JP7786458B2 - 抗体を分析する方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗体を分析する方法に関する。具体的には、質量分析を利用した抗体の定量方法に関する。

タンパク質の定量法としては、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）が一般的に行われている。しかしながら、ＥＬＩＳＡは、検出したいタンパク質ごとに特異抗体を準備する必要があること、複数のタンパク質を同時に検出できないこと等の課題があった。そこで、ＥＬＩＳＡに代わるタンパク質の定量法として、質量分析を用いる方法の開発が行われている。

本発明者等のグループは、抗体等のタンパク質を位置選択的にプロテアーゼによって消化することで、質量分析を用いたタンパク質の特異的検出のために最適なペプチド断片を得ることができる方法を見出している。得られたペプチド断片は液体クロマトグラフ質量分析によって効果的に検出および定量できる（特許文献１：国際公開第２０１５／０３３４７９号、特許文献２：国際公開第２０１６／１９４１１４号、非特許文献１：Iwamoto N et.al., Analyst. 2014 Feb 7; 139(3): 576-80. doi: 10.1039/c3an02104a）。

国際公開第２０１５／０３３４７９号 国際公開第２０１６／１９４１１４号

Iwamoto N et.al., Selective detection of complementarity-determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate: nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis, Analyst. 2014 Feb 7; 139(3): 576-80. DOI: 10.1039/c3an02104a

質量分析により抗体を定量するためには、測定対象である抗体を用いて検量線を作成することが一般的である。しかしながら、複数の抗体を測定する場合に、測定対象ごとに検量線を作成することは効率的ではない。また、そもそも、機能的な解析で重要になってくる中和抗体や新規クローンなどの抗体においては、安定的に検量線を作成するための抗体が得られない場合も多い。本発明は、測定対象である抗体を用いて検量線を作成しなくても質量分析により抗体を定量することが可能な方法を提供する。

本発明は、
生体タンパク質および標的抗体をプロテアーゼで消化することと、
消化された前記生体タンパク質および前記標的抗体のペプチド断片を質量分析することと、
前記質量分析によって得られた前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比に基づいて、前記標的抗体を定量することを含み、
前記プロテアーゼで消化することは、
担体の細孔内に前記生体タンパク質および前記標的抗体を固定することと、
前記細孔の径よりも大きい径を有し、前記プロテアーゼが表面に固定された微粒子と、前記担体と、を近接させることとを含み、
前記生体タンパク質は、前記細孔に固定可能なドメインを有する、
抗体を分析する方法に関する。

本発明は、
生体タンパク質と、少なくとも２種の標的抗体を含む試料と、をプロテアーゼで消化することと、
消化された前記生体タンパク質および前記標的抗体のペプチド断片を質量分析することと、
前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比に基づいて、前記標的抗体を定量することを含み、
前記生体タンパク質は、モノクローナル抗体である、
抗体を分析する方法に関する。

本発明は、
上記抗体を分析する方法に用いるプログラムであって、
前記プログラムは、
質量分析装置から出力されるマススペクトルを受付け、
前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比を記憶部から読出し、
前記マススペクトルから算出される前記生体タンパク質の検出量を補正し、
前記標的抗体の量を算出する処理を処理装置に実行させる、プログラムに関する。

本発明によれば、測定対象である抗体を用いて検量線を作成することなく、質量分析によって抗体を定量することができる。

抗体を位置選択的に切断する方法の一例を示す図である。 実施例で用いられた抗体のシグネチャーペプチド配列およびＣＤＲ３配列を示す表である。 実施例で用いられた抗体のシグネチャーペプチド配列を示す表である。 実験３において、抗体をプロテアーゼで消化する手順を説明する図である。 実験３において、単一試料を質量分析したときのイオンカウント数（ｃｐｓ）と、混合試料を質量分析したときの各抗体のｃｐｓとを比較したグラフである。横軸は各抗体の略号を示し、縦軸はｃｐｓを示している。 実験３において、内部標準を用いて単一試料の検出量を補正した値と、内部標準を用いて混合試料中の各抗体の検出量を補正した値とを比較したグラフである。横軸は各抗体の略号を示し、縦軸は内部標準を用いて補正した値（内部標準補正値）を示している。 実験４において、トラスツズマブのｃｐｓに対する各抗体のｃｐｓ比を示すグラフである。横軸は各抗体の濃度を示し、縦軸はトラスツズマブのｃｐｓに対する各抗体のｃｐｓ比を示す。 実験４において、トラスツズマブのｃｐｓに対する各抗体のｃｐｓ比を示すグラフである。横軸は各抗体の濃度を示し、縦軸はトラスツズマブのｃｐｓに対する各抗体のｃｐｓ比を示す。 実験４において、トラスツズマブのｃｐｓに対する各抗体のｃｐｓ比を示すグラフである。横軸は各抗体の濃度を示し、縦軸はトラスツズマブのｃｐｓに対する各抗体のｃｐｓ比を示す。 実験５において、トラスツズマブを用いた検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度（横軸）と、イピリムマブを用いた検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度（縦軸）とを比較したグラフである。 実験５において、トラスツズマブを用いた検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度（横軸）と、ペムブロリズマブを用いた検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度（縦軸）とを比較したグラフである。 実験６において、イピリムマブを用いた検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度（横軸）と、トラスツズマブを用いた検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度（縦軸）とを比較したグラフである。 実験６において、ペムブロリズマブを用いた検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度（横軸）と、トラスツズマブを用いた検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度（縦軸）とを比較したグラフである。 実験６において、イピリムマブを用いた検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度（横軸）と、各参照タンパク質を用いた検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度（縦軸）とを比較したグラフである。 実験６において、イピリムマブを用いた検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度（横軸）と、各参照タンパク質を用いた検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度（縦軸）とを比較したグラフである。 実験６において、ペムブロリズマブを用いた検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度（横軸）と、各参照タンパク質を用いた検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度（縦軸）とを比較したグラフである。 実験６において、ペムブロリズマブを用いた検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度（横軸）と、各参照タンパク質を用いた検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度（縦軸）とを比較したグラフである。

［抗体を分析する方法］
本実施形態に係る抗体を分析する方法は、
生体タンパク質および標的抗体をプロテアーゼで消化することと、
消化された前記生体タンパク質および前記標的抗体のペプチド断片を質量分析することと、
前記質量分析によって得られた前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比に基づいて、前記標的抗体を定量することを含む。

本実施形態において、「生体タンパク質」とは、細胞、生体組織等の生体に由来するタンパク質、又は、これらを人工合成したタンパク質を意味する。本実施形態の一側面において、上記生体タンパク質は、本実施形態に係る抗体を分析する方法において参照物質として用いられていることから、「参照タンパク質」と把握することもできる。上記生体タンパク質は、バイオロジックスであることが好ましい。本実施形態において「バイオロジックス」とは、生物を用いて製造、抽出、合成などされた医薬品を意味する。上記バイオロジックスは、「バイオ医薬品」、「生物学的製剤」と把握することもできる。本実施形態の他の側面において、上記生体タンパク質としては、例えば、後述する抗体（例えば、参照抗体等）、Ｆｃ融合タンパク質、並びに、マウス、ラット及びウサギ等に由来するモノクローナル抗体等が挙げられる。本実施形態において、上記生体タンパク質は、参照抗体又はＦｃ融合タンパク質を含むことが好ましい。

本実施形態の一側面において、上記生体タンパク質は、参照抗体を含むことが好ましい。

すなわち、本実施形態に係る抗体を分析する方法は、
参照抗体および標的抗体をプロテアーゼで消化するステップと、
消化された参照抗体および標的抗体のペプチド断片を質量分析するステップと、
参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比に基づいて、標的抗体を定量するステップを含むことが好ましい。

本実施形態に係る方法においては、測定対象ごとに検量線を作成する必要がないため、検量線の作成に用いられる抗体の削減および質量分析の簡素化が期待される。抗体医薬の現場においては、生体内、例えば血液または組織中の抗体量を簡便に定量することの重要性が高まっている。本実施形態によれば、測定対象である抗体によって検量線を作成することができない場合であっても、他の抗体を基準にして試料中の抗体医薬の濃度を算出することができる。また、本実施形態に係る方法によれば、汎用的なひとつの抗体を基準に用いることができるため、試料中に含まれる２種以上の抗体を同時に測定したい場合にも有用である。本実施形態に係る方法によれば、薬物動態試験の簡素化およびコスト削減が見込まれる。

生体中には、医薬として投与された抗体（例えばモノクローナル抗体）以外にも、生体内で産生された抗体が多数存在する。生体内で産生された抗体は検量線を作成することが容易ではなく、従来、このような抗体を質量分析により定量することは困難であった。本実施形態に係る方法によれば、生体内で産生された中和抗体、自己抗体およびそのクロノタイプ等の定量も質量分析によって行うことが可能になる。

