JP7797409B2 - 複合体である複合糖質組成物中の多糖類を同定し定量する方法 - Google Patents

Description

本発明は、複合体である複合糖質組成物を同定し定量する分析方法に関し、特に試料中の糖タンパク質の分析に関する。本発明は、そのような分析方法における液体クロマトグラフィ－質量分析システム（「ＬＣ－ＭＳシステム」）の使用、特に複合糖質製造中のインプロセス制御、生産された複合糖質のリリース制御、貯蔵された複合糖質の安定性制御、及び複合糖質製造プロセス最適化へのＬＣ－ＭＳシステムの使用に更に関する。

糖タンパク質系薬剤における糖化を理解、測定、制御するために満足のいくプログラムを示すために、バイオ製薬会社への監督官庁の圧力が増している。しかしながら、複合体である複合糖質組成物の分析、即ちその同定及び絶対定量は難しいタスクである。そのような分析は典型的には、幾つかのアッセイを含み、ＧＭＰ条件下で１週間又はそれを超える完全分析を必要とする。

糖タンパク質系薬剤について、当技術分野の現行水準の化学アッセイは、様々な検出器が装備された高性能液体クロマトグラフィシステム（ＨＰＬＣシステム）で実行される：総多糖類（ＰＳ）及び遊離ＰＳを特定する場合、パルス電流測定検出器が使用され、これは、糖鎖を加水分解し、イオンクロマトグラフィ分離後にリリースされた単糖類を検出することによる研究所での試料準備を必要とする。そのようなＨＰＬＣシステムの製造業者であるＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより述べられているように、「炭水化物は一般的なクラオマトグラフィ及び検出方法を使用しての分析が難しい」が、それらの「電気化学的検出は炭水化物分析に最適化されている」（１）。結論的に、電流測定検出及び定量は、炭水化物定量におけるゴールドスタンダードと見なすことができる。しかしながら、この技法の主な欠点の１つ（単糖類を必要とする）により、糖タンパク質系薬剤の研究室での試料準備及びリリースアッセイは時間集約的且つ費用集約的である。

さらに、全ての糖タンパク質系薬剤は、監督省庁によって求められる純度及び特定名についての一般的なリリースアーセナル（ａｒｓｅｎａｌ）を超えて更なる分析リリーステスト（例えば薬剤物質中の遊離グリカン、グリカン修飾）を経る。これらの複数の異なるリリース基準により、糖タンパク質系薬剤のリリース時間は遅くなる。

Ｍａｚｓａｒｏｆｆらは、（２）ＬＣ－ＭＳシステム及びインソース断片化を使用した糖タンパク質の炭水化物構造の分析を記載している。この文献には、２つのピークの比率を特定することにより相対的に定量する分析方法が記載されている。著者により明確に述べられているように、「信号対雑音比の最適条件における断片イオンピークエリアが、調査されている糖タンパク質分子に存在する断片イオンの絶対比率を反映しないことがあるが、最適条件が、バイオ製剤の異なるバッチをその基準と比較するに当たり断片イオン比率の相対定量の最良尺度をもたらすことを理解することが重要である」。結論的に、この文献は、炭水化物構造のいかなる絶対定量も記載できておらず、参照材料較正曲線の使用も示唆していない。

Ｉｖａｎｃｉｃらは、（３）インタクト糖ペプチド分析の同定及び定量方法を開発するためのモデルとして、複合多糖化されたヒトのＡ１酸糖タンパク質のＬＣ－ＭＳ分析を記載している。この文献は、インソース断片化を使用して炭水化物を断片化し、糖ペプチドを同定するためのマーカーとして、断片化された炭水化物を使用する分析方法を記載している。この技法は最終的に、ＡＡＧタンパク質中のペプチドの「糖化の程度」を定量することを目的としている。これは、糖化と同定されたペプチドのピーク強度と非糖化ペプチドのピーク強度との比較を意味する。ここでも、この文献は、炭水化物構造のいかなる絶対定量も記載できておらず、参照材料較正曲線の使用も示唆していない。

Ｃａｒｅｌｌら（米国特許出願公開第２０２０／０４１４７０号明細書）は、（４）糖タンパク質の化合物として多糖類の誘導体化試薬を開示している。参照材料から生成される較正曲線と組み合わせたこの誘導体化試薬及びその同位体置換体の使用は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって選択されたイオンを断片化可能なＬＣ－ＭＳシステムにより、そのような多糖類の絶対定量を可能にする。検体の誘導体化は、定量の必要条件であるため、この文献は、糖タンパク質がその天然状態であるいかなるＬＣ－ＭＳ方法も記載することができていない。多糖類成分のそのような誘導体化では、天然状態で糖タンパク質を分析する方法と比較して、試料準備ステップを追加する必要があり、したがって、そのような方法は必然的により面倒になる。さらに、この方法は、インソース断片化から生じた特定のイオンをＣＩＤによって選択し更に断片化することができる高度なＬＣ－ＭＳシステムの使用を必要とする。そのような高度な機器はそれ自体より高価であるのみならず、対応する分析方法の検証も、そのような要件のない方法よりも時間がかかる。したがって、最小のハンドリングステップだけでよい比較的単純なＬＣ－ＭＳシステム及びプロトコルの使用は、特に薬剤リリースアッセイの状況で有利と見なされる。

Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａらは、（５）モノクローナル抗体の一部であるグリカンを定量するＭＳ法を記載している。多糖類の絶対定量は、酵素ＰＮＧａｓｅ Ｆを用いた培養により抗体から切断した後、達成される。定量の場合、同位体標識されたグリカンの混合物を内部標準として試料に添加し、分析が、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化－飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）ＭＳによって実行される。ここでも、この文献は、天然状態である糖タンパク質のいかなる分析方法も記載できていない。さらに、この方法は、ＭＳ分析前に試料内の糖タンパク質を分離するために液体クロマトグラフィを使用せず、同位体標識されたグリカン標準の報告された混合物をＬＣ－ＭＳベースの方法に適用する可能性を示唆しているにすぎない。先に論じたように、試料準備ステップ、例えば担体タンパク質からのＰＳ成分のＰＮＧａｓｅ Ｆ仲介リリースの追加により、分析方法はより面倒になり、したがって、そのようなステップを含まない方法と比較してスループットが低下する。さらに、ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化は全ての多糖類構造に適用可能であるわけではなく、したがって、従来技術による方法をＰＮＧａｓｅ Ｆの基質特異性内の糖タンパク質に制限する。

同様に、Ｊｅｏｎｇらは、（６）糖タンパク質からＰＮＧａｓｅ Ｆ仲介リリースし、その後、グリカンを多メチル化した後、グリカンを絶対定量するＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ方法を記載している。したがって、この文献も天然状態である糖タンパク質の定量方法を記載していない。記載される方法は、ＭＳ分析に先立った糖タンパク質のＬＣベースの分離も含んでいない。先に概説したように、試料準備ステップの追加は、分析方法をより面倒にし、スループットを低下させる。この特定の事例では、試料準備はＰＮＧａｓｅ Ｆ消化のみならず（それにより必然的に方法に制限が課される）、多メチル化ステップも含み、それにより試料準備が更に複雑になる。

結論として、複合糖質、特に糖タンパク質系薬剤の改良された分析方法が必要とされている。

したがって、本発明の目的は、当技術分野の現行水準のこれらの欠点の少なくとも幾つかを軽減することである。

特に、本発明の目的は、糖タンパク質系薬剤に関して試料準備を迂回し、それにより、分析スループットを上げるとともに、リリースコストを削減する分析方法を提供することである。

さらに、本発明の目的は、複数の異なるリリース基準を結合して１つのアッセイにし、それにより、糖タンパク質系薬剤のバッチリリース時間を更に短縮する分析方法を提供することである。

特に、本発明の目的は、糖タンパク質系薬剤の特定名及び絶対定量についての情報を同時に提供する分析方法を提供することである。

上記目的の１つ又は複数は、請求項１に記載の分析方法及び請求項１２に記載のＬＣ－ＭＳシステムの使用によって達成される。本発明の更なる態様は本明細書及び独立請求項において開示され、好ましい実施形態は本明細書及び従属請求項において開示される。

