結合している。荷電したリン脂質のそのようなリソ形態は ２個の脂肪族アシル基を含む荷電したリン脂質と混合物にして有利に使用するこ とができる。 ホスファチジルセリンは本発明の造影剤における使用に特に好ましいリ ン脂質を代表しており、そして好ましくはその当初のリン脂質含量の実質的部分 、例えば少なくとも８０％、例えば８５〜９２％を占めるが、しかしながらこれ はその後の処理例えば熱殺菌において或る程度まで、例えば約７０％まで減少さ れうる。我々は理論的考察に束縛されることを望まないが、隣接するセリン部分 のカルボキシル及びアミノ基の間のイオン性橋架けがそのような系の安定性に寄 与しているのかもしれない。好ましいホスファチジルセリンには飽和の（例えば 水素化された又は合成の）天然ホスファチジルセリン及び合成又は半合成のジア ルカノイルホスファチジルセリン例えばジステアロイルホスファチジルセリン、 ジパルミトイルホスファチジルセリン及びジアラキドイルイルホスファチジルセ リンが含まれる。 そのようなホスファチジルセリンをベースとする造影剤を使用することの重要 な利点は身体が老化した赤血球及び血小板をその表面におけるホスファチジルセ リンの濃度が高いことによりこれらを認識し、それにより老化した赤血球を除去 するのと同じ仕方でそのような造影剤を血流から排除するであろうことである。 その上、そのような造影剤の表面は体により内生物として記憶されるので、それ らはある種のリポソーム製剤の投与の際に起こることのある有害な全身性副作用 例えば血流力学的作用及びその他のアナフィラキシー反応の誘発を回避すること ができる（例えば、WO−A−95／12386参照）。 本発明による使用に適当なリポソーム超音波造影剤は文献に記述されたように 製造することができ、例えば、WO−A−92／22247、WO−A−94／28780、WO−A−9 3／05819、WO−A−95／16467、PCT/GB 96/01361、及びUnger等，Invest.Radiol. ，29(Suppl.2):S134-S136(1994)を参照されたい。 本発明により使用される安定剤は２０℃を超える、例えば２５〜７０℃のガラ ス転移温度(Tg)、及び−３７℃又はそれを超えるTg'値を有する生理学的に許容 し得る凍結乾燥安定剤（又は混合物）であることができる。適当な安定剤の例は スクロース、マルトース.Ｈ₂Ｏ、トレハロース、ラフィノース及びスタキオース を含む。一つの特に好適な例は場合によって他の安定剤の少量（例えば20重量％ まで、好ましくは10重量％まで）と混合物にしたスクロースである。 一般に安定剤は凍結乾燥される組成物中で小胞造影剤の濃度より著しく過剰な 濃度で、例えば少なくとも１０：１、より正常には少なくとも２０：１、最適に は200：１のような高い割合で、そして、例えば5000：１の重量割合まで又はそ れを超えさえする割合で存在しうる。従って、乾燥製造物のガラス転移温度(Tg) への寄与は相対的に小胞成分と無関係であり、そして安定剤候補物質はそれらが 水性担体媒質に存在する他の補助剤との組み合わせにおいて、乾燥させて２０℃ を超えるガラス転移温度を有する製造物が形成されるか否かを決定する通常の技 法により容易に選別することができる。 安定剤は凍結乾燥に当てる組成物中で１〜５０重量％、好ましくは５〜３０％ 、より特別には約１０〜２０重量％存在させるのが好都合である。安定剤の濃度 は希望するなら等張濃度を超えてよく、なぜなら凍結乾燥後における復元（reco nstitution）の際製造物は希釈され得るからである。小胞成分は0.01〜５重量％ 、好ましくは0.1〜３％、特に好ましくは約0.5〜1.5重量％存在させるのが好ま しい（その重量としては膜形成性物質の重量のみを考慮する）。凍結乾燥製造物 を投与可能な分散体に変えるために使用する復元液に対する安定剤の量は像形成 される身体の部位又は器官及び選択される投与方法に依存して選ばれる。