＜抗体をプロテアーゼで消化するステップ＞
質量分析法により、タンパク質を簡便に精度よく検出および定量するためには、測定対象のタンパク質を位置選択的に切断し、そのタンパク質に特異的なペプチド断片を効率的に産生させ、他のペプチド断片の産生量を小さくすることが有効である。測定対象が抗体である場合には、例えばＦａｂドメインまたはＦａｂドメインの可変領域を位置選択的に消化し、一方、Ｆｃドメインの消化を抑制することにより、高感度で抗体を検出できる。

本実施形態に係る方法において、標的抗体は、定量する対象の抗体であり、参照抗体は標的抗体を定量するために対比される抗体である。上記参照抗体は、上記生体タンパク質に相当する。本明細書において、標的抗体および参照抗体をまとめて「抗体」ということがある。抗体の一例は、ＦｃドメインとＦａｂドメインとがヒンジ部を介してつながった免疫グロブリンＩｇＧである。抗体分子を構成する２本の重鎖および２本の軽鎖はそれぞれ定常領域と可変領域とを有する。定常領域は、同一種由来の抗体のほとんどで共通するアミノ酸配列を有する。可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特異的な配列を持つ部位が各３つずつ存在する。このＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が規定する立体構造が抗原との特異性を決定する。

参照抗体のプロテアーゼによる消化と標的抗体のプロテアーゼによる消化とは、一方を行ったあとに他方を行ってもよいが、好ましくは同時に行う。標的抗体と参照抗体とは、同一の試料中に含まれていてもよいし、異なる試料中に含まれていてもよい。

標的抗体は、製造された抗体を含んでよく、生体内で産生された抗体を含んでもよい。標的抗体は、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含んでよい。標的抗体は、免疫反応により生体内で産生された抗体を含んでもよく、中和抗体、自己抗体および／またはそのクロノタイプを含んでもよい。標的抗体は、２種以上の抗体を含んでもよい。同時に定量できる抗体の種類は、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１５種、２０種、４０種、６０種、８０種またはそれ以上であってよい。複数の標的抗体は、同一の試料中に含まれていてもよいし、異なる試料中に含まれていてもよい。

標的抗体は、培養細胞、培養組織またはその培養上清に含まれる抗体であってもよいが、好ましくは生体試料に含まれる抗体である。生体試料は、被検体から得た血液であってよく、生体組織、尿、糞便、汗、唾液、リンパ液、羊水、母乳、胸水、腹水、脳脊髄液、涙等であってもよい。血液に由来する生体試料は、全血であってもよいが、好ましくは血漿または血清である。試料は、生理食塩水、緩衝液等で希釈されてもよい。被検体は、動物であってよく、例えばヒトを含む哺乳類である。被検体は、モノクローナル抗体を抗体医薬として投与された患者であってもよい。生体試料は、生体試料の種類に応じて適宜採取すればよく、採取後に室温または低温で保存してもよい。標的抗体が生体試料に含まれる抗体であるとき、本実施形態に係る方法によって、生体内の標的抗体の濃度を決定することができる。

参照抗体は、標的抗体として例示された抗体を使用できる。参照抗体は、標的抗体とは異なる抗体である。本実施形態の一側面において、参照抗体は、標的抗体に対して少なくとも可変領域のアミノ酸配列が異なる抗体である、と把握することもできる。一つの分析において参照抗体として用いられた抗体は、他の分析においては標的抗体であってもよい。参照抗体は濃度が特定されていることが好ましい。複数の濃度を有する参照抗体を用いて、検量線を作成できる。参照抗体は、安定性同位体アミノ酸でラベルされていてもよいし、ラベルされていなくてもよい。

参照抗体は、入手が容易な抗体であることが好ましい。参照抗体は、濃度およびアミノ酸配列の特定が容易である観点から、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体としては、特に限定されないが、完全ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってよく、トラスツズマブ、トラスツズマブ－ＤＭ１、ベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ニボルマブ、ブレンツキシマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、モガムリズマブ、ラムシルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、インフリキシマブ、トシリズマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、メポリズマブ、ウステキヌマブ、エクリズマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、ゲムツズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ、オクレリズマブ、バシリキシマブ等が挙げられる。モノクローナル抗体の分子径は約１４．５ｎｍである。モノクローナル抗体の特異性を維持しつつ更なる機能を付加した複合体、例えば抗体－薬物複合体（例えばブレンツキシマブ－ベドチン、ゲムツズマブ－オゾガマイシン、トラスツズマブ－エムタンシン等）も本実施形態の方法におけるモノクローナル抗体に含まれる。分析に先立って複合体の結合を解離させ、抗体部分のみを分析に供してもよいが、複合体の形態のままで分析に供することもできる。

本実施形態において、上記生体タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質であってもよい。ここで、「Ｆｃ融合タンパク質」とは、機能性タンパク質又はそのドメインと、免疫グロブリンのＦｃドメインとを融合させた組換えタンパク質を意味する。上記機能性タンパク質又はそのドメインとしては、例えば、ヒト細胞障害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）の細胞外ドメイン、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体１及び２タンパク質の細胞外ドメイン、並びに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体等が挙げられる。上記Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、アバタセプト（ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインと免疫グロブリンのＦｃドメインとの融合タンパク質）、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ受容体１及び２タンパク質の細胞外ドメインと免疫グロブリンのＦｃドメインとの融合タンパク質）、及び、エタネルセプト（ＴＮＦ受容体と免疫グロブリンのＦｃドメインとの融合タンパク質）等が挙げられる。本実施形態の一側面において、上記Ｆｃ融合タンパク質は、アバタセプト、アフリベルセプト及びエタネルセプトからなる群より選択されることが好ましい。

本実施形態の一側面において、プロテアーゼで消化するステップは、好ましくは
（ａ）担体の細孔内に生体タンパク質および標的抗体を固定するステップと、
（ｂ）細孔の径よりも大きい径を有し、プロテアーゼが表面に固定された微粒子と、担体と、を近接させるステップとを含む。

本実施形態の他の側面において、Ｆａｂドメイン（又は、Ｆｃ融合タンパク質における機能性タンパク質のドメイン）を位置選択的に消化するために、抗体をプロテアーゼで消化するステップは、好ましくは
（ａ）担体の細孔内に参照抗体（又は、Ｆｃ融合タンパク質）および標的抗体を固定するステップと、
（ｂ）細孔の径よりも大きい径を有し、プロテアーゼが表面に固定された微粒子と、担体と、を近接させるステップとを含む。

（ａ）担体の細孔内に参照抗体および標的抗体を固定するステップ
抗体を固定する担体は、多数の細孔を有する多孔質体であってよく、細孔内に抗体を結合可能である。担体の材料は特に限定されないが、活性炭、多孔質膜、多孔質樹脂ビーズ、金属粒子等を用いることができる。

細孔の形状は特に限定されないが、半球形状であってもよく、担体を貫通する形状であってもよい。細孔の大きさは、抗体を固定した際に、細孔の開口部付近に抗体の先端部分、すなわち選択的消化されるべき部位が位置するように、抗体の分子径等を考慮して決定することが好ましい。担体の平均細孔径は、例えば１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下程度の範囲で、かつ微粒子の平均粒径よりも小さい範囲で適宜に設定される。担体の平均細孔径は、例えば２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上または５０ｎｍ以上であってよく、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下または１００ｎｍ以下であってよい。担体の平均細孔径は、電子顕微鏡法によって求めることが可能である。

担体の細孔内に抗体を固定するために、抗体と部位特異的に相互作用するリンカーが細孔内に固定化された担体が好ましく用いられる。抗体とリンカーとの相互作用としては、化学結合、水素結合、イオン結合、錯体形成、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用、立体選択的相互作用等が挙げられる。細孔内に固定されやすい観点から、好ましくは参照抗体は、より好ましくは参照抗体および標的抗体は、細孔に固定可能なドメインを有する。細孔に固定可能なドメインは、例えば抗体のＦｃドメインである。本実施形態の一側面において、生体タンパク質は、前記細孔に固定可能なドメインを有する。

リンカーとしては、好ましくは抗体のＦｃドメインと部位特異的に結合するＰｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ等が用いられる。細孔内にこれらのリンカーが固定化された担体を用いることにより、細孔内に抗体のＦｃドメインが固定化され、Ｆａｂドメインが細孔の開口部付近に位置する。細孔内での抗体の配向が制御されることで、プロテアーゼによるＦａｂドメインの位置選択的消化が可能となる。

本実施形態において好適に使用可能な担体として、特に限定するものではないが、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ社製）、トヨパール ＴＳＫｇｅｌ（ＴＯＳＯＨ社製）、トヨパール ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＣ－６５０Ｆ ｒｅｓｉｎ（ＴＯＳＯＨ社製）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）、ＫａｎＣａｐＡ（ＫＡＮＥＫＡ）等が挙げられる。