本発明についてより詳細に以下説明する。本明細書に提供／開示される種々の実施形態、選好、及び範囲が随意組み合わせ可能なことが理解される。さらに、特定の実施形態に応じて、選択された定義、実施形態、又は範囲が該当しないことがある。

別記される場合を除き、以下の定義が本明細書において適用されるものとする。

本明細書で使用される場合、本発明の文脈（特に特許請求の範囲の文脈）で使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び同様の用語は、別段のことが本明細書で示されるか、又は文脈により明確に矛盾する場合を除き、単数形及び複数形の両方を包含するものとして解釈されるべきである。

本明細書で使用する用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書ではそれらの開放された、非限定的意味で使用する。種々の実施形態、選好、及び範囲が随意組み合わせ可能なことが理解される。

本明細書全体を通して、以下を含め、幾つかの略称が使用される。
ＡＵＣ 曲線下面積
ＣＩＤ 衝突誘起解離、ＭＳ技法
ＥＰＡ 緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ
ＥＴＤ 電子移動解離、ＭＳ技法
ＨＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィ
ＩＣ－ＰＡＤ イオンクロマトグラフィ－パルス電流測定検出
ＩＳＦ インソース断片化
ＬＣ 液体クロマトグラフィ
ＬＰＳ リポ多糖類
ＭＳ 質量分析法
ＰＳ 多糖類
ＲＰ 逆相
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィ
ＴＩＣ 全イオン電流、ＭＳ技法

上記略称及び本明細書において述べられる更なる略称は当分野で一般的である。

「複合糖質」という用語は、当分野で既知であり、特に、１つ又は複数の多糖類に共有結合した化学物質を記述する。そのような複合糖質は、生細胞における生物学的共役反応（「バイオ共役反応」若しくは「生体共役反応」）によって取得し得、又は多糖類の化学共役（「化学」若しくは「合成」複合糖質）によって取得し得る。適した化学物質にはタンパク質／ペプチド及び脂質があり、対応する複合糖質は糖タンパク質（プロテオグリカン、ペプチドグリカン、及び糖ペプチドを含む）及び糖脂質である。

糖タンパク質という用語は、「従来の糖タンパク質」及び「と複合糖質ワクチン」を含む。従来の糖タンパク質では、例えば抗体又はエリスロポエチン糖のタンパク質部分に重きが置かれ、「活性」原理はタンパク質部分により多く存在し、グリカンは例えば、半減期又は他の性質の定義において役割を果たす。そのような従来の糖タンパク質は、製剤用途で広く使用されている。複合糖質ワクチンでは、グリカンは関連抗原であるため、免疫応答が望まれるグリカン部分に重きが置かれ、タンパク質部分は単に、所望のＴ細胞記憶免疫応答に繋がる担体として機能する。

糖タンパク質という用語は、「プロテオグリカン」、「ペプチドグリカン」、「糖ペプチド」を更に含む。「プロテオグリカン」という用語は、重度にグリコシル化されたタンパク質を指す。基本的なプロテオグリカン単位は、１本又は複数の共有結合されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を有するコアタンパク質からなる。付着点は、グリコサミノグリカンが四糖の架橋を介して接合するセリン（Ｓｅｒ）残基である。「ペプチドグリカン」という用語は、大半の細菌の血漿膜外にメッシュ様層を形成し、細胞壁を形成する糖類及びアミノ酸からなるポリマーを指す。「糖ペプチド」という用語は、タンパク質部分に最高で５０のアミノ酸を含む糖タンパク質を指す。より大きな糖タンパク質の消化（例えばトリプシン消化）、細菌発酵、又は化学合成を介して利用可能であるそのような糖ペプチド。

「糖脂質」という用語は、当分野で既知であり、特に、１つ又は複数の糖類が脂質にグリコシド（共有）結合によって連結される物質を記述する。したがって、糖脂質の特徴的な特徴は、脂質部分に結合された糖類（特に本明細書で論じるように多糖類）の存在である。

「多糖類」という用語は当分野で既知であり、特に、直鎖状又は分岐状を問わず、グリコシド結合によって一緒に結合された単糖類単位で組成される重合炭水化物を記述する。そのような多糖類は反復単位を特徴とし、各反復単位はそれぞれの単糖類組成を用いて記述される。上記反復単位は、化学修飾することもできる（例えばアミド化、硫酸化、アセチル化、リン酸化等）１つ又は複数の単糖類を含む。上記反復単位中に典型的に見られる単糖類は、３から７の炭素原子を含む環状又は直鎖状単糖類である。複合糖質ワクチンの特定の場合、複合多糖類は病原性種（例えば大腸菌）に由来し、上記反復単位は特定の病原体の遺伝的性質によって定義される。したがって、反復単位は病原体の特異的マーカー／識別子であることができる。

「多糖類成分」という用語はしたがって、複合糖質の１つ又は複数のグリカン鎖を示す。グリカンは、糖残基のモノマー又はポリマーであることができるが、典型的には少なくとも３つの糖を含み、直鎖状又は分岐状であることができる。グリカンは、天然糖残基（例えばグルコース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アラビノース、リボース、キシロース等）及び／又は修飾糖（例えば２’－フルオロリボース、２’－デオキシボース、ホスホマンノース、６’－スルホＮ－アセチルグルコサミン等）を含み得る。「グリカン」という用語は、糖残基のホモポリマー及びヘテロポリマーを含む。「グリカン」という用語は、複合糖質（例えば糖タンパク質、等ペプチド、糖脂質）のグリカン成分も包含する。この用語は、複合糖質から切断されたか、そうでなければリリースされたグリカンを含め、遊離グリカンも包含する。

「Ｏ－アセチル化多糖類」という用語は、本明細書で使用される場合、反復単位の１つ又は複数の単糖類がアセチル化によって化学修飾される多糖類を指す。上記単糖類は、存在するヒドロキシル基の１つ又は複数をアセチル化させる。複合糖質ワクチンで使用される病原体由来の反復単位の場合、特定の単糖類のＯ－アセチル化は、上記病原体の免疫応答の誘導にとって極めて重要であることができる。病原体由来の多糖類成分の例を表１に示す。

「グリカン」／「グリカン鎖」という用語は、下に定義する「多糖類」と同義である。それに対応して、本発明の文脈において、「グリカン」及び接頭辞「グリコ－」は、糖タンパク質又は糖脂質等の複合糖質の炭水化物部分も指す。

「血清型」という用語は、本明細書で使用される場合、異なる細菌血清型に由来する異なる多糖鎖を有する複合糖質を指す。幾つかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型からのグリカンの例を以下表１において識別する。

「天然状態」という用語は、当分野で既知であり、インタクトな機能状態の、複合糖質等の生体分子に関連する。本発明内で天然状態と言及するとき、天然状態は、分析される複合糖質が、試料準備中、例えばＰＮＧａｓｅ Ｆ等の酵素を用いて誘導体化若しくは他の方法で修飾されず、又は化学反応を受けないことを意味する。したがって、天然状態での複合糖質の分析は、複合糖質の誘導体化を含むか、又は試料を分析のＬＣ－ＭＳステップに付す前、担体分子、例えば担体タンパク質からグリカンをリリースする試料準備ステップを含むいかなる方法とも異なる。しかしながら、本明細書内で天然状態に言及するとき、天然状態という用語は、複合糖質の配座、即ち、二次構造、三次構造、又は四次構造等のその三次元フォールドに関連しない。したがって「天然状態での糖タンパク質の分析」は、「糖タンパク質が（ｉ）多糖類成分を担体タンパク質から除去する酵素を用いた酵素消化も受けず、また（ｉｉ）各事例でＬＣ－ＭＳシステムに糖タンパク質を導入する前に化学反応、例えば誘導体化も受けない、糖タンパク質の分析」と同義を意味する。