例とし て挙げれば凍結乾燥 を受ける組成物におけるそれの少なくとも２倍でよい。 超音波適用例えば超音波心臓検査法の場合、肺系の自由な通過を可能にしそし て約0.1〜１５MHzの好ましい像形成周波数との共鳴を達成するためには、0.1〜 １０μm、例えば１〜７μmの平均の大きさの小胞を使用するのが好都合であろう 。小胞は超音波心臓検査法にとって好ましい範囲内で極めて狭いサイズ分布をも って製造することができ、それによりそれらの音響発生性並びに生体内における 安全性が大きく向上し、そして血圧測定、血流追跡及び超音波断層撮影法のよう な適用において特定の利益を造影剤に付与する。かくして、例えば小胞の９０％ を超える（例えば少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％）部分が１〜７μ mの直径を有し、そして小胞の５％未満（例えば３％以下、好ましくは２％以下 ）が７μmを超える直径を有する製造物を容易に製造することができる。 超音波適用においては、造影媒質は例えば注射される膜形成性物質（例えばリ ン脂質）の量が0.1〜１０μg／kg体重、より好ましくは１〜５μg／kgの範囲で あるような用量を投与してよい。膜形成性物質のそのような低水準の使用はある かも知れない有毒な副作用を最小にする点で実質的な利益があると評価されるで あろう。 本発明の乾燥製造物を使用して作ったすぐ使用できる組成物中の全膜形成性物 質濃度は望ましくは0.01〜５重量％の範囲、好ましくは0.05〜2.0％そして特に 約0.5重量％である。 凍結乾燥に付される組成物は少なくとも一つの増量剤、例えばポリオール（例 えばグリセロール又はプロピレングリコールのようなＣ₃ポリオール）又は多糖 例えばデキストラン、又はポリグリコール例えばポリエチレングリコール又はそ れらの混合物を含有するのが有利である。典型的には増量剤は安定剤の濃度と同 じか又は僅かに少ない濃度、例えば３〜１０重 量％、好ましくは約５重量％の濃度で使用してよい。増量剤は凍結乾燥工程の際 結晶化可能でなければならず、これによりこの状態においてのみそれらは製造物 安定性に対して作用が中性である。かくしてそれらは凍結乾燥の間に非晶質状態 でなければならない安定剤と区別される。 その他の補助剤は希望により乾燥させる組成物に存在させてよく、又は投与の ための処方の際添加してよい。そのような補助剤は例えばｐＨ調節剤、浸透圧調 節剤、粘度増強剤、乳化剤などを包含してよく、そして慣用的な量で使用してよ い。 乾燥製造物は一般に粉末形態であり、そして水、水溶液例えば塩水（注射用最 終製造物が低張性にならないように釣り合わせるのが有利であろう）、又は１つ 又はそれより多くの張度調節物質例えば塩類（例えば生理学的に許容し得る対イ オンを有する血漿陽イオン）、又は糖、糖アルコール、グリコール及びその他の 非イオン性ポリオール物質（例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、マ ンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールな ど）の溶液で容易に復元可能である。復元は一般に例えば手で穏やかに振盪する ような最小限の撹拌を必要とするだけである。このようにして得られる小胞の大 きさは一貫して再現性があり、そして実際に加えられる撹拌エネルギーの量とは 無関係であり、最初の小胞分散体中に形成された小胞の大きさにより決まるが、 このサイズパラメータは驚くべきことに凍結乾燥及び復元製造物を通じて実質的 に維持される。従って、最初の分散体の小胞の大きさは撹拌の方法、速度及び時 間のような工程パラメータにより容易に調節されるので、最終の小胞の大きさは 容易に管理することができる。 