抗体を担体の細孔内に固定する方法は特に限定されず、例えば細孔内にＰｒｏｔｅｉｎ ＡまたはＰｒｏｔｅｉｎ Ｇが固定化された担体に抗体を固定化する場合は、担体の懸濁液と抗体を含む溶液とを混合することにより、細孔内に抗体を容易に固定化できる。担体と抗体の量比は、目的に応じて適宜に設定できる。その後、担体を適当な緩衝液を用いて洗浄し、非特異的に結合した抗体および試料に含まれる分子を除く。緩衝液としては、例えばＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、ｎ－オクチルチオグリコシド（ＯＴＧ）含有ＰＢＳ等が用いられる。洗浄は、例えばフィルター内蔵プレートを用いて吸引または遠心操作によって、多サンプルを同時に、自動化して行うことができる。

（ａ’）酸性条件下で還元反応を行うステップ
上記の（ａ）担体の細孔内に参照抗体および標的抗体を固定するステップの後で、（ａ’）酸性条件下で抗体に対して還元反応を行うステップを実施してもよい。抗体は、何らかのメカニズムで、例えばＳＳ結合（ジスルフィド結合）によるシステインノット構造の存在によって非常にリジッドな領域が存在して、プロテアーゼに対する耐性が生じる場合がある。例えばモノクローナル抗体の約２０～３０％は局所的なプロテアーゼ抵抗性を有することが知られている。このようなリジッドな抗体は、酸性還元処理を行うことにより、プロテアーゼによる消化効率が向上することがある。酸性還元条件ではｐｒｏｔｅｉｎ Ａまたはｐｒｏｔｅｉｎ ＧとＦｃドメインとの結合は解離しないため、抗体分子を担体上に保持したままシステインノット構造をほぐすことが可能となると考えられる。

酸性条件下での還元反応は、例えば有機リン系還元剤の存在下でのインキュベーションによって実施することができる。有機リン系還元剤としては、例えばトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ：ＴＣＥＰ）またはその塩酸塩、トリブチルホスフィン等が挙げられる。これらの還元剤は、シグマ・アルドリッチ社、ナカライテスク株式会社、フナコシ株式会社等から入手することができる。反応液中のＴＣＥＰの濃度は、例えば１００ｍＭ以上５００ｍＭ以下であってよく、例えば２５０ｍＭである。

還元反応は、ｐＨ２．５以下の強酸性条件下、例えばｐＨ１．５、ｐＨ２．０、ＰＨ２．５等で実施することが好ましい。還元反応の時間は、限定するものではないが、１０分以上６０分以下であれば十分であり、例えば２０分間、３０分間、４０分間、４５分間、５０分間であり得る。６０分間を超えて還元反応を行うことも可能であるが、その場合、測定のための作業時間が長くなる。反応温度は、限定するものではないが、例えば１５℃以上３０℃以下であればよく、室温で反応を実施することができる。好適には、反応温度は約２５℃である。

酸性還元処理を行わない試料と、酸性還元処理を行う試料とは同時に質量分析に供されてもよい。具体的には、担体と抗体溶液とを混合した溶液を二分し、一方はそのまま洗浄を行う。もう一方は酸性還元処理を行ったあと、洗浄を行う。洗浄後の両者の担体を合わせて、次のプロテアーゼによる消化のステップを行う。これにより、ＴＣＥＰ酸性還元処理を行った抗体から生じたペプチド断片とＴＣＥＰ酸性還元処理を行っていない抗体から生じたペプチド断片との両方を１つのサンプルとして質量分析に供することができる。

（ｂ）細孔の径よりも大きい径を有し、プロテアーゼが表面に固定された微粒子と、担体と、を近接させるステップ
微粒子に固定させるプロテアーゼの種類は、質量分析による定量の対象となる抗体の種類に応じて適宜選択すればよく、例えばトリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮプロテアーゼ（Ａｓｐ－Ｎ）、ＡｒｇＣプロテアーゼ（Ａｒｇ－Ｃ）、パパイン、ペプシン、ジペプチジルペプチダーゼを単独または組み合わせて使用することができる。プロテアーゼとして、好ましくはトリプシンが用いられる。本実施形態の方法において好適に使用できるプロテアーゼとして、例えばＴｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ（プロメガ社製）、Ｔｒｙｐｓｉｎ ＴＰＣＫ－ｔｒｅａｔｅｄ（シグマ社製）等が挙げられる。

微粒子は、その表面にプロテアーゼを固定化して、担体の細孔内に固定された抗体へのプロテアーゼのアクセスを制御する目的で用いられる。そのため、微粒子は、担体の細孔の奥深くまで入り込まないように、その平均粒径が、担体の平均細孔径よりも大きいものが用いられる。微粒子の平均粒径は、担体の平均細孔径の１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上であってよく、約２倍であってもよい。微粒子の平均粒径は、５０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１２０ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上または１７０ｎｍ以上であってよく、５００ｎｍ以下または３００ｎｍ以下であってよい。微粒子の平均粒径は、電子顕微鏡法によって求めることが可能である。

微粒子の形状は、特に限定されないが、担体へのプロテアーゼのアクセスの均一化の観点から、球状であることが好ましい。微粒子は、分散性が高く、平均粒径が均一であることが好ましい。

微粒子は、プロテアーゼを表面に固定化できるものであれば、その材質は特に限定されず、金属および樹脂等が適宜に用いられる。また、金属表面を樹脂で被覆した微粒子、樹脂表面を金属で被覆した微粒子等を用いることもできる。

微粒子は、水性媒体に分散または懸濁することができ、分散液または懸濁液から磁気分離または磁性沈殿分離により容易に回収することができる磁気ナノ粒子が好ましい。凝集が起こりにくい観点からは、その表面が有機ポリマーで被覆されていることが好ましい。有機ポリマーで被覆された磁性ナノビーズの具体例としては、ＦＧビーズ、ＳＧビーズ、Ａｄｅｍｂｅａｄｓ、ｎａｎｏｍａｇ等が挙げられる。市販品としては、例えば多摩川精機株式会社製のＦＧ ｂｅａｄｓ（フェライト粒子をポリグリシジルメタクリレート（ポリＧＭＡ）で被覆した粒径約２００ｎｍのポリマー磁性ナノ粒子）が好適に用いられる。

微粒子は、非特異的なタンパク質の吸着抑制と、プロテアーゼの選択的な固定化のために、プロテアーゼと結合可能なスペーサで修飾されていることが好ましい。スペーサを介してプロテアーゼを固定化することにより、微粒子表面からのプロテアーゼの脱離が抑制され、プロテアーゼによる消化の位置選択性が高められる。スペーサの分子サイズを調整することにより、抗体の所望の位置にプロテアーゼを選択的にアクセスさせ、位置選択性を高めることもできる。

スペーサは、プロテアーゼと結合可能であり、かつプロテアーゼを失活させないものが好ましい。プロテアーゼのアクセス範囲を制御する観点から、スペーサは分子径が小さいものが好ましい。スペーサの分子径は、５ｎｍ以下が好ましく、３ｎｍ以下がより好ましく、２ｎｍ以下がさらに好ましい。スペーサの分子量は２０００以下が好ましく、１５００以下がより好ましく、１０００以下がさらに好ましい。

スペーサは、非タンパク質が好ましく、末端にアミノ基、カルボキシル基、エステル基、エポキシ基、トシル基、ヒドロキシル基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミド基、アジド基、ビオチン、アビジン、キレート等の官能基を有する分子が好ましい。例えばトリプシンの固定には、活性化されたエステル基を有するスペーサを用いることが好ましい。スペーサのうち、上記官能基以外のスペーサアーム部分は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリ（エチレンオキシド）、ポリエチレンテレフタラートおよびこれらの誘導体等の親水性分子が用いられる。

スペーサで表面修飾された微粒子としては、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基（活性エステル基）を有するスペーサで修飾された微粒子が挙げられ、商品名「ＦＧ ｂｅａｄｓ ＮＨＳ」（多摩川精機株式会社製）として市販されている。

プロテアーゼを微粒子の表面に固定させる方法は特に限定されず、プロテアーゼと微粒子（あるいは微粒子表面を修飾するスペーサ）の特性等に応じて適宜の方法を採用できる。例えばスペーサ修飾された微粒子の懸濁液とプロテアーゼを含む溶液とを混合することにより、プロテアーゼが表面に固定された微粒子を得ることができる。プロテアーゼとしてトリプシンが固定された微粒子の市販品として、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ用前処理キット「ｎＳＭＯＬ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＢＡ Ｋｉｔ」（島津製作所製）に含まれる「ＦＧ ｂｅａｄｓ Ｔｒｙｐｓｉｎ ＤＡＲＴ（登録商標）」も好適に用いることができる。