本発明は図を参照することによってより良く理解されよう。

分析された糖タンパク質Ｅｃ０６Ａ（ＥＰＡ担体タンパク質に共有結合する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ６Ａからの多糖類を含む複合糖質ワクチン成分；ＰＳ反復単位の構造は表１に与えられる）並びに異なる糖タンパク質ＥｃＯ７５、ＥｃＯ２、ＥｃＯ１Ａ、ＥｃＯ４、ＥｃＯ２５Ｂ、及びＥｃＯ６Ａの混合物（各々が独立してＥＰＡ担体タンパク質に共有結合する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ７５、Ｏ２、Ｏ１Ａ、Ｏ４、Ｏ２５Ｂ、及びＯ６Ａの多糖類；これらの多糖類の反復単位の構造は表１に与えられる）の主クロマトグラフィピークにわたって結合されたＬＣ－ＭＳスペクトル（ＴＩＣ ＭＳ機能、ｘ軸－ｍ／ｚ；ｙ軸－相対強度［％］）であり、パネルＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型ＥｃＯ６Ａのインソース断片化及び反復単位固有断片のリリース（質量８９３．３２６２ｇ／ｍｏｌを有するピーク）を示し、パネルＢに見られるように、ピーク近くに示される６つの異なる血清型を有する６価混合質量で見られるように、グリカン反復単位のリリース及びその選択的割り当ても複合タンパク質試料において可能である。 例示的な較正曲線が示され、インソース断片化は、ここでは糖タンパク質ＥｃＯ６Ａを使用した概念実証で示される、注入される血清型の量に基づいて線形で生じ、異なる注入量のタンパク質（０．２μｇから１．２μｇまで）は、ＥｃＯ６Ａの反復単位の異なる信号応答に繋がる（分子質量８９３．３２ｇ／ｍｏｌを有する断片；ｙ軸－応答／［ａ．ｕ．］；ｘ軸－マイクログラムＥｃＯ６Ａ］。 糖タンパク質ＥｃＯ２５Ｂ及びＥｃＯ１６（ＴＩＣ ＭＳ機能、ｘ軸ｍ／ｚ；ｙ軸相対強度［％］）の主クロマトグラフィピークにわたって結合されたＬＣ－ＭＳスペクトル（アセチル化あり／なし）であり、各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ及びＯ１６血清型のＯ－アセチルありの反復単位の構造が表１に与えられ、パネルＡは、２つの別個のピーク：Ｏ－アセチルあり（８６２ｇ／ｍｏｌ）及びなし（８２０ｇ／ｍｏｌ）の反復単位を有する糖タンパク質ＥｃＯ２５Ｂのインソース断片化を示し、パネルＢは、Ｏ－アセチルあり及びなしの反復単位の質量７１６ｇ／ｍｏｌ及び６７４ｇ／ｍｏｌを有する２つの別個のピークを有する糖タンパク質ＥｃＯ１６での同じ効果を示す。

より一般的な用語では、第１の態様において、本発明は、試料中の複合糖質の多糖類成分（グリカン）を分析する方法に関する。そのような分析が、上記多糖類成分の同定及び上記多糖類成分の絶対定量の両方を指すことに留意することが重要である。本発明による方法は、（ａ）ＬＣ－ＭＳシステムによって上記多糖類成分の較正曲線を確立するステップと、（ｂ）同じＬＣ－ＭＳシステムで試料を測定するステップと、（ｃ）（ａ）と（ｂ）との結果を比較するステップであって、それにより、上記試料中の上記多糖類成分を分析する、比較するステップとを含む。有利な一実施形態において、複合糖質は糖タンパク質である。

好ましい一実施形態において、複合糖質、好ましくは糖タンパク質は天然状態である。したがって、担体タンパク質からのＰＳ成分の酵素リリース、例えばＰＮＧａｓｅ Ｆ仲介リリースは必要とされないため、方法は、そのような酵素切断を受けにくい複合糖質、例えばアルファ１，３－フコースに連結されていないＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む糖モチーフ等のＰＮＧａｓｅ Ｆの基質特異性にない糖モチーフを含む複合糖質の分析にも適用可能である。

更に詳細に以下概説するように、本発明による方法は、
（ｉ）中の多糖類の同定、
（ｉｉ）中のタンパク質等の複合糖質の別の化学物質に結合した多糖類の絶対定量、
（ｉｉｉ）中の遊離多糖類の定量、
（ｉｖ）中の結合多糖類及び遊離多糖類におけるアセチル化等の修飾の定量及び同定、並びに
（ｖ）複合糖質を含有する試料、特に糖タンパク質系製剤組成物の純度
のうちの少なくとも２つ、好ましくは３つ以上、最も好ましくは全てについての情報を提供する。本発明のこの態様、特にプロセスステップ及び使用される用語について更に詳細に以下説明するものとする。

複合糖質：この用語については先に論じている。本発明の方法は広く適用可能であり、糖タンパク質（プロテオグリカン、ペプチドグリカン、及び糖ペプチドを含む）並びに糖脂質の分析に使用し得る。

糖タンパク質：この用語については先に論じている。具体的には、糖タンパク質は、多糖類（即ちグリカン）が担体タンパク質に共有結合する複合産物に関する。複合体は、宿主細胞内で調製された複合生成物である生体複合体であり得、宿主細胞機構がグリカン及びタンパク質を産生し、グリカンを担体タンパク質に、例えばアスパラギン又はアルギニンのＮ結合を介して連結する。複合体は、タンパク質及びグリカン鎖の、例えばチオールアルキル化を介した化学結合によって準備することもできる。本発明による方法は全てのタイプの複合体に適用可能である。理論に拘束されずに、ＭＳによってインソース断片化される限り、糖がいかに付着するかは関係ないと考えられる。参照材料は同じ断片化を示すため、断片化がタンパク質－グリカン境界面で生じるか否かは関係ない。

特に有用な複合糖質には、１つ又は複数の多糖類が付着する担体タンパク質がある。そのような複合糖質は例えば、特定のワクチンの活性成分として使用され、複合糖質の多糖類に対する機能的免疫応答を誘導することを目的とする。

本発明の実施形態において、上記糖タンパク質は、１つの担体タンパク質と、上記担体タンパク質に共有結合する１つ又は複数の多糖類、好ましくは上記担体タンパク質に挙有結合する１から４つの多糖類とを含む。
本発明の実施形態において、糖タンパク質は、担体タンパク質に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ抗原を含有する複合体産物である。Ｏ抗原という用語は当分野で既知であり、その通常の文脈で使用され、Ｏ結合と混同すべきではない。Ｏ抗原という用語は一般に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の細菌のＬＰＳ内に含有される反復性グリカンポリマーを指す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯ抗原は、免疫原性反復オリゴ糖（典型的には１～４０の反復単位）のポリマーであり、典型的には血清型分類及び複合糖質ワクチン製造に使用される。

担体タンパク質：本発明の実施形態において、担体タンパク質は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜蛋白質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィリスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄからなる群から選択される。

特定の実施形態において、担体タンパク質は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）である。そのような実施形態において、ＥＰＡは好ましくは１～２０、好ましくは１～１０、好ましくは２～４のグリコシル化部位を含む。

特定の実施形態において、ＥＰＡは４つのグリコシル化部位を含む。例えば、ＥＰＡ担体タンパク質への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖類の生体共役反応の例の説明について、国際公開第２０１７／０３５１８１号パンフレットを参照のこと。

多糖類：この用語については先に論じている。適した多糖類は１～１００、例えば１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、及び１～１０、３～５０、３～４０、例えば少なくとも５つ、例えば５～４０、例えば７～３０、例えば７～２５、例えば１０～２０、例えば５～２０の反復単位ｎを含む。そのような反復単位は（ｉ）非修飾単糖類及び／又は（ｉｉ）修飾単糖類を含む（即ちこれらを含むか、又はこれらからなる）。「修飾単糖類」という用語は特に、化学修飾単糖類に関連し、非限定的な実施形態において、単糖類のＮアセチル化、Ｏアセチル化、アミド化、及び／又はアミノ化を含む。そのような単糖類は、同じ単糖類において１つ又は複数の修飾、特に上記修飾の１、２、又は３つを含み得る。