復元液の量及び濃度は得られるすぐ使用できる処方物が実質的に等張性となる ように釣り合わせるのが望ましい。この故に選択される復元液の量 及び濃度は凍結乾燥製造物に存在する安定剤（及び他の増量剤）の種類及び量に 依存する。 本発明の凍結乾燥製造物は周囲条件下で数カ月間貯蔵安定であることが証明さ れた。水（又は上で述べたその他の復元液）で復元して得られる小胞分散体はか なりの長時間、例えば少なくとも１２時間まで安定であると思われ、注射前いつ 乾燥製造物を復元するかの判断は相当な柔軟性をもつことが許される。 復元液が張度調節剤として凍結乾燥時安定剤として使用したのと同じ化合物を 含有する場合、凍結乾燥のため組成物に存在する安定剤の量は凍結乾燥の間最適 の安定化を与えるに十分であることのみを必要とする。従って最終製造物の等張 性は復元液の適当な量及び濃度を選択することにより得ることができる。この故 に凍結乾燥段階で安定剤（１つ又は複数）として使用する化合物（１つ又は複数 ）の濃度及び種類、並びに復元液の化合物（１つ又は複数）の濃度及び種類につ いてはかなりの柔軟性が許容される一方、それでもなお安定な復元製造物が得ら れるのである。 本発明による凍結乾燥は慣用的な方法で実行できるが、本発明の安定剤の使用 はさらに利点を付加するものであり、何故なら乾燥前の組成物は一般にグルコー ス又はマンニトールのような低温保護剤を含有する同等の組成物より高いガラス 転移温度(Tg')を有し、より短い凍結乾燥サイクルを使用できるからである。 本発明は小胞超音波造影剤に関連して上に記述した。しかしながらその他の診 断用像形成方式（例えばMRI、Ｘ線、SPECT、PET、磁力記録式像形成など）につ いても小胞性造影剤に適用することが可能である。 ここで本発明は以下の限定されない実施例に関連してさらに説明されるであろ う。 実施例１ 凍結乾燥製造物の製造 500.4mgの水素化卵ホスファチジルセリンを5.4％(w/w)のプロピレングリコー ルとグリセロールとの混合物（３：10 w/w）を含む100mLの水に添加した。混合 物を振盪しそして８０℃に５分間加熱し、室温に放冷し、再び振盪しそして使用 する前一晩静置した。 得られる溶液の５０mLを、円錐状頚部を有する丸底フラスコに移した。２５℃ に維持する水浴に接続した温度調節用入口及び出口を有するガラスジャケットに フラスコを取り付けた。ロータステータ撹拌軸を溶液に導入し、そしてガス漏洩 を防ぐため頚部壁と撹拌軸との間の空隙をガス含量の調節及び圧力制御のための ガス入口／出口接続部とはめ合わせた特別に設計した金属栓で密封した。ガス出 口を真空ポンプに接続しそして溶液を１分間脱気した。次にペルフルオロ−ｎ− ブタンガスの気体をガス入口から適用した。 溶液を23000rpmで１０分間均質化し、ロータステータ撹拌軸を開口部が液体表 面の僅かに上にあるように保った。白色クリーム状の分散体が得られ、これを密 封可能な容器に移しそしてペルフルオロ−ｎ−ブタンをフラッシュさせた。次に 分散体を分離漏斗に移し、12000rpmで３０分間遠心分離して上に泡のクリーム状 層及び混濁した下層液を得た。下層液を除き、水で置き換えた。次いで遠心分離 を２回、但し今回は12000rpmで１５分間行った。最後の遠心分離後、上澄液を１ ０％(w/w)スクロースで置き換えた。得られた分散体を２mLづつ凍結乾燥用に特 別に設計した１０mL平底バイアル瓶に分注し、そしてバイアル瓶を−４７℃に冷 却し、約４８時間凍結乾燥して白色綿毛状の固体物質を得た。バイアル瓶を真空 室に移し、そして空気を真空ポンプで除き、ペルフルオロ−ｎ−ブタンガスで置 き換え た。使用する前、水を添加しそしてバイアル瓶を手で穏やかに数秒間振盪すると 超音波造影剤として適当な微小泡分散体が得られた。 特性の測定 微小泡のサイズ分布及び容積濃度を測定範囲が１〜３０μmの５Oμmの開口部 を取り付けたコールターカウンターマークII装置を使用して測定した。