抗体が固定された担体と、プロテアーゼが固定された微粒子とを近接または接触させることにより、抗体の可変領域が選択的にプロテアーゼにより消化される。

プロテアーゼによる消化は、例えばプロテアーゼの至適ｐＨ近傍に調整された緩衝溶液中で実施することができる。プロテアーゼによる消化は、好ましくはｐＨ７以上９以下の範囲、より好ましくはｐＨ約８．０で実施される。プロテアーゼによる消化は、約３７℃の環境下で行ってもよいが、飽和蒸気圧下、約５０℃で行うことが好ましい。反応時間は、例えば３０分間以上２０時間以下であってよく、例えば１時間以上または３時間以上であってよく、５時間以下または８時間以下であってもよい。反応液の蒸発を防ぐために、反応を飽和蒸気圧下で行うことが好ましい。

プロテアーゼで消化するステップは、反応液を撹拌して担体と微粒子との接触を促進してもよい。反応液の撹拌は反応時間全体に亘って行ってもよく、反応時間の一部のみ、例えば反応初期のみに撹拌してもよい。

プロテアーゼによる消化によって生じたペプチド断片は、反応液中に放出される。ペプチド断片を質量分析に供するためには、担体および微粒子を除去することが必要である。これは、プロテアーゼによる消化後の反応液を濾過、遠心分離、磁気分離、透析等の操作を行うことで達成できる。

担体および微粒子とペプチド断片との分離は、例えばポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製のろ過膜（Ｌｏｗ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ＰＶＤＦ、孔径０．２μｍ、ミリポア社製）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製のろ過膜（Ｌｏｗ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ＰＴＦＥ、孔径０．２μｍ、ミリポア社製）等を用いてろ過することにより簡便に行うことができる。さらに遠心を行うことにより、迅速かつ簡便なろ過が可能である。

抗体をプロテアーゼで消化する上述の工程は、本発明者等のグループが先に開発したナノ表面および分子配向制限的タンパク分解方法（ｎａｎｏ－ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ：ｎＳＭＯＬ法）（登録商標）を適用でき、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ用前処理キット「ｎＳＭＯＬ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＢＡ Ｋｉｔ」（島津製作所製）を好適に用いることができる。ｎＳＭＯＬ法の詳細は、例えば国際公開第２０１５／０３３４７９号およびＩｗａｍｏｔｏ Ｎ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ．２０１４ Ｆｅｂ ７；１３９（３）：５７６－８０，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ３ａｎ０２１０４ａに記載されている。ｎＳＭＯＬ法の改良技術等は、例えば国際公開第２０１６／１４３２２３号、国際公開第２０１６／１４３２２４号、国際公開第２０１６／１４３２２６号、国際公開第２０１６／１４３２２７号、国際公開第２０１９／１３０５４９号、国際公開第２０１９／１５５５７６号、Ｉｗａｍｏｔｏ Ｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，ｄｏｉ：１０．４１５５／ｂｉｏ－２０１６－００１８、およびＩｗａｍｏｔｏ Ｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＆Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２０１６，ｄｏｉ：１０．１２４８／ｂｐｂ．ｂ１６－００２３０等に開示されている。これらの文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れるものとする。

ｎＳＭＯＬ法のプロトコールの例は以下のようなものである。
＜ステップ（ａ）＞
１．抗体が含まれる生物学的サンプル５－１０μＬを約１０－２０倍量のＰＢＳ＋０．１％ ｎ－オクチルチオグリコシド（ＯＴＧ）に希釈する。
２．希釈した生物学的サンプルに対して、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ （ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＣ－６５０Ｆ，５０％ ｓｌｕｒｒｙ）を２５μＬ加えて、混合液を得る。
３．得られた混合液を５分程度穏やかにボルテックスで攪拌する。
４．ウルトラフリーｌｏｗ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｕｒａｐｏｒｅ ＰＦＤＦ（０．２２μｍ）に、上記混合液の全量を回収する。
５．上清を遠心除去する（１００００ｇ，１分間）。
６．ＰＢＳ＋０．１％ ＯＴＧを３００μＬ加え、上清を遠心除去する（１００００ｇ，１分間）。
７．ステップ６を繰り返す。
８．界面活性剤（ＯＴＧ）を除くため、ＰＢＳを３００μＬ加え、上清を遠心除去する（１００００ｇ，１分間）。
９．ステップ８を繰り返す。
１０．Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎもしくはＥｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを７５－１００μＬ加える。この溶液には１０ｆｍｏｌ／μＬのＰ１４Ｒ合成ペプチドを添加してもよい。

＜ステップ（ｂ）＞
１１．化学修飾トリプシンを固相したＦＧ ｂｅａｄｓ（０．５ｍｇ／ｍｌのＦＧｂｅａｄｓ懸濁液）を５－１０μＬ加える。
１２．飽和蒸気圧下５０℃にて、穏やかに攪拌しながら４－６時間反応を行う。
１３．反応液に１０％ギ酸を１０μＬ加えることで反応を停止する。
１４．遠心ろ過（１００００ｇ，１分間）し、溶液を回収する。
１５．上記溶液が収容されたチューブを磁気スタンドに立て、約１－２分間静置し、上記溶液から余剰樹脂を除去する。

図１にｎＳＭＯＬ法によって抗体が位置選択的に切断される様子の一例を示す。平均粒子径Ｄ_１を有する微粒子１０の表面には、プロテアーゼ１５が固定されている。プロテアーゼ１５は、スペーサ１１により微粒子に固定されている。担体２０は、平均細孔径Ｄ_２を有する多数の細孔２９を有し、抗体と特異的に結合可能なリンカー２１が固定されている。抗体２５は、リンカー２１を介して細孔内に固定されている。細孔２９付近の点線は、プロテアーゼ１５がアクセスできる領域の境界を表している。細孔内の表面に結合している抗体のＦｃドメインへのプロテアーゼのアクセスが制限されることにより、細孔との結合部位から離れた開口部付近に位置するＦａｂドメインへのプロテアーゼのアクセス確率が相対的に高められる。これにより、抗体のＦａｂドメインを位置選択的にプロテアーゼにより切断して、ペプチド断片を得ることができる。

＜ペプチド断片を質量分析するステップ＞
上記ステップで得られたペプチド断片を質量分析に供する。参照抗体のペプチド断片と標的抗体のペプチド断片とは、同一試料中に含まれていてもよいし、異なる試料中に含まれていてもよい。複数の標的抗体から得られたペプチド断片は、同一試料中に含まれていてもよいし、異なる試料中に含まれていてもよい。

ペプチド断片の分離をより確実に行い、分析精度を高める目的で、質量分析に供する前の試料を、液体クロマトグラフ（ＬＣ）により、分離および濃縮することが好ましい。ＬＣにより試料の分離を行う場合、ＬＣからの溶出液を直接イオン化して質量分析に供してもよい。ＬＣとタンデム質量分析を組み合わせたＬＣ／ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳｎにより分析を行うこともできる。ＬＣからの溶出液を一度分取してから、質量分析に供してもよい。ＬＣのカラムは特に限定されず、ペプチドの分析に一般的に用いられるＣ３０、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ４等の疎水カラム、親水性アフィニティークロマトグラフィー用の担体等を適宜に選択して用いることができる。必要に応じて、脱塩、可溶化、抽出、濃縮、乾燥等の処理を行った後、試料を質量分析に用いてもよい。

質量分析におけるイオン化法は特に限定されず、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電界脱離（ＦＤ）法、高速原子衝突（ＦＡＢ）法、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法等を採用し得る。イオン化された試料の分析方法も特に限定されず、磁場偏向型、四重極（Ｑ）型、イオントラップ（ＩＴ）型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ－ＩＣＲ）型等を、イオン化法に応じて適宜に決定できる。三連四重極型質量分析装置等を用いて、ＭＳ／ＭＳ分析、ＭＳ３以上の多段階質量分析または多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ＭＲＭ）を行うこともできる。

本実施形態の方法において特に適した装置は、特に限定するものではないが、例えばＬＣＭＳ－８０３０、ＬＣＭＳ－８０４０、ＬＣＭＳ－８０５０、ＬＣＭＳ－８０６０、ＬＣＭＳ－９０３０、ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ（いずれも島津製作所製）を挙げることができる。

質量分析により、標的抗体に特異的なＦａｂ領域、例えば重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むペプチド断片を検出することで、標的抗体の同定が可能である。標的抗体を同定するために、既存のデータベースを用いることができる。ｎＳＭＯＬ法によれば、抗体が位置特異的にプロテアーゼで消化されたペプチド断片が用いられるため、データベース検索によるヒット率及びデータの確度が高められる。Ｆａｂ領域由来の複数のペプチド断片のうち、特に抗体の同定に好適なペプチド断片を分析対象として選択することができる。このように選択されるペプチド断片は「シグネチャーペプチド」と呼ばれる。