本発明の実施形態において、適した反復単位は、マンノース、ラムノース、グルコース、フコース、ガラクトース、修飾マンノース、修飾ラムノース、修飾グルコース、修飾フコース、及び修飾ガラクトースからなる群から選択される単糖類を含む。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖類の非限定的で例示的な構造は以下の表１に示す。各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖類の単一の反復単位が示されている。この表において、各ｎは独立して１から１００の整数であり、例えば１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、及び１～１０、３～５０、３～４０、例えば少なくとも５、例えば５～４０、例えば７～３０、例えば７から２５、例えば１０から２０、例えば５から２０の整数であるが、場合によっては１～２であることができる。

試料：この用語は当分野で既知である。試料は、任意選択的に希釈後、分析システムに供給し得るあらゆる材料を含む。そのような試料は特に、（ｉ）複合糖質製造の製造バッチ（進行中のバッチ及びリリース／貯蔵された製造バッチを含む）、（ｉｉ）複数の複合糖質を含む組成物、例えば多価ワクチンを含む医薬組成物を含む。

適した試料は、複合糖質に加えて、（ｉ）水溶性マトリックス、（ｉｉ）任意選択的に、多糖類（又は糖ペプチドの場合には遊離ペプチド又は糖脂質の場合には遊離脂質）を含有しない担体タンパク質、（ｉｉｉ）任意選択的に、担体タンパク質（又は本明細書ではペプチド、又は脂質：「遊離ＰＳ」）に結合していない多糖類、（ｉｖ）任意選択的に非関連タンパク質（又はペプチド、又は脂質）を含む。水溶性マトリックス（ｉ）は、バッファー類（例えばリン酸塩バッファー）、無機塩類（例えばＮａＣｌ）、糖アルコール類（例えばＤソルビトール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０）の１つ又は複数を含み得る。非関連タンパク質（ｉｖ）は、最高で１０％、最高で５０％、又は最高で９０％のプロセス関連不純物（例えば宿主細胞タンパク質）を含み得る。本発明による方法が試料中の広範囲の追加成分に対して寛容であることが特に有益であると見なされる。したがって、研究所での準備なしで且つ標準分析プロトコルに干渉する材料を含まずに、試料を分析することが適する。

一実施形態において、試料は単一の複合糖質を含む。

更なる実施形態において、試料は、複数の複合糖質、例えば２～２０、例えば４～１０の複合多糖類を含む。ここでも、複合糖質は好ましくは糖タンパク質に関連する。したがって、本発明による方法は、例えば複数の血清型からのグリカンを有する複数の複合糖質を含む複合試料の分析も可能である。したがって、多価結合型ワクチン等の製剤をリリースするための複合試料であっても本発明による方法により分析することができる。本発明による方法が、複数の血清型を含む製剤の製造生産を進歩させ、そのような複合製剤の品質及び安全性を改善することが明らかである。

本発明による方法が、複合糖質の有無、例えば空試料の検証にも適することが明らかであり、したがって特定の実施形態において、試料は複合糖質を含まない。

一実施形態において、試料は１つの担体タンパク質又は担体ペプチドを含む。別の実施形態において、試料は２つ以上の担体タンパク質又は担体ペプチドを含む。したがって、本発明による方法は、グリコシル化パターンの異なる同じ担体タンパク質／ペプチドのみならず、異なる担体タンパク質／ペプチドも含む複数の異なる糖タンパク質／糖ペプチドを含む試料を分析するのに適する。したがって、担体タンパク質／ペプチドという用語は、先に概説したように単一の担体タンパク質／ペプチドを指すとともに、試料中に存在する複数の担体タンパク質／ペプチド、例えば２～１０、例えば２～５個の異なる担体タンパク質／ペプチドも指す。

分析方法：本発明による方法は、試料中の多糖類の総量の同定及び絶対定量を可能にする。さらに、本発明の方法は、試料中の結合多糖類量と遊離多糖類量を区別することが可能である。したがって、一実施形態において、本発明は、少なくとも１つの複合糖質を含む組成物中の結合多糖類含有及び遊離多糖類含有を識別し、それらを定量する方法を提供する。さらに、本発明の方法は、試料中の多糖類成分（結合ＰＳ及び／又は遊離ＰＳ）の存在を確認することが可能である。

先に論じたように、本発明の方法は３つのステップ：（ａ）較正、複合糖質の多糖類成分の（ｂ）測定、（ｃ）同定及び定量を含み、好ましくは、複合糖質は天然状態である。これらのステップについて更に詳細に以下説明し、提供される図における例で更に示すものとする。

ステップ（ａ）：ＬＣ－ＭＳシステムにより多糖類成分の較正曲線を確立する。較正曲線を準備するために、参照材料のアリコートをＬＣ－ＭＳシステムに提供する。参照材料は、既知の特定名及び既知の絶対量の上記多糖類成分を有する試料である。そのような参照材料は、多糖類成分を含む試料に従来の分析プロトコルを受けさせることにより取得し得る。

本発明の一実施形態において、ステップ（ａ）は、参照材料を準備し、上記参照材料を用いてＬＣ－ＭＳシステムを較正することを含む。参照材料の準備は、以下概説するように、ステップａ１～ａ３及び任意選択的にａ４、ａ５に従って達成し得る。参照材料の較正は、以下概説するように、ステップａ６に従って達成し得る。

ステップ（ａ１）：このステップは、参照材料中の上記糖タンパク質の特定名を特定することを含む。適した分析方法はそれ自体既知であり、例として、ウェスタンブロット電気泳動又はＭＳがある。

ステップ（ａ２）：以下のステップは、参照材料中の上記糖タンパク質の多糖類（ＰＳ）総含有量を特定することを含む。適した分析方法はそれ自体既知であり、例として、下垂部会後のＩＣ－ＰＡＤがある。

ステップ（ａ３）：以下のステップは、参照材料中の遊離ＰＳ含有量を特定することを含む。適した分析方法はそれ自体既知であり、例として、加水分解後のＩＣ－ＰＡＤ及び結合ＰＳと非結合ＰＳとの分離がある。

ステップ（ａ４）：以下の任意選択的なステップは、上記糖タンパク質の修飾の程度（特定の実施形態において、修飾はＯ－アセチル化である）を特定することを含む。適した分析方法はそれ自体既知であり、例として、修飾基除去（例えば加水分解によるＯ－アセチル基のリリース）後のイオンクロマトグラフィＩＣ－ＣＤがある。

ステップ（ａ５）：以下の任意選択的なステップは、参照材料中の上記糖タンパク質の純度を特定することを含む。適した分析方法はそれ自体既知であり、例として、ＲＰ－ＨＰＬＣ及び／又はＳＥＣがある。

ステップ（ａ１．．．ａ３）及び任意選択的に（ａ４．．．ａ５）に続き、糖タンパク質の多糖類成分を含む参照材料が取得される。そのアリコートは以下のステップ（ａ６）に向けて準備される。参照材料のそのようなアリコートは、既知の濃度、即ち既知音絶対量の多糖類成分を含む。

ステップ（ａ６）：このステップは、ＬＣ－ＭＳシステムにより参照材料のアリコートを測定することを含む。取得されたデータ（滞留時間、ピーク識別、ＡＵＣ特定を含む）により、較正曲線を確立することができる。このステップにおいて、参照材料はまずＬＣを介して分離され、溶出液は、イオン化電圧（コーン電圧）を調整することによりＭＳ検出器内部でインソース断片化（ＩＳＦ）を受ける。参照材料のアリコートが取得された後、ステップａ６が実行されることが理解される。ＬＣ－ＭＳシステム及び使用されるパラメータに固有であるそのような較正曲線。

先に概説したように、糖タンパク質は好ましくは天然状態である。しかしながら、代替の実施形態において、試料を分析のＬＣ－ＭＳステップに付す前、ペプチダーゼ、例えばトリプシンを用いて糖タンパク質を消化することが可能である。ペプチダーゼ、例えばトリプシンを用いたそのような消化は、ペプチド結合の切断のみに繋がり、糖ペプチド結合の切断は生じさせない。糖タンパク質含有試料の場合、そのような消化は、分析のＬＣ－ＭＳステップを受ける糖ペプチドの生成に繋がる。その場合、ステップ（ａ６）の実行前、参照材料は消化され、ステップ（ｂ１）の実行前、試料は消化される。生成された糖ペプチドは、ＬＣ－ＭＳシステムに試料を導入する前、各事例でなお天然状態であるとして、即ち（ｉ）担体タンパク質から多糖類成分を除去する酵素を用いた酵素消化も受けておらず、また（ｉｉ）化学反応、例えば誘導体化も受けていないものとして見なすことができる。ペプチダーゼ、例えばトリプシンを用いた処理を用いた糖タンパク質の消化は当業者に既知である。