２０μL の試料を空気を飽和させた２００mLの塩水に室温で希釈し、そして測定前３分間 平衡させた。 超音波特性測定は、de Jong，N．及びHoff，Ultrasonics，31：175-181(1993) により僅かに修正した実験計画に従って実行した。この機器使用により造影剤の 希釈懸濁液の２〜８MHzの周波数範囲における超音波減衰効力を測定する。減衰 測定の際、試料を１２０mmHgの超過圧力に９０秒間さらして圧力安定性試験を実 行した。典型的には２〜３μLの試料を５５mlのIsoton IIで希釈しそして希釈し た試料懸濁液を分析する前３分間撹拌した。主要な反応パラメータとして3.5MHz における減衰と、超過圧力を解除後3.5MHzにおける回復減衰値とを併せて使用し た。 表 １ 実施例１により製造した泡分散体のインビトロ特性； 数及び容積加重濃度及び容積平均直径；上の記述により 測定した音響特性： 実施例 ２ 上の実施例１により製造した５つの試料の気体内容物をそれぞれ空気、ペルフ ルオロブタン、六フッ化硫黄、トリフルオロメチル硫黄ペンタフルオリド及びテ トラメチルシランで次の手順により置き換えた。 実施例１の凍結乾燥製造物を含む２つの試料をガス入口及びガス出口を有する デシケータに入れた。デシケータを試料の制御された脱気が可能なBuchi 168真 空／蒸溜器制御装置及び選択したガスの入口に接続した。試料を約１０mbarで５ 分間脱気し、その後選択ガスを流入させて圧力を大気圧まで上げ、次いでバイア ル瓶に注意深くキャップを付した。この手順を選択ガスのそれぞれにつき、別の 試料の一対を使用して繰り返した。 ２mLの蒸留水を各バイアル瓶に添加しそして使用前バイアル瓶を手で穏やかに 振盪した。得られた微小泡分散体につき実施例１に記述したようにサイズ分布測 定に関連した特性を把握した。結果を表２に要約して示す。表 ２ 実施例２により製造したホスファチジルセリン安定化微小泡分散体 のインビトロ特性−数及び容積加重濃度及び容積平均直径 上表の結果に見られるように気体交換によるサイズ分布における著しい変化は 認められず、予め形成された微小泡の大きさは凍結乾燥及び再構成の両方を通じ て実質的に維持されることを示している。 インビボの結果 ５種類のガスをそれぞれ使用して製造した１バッチにつき１０MHzにおけるド ップラー増強特性をインビボで評価した。分散体をチンチラ兎に耳 動脈を経由して注射し、そして超音波プローブを直接頚動脈においてドップラー 法を使用して測定した。信号の強度及び持続時間を記録しそしてドップラー曲線 の積分を計算した。得られた結果（下記表３参照）はペルフルオロブタンを含む 微小泡が最も強いドップラー強度増強を与えることを示している。六フッ化硫黄 、トリフルオロメチル硫黄ペンタフルオリド又はテトラメチルシランを含む微小 泡はペルフルオロブタンを含むそれよりドップラー増強剤として僅かながら効力 が劣り、ペルフルオロブタンの数値の６０〜８０％の積分を示す。 表 ３ 実施例２製造物の兎静脈内注射についての結果。数値は基線に おける移動を補正してある。ドップラー単位は血液の信号に 対してドップラー信号の増加と定義する： 実施例３ ペルフルオロブタンの雰囲気下で凍結乾燥物質を含むバイアル瓶を実施例１に 記述したように製造した。使用の直前水をバイアル瓶に添加して微小泡懸濁液を 作った。 ２００mLのIsoton II液を室温で数日間空気にさらして十分に空気で飽和させ た溶液を作った。別の２００mLの液体を真空フラスコ中で６０℃ で１時間脱気しそして室温に冷却し、その間真空を保った。使用直前空気をフラ スコに導入した。 微小泡懸濁液の１０μLづつを各々の液体に添加しそして得られた混合物をサ イズ特性測定（コールターマルチサイザーマークII）の前５分間インキュベート した。 