ＣＤＲの配列を含む特定のペプチド断片の検出結果に基づいて抗体の同定を行う場合、検出対象のペプチド断片は、アミノ酸残基数が５以上３０以下程度が好ましく、７以上２５以下程度がより好ましい。アミノ酸残基数が過度に小さいと、夾雑物又は同一タンパク質の別の部位に由来するペプチド断片との区別がつき難く、誤検出等の原因となり得る。また、アミノ酸残基数が過度に大きいと、イオン化が困難となる等の理由により、検出が困難となったり、定量性が低下する場合がある。

＜標的抗体を定量するステップ＞
質量分析によって得られた参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比に基づいて、標的抗体を定量する。本実施形態において、「検出強度」とは、質量分析に供して得られたマススペクトルにおける、対象のペプチド断片に由来するピーク面積またはピーク強度を意味する。すなわち、「参照抗体の検出強度」とは、質量分析に供して得られたマススペクトルにおける、参照抗体のペプチド断片に由来するピーク面積またはピーク強度を意味する。「標的抗体の検出強度」とは、質量分析に供して得られたマススペクトルにおける、標的抗体のペプチド断片に由来するピーク面積またはピーク強度を意味する。参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比、および参照抗体の検出量と標的抗体の検出量との比に基づいて、標的抗体を定量できる。参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比に基づいて、標的抗体の検出量または参照抗体の検出量を補正することができる。参照抗体の検出量と標的抗体の検出量とは、上記の参照抗体および標的抗体のペプチド断片の質量分析で得られたマススペクトルのピーク面積またはピーク強度に基づいて算出される。

例えば参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比に基づいて参照抗体の検出量を標的抗体における標準量に変換し、それと標的抗体の実際の検出量とを比較して、標的抗体を定量できる。例えば参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比に基づいて標的抗体の検出量を参照抗体における検出量に変換し、それと参照抗体の実際の検出量（標準量）とを比較して、標的抗体を定量できる。参照抗体は１点の濃度において質量分析されてもよく、複数の濃度点で質量分析されてもよい。複数の濃度で参照抗体を質量分析したとき、質量分析の結果に基づいて参照抗体の検量線が作成され得る。例えば参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比に基づいて、参照抗体の検量線を標的抗体の検量線に変換し、標的抗体を定量してもよい。

参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比は、所定の濃度を有する参照抗体および所定の濃度を有する標的抗体を質量分析することによって決定することができる。例えば等量の参照抗体と標的抗体とを同条件でプロテアーゼにより消化し、質量分析に供して得られたマススペクトルのピーク面積またはピーク強度の比を、参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度の比とすることができる。参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比は、独立した分析を５回行い、得られた比率の中央値または平均値であってよい。通常、参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比は、その濃度によらず一定である。参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比は、予め決定しておくことができる。予め決定しておくことにより、標的抗体の定量を簡便に行うことができる。参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比は、標的抗体を定量するための定数として、普遍的に使用することができる。

すなわち、本実施形態の一側面において、上記抗体を分析する方法は、
所定の濃度を有する前記生体タンパク質および所定の濃度を有する前記標的抗体を質量分析することと、
前記質量分析の結果に基づいて、前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体と検出強度との比を予め決定することをさらに含むことが好ましい。

本実施形態の他の側面において、上記抗体を分析する方法は、
所定の濃度を有する前記参照抗体および所定の濃度を有する前記標的抗体を質量分析することと、
前記参照抗体の検出強度と前記標的抗体と検出強度との比を予め決定することをさらに含むことが好ましい。

所定の濃度を有する参照抗体および所定の濃度を有する標的抗体の質量分析は、特に限定されず、上記の参照抗体および標的抗体を質量分析するステップに記載の方法によって行うことができる。所定の濃度を有する参照抗体および所定の濃度を有する標的抗体の質量分析は、上記の参照抗体および標的抗体を質量分析するステップと同時に行ってもよいし、上記の参照抗体および標的抗体を質量分析するステップよりも前に行っていてもよい。参照抗体および標的抗体を質量分析するステップは、所定の濃度を有する参照抗体および所定の濃度を有する標的抗体の質量分析と同じ条件で行うことが好ましい。

［キット］
本実施形態に係るキットは、
上記生体タンパク質と、
上記プロテアーゼが表面に固定された微粒子と、
上記細孔が設けられた担体とを含む。

上記キットは、上述の抗体を分析する方法に用いられるキットである。
本実施形態に係るキットは、
参照抗体と、
プロテアーゼが表面に固定された微粒子と、
細孔が設けられた担体とを含む。

キットは、上述の抗体を分析する方法に用いられるキットであってもよい。
生体タンパク質、参照抗体、微粒子および担体は、上述の方法に記載されたものであってよい。キットは、上述の方法において使用され得るマイクロプレートおよびチューブ等の反応容器、フィルター内蔵プレート、緩衝液、洗浄液、プロテアーゼ反応液、酸性還元剤、ろ過膜、チップ、分析カラムをさらに含んでもよい。キットは、キットの使用方法および／または抗体の検出のための質量分析条件を記載した説明書を含んでよい。キットは、生体タンパク質の検出強度と標的抗体の検出強度との比が示された対応表、又は参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比が示された対応表を含んでもよい。

本実施形態に係るキットの使用により、抗体の検出のためのペプチド断片調整の操作をより簡便に行うことができ、装置による自動化もなし得る。本実施形態に係るキットの使用により、質量分析および標的抗体の定量も簡便に行い得る。

［プログラム］
本実施形態に係るプログラムは、
上記抗体を分析する方法に用いるプログラムであって、
上記プログラムは、
質量分析装置から出力されるマススペクトルを受付け、
上記生体タンパク質の検出強度と上記標的抗体の検出強度との比を記憶部から読出し、
上記マススペクトルから算出される上記生体タンパク質の検出量を補正し、
上記標的抗体の量を算出する処理を処理装置に実行させる、プログラムであってよい。

本実施形態に係るプログラムは、
質量分析装置から出力されるマススペクトルを受付け、
参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比を記憶部から読出し、
前記マススペクトルから算出される前記参照抗体の検出量を補正し、
前記標的抗体の量を算出する処理を処理装置に実行させる。

本実施形態に係るプログラムは、上記の抗体を分析する方法において、標的抗体を定量するステップを実現させるプログラムであってよい。

プログラムの一例は、質量分析装置から出力されたマススペクトルから参照抗体および標的抗体を同定し、それぞれの検出量を算出する。参照抗体の種類およびその濃度は、ユーザーから受付け得る。受付けた参照抗体に応じて、参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比を記憶部から読出す。参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比は、上述のように所定の濃度を有する参照抗体および所定の濃度を有する標的抗体を質量分析することによって決定された値であってよい。この値は、予め記憶部に記憶させておくことが好ましい。参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比に基づいて、マススペクトルから算出された参照抗体の検出量を定数倍し、標的抗体における標準量に変換できる。この値をマススペクトルから得られた標的抗体の検出量と比較し、標的抗体の濃度を決定できる。

プログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されていてよい。本実施形態に係るプログラムが記録された記録媒体と下記の質量分析を実行させるためのデータが記録された記録媒体とは、同一であってもよいし異なっていてもよい。記録媒体に記録されたプログラムは、コンピュータシステムに読み込ませ、実行させてもよい。本明細書において「コンピュータシステム」は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）および周辺機器のハードウェアを含む。「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」は、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、光ディスク、メモリカード等の可搬型記録媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置を含む。「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」は、インターネット等のネットワークおよび電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間の間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバーやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持するものを含んでもよい。プログラムは、コンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせにより処理を実行するものであってもよい。

［質量分析を実行させるためのデータが記録された記録媒体］
本実施形態は、本実施形態に係る方法に使用するための、質量分析を実行させるためのデータが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体も提供し得る。データは、特に限定されるものではないが、各抗体に特有のアミノ酸配列を有するペプチド断片の１以上についての、親イオン、フラグメントイオン、予想保持時間、および三連四重極のそれぞれ（第１四重極、第２四重極、第３四重極）における電圧のデータを含んでよい。データは、特定の抗体に係る情報を含むものであってよい
上記の予想保持時間、電圧データ等は、使用する機器および測定条件等によって変動する数値であり、機器に合わせて提供することが好ましい。条件によって変動する数値については、当業者には理解されるようにその変動幅も併せて提供することが好ましい。

［メソッドパッケージ］
本実施形態はまた、上記のプログラムおよび／またはデータが記録された記録媒体を含む、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）による標的抗体の検出および定量のためのメソッドパッケージを提供し得る。

本明細書において、「メソッドパッケージ」とは、特定の測定対象に対する液体クロマトグラフ質量分析の分析条件および／または標的抗体を定量するためのプログラムを読取り可能な形態で含み、単独で流通可能なものをいう。メソッドパッケージに含まれるデータをＬＣ－ＭＳにインポートすることで、詳細な検討の末に得られた最適測定条件で分析することが可能となる。メソッドパッケージに含まれるプログラムを実行させることで、標的抗体の定量が可能となる。メソッドパッケージには、上記記録媒体の使用説明書を含めることもできる。