本発明の好ましい実施形態において、試料はペプチダーゼ糖の酵素を用いて消化されない。

ステップ（ｂ）：同じＬＣ－ＭＳシステムで試料を測定する。ＬＣ－ＭＳシステムで試料を測定することはそれ自体既知であり、（ｂ１）試料をＬＣ－ＭＳシステムに提供すること及び（ｂ２）ＬＣ－ＭＳシステムで試料を測定することを含む。

ステップ（ａ）の較正が、ステップ（ｂ）における単一試料の測定又はステップ（ｂ）における複数の試料の測定に使用可能なことが当業者には明らかである。したがって、ステップ（ｂ１）及び（２）は繰り返し実行されて、複数の試料を測定し得る。例えば、同じ血清型からの２つの試料は、第１の試料を提供し（ｂ１）、第１の試料を測定し（ｂ２）、続けて第２の試料を提供し（ｂ１’）、第２の試料を測定する（ｂ２’）ことにより、同じ較正曲線を用いて測定される。したがって、試料を測定することは、単一試料を測定すること及び複数の試料を測定することを含む。

ステップ（ｂ１）：試料を任意の既知の様式でＬＣ－ＭＳシステムに提供し得る。典型的には、オートサンプラによる試料を含むバイアルからシステムへの注入が選ばれる。試料は、製造バッチから直接取得し得る。試料は、較正曲線の濃度範囲に合うように希釈し得る。糖タンパク質含有試料の場合、試料は好ましくは天然状態である。

代替の実施形態において、そのような試料は、トリプシン等のペプチダーゼを用いて消化されて、糖ペプチドを分析に付し得る。先に論じたように、生成された糖ペプチドは、ＬＣ－ＭＳシステムに試料を導入する前、各事例でなお天然状態であるとして、即ち（ｉ）担体タンパク質から多糖類成分を除去する酵素を用いた酵素消化も受けておらず、また（ｉｉ）化学反応、例えば誘導体化も受けていないものとして見なすことができる。したがって、本発明による方法では、試料を分析のＬＣ－ＭＳステップに付す前、糖ペプチド結合は切断されない。

その代替の実施形態において、参照材料も同様に、ステップ（ａ６）を実行する前に消化される。

本発明の方法の好ましい実施形態において、試料はペプチダーゼを用いても消化させず、またいかなる酵素を用いても消化されない。酵素消化を用いない方法には、分析がはるかに簡便であるという利点がある。

ステップ（ｂ２）：本発明による方法によれば、試料は、上記ステップ（ａ６）と同じパラメータを用いて測定される。好ましくは、試料は、較正曲線の準備に使用したものと同じＬＣ－ＭＳシステムで測定される。好ましくは、試料は、較正曲線が確立されてから８時間以内に測定される。これらの全ての測定はデータ品質を改善し、当業者には既知であり、外部因子に対するＬＣ－ＭＳシステムの感度を考慮する。

第１の実施形態において、試料の測定は、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
を含む。これにより、グリカン鎖の絶対量を特定することができる。

第２の実施形態において、試料を測定することは、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
・糖タンパク質のアセチル化ＰＳ含有量を特定することと、
を含む。これにより、試料中のアセチル化の程度を更に特定することができる。

第３の実施形態において、試料を測定することは、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
・試料純度を特定することと、
を含む。

第４の実施形態において、試料を測定することは、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
・糖タンパク質のアセチル化ＰＳ含有量を特定することと、
・試料純度を特定することと、
を含む。

第５の実施形態において、試料を測定することは、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
・遊離ＰＳ含有量を特定することと、
を含む。これにより、非共役グリカンの量（相対又は絶対）を更に特定することができる。

第６の実施形態において、試料を測定することは、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
・糖タンパク質のアセチル化ＰＳ含有量を特定することと、
・遊離ＰＳ含有量を特定することと、
を含む。これにより、非共役グリカンの量（相対又は絶対）を更に特定するとともに、結合したアセチル化ＰＳの程度を考慮することもできる。

第７の実施形態において、試料を測定することは、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
・糖タンパク質のアセチル化ＰＳ含有量を特定することと、
・遊離ＰＳ含有量を特定することと、
・遊離アセチル化ＰＳ含有量を特定することと、
を含む。これにより、遊離アセチル化ＰＳの量を更に特定することができる。

第８の実施形態において、試料を測定することは、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
・試料の遊離ＰＳ含有量を特定することと、
・試料の純度を特定することと、
を含む。

第９の実施形態において、試料を測定することは、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
・糖タンパク質のアセチル化ＰＳ含有量を特定することと、
・試料の遊離ＰＳ含有量を特定することと、
・試料の純度を特定することと、
を含む。

第１０の実施形態において、試料を測定することは、
・試料の特定名を特定することと、
・糖タンパク質のＰＳ含有量を特定することと、
・糖タンパク質のアセチル化ＰＳ含有量を特定することと、
・試料の遊離ＰＳ含有量を特定することと、
・試料の遊離アセチル化ＰＳ含有量を特定することと、
・試料の純度を特定することと、
を含む。

したがって、本発明の実施形態において、試料及び以下の１つ又は複数の特定名の同時特定が達成される：試料のＰＳ含有量、アセチル化ＰＳ含有量、遊離ＰＳ含有量、遊離アセチル化ＰＳ含有量、及び純度。特に、試料及び以下のパラメータの特定名の同時特定は通常、グリカンを担体分子、例えば担体タンパク質からリリースする試料準備ステップ又は糖タンパク質の誘導体化（更なる不純物の導入）を含む方法の場合には可能ではない：試料の遊離ＰＳ含有量、遊離アセチル化ＰＳ含有量、及び純度。

他の実施形態において、第１～第１０の実施形態に概説した態様に関する試料中の糖タンパク質の多糖類成分を分析する方法は、（ａ）ＬＣ－ＭＳシステムにより上記多糖類成分の較正曲線を確立することであって、このステップ（ａ）は、参照材料を準備すること（ステップａ１～ａ３及び任意選択的にａ４、ａ５）及び上記参照材料を用いてＬＣ－ＭＳシステムを較正すること（ステップａ６）を含み、較正曲線は、ＬＣを介して上記参照材料のアリコートを分離し、イオン化電圧を調整することによりＬＣの溶出液をＭＳ検出器内部のインソース断片化に付すことにより確立される、確立するステップと、（ｂ）同じＬＣ－ＭＳシステムを用いてステップ（ａ６）と同じパラメータを使用して同じＬＣ－ＭＳシステムで試料を測定することと、（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の結果を比較し、それにより、上記試料中の上記多糖類成分を分析することとを含む。

特に、例えばＣＩＤ又はＥＴＤを使用した更なる断片化は必要ない。したがって、一実施形態において、本明細書に記載される本発明は、インソース断片化後に取得されるイオンの追加の断片化が必要ない方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、内部標準が試料に追加されない、本明細書に記載される方法を提供する。信頼性の高い結果を提供するために、別個の較正曲線を生成することで十分であることが分かった。内部標準を省略すると、ハンドリングステップが知恵源し、したがって、方法が簡便化されるため、内部標準を使用する必要がないことは恩益と見なされる。

試料の純度は既知の様式で、例えばＬＣ－ＭＳシステムのＬＣ部分の屈折率検出器、ＵＶ検出器を介して特定し得る。代替又は追加として、純度はＭＳにより特定し得る。これは、総イオン電流を見ることで行われ得る。