液体から微小泡への気体の拡散が予想されない脱気された環境で、平均微小泡 直径は1.77μmであり、そして微小泡の0.25％は５μmより大きかった。空気で飽 和させた液体では対応する値は2.43μm及び0.67％であった。さらに５分後行っ た繰り返し測定は微小泡の大きさが安定な値に達していることを示した。 これらの知見は微小泡の直径はそれらが動脈血に類似する空気で飽和させた液 体にさらされる場合でも３７％増加するのみであり、毛細血管の閉塞を引き起こ すことのある大きさに達する微小泡は極めて稀であることを示している。これは 、WO−A−95／03835の実施例IIに報告されているように同様の環境（すなわち溶 存空気を含む水中で高度に希釈された微小泡の分散体）で空気／ペルフルオロヘ キサン含有微小泡の大きさが２倍になるのとは対照的である。 実施例 ４ 比較試験 凍結乾燥前の上澄液を、(ａ)スクロース６５mg／mL＋マンニトール６５mg／mL 、（ｂ）マンニトール100mg／mL＋グルコース５０mg／mL、(ｃ)スクロース２０m g／mL、マンニトール７６mg／mL及びグルコース３８mg／mL、及び(ｄ)スクロー ス９０mg／mLで置き換えて実施例１を繰り返した。 湿潤及び乾燥組成物のTg'及びTg値を測定した。結果を下の表４に示す。表 ４ 処 方 Tg' Tg (ａ) −３８℃ １９℃ (ｂ) −４３℃ １４℃ (ｃ) −４２℃ １２℃ (ｄ) −３２℃ ６６℃ 処方(ａ)〜(ｃ)は処方(ｄ)より長い凍結乾燥周期を必要とし、そして処方(ｄ) とは異なってそれらの完全性を維持するには周囲温度より低温で貯蔵しなければ ならない。 実施例 ５ 気体の保持 凍結乾燥の前に、上澄液を(ａ)スクロース１０％(w/w)、(ｂ)PEG3000 ５％(w/ w)、(ｃ)マンニトール２％(w/w)及びグルコース１％(w/w)、並びにトレハロース ５％(w/w)を使用して置き換えたことを除いて実施例１と同様に製造した物質を Ｎ₂による大量のフラッシングにさらし、反復する真空周期にさらし、そして粉 砕して製造物のペルフルオロブタンを保持する能力を試験した。圧力処理後残存 するペルフルオロブタン含量を測定した。結果を下の表５に示す。 表 ５ 低温保護剤 mg PFB ／ｇ製造物 スクロース 0.69±0.10 ＰＥＧ３０００ ≦0.05 マンニトール＋グルコース 0.29±0.10 トレハロース 1.24±0.38 前の実施例において、より高いパーセンテージ（例えば10％より20％）の安定 剤を使用することができ、そして水以外の他の復元液、例えば塩水 又は上に挙げたポリオール溶液を使用することができる。同様に、凍結乾燥され る分注量はより多くてもよく（例えば２mLより４mL）、凍結乾燥バイアル瓶はよ り大きくてもよく（例えば２０mL）、そして凍結乾燥時間はより長くてもよい（ 例えば60時間）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年４月２０日（１９９８．４．２０） 【補正内容】 請求の範囲 １．凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤において凍結乾燥安定剤の小胞に対する 重量比が少なくとも１０：１で前記凍結乾燥安定剤を含有しそして２０℃を越え る温度で熱安定である前記凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤。 ２．凍結乾燥安定剤を含有しそして２０℃を越えるガラス転移温度(Tg)を有する 凍結乾燥した小胞含有超音波造影剤。 ３．前記安定剤がスクロース、マルトース.Ｈ₂Ｏ、トレハロース、ラフィノース 及びスタキオースからなる群より選ばれる請求項１及び２のいずれかの項に記載 の造影剤。 ４．前記安定剤がスクロースからなる請求項１及び２のいずれかの項に記載の造 影剤。 ５．