質量分析による測定は、非常に高精度な分析ができる一方、目的のイオンによって分析条件が全く異なってくるため、適正な分析条件の設定が非常に重要でありながら、非常に困難であり、条件設定のために膨大な時間を要する。こうした条件を予め準備しておくことで、実際に質量分析を行うユーザーの利便性を向上させることができる。

メソッドパッケージは、複数の質量分析装置で共通のデータを記載するものであってもよく、特定の質量分析装置による分析に適した種々のデータを記載するものであってもよい。

記録媒体またはメソッドパッケージは、上記の本実施形態のキットと併せて、またはキットと別個に提供することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜実験１＞
ｎＳＭＯＬ法によりプロテアーゼで消化した複数の抗体を質量分析により同時に同定できるかどうかを検証した。血清から分画した抗体をｎＳＭＯＬ法により消化した。得られたペプチド断片を質量分析にかけて配列を同定した。血清はヒトの標準品試薬（被検体１０人の混合サンプル、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、製品名「Ｐｏｏｌｅｄ Ｈｕｍａｎ ＡＢ Ｓｅｒｕｍ Ｐｌａｓｍａ Ｄｅｒｉｖｅｄ」）を使用した。質量分析装置はＬＣＭＳ－９０３０（島津製作所製）を用い、取得したＭＳスペクトルは、ｍｚＭＬファイルフォーマットに出力後、Ｐｅａｋｓ Ｓｔｕｄｉｏ ｖｅｒｓｉｏｎ１０．５を用いて解析した。個別のヒト由来の抗体配列情報（抗体のアミノ酸配列情報）は存在しないので、公共データベース（ＩＭＧＴデータベース）に対してスペクトルマッチおよび検索を実施した。

ｎＳＭＯＬ法による抗体の消化は、「ｎＳＭＯＬ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＢＡ Ｋｉｔ」（島津製作所製）を使用して次のように行った。
（１）血清１０μＬを約１０倍量のＰＢＳ＋０．１％ ＯＴＧに希釈した。
（２）希釈した血清に対して、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ（細孔内にＰｒｏｔｅｉｎ Ａが固定化されている担体、細孔径１００ｎｍ）を２５μＬ加えて、混合液を得た。
（３）得られた混合液を５分間穏やかにボルテックスで攪拌した。
（４）ウルトラフリーｌｏｗ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｕｒａｐｏｒｅ ＰＶＤＦ（０．２２μｍ）（遠心分離式の限外濾過フィルター）に、上記混合液の全量を回収した。
（５）上清を遠心除去した（１００００ｇ，１分間）。
（６）ＰＢＳ＋０．１％ ＯＴＧを３００μＬ加え、上清を遠心除去した（１００００ｇ，１分間）。
（７）ステップ（６）を繰り返した。
（８）界面活性剤（ＯＴＧ）を除くため、ＰＢＳを３００μＬ加え、上清を遠心除去した（１００００ｇ、１分間）。
（９）ステップ（８）を繰り返した。
（１０）Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ加えた。
（１１）化学修飾トリプシンを固相したＦＧ ｂｅａｄｓ ＤＡＲＴ（直径２００ｎｍ）（プロテアーゼが表面に固定された微粒子）を５μＬ加えた。
（１２）飽和蒸気圧下５０℃にて、穏やかに攪拌しながら５時間反応を行った。
（１３）反応液に１０％ギ酸を１０μＬ加えることで反応を停止した。
（１４）遠心ろ過（１００００ｇ，１分間）し、溶液を回収した。
（１５）上記溶液が収容されたチューブを磁気スタンドに立て、約１分静置し、上記溶液から余剰磁気ビーズを除去した。
（１６）上記溶液をＬＣＭＳ分析に供した。

比較例として、ペプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品名「Ｐｅｐｓｉｎ」）またはＩｄｅＳ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品名「ＩｄｅＳ Ｐｒｏｔｅａｓｅ」）により抗体を消化したペプチド断片を質量分析に供した。結果を表１に示す。

ｎＳＭＯＬ法によって、複数の抗体の同定を同時に行うことができることが確認された。ｎＳＭＯＬ法によれば、ペプシン法およびＩｄｅＳ ｐｒｏｓｅａｓｅ法と比較して、より少ない血清量から、より多くの配列を同定することができた。

＜実験２＞
ｎＳＭＯＬ法によって消化した複数の抗体を質量分析により同時に同定できるかどうかを、配列が既知のモノクローナル抗体を用いてさらに検証した。トラスツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ニボルマブ、ブレンツキシマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、モガムリズマブ、ラムシルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、インフリキシマブ、トシリズマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、メポリズマブ、ウステキヌマブおよびエクリズマブを含む２０種のモノクローナル抗体をヒト血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、製品名「Ｐｏｏｌｅｄ Ｈｕｍａｎ ＡＢ Ｓｅｒｕｍ Ｐｌａｓｍａ Ｄｅｒｉｖｅｄ」）に混合した。このサンプルを実験１と同じｎＳＭＯＬ法により消化し、得られたペプチド断片を質量分析に供した。質量分析装置はＬＣＭＳ－９０３０（島津製作所製）を用いた。取得したＭＳスペクトルは、ｍｚＭＬファイルフォーマットに出力後、Ｐｅａｋｓ Ｓｔｕｄｉｏ ｖｅｒｓｉｏｎ１０．５を用い、ｉｎ－ｈｏｕｓｅモノクローナル抗体ＦＡＳＴＡデータベースに対してスペクトルマッチおよび検索を実施した。この結果、用いたすべての抗体でシグネチャーペプチドおよびＣＤＲ３配列が同定できた。ｎＳＭＯＬ法を利用した質量分析が、普遍的に抗体の定量に応用できることが示唆された。各抗体のシグネチャーペプチド配列およびＣＤＲ３配列（配列番号１～４３）は図２に示される。

＜実験３＞
抗体を個別に分析したときの定量値と複数の抗体を同時に分析したときの定量値との誤差を検証した。１つの抗体を添加した単一試料を定量した値と複数の抗体が添加された混合試料を定量した値とを比較した。単一試料は、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ、アテゾリズマブ、ベバシズマブ、ペムブロリズマブ、トラスツズマブ、エクリズマブ、メポリズマブ、トシリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ラムシルマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、アバタセプト、アフリベルセプトおよびエタネルセプトの２１種のモノクローナル抗体又はＦｃ融合タンパク質のうちの１種をヒト血清中に混合した試料であり、混合試料はこれらの抗体及びＦｃ融合タンパク質を全て含む試料であった。各抗体及びＦｃ融合タンパク質の混合量は５０μｇ／ｍＬであった。各抗体のシグネチャーペプチド配列は、図２および図３に示される。なお、以降の記載において、モノクローナル抗体及びＦｃ融合タンパク質をまとめて「抗体」と呼ぶ場合がある。

この試料を以下に示す改良されたｎＳＭＯＬ法（図４）によって消化した。実験２との変更点として、改良ｎＳＭＯＬ法では、多くのサンプルを処理するためにマイクロプレート上で反応を行った。遠心操作を簡略するために、フィルター内蔵マイクロプレートを使用した。プロテアーゼ抵抗性を示す抗体を分析するために、強酸還元条件で抗体を前処理した。強酸還元処理を行わない抗体と行った抗体を合わせて分析することで、プロテアーゼ処理効率を向上させた。

具体的な操作は次のとおりである。
（１）１０μＬの試料を９０μＬのＰＢＳ＋０．１％ ＯＴＧで希釈した。
（２）希釈した試料を低吸着マイクロプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製、製品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄ Ｐｌａｔｅ」）に移し、ＩｇＧ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎ（細孔内にＰｒｏｔｅｉｎ Ａが固定化されている担体、細孔径１００ｎｍ）を２５μＬ更に加えた。
（３）ＩｇＧ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎを等量に分けた。一方はそのままＰＢＳ＋０．１％ ＯＴＧで洗浄し、他方は酸性還元処理（２５０ｍＭ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）後、洗浄した。洗浄はフィルター内蔵マイクロプレート（Ｗｈａｔｍａｎ社製、「ＵＮＩＦＩＬＴＥＲ ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ」、孔径２０μｍ）上で実施し、吸引マニフォールドで廃液処理を行った。
（４）フィルター内蔵マイクロプレート上のＩｇＧ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｉｎをＥｎｈａｎｃｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎで懸濁後、低吸着マイクロプレートの同一ウェルにいれ、２つの条件のｒｅｓｉｎを混合した。
（５）１０μＬのＦＧ ｂｅａｄｓ Ｔｒｙｐｓｉｎ ＤＡＲＴ（直径２００ｎｍ）（プロテアーゼが表面に固定された微粒子）を加えた。
（６）飽和蒸気圧下５０℃にて、穏やかに攪拌しながら５時間反応を行った。
（７）反応後、１０％ギ酸を１０μＬ加えて反応を停止し、フィルター内蔵マイクロプレート（日本ポール株式会社製、「ＡｃｒｏＰｒｅｐ ａｄｖａｎｃｅ ９６－ｗｅｌｌ Ｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｔｅ」、孔径２００ｎｍ）上に回収した。
（８）遠心（１５００ｇ，１０分間）し、ペプチド断片を含む溶液を回収した。