ステップ（ｃ）：（ａ）及び（ｂ）の結果を比較し、それにより、試料中の多糖類成分を分析する：今まで、ＬＣ－ＭＳシステムは、較正曲線と突き合わせた複合糖質中の多糖類成分の絶対定量に使用されなかった。したがって、ステップ（ｃ）は、（ｃ１）試料中の各ＰＳの特徴的ピークを識別することと、（ｃ２）そのようなピークの曲線下面積（ＡＵＣ）を較正曲線と比較することとを含む。上述したようにステップ（ｂ）における試料の測定が複数の試料（例えば同じ血清型の又は同じ糖タンパク質を含む）に対して繰り返された実施形態において、ステップ（ｃ）も同様に、同じ較正曲線を使用して各試料に繰り返し得ることが当業者には明らかである。

第２の態様において、本発明は、試料中の複合糖質の多糖類成分を分析するための液体クロマトグラフィ－質量分析システム（「ＬＣ－ＭＳ」システム）の使用に関する。好ましい実施形態において、上記糖タンパク質は天然状態である。「試料」、「複合糖質」、「多糖類」、「担体タンパク質」、及び「天然状態」等の上記定義は、本発明のこの第２の態様にも同様に当てはまる。特に、「複合糖質」という用語は、「糖タンパク質」の意味を含み、より具体的には、「１つ又は複数の多糖類が付着する担体タンパク質」の意味を含む。本発明のこの態様について更に詳細に以下説明するものとする。

分析：ここでも、上記分析することが、上記多糖類成分の同定及び上記多糖類成分の絶対定量の両方を含むことに留意することが重要である。ＰＳ成分の同定は、上記ＰＳ成分の存在の確認及び不在の確認を含む。したがって、例えば試料が製造バッチ由来であるため、特定のＰＳ成分が試料中に存在することが予期される場合、上記ＰＳ成分の同定は、その存在の確認である。同様に、特定のＰＳ成分が試料中に存在しないことが予期され得、それも同様に確認することができる。上記ＰＳ成分の絶対定量は、例えばμｇ［ＰＳ－成分］／ｍＬ［試料］単位で測定される濃度の特定を含む。

実施形態において、本発明は、複合糖質の製造におけるインプロセス制御、特に複合糖質ワクチンの製造におけるインプロセス制御へのＬＣ－ＭＳシステムの使用にも関する。

実施形態において、本発明は、製造された複合糖質のリリース制御、特に複合糖質ワクチンの製造におけるリリース制御へのＬＣ－ＭＳシステムの使用にも関する。したがって、ＬＣ－ＭＳシステムは、薬剤物質又は製剤のリリースアッセイとして使用することができ、上記薬剤物質又は製剤は１つ又は複数の複合糖質、特に１つ又は複数の複合糖質ワクチンを含む。

実施形態において、本発明は、貯蔵されている複合糖質の安定性制御、特に貯蔵されている複合糖質ワクチンの安定性制御へのＬＣ－ＭＳシステムの使用にも関する。したがって、ＬＣ－ＭＳシステムは、薬剤物質又は製剤の貯蔵寿命のアッセイとして使用することができ、上記薬剤物質又は製剤は、１つ又は複数の複合糖質、特に１つ又は複数の複合糖質ワクチンを含む。

実施形態において、本発明は、複合糖質製造、特に複合糖質ワクチン製造の開発におけるプロセス最適化へのＬＣ－ＭＳシステムの使用にも関する。本明細書に記載のようなＬＣ－ＭＳシステムの使用は、極めて重要なパラメータの識別を大幅に簡易化し、したがって、開発を高速化し、スケールアップ中にタイムラインを短縮できるようにする。

ＬＣ－ＭＳ法：質量分析検出器に接続されたＨＰＬＣシステムは、一般にＬＣ－ＭＳシステムと呼ばれる。これらの検出器は、試料中に存在する特定の検体の分子質量を特定することが可能である。それらの精度及び質量正確性は多くの場合、分子の分子質量を特定するためのゴールドスタンダードと呼ばれる。

ＬＣ－ＭＳシステムで糖タンパク質糖の複合糖質を分析することの既知の副作用は、試料を検出器に注入する際のグリカンの断片化である。この作用は「インソース断片化」（ＩＳＦ）と呼ばれ、注入中に印加される電圧（いわゆる「コーン電圧」）に関連する。ＩＳＦは、複合試料における未知／同定不可能なイオン断片化に繋がり得るため、良好な性能のＭＳ検出器には理想的ではない。したがって、供給業者は、システム性能定量中、低ＩＳＦについてテストする（＜２％）。

ＭＳ分野では、ＩＳＦは一般に既知であり、抱合体の残りの部分からグリカン修飾（例えば糖ペプチドからペプチド鎖）を完全に除去することができるため、グリカン占有率テストにとっては望ましくない。他方、糖断片化が実行されて、リポーターイオンにより単糖類組成物を更に同定し特徴付ける。しかしながら、この断片化は通常、はるかに高いエネルギーを必要とし、したがって、異なるＭＳ技法（ＣＩＤ、ＥＴＤ）を必要とする。

本発明者らは驚くべきことに、ＬＣ－ＭＳ分析を受けた複合糖質が、対応する質量の別個のピーク（図１Ａ）として明確に見られるグリカン反復単位を分離するＩＳＦの効果を示すことを見出した。コーン電圧の調整後、この効果は、単一の複合糖質を注入する際のみならず、複数の複合糖質を含む組成物のようなより複雑な混合物（図１Ｂ）でも見られる。この効果は異なる血清型からの全ての多糖類で生じ、各血清型特異的な多糖類は別個の質量を有するため、それを使用して、分析される試料中の特定の血清型を同定することができる（その多糖類を介して）。

一実施形態において、ＬＣ－ＭＳシステムは、液体クロマトグラフィから取得された溶出液のインソース断片化を用いるＬＣ－ＭＳシステムである。そのようなシステムは、例えばＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。

一実施形態において、ＬＣ－ＭＳシステムはＭＳ検出器の前方に切替弁を更に備える。そのような弁は、溶出液の一部分のみをＭＳ検出器に偏向できるようにする。ここでも、そのようなシステムは市販されている。

実施形態において、糖タンパク質は先に定義されたようなものであり、特に１つの担体タンパク質と、上記タンパク質に共有結合される１つ又は複数の多糖類とを含む。特定の実施形態において、試料は、各々が１つ又は複数の共有結合された多糖類を担持する２つ以上の担体タンパク質を含む。

実施形態において、担体タンパク質は先に定義したようなものである。例えば、担体タンパク質は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜蛋白質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィリスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄからなる群から選択される。特定の実施形態において、担体タンパク質は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）である。

実施形態において、多糖類は先に定義されたようなものである。例えば、多糖類は１～１００、例えば５～２０の反復単位を含む。例示的な構造は先の表１に示されている。

実施形態において、試料は、水溶性マトリックス；任意選択的に、多糖類を含有しない担体タンパク質；任意選択的に、担体タンパク質（又は脂質又はペプチド）に結合していない多糖類；任意選択的に非関連タンパク質を含む。

引用文献のリストは、本発明の文脈における追加情報を提供する。これらの文献は参照により援用される。
（１）ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｈ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ／ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｌｅａｒｎｉｎｇ－ｃｅｎｔｅｒ／ｉｏｎ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｉｏｎ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ａｎａｌｙｓｉｓ－ａｎａｌｙｔｅ／ａｎａｌｙｚｉｎｇ－ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ－ｈｐａｅ－ｐａｄ－ｉｏｎ－ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ｈｔｍｌ
（２）Ｍａｚｓａｒｏｆｆら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７
（３）Ｉｖａｎｃｉｃら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０
（４）米国特許出願公開第２０２０／０４１４７０号明細書
（５）Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５
（６）Ｊｅｏｎｇら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２

本発明を更に示すために、以下の例を提供する。これらの例は、本発明の範囲を限定することを意図せずに提供される。

Ｉ．参照材料の準備
より大きな数量での糖タンパク質試料を製造バッチから直接取得し、アリコート化し適宜貯蔵する（例えば－８０℃）。上記糖タンパク質試料の解凍したアリコートに対して異なる特徴付けステップが実行される。