前記剤において前記安定剤の小胞に対する重量比が少なくとも２０：１であ る請求項１〜４のいずれか一項に記載の造影剤。 ６．前記剤において小胞がハロカーボンガス又はガス前駆物質を含有する請求項 １〜５のいずれか一項に記載の造影剤。 ７．前記剤において小胞がペルフルオロアルカンを含有する請求項６に記載の造 影剤。 ８．前記剤において小胞がペルフルオロブタン及びペルフルオロペンタンから選 ばれるペルフルオロアルカンを含有する請求項６に記載の造影剤。 ９．前記剤において小胞の膜がリン脂質からなる請求項１〜８のいずれか一項に 記載の造影剤。 10．小胞超音波造影剤及び凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物からなる水性分散 体を凍結乾燥することからなる熱安定な凍結乾燥した小胞含有超 音波造影剤の製造方法であって、ここで前記安定剤又は安定剤の混合物は少なく とも２０℃のTg値及び−３７℃又はそれより高いTg'値(前記安定剤又は安定剤の 混合物の最大限に凍結濃縮した純粋な水溶液のガラス転移温度)を有し、そして 前記安定剤又は安定剤の混合物は前記小胞超音波造影剤に対する重量比が少なく とも１０：１で前記分散体に存在することを特徴とする前記方法。 11．前記水性分散体が前記安定剤の１〜５０重量％を含有する請求項１０に記載 の方法。 12．前記小胞造影剤がハロカーボンガス又はガス前駆物質を含有する請求項１０ 及び１１のいずれかの項に記載の方法。 13．前記小胞がペルフルオロブタン及びペルフルオロペンタンから選ばれるハロ カーボンを含有する請求項１２に記載の方法。 14．前記水性分散体がさらに増量剤を含有する請求項１０〜１３のいずれか一項 に記載の方法。 15．前記増量剤がＣ₃ポリオールである請求項１４に記載の方法。 16．前記水性分散体が前記増量剤の３〜１０重量％を含有する請求項１４及び１ ５のいずれかの項に記載の方法。 17．水性担体媒質、凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物及び音響発生小胞超音波 造影剤からなる超音波造影媒質であって、ここで前記安定剤又は安定剤の混合物 は少なくとも２０℃のTg値及び−３７℃又はそれより高いTg'値を有しそして前 記安定剤又は安定剤の混合物は前記小胞超音波造影剤に対する重量比が少なくと も１０：１で前記媒質に存在することを特徴とする前記媒質。 18．前記安定剤又は安定剤の混合物を少なくとも１０：１の小胞に対する重量比 で含有しそして診断用超音波像形成を包含する診断に使用する 小胞含有超音波造影媒質の製造のため、少なくとも２０℃のTg値及び−３７℃又 はそれより高いTg'値を有する凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物の使用。 19．小胞含有超音波造影剤の貯蔵及び輸送の方法であって、ここで前記剤は凍結 乾燥形態であり、凍結乾燥安定剤を少なくとも１０：１の小胞に対する重量比で 含有しそして少なくとも２０℃のガラス転移温度(Tg)を有し、そして貯蔵及び輸 送を冷却を使用しないで実行することを特徴とする前記方法。 20．小胞含有超音波造影媒質の製造方法であって、前記方法は請求項１〜１９の いずれか一項に記載の凍結乾燥した造影剤を生理学的に許容し得る水性分散媒質 に分散させることからなる前記方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９６２４９１９．８ (32)優先日 平成８年11月29日(1996．11．29) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ブレンデン，ヨールン・ウンヘイム ノールウエー国エン―0401 オスロ．ニユ コヴエイエン １―２．ニユコメド・イメ ージング・アクシエセルカペト (72)発明者 フアールヴイク，アンネ・ヒエーシユテイ ノールウエー国エン―0401 オスロ．