ＬＣＭＳは、次の条件で行った。
［ＬＣ］ ＮｅｘｅｒａＸ２ システム（島津製作所製）
カラム ：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＧＩＳＳ Ｃ１８（５０ｍｍ×２．１ｍｍ）
カラム温度 ：５０℃
溶媒 Ａ ：０．１％ギ酸／水
溶媒 Ｂ ：０．１％ギ酸／アセトニトリル
勾配 ：１％Ｂ（１分）／１－５０％Ｂ（５分）／９５％Ｂ（１．５分）／１％Ｂ（１０．５分）
流速 ：０．４ｍＬ／分
注入量 ：１０μＬ
［ＭＳ］ ＬＣＭＳ－９０３０（島津製作所製）
イオン化 ：ＥＳＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＤＬ温度 ：２５０℃
ヒートブロック温度 ：４００℃
インターフェイス温度：３００℃
ネブライザーガス ：３Ｌ／分
ドライイングガス ：１０Ｌ／分
ヒーティングガス ：１０Ｌ／分
質量分析装置および解析方法は、実験２と同じである。

まず、単一試料（Ｎ＝３）および混合試料（Ｎ＝３）について、検量線の再現性および正確性が十分に高いことを確認した。単一試料と混合試料との比較は、絶対数であるイオンカウント数について、および内部標準を用いて補正した値について行った。単一試料を質量分析したときのイオンカウント数（ｃｐｓ）と、混合試料を質量分析したときの各抗体のｃｐｓとを比較した結果を図５に示す。内部標準を用いて単一試料の検出量を補正した値と、内部標準を用いて混合試料中の各抗体の検出量を補正した値とを比較した結果を図６に示す。内部標準は、Ｐ１４Ｒ合成ペプチド（ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＲ：配列番号４７）を用いた。図５および図６は、単一試料の値を１００としたときの混合試料中の各抗体の相対値である。抗体を個別に分析したときと複数の抗体を同時に分析したときとの定量正確性は６．７％（０．６２％～１５．９％、中央値６．５％）であった。アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）のバリデーションガイダンス基準による誤差範囲は±１５％以内である。複数の抗体を同時に質量分析に供して得られた定量値は、高い正確性を有していることが確かめられた。例えば生体から取得された臨床サンプルであっても、質量分析によって複数の抗体を同時に定量可能であることが示された。

＜実験４＞
１つの抗体の検出強度と他の抗体の検出強度との比を求めた。実験３に記載の２１種のモノクローナル抗体及びＦｃ融合タンパク質の全てが血清に添加された混合試料を用いて、トラスツズマブのｃｐｓに対する、他の抗体のｃｐｓ比を算出した。１つの抗体の検出強度と他の抗体の検出強度との比は、トラスツズマブ以外の抗体を基準としても算出できる。抗体のプロテアーゼによる消化方法および質量分析条件は、実験３と同じである。混合試料は４濃度点で、各濃度について５回の独立した分析を行った（Ｎ＝５）。この条件は、ＦＤＡの基準を満たす。

トラスツズマブのｃｐｓに対する他の抗体のｃｐｓ比（すなわち、参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比）は、抗体の濃度に関わらず一定であることが示された（図７～図９）。この比（定数）を利用すれば、トラスツズマブによって作成された検量線を用いて、トラスツズマブ以外の抗体を定量することが可能である。１つの抗体に対する他の抗体のｃｐｓ比は、複数回の実験の平均値または中央値であってよい。

＜実験５＞
臨床検体に含まれる抗体（標的抗体）を、トラスツズマブ（参照抗体）を用いて作成した検量線に基づいて定量した。臨床検体は、イピリムマブを投与されたヒトの血清（Ｎ＝７１）およびペムブロリズマブを投与されたヒトの血清（Ｎ＝９５）である。定量は、実験３に記載の方法と同じ方法で行った。トラスツズマブの検量線は、希釈系列法（ヒト血清にトラスツズマブを１０００μｇ／ｍＬとなるように添加し、これを二倍希釈系列により検量線サンプルとした）によって作成した。トラスツズマブの検量線を実験４で算出したトラスツズマブの検出強度とイピリムマブの検出強度との比に基づいて補正した。補正された検量線に基づいて、イピリムマブの濃度を決定した。同じ方法で、トラスツズマブを用いて作成した検量線をトラスツズマブの検出強度とペムブロリズマブの検出強度との比に基づいて補正し、ペムブロリズマブの濃度を決定した。

定量値の再現性を確認するために、イピリムマブを用いて作成した検量線に基づいて、同じ臨床検体中のイピリムマブを定量した。イピリムマブの検量線は、希釈系列法（ヒト血清にイピリムマブを１０００μｇ／ｍＬとなるように添加し、これを二倍希釈系列により検量線サンプルとした）によって作成した。同じ方法で、ペムブロリズマブを用いて作成した検量線に基づいて、臨床検体中のペムブロリズマブを定量した。

トラスツズマブの検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度と、イピリムマブの検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度とを比較した。２つの方法で得られた数値をピアソンの積率相関分析すると、Ｒ^２＝０．８１であり、両者は高い再現性を有することが示された（図１０）。同様に、トラスツズマブの検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度と、ペムブロリズマブの検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度とを比較した。２つの方法で得られた数値をピアソンの積率相関分析すると、Ｒ^２＝０．８６であり、両者は高い再現性を有することが示された（図１１）。参照抗体の検出強度と標的抗体の検出強度との比を利用して、臨床検体に含まれる複数の標的抗体の濃度を、１つの参照抗体を基準にして求めることができることがわかった。

＜実験６＞
実験５の結果を踏まえて、トラスツズマブ以外の抗体、及びＦｃ融合タンパク質が、参照タンパク質（すなわち、生体タンパク質）として使用できるか検証した。すなわち、臨床検体に含まれる抗体（標的抗体）を、以下に示す参照タンパク質のいずれか一つを用いて作成した検量線に基づいて定量した。臨床検体は、イピリムマブを投与されたヒトの血清（Ｎ＝７１）およびペムブロリズマブを投与されたヒトの血清（Ｎ＝７４）である。定量は、実験３に記載の方法と同じ方法で行った。参照タンパク質の検量線は、希釈系列法（採取されたヒト血清に参照タンパク質を１０００μｇ／ｍＬとなるように添加し、これを二倍希釈系列により検量線サンプルとした。）によって作成した。当該参照タンパク質の検量線を、実験４と同様の方法で算出した当該参照タンパク質の検出強度とイピリムマブの検出強度との比に基づいて補正した。補正された検量線に基づいて、イピリムマブの濃度を決定した。同じ方法で、参照タンパク質を用いて作成した検量線を、参照タンパク質の検出強度とペムブロリズマブの検出強度との比に基づいて補正し、ペムブロリズマブの濃度を決定した。

（用いられた参照タンパク質）
トラスツズマブ（Ｔｒａ）、ブレンツキシマブ ベドチン（Ｂｒｅ）、セツキシマブ（Ｃｅｔ）、リツキシマブ（Ｒｉｔ）、インフリキシマブ（Ｉｆｘ）、アテゾリズマブ（Ａｔｚ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍ）、エクリズマブ（Ｅｃｕ）、メポリズマブ（Ｍｅｐ）、トシリズマブ（Ｔｏｃ）、アベルマブ（Ａｖｅ）、デュルバルマブ（Ｄｙｒ）、イピリムマブ（Ｉｐｉ）、ニボルマブ（Ｎｉｖ）、ラムシルマブ（Ｒａｍ）、アダリムマブ（Ａｄａ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌ）、アバタセプト（Ａｂｔ）及びエタネルセプト（Ｅｔｎ）。

また、定量値の再現性を確認するために、イピリムマブを用いて作成した検量線に基づいて、同じ臨床検体中のイピリムマブを定量した。イピリムマブの検量線は、希釈系列法（ヒト血清にイピリムマブを１０００μｇ／ｍＬとなるように添加し、これを二倍希釈系列により検量線サンプルとした）によって作成した。同じ方法で、ペムブロリズマブを用いて作成した検量線に基づいて、臨床検体中のペムブロリズマブを定量した。