１）参照材料の正しい特定名を特定する。対象糖タンパク質の多糖鎖への特異性について選択されテストされた特定の抗体を使用して、標準ウェスタンブロットプロトコルに従う。任意選択的に、担体タンパク質の正しい特定名は、担体タンパク質に特異的な抗体を使用して特定される。

２）参照材料内の多糖類総含有量を特定する。単糖類への全酸加水分解が実行され、そして以下の命令に従ってイオンクロマトグラフィ及びパルス電流測定検出（ＩＣ－ＰＡＤ）による分析が続く。参照材料のアリコートをとり、最終濃度１．８Ｍでトリフルオ酢酸（ＴＦＡ）を使用して１２０℃で２時間加水分解する。最適な加水分解条件（温度、ＴＦＡ濃度、及び時間）は、多糖類の開始濃度に応じて様々であり得る。最適条件は、絶対定量の標的である単糖類分子の更なる劣化なしで多糖鎖から全ての単糖類を定量的にリリースすることを示さなければならない。

加水分解後、試料を室温まで冷まし、次いでＳｐｅｅｄＶａｃを典型的には３０℃で一晩使用することにより乾燥させる。乾燥試料をＨ２Ｏ（ミリＱ等級）に完全に再懸濁し、試料をＨＰＬＣバイアルに移す。市販の単糖類（例えばマンノース）を使用して較正標準のセットを準備する。定量の標的である単糖類が、上記加水分解ステップ中に修飾を経る（例えばＮ－アセチルグルコサミンがグルコサミンになる）場合、適切な単糖類を使用し、又は代替的には上述した加水分解手順を較正標準のセットに対しても同様に実行する。

ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）に使い捨て金電極が設置されたパルス電流測定検出器（ＰＡＤ）を装備したイオンクロマトグラフィシステム（例えばＤｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－５０００）を準備する。Ｄｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１分析カラム（４×２５０ｍｍ）及び任意選択的にＤｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ガードカラム（４×５０ｍｍ）を使用する。試料溶出の場合、溶出液Ａ、１６ｍＭ ＮａＯＨを用い、カラムクリーニングの場合、溶出液Ｂ ５００ｍＭ ＮａＯＨを用いてシステムを平衡化させる。続けて、以下の機器方法／勾配プロファイルを使用して試料及び較正標準セットを注入する；
－０～２４分、１００％溶出液Ａ、１ｍＬ／最小流量（溶出）、
－２５～３２分、１００％溶出液Ｂ、１ｍＬ／最小流量（洗浄）、
－３３～６０分、１００％溶出液Ａ、１ｍＬ／最小流量（再平衡）。

標的とされる単糖類に応じて、これらの勾配を最適化する必要があり得る。

測定された較正セットからの曲線下面積を使用して、較正曲線を取得し、次いで未知の試料を定量する。任意選択的に、次いで標的とされる単糖類の量を使用して、糖タンパク質試料中のμｇ／ｍＬ単位の反復単位／多糖類の絶対量を逆算する。

３）参照材料内の遊離多糖類含有量を特定する。担体タンパク質に結合した多糖類はＣ４カートリッジにより除去され、その後、単糖類に全酸性加水分解され、イオンクロマトグラフィ及びパルス電流測定検出が続く。糖タンパク質のサイズに応じて、異なるカーボンポリマー長のカートリッジ材料（例えばＣ８カートリッジ）を担体タンパク質の完全保持に選ぶことができる。試料準備ステップは手が掛かるため、参照材料に存在しない追加の単糖類（例えばガラクトース）を内部標準として使用して、準備中の潜在的な試料損失を補償することが推奨される。

参照材料のうちの２つのアリコートをとり、同量の内部標準を追加する。製造業者のマニュアルに従ってＣ４カートリッジ（例えばＭａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌからのＣｈｒｏｍａｆｉｘ Ｃ４－ＳＰＥ）を平衡化する：例えば、５カラム容量の１００％メタノール、次いで５カラム容量の１００％アセトニトリル、次いで５カラム容量の５％ｖ／ｖアセトニトリル。次のステップ中、遊離多糖類を含むフロースルーを収集する：２つのアリコートのうちの一方をカートリッジに適用し、続けて２カラム容量の５％アセトニトリルを適用する。収集されたフロースルーの容量を測定し、等量の５％アセトニトリルを、Ｃ４カートリッジに適用されていない他方のアリコートに添加する。ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して典型的には３０℃で一晩、準備された両試料を乾燥させる。乾燥させた両試料をＨ２Ｏ（ミリＱ等級）中に完全に再懸濁させ、次いで上述した手順に従って全酸性加水分解して単糖類にする：トリフルオ酢酸（ＴＦＡ）を最終濃度１．８Ｍまで両試料に添加し、１２０℃で２時間加水分解する（最適加水分解条件は様々であり得、最適化されるべきである）。加水分解後、両試料を室温に冷まし、次いでＳｐｅｅｄＶａｃを使用して典型的には３０℃で一晩乾燥する。乾燥した両試料をＨ２Ｏ（ミリＱ等級）に完全に再懸濁し、ＨＰＬＣバイアルに移す。

ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）に使い捨て金電極が設置されたパルス電流測定検出器（ＰＡＤ）を装備したイオンクロマトグラフィシステム（例えばＤｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－５０００）を準備する。Ｄｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１分析カラム（４×２５０ｍｍ）及び任意選択的にＤｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ガードカラム（４×５０ｍｍ）を使用する。試料溶出の場合、溶出液Ａ、１６ｍＭ ＮａＯＨを用い、カラムクリーニングの場合、溶出液Ｂ ５００ｍＭ ＮａＯＨを用いてシステムを平衡化させる。続けて、以下の機器方法／勾配プロファイルを使用して準備された両試料を注入する；
－０～２４分、１００％溶出液Ａ、１ｍＬ／最小流量（溶出）、
－２５～３２分、１００％溶出液Ｂ、１ｍＬ／最小流量（洗浄）、
－３３～６０分、１００％溶出液Ａ、１ｍＬ／最小流量（再平衡）。

標的とされる単糖類に応じて、これらの勾配を最適化する必要があり得る。

標的とされる単糖類（例えばマンノース）からの曲線下面積及び適用された内部標準（例えばガラクトース）を使用して、測定された面積を正規化する。分析された試料の遊離単糖類含有量が、２つの測定されたアリコートの正規化された面積を相対的に比較することにより特定される。Ｃ４カートリッジにより処理されたアリコートは、利用可能な多糖類の１００％を表すＣ４カートリッジ非処理のアリコートと比較した試料内の遊離多糖類の割合を表す。得られた遊離多糖類の値を使用して、上記特定された総多糖類含有量から「結合多糖類」量を計算する。

４）参照材料中の多糖鎖の修飾の程度を特定する。この任意選択的なステップは、弱アルカリ加水分解を使用し、その後、イオンクロマトグラフィ及び導電度検出による分析が続くＯ－アセチル化糖部分の特定を記述する。

参照材料のアリコートをとり、製造業者のマニュアルに従って脱塩ステップを実行し、試料中の遊離酢酸塩分子を除去する（例えばＺｅｂａ Ｓｐｉｎカラム、ＰＤ－１０カラム）。内部標準を脱塩された試料に添加し（例えばプロピオン酸２０μｇ／ｍＬ）、最終濃度１０ｍＭでＮａＯＨを使用して３７℃で２時間加水分解する。最適な加水分解条件（ＮａＯＨ濃度、温度、及び時間）は、多糖類の開始濃度に応じて様々であり得る。最適な条件は、試料中の酢酸塩の更なる劣化なしで多糖鎖から全てのＯ－アセチル基を定量的にリリースすることを示さなければならない。

加水分解後、試料を室温まで冷まし、次いで濾過して、ＨＰＬＣ分析中に干渉する恐れがある残留タンパク質を除去する（例えば遠心フィルタ、ＰＥＳ３ｋＤａ）。製造業者のマニュアルに従ってフィルタを準備し、リリースされた酢酸塩分子を含む濾過液を収集する。

イオンクロマトグラフィの市販の酢酸塩標準を使用して較正標準のセットを準備する。較正標準セットは、先に適用されたものと同量の内部標準（例えばプロピオン酸２０μｇ／ｍＬ）を含まなければならない。

設置された導電度検出器及びサプレッサを装備したイオンクロマトグラフィシステム（例えばＤｉｏｎｅｘ ＩＣＳ－５０００）を準備する。Ｄｉｏｎｅｘ ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１－ＨＣ分析カラム（４×２５０ｍｍ）及び任意選択的にＤｉｏｎｅｘ ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１－ＨＣガードカラム（４×５０ｍｍ）を使用する。試料溶出の場合、溶出液Ａ、１ｍＭ ＮａＯＨを用い、カラムクリーニングの場合、溶出液Ｂ １００ｍＭ ＮａＯＨを用いてシステムを平衡化させる。続けて、以下の機器方法／勾配プロファイルを使用して試料及び較正標準セットを注入する；
－０～１５分、１００％溶出液Ａ、１．５ｍＬ／最小流量、サプレッサ４ｍＡ（溶出）、
－１６～２１分、１００％溶出液Ｂ、１．５ｍＬ／最小流量、サプレッサ３７２ｍＡ（洗浄）、
－２２～２５分、１００％溶出液Ａ、１．５ｍＬ／最小流量、サプレッサ４ｍＡ（再平衡）。

イオンクロマトグラフィシステムに応じて、サプレッサ設定は様々であり得る。

内部標準を使用して、測定較正セット及び未知の試料の両方について曲線下面積を正規化する。次いで取得された較正曲線を使用して、未知の試料中の酢酸塩濃度を定量する。Ｏ－アセチル化単糖類の程度は、特定された多糖類含有量（上述のように）当たりの酢酸塩の比率を特定することにより計算することができる。

５）任意選択的に、参照材料の相対純度を特定する。これは、サイズ排除クロマトグラフィ及び／又は逆相クロマトグラフィにより達成される。標的とする糖タンパク質に適切なカラムを選択し（例えばサイズ排除ではＳｕｐｅｌｃｏ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、逆相ではＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ４－ＡＲ－３００）、製造業者のマニュアルに従ってクロマトグラフィステップを実行する。例えば、２１５ｎｍにおいて測定された吸光度を使用して、２１５ｎｍにおいて吸光する他の化合物と比較した糖タンパク質の相対純度を特定することができる。ＨＰＬＣソフトウェアのマニュアルに従って糖タンパク質の相対純度（％単位）を特定する。

ＩＩ．ＬＣ－ＭＳシステムでの分析
分析する糖タンパク質試料は、製造バッチから直接取得される。上記試料の多糖類含有量を同定、定量するために、同じ糖タンパク質種を反映する、例えば同じ担体タンパク質上に同じグリカン構造を有する、上述したように事前に準備された参照材料を使用する。

分析する試料は、以下述べるプロトコルで使用される参照材料が、組成及びグリカン構造に関して同一である場合、複数の異なる糖タンパク質を含むこともできる。
別記されない場合、ＭＳ等級化学物質を使用して溶出液を準備する。
注：分析する糖タンパク質を誘導体化する必要はない（例えば同位体標識を介して）。さらに、酵素処理が必要なく、したがって、分析前の長々とした試料準備の必要がない。糖タンパク質は、上述したように天然状態で分析されると見なすことができる。さらに、定量のための内部標準は試料に添加されず、代わりに別個の較正曲線の生成で十分である。

１）任意選択的に、試料のバッファー及び較正参照標準材料のバッファー交換を実行する。このステップは、特定のマトリックス成分がＭＳ検出器に入るのを防ぐために望ましいことがある。しかしながら、バッファー交換も遊離多糖類断片を除去し、それにより、上記試料内の遊離多糖類含有量の正確な特定を妨げる恐れがある。
代わりに、ＬＣシステムとＭＳシステムとの間で切替弁を使用することが推奨され、切替弁は、液体クロマトグラフィからの溶出後、望ましくない成分を水中に逸らすようにプログラムすることができる。実行される場合、適切な分子重量カットオフを有する遠心フィルタを使用して、溶出液Ａ（Ｈ２ＯミリＱ等級、０．１％ｖ／ｖ蟻酸）へのバッファーを少なくとも３回交換する。試料の量（例えば３０μｇ）は、対象となる糖タンパク質に依存し、最適化されなければならない。

２）分析する試料及び参照材料を用いてＨＰＬＣバイアルを準備する。最適な濃度は使用されるＬＣ－ＭＳシステムに依存する。較正曲線を作成するために、準備された異なる濃度で等量を注入することにより又は同濃度で異なる容量を注入することにより、参照材料の異なる較正点を採用することができる。これは、ＬＣシステムの注入器線形性及び分析する試料（例えばバイアルへの経時吸収による潜在的な干渉等）に依存し、特定の試料に向けて最適化されなければならない。

３）ＬＣ－ＭＳシステムを準備する。例示的なシステムとして、ＷａｔｅｒｓからのＡＣＱＵＩＴＹ－Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２ ＨＤＭＳが、ＮａＩを用いて製造業者のマニュアルに従ってＭＳ検出器を較正することにより準備される。分析するタンパク質を溶出可能な、ユーザのシステムに適した逆相カラム（例えばＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ３００ Ｃ４、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用する。試料を適宜保持し溶出するために、分析する糖タンパク質のサイズに応じて、異なるカーボンポリマー長の逆相材料を選び得る。溶出液Ａ（Ｈ２ＯミリＱ等級、０．１％ｖ／ｖ蟻酸）及び溶出液Ｂ（アセトニトリル、０．１％ｖ／ｖ蟻酸）でシステムを平衡化する。

４）続けて試料及び参照材料の較正点を注入する。以下の機器方法／勾配プロファイルが適する：
－まず、９５％溶出液Ａ、５％溶出液Ｂ、０．４ｍＬ／最小流量、
－１分、９５％溶出液Ａ、５％溶出液Ｂ、０．４ｍＬ／最小流量、
－９分、６０％溶出液Ａ、４０％溶出液Ｂ、０．４ｍＬ／最小流量、
－１１分、５％溶出液Ａ、９５％溶出液Ｂ、０．４ｍＬ／最小流量、
－１２分、５％溶出液Ａ、９５％溶出液Ｂ、０．４ｍＬ／最小流量、
－１２．５分、９５％溶出液Ａ、５％溶出液Ｂ、０．４ｍＬ／最小流量、
－１５分、９５％溶出液Ａ、５％溶出液Ｂ、０．４ｍＬ／最小流量。

標的とする糖タンパク質及び使用されるシステム／カラムに応じて、これらの勾配及び注入量を適合し得る。

５）取り付けられた検出器を用いて溶出されたタンパク質を分析する。任意選択的に、所望の波長のＵＶ吸収信号を取得する。ＵＶ吸収信号が望ましい場合、より多量の試料を注入する必要があり得、注入濃度を最適化しなければならない。任意選択的に、スプリット／切替弁をＬＣシステムとＭＳシステムとの間に使用して、ＭＳ検出器の過飽和を防ぐ。システムのＭＳ検出器（例えば四重極ＴＯＦ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２ ＨＤＭＳ分光計、Ｗａｔｅｒｓ）をポジ解像度モードのエレクトロスプレイイオン化と共に使用する。機器最適化条件でデータを取得する。以下のパラメータをＴＯＦ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２ ＨＤＭＳ分光計で使用した：
－１秒スキャン時間、
－３ｋＶキャピラリ電圧、
－３７Ｖサンプリングコーン電圧、
－１２０℃ソース電圧、
－４５０℃脱溶媒温度、
－２０Ｌ／Ｈコーンガスフロー、
－５５０Ｌ／Ｈ脱溶媒ガスフロー、
－ＭＳ機能５００～２０００Ｄａ、４ｅＶトラップあり、移行衝突エネルギーなし
－任意選択的に：標的質量でＭＳＭＳ機能１００～１０００Ｄａ、４ｅＶトラップあり、ランプ移行衝突エネルギー１８～２５ｅＶを得る。
－ロイケンエンケファリン（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）のスプレイ取得を３０秒間隔でロックする。

クリティカルパラメータは、グリカン鎖のインソース断片