ニユ コヴエイエン １―２．ニユコメド・イメ ージング・アクシエセルカペト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．凍結乾燥安定剤を含有しそして２０℃を越える温度で熱安定な凍結乾燥した 小胞含有超音波造影剤。 ２．凍結乾燥安定剤を含有しそして２０℃を越えるガラス転移温度（Tg）を有す る小胞含有超音波造影剤。 ３．前記安定剤がスクロース、マルトース.Ｈ₂Ｏ、トレハロース、ラフィノース 及びスタキオースからなる群より選ばれる請求項１及び２のいずれかの項に記載 の造影剤。 ４．前記安定剤がスクロースからなる請求項１及び２のいずれかの項に記載の造 影剤。 ５．前記剤において前記安定剤の小胞に対する重量比が少なくとも１０：１であ る請求項１〜４のいずれか一項に記載の造影剤。 ６．前記剤において前記安定剤の小胞に対する重量比が少なくとも２０：１であ る請求項１〜４のいずれか一項に記載の造影剤。 ７．前記剤において小胞がハロカーボンガス又はガス前駆物質を含有する請求項 １〜６のいずれか一項に記載の造影剤。 ８．前記剤において小胞がペルフルオロアルカンを含有する請求項７に記載の造 影剤。 ９．前記剤において小胞がペルフルオロブタン及びペルフルオロペンタンから選 ばれるペルフルオロアルカンを含有する請求項７に記載の造影剤。 10．前記剤において小胞の膜がリン脂質からなる請求項１〜９のいずれか一項に 記載の造影剤。 11．小胞超音波造影剤及び凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物からなる水性分散 体を凍結乾燥することからなる熱安定な凍結乾燥した小胞含有超 音波造影剤の製造方法であって、ここで前記安定剤又は安定剤の混合物は少なく とも２０℃のTg値及び−３７℃又はそれより高いTg'値を有することを特徴とす る前記方法。 12．前記水性分散体が前記安定剤の１〜５０重量％を含有する請求項１１に記載 の方法。 13．前記水性分散体が前記安定剤及び小胞超音波造影剤を少なくとも１０：１の 重量比で含有する請求項１１及び１２のいずれかの項に記載の方法。 14．前記小胞造影剤がハロカーボンガス又はガス前駆物質を含有する請求項１１ 〜１３のいずれか一項に記載の方法。 15．前記小胞がペルフルオロブタン及びペルフルオロペンタンから選ばれるハロ カーボンを含有する請求項１４に記載の方法。 16．前記水性分散体がさらに増量剤を含有する請求項１１〜１５のいずれか一項 に記載の方法。 17．前記増量剤がＣ₃ポリオールである請求項１６に記載の方法。 18．前記水性分散体が前記増量剤の３〜１０重量％を含有する請求項１６及び１ ７のいずれかの項に記載の方法。 19．水性担体媒質、凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物及び音響発生小胞超音波 造影剤からなる超音波造影媒質であって、ここで前記安定剤又は安定剤の混合物 は少なくとも２０℃のTg値及び−３７℃又はそれより高いTg'値を有することを 特徴とする前記媒質。 20．診断用超音波像形成を包含する診断に使用する小胞含有超音波造影媒質の製 造のため、少なくとも２０℃のTg値及び−３７℃又はそれより高いTg'値を有す る凍結乾燥安定剤又は安定剤の混合物の使用。 21．小胞含有超音波造影剤の貯蔵及び輸送の方法であって、ここで前記剤 は凍結乾燥形態であり、凍結乾燥安定剤を含有しそして少なくとも２０℃のガラ ス転移温度(Tg)を有し、そして貯蔵及び輸送を冷却を使用しないで実行すること を特徴とする前記方法。 22．小胞含有超音波造影媒質の製造方法であって、前記方法は請求項１〜１０の いずれか一項に記載の凍結乾燥した造影剤を生理学的に許容し得る水性分散媒質 に分散させることからなる前記方法。