参照タンパク質の検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度と、イピリムマブの検量線に基づいて定量されたイピリムマブの濃度とを比較した（図１２、１４Ａ、１４Ｂ）。２つの方法で得られた数値をピアソンの積率相関分析すると、いずれの参照タンパク質においてもＲ^２の値が０．９９以上であり、高い再現性を有することが示された（表２）。

同様に、参照タンパク質の検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度と、ペムブロリズマブの検量線に基づいて定量されたペムブロリズマブの濃度とを比較した（図１３、１５Ａ、１５Ｂ）。２つの方法で得られた数値をピアソンの積率相関分析すると、いずれの参照タンパク質においてもＲ^２の値が０．９９以上であり、高い再現性を有することが示された（表３）。以上の結果から、参照タンパク質の検出強度と標的抗体の検出強度との比を利用して、臨床検体に含まれる複数の標的抗体の濃度を、１つの参照タンパク質を基準にして求めることができることがわかった。

［態様］
上述した複数の例示的な実施形態および実施例は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。

（第１項）
一形態に係る抗体を分析する方法は、
生体タンパク質および標的抗体をプロテアーゼで消化することと、
消化された前記生体タンパク質および前記標的抗体のペプチド断片を質量分析することと、
前記質量分析によって得られた前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比に基づいて、前記標的抗体を定量することを含み、
前記プロテアーゼで消化することは、
担体の細孔内に前記生体タンパク質および前記標的抗体を固定することと、
前記細孔の径よりも大きい径を有し、前記プロテアーゼが表面に固定された微粒子と、前記担体と、を近接させることとを含み、
前記生体タンパク質は、前記細孔に固定可能なドメインを有する。

第１項に記載の抗体を分析する方法によれば、測定対象である抗体の検量線を作成することなく、質量分析により抗体を定量することができる。

（第２項）
第１項に記載の抗体を分析する方法において、所定の濃度を有する前記生体タンパク質および所定の濃度を有する前記標的抗体を質量分析することと、
前記質量分析の結果に基づいて、前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体と検出強度との比を予め決定することをさらに含む。

生体タンパク質（例えば、参照抗体等）の検出強度と標的抗体と検出強度との比を予め決定しておけば、標的抗体の定量を簡便に行うことができる。

（第３項）
第１項または第２項に記載の抗体を分析する方法において、生体タンパク質は、参照抗体又はＦｃ融合タンパク質を含む。

参照抗体及びＦｃ融合タンパク質は、汎用性が高く、入手が容易であるため、生体タンパク質として適している。

（第４項）
第３項に記載の抗体を分析する方法において、参照抗体は、モノクローナル抗体である。

モノクローナル抗体は、入手が容易であり、濃度およびアミノ酸配列の特定が容易であるため、参照抗体として適している。

（第５項）
第３項に記載の抗体を分析する方法において、参照抗体は、トラスツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ニボルマブ、ブレンツキシマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、モガムリズマブ、ラムシルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、インフリキシマブ、トシリズマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、メポリズマブ、ウステキヌマブ、およびエクリズマブからなる群より選択される。

上記の抗体は、汎用性が高く、入手が容易であるため、参照抗体として適している。
（第６項）
第３項に記載の抗体を分析する方法において、Ｆｃ融合タンパク質は、アバタセプト、アフリベルセプト及びエタネルセプトからなる群より選択される。

上記のＦｃ融合タンパク質は、汎用性が高く、入手が容易であるため、生体タンパク質として適している。

（第７項）
第１項～第６項のいずれかに記載の抗体を分析する方法において、標的抗体は、生体試料に含まれる抗体である。

第７項に記載の抗体を分析する方法によれば、被検体から採取した生体試料に含まれる標的抗体を定量することができる。

（第８項）
第１項～第７項のいずれかに記載の抗体を分析する方法において、標的抗体は、少なくとも２種の抗体を含む。

第８項に記載の抗体を分析する方法によれば、ひとつの生体タンパク質（例えば、参照抗体等）を基準にして、複数の標的抗体の定量が可能である。２種以上の抗体は、同時に定量できる。

（第９項）
第１項～第８項のいずれかに記載の抗体を分析する方法において、標的抗体は、生体内で産生された抗体を含む。

第９項に記載の抗体を分析する方法によれば、検量線を作成することが難しい、生体内で産生された抗体であっても定量することができる。

（第１０項）
一形態に係る抗体を分析する方法は、
生体タンパク質と、少なくとも２種の標的抗体を含む試料と、をプロテアーゼで消化することと、
消化された前記生体タンパク質および前記標的抗体のペプチド断片を質量分析することと、
前記質量分析によって得られた前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比に基づいて、前記標的抗体を定量することを含み、
前記生体タンパク質は、モノクローナル抗体である。

第１０項に記載の抗体を分析する方法によれば、測定対象である抗体を用いて検量線を作成することなく、質量分析により抗体を定量することができる。

（第１１項）
一態様に係るキットは、
第１項～第１０項のいずれかに記載の抗体を分析する方法に用いるキットであって、
前記生体タンパク質と、
前記プロテアーゼが表面に固定された微粒子と、
前記細孔が設けられた担体とを含む。

第１１項に記載のキットによれば、第１項の方法を簡便に行うことができる。
（第１２項）
一態様に係るプログラムは、
第１項～第１０項のいずれかに記載の抗体を分析する方法に用いるプログラムであって、
前記プログラムは、
質量分析装置から出力されるマススペクトルを受付け、
前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比を記憶部から読出し、
前記マススペクトルから算出される前記生体タンパク質の検出量を補正し、
前記標的抗体の量を算出する処理を処理装置に実行させる。

第１２項に記載のプログラムによれば、生体タンパク質の検出強度と標的抗体の検出強度との比に基づいて、標的抗体を定量する処理を簡便に行うことができる。

１０ 微粒子、１１ スペーサ、１５ プロテアーゼ、２０ 担体、２１ リンカー、２５ 抗体、２９ 細孔。

Claims (10)

1. 生体タンパク質および標的抗体をプロテアーゼで消化することと、
   消化された前記生体タンパク質および前記標的抗体のペプチド断片を質量分析することと、
   前記質量分析によって得られた前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比に基づいて、前記標的抗体を定量することを含み、
   前記プロテアーゼで消化することは、
   担体の細孔内に前記生体タンパク質および前記標的抗体を固定することと、
   前記細孔の径よりも大きい径を有し、前記プロテアーゼが表面に固定された微粒子と、前記担体と、を近接させることとを含み、
   前記生体タンパク質は、前記細孔に固定可能なドメインを有し、
   前記生体タンパク質は、濃度が特定されていて、
   前記標的抗体は、少なくとも２種の抗体を含む、
   抗体を分析する方法。
2. 所定の濃度を有する前記生体タンパク質および所定の濃度を有する前記標的抗体を質量分析することと、
   前記質量分析の結果に基づいて、前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比を予め決定することをさらに含み、
   前記生体タンパク質における所定の濃度は、前記標的抗体における所定の濃度と同じであるか又は異なる、請求項１に記載の抗体を分析する方法。
3. 前記生体タンパク質は、参照抗体又はＦｃ融合タンパク質を含む、請求項１又は請求項２に記載の抗体を分析する方法。
4. 前記参照抗体は、モノクローナル抗体である、請求項３に記載の抗体を分析する方法。
5. 前記参照抗体は、トラスツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ニボルマブ、ブレンツキシマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、モガムリズマブ、ラムシルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、インフリキシマブ、トシリズマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、メポリズマブ、ウステキヌマブ、およびエクリズマブからなる群より選択される、請求項３に記載の抗体を分析する方法。
6. 前記Ｆｃ融合タンパク質は、アバタセプト、アフリベルセプト及びエタネルセプトからなる群より選択される、請求項３に記載の抗体を分析する方法。
7. 前記標的抗体は、生体試料に含まれる抗体である、請求項１又は請求項２に記載の抗体を分析する方法。
8. 前記標的抗体は、生体内で産生された抗体を含む、請求項１又は請求項２に記載の抗体を分析する方法。
9. 生体タンパク質と、少なくとも２種の標的抗体と、をプロテアーゼで消化することと、
   消化された前記生体タンパク質および前記標的抗体のペプチド断片を質量分析することと、
   前記質量分析によって得られた前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比に基づいて、前記標的抗体を定量することを含み、
   前記生体タンパク質は、濃度が特定されていて、
   前記生体タンパク質は、モノクローナル抗体である、
   抗体を分析する方法。
10. 請求項１又は請求項２に記載の抗体を分析する方法に用いるプログラムであって、
    前記プログラムは、
    質量分析装置から出力されるマススペクトルを受付け、
    前記生体タンパク質の検出強度と前記標的抗体の検出強度との比を記憶部から読出し、
    前記マススペクトルから算出される前記生体タンパク質の検出量を補正し、
    前記標的抗体の量を算出する処理を処理装置に実行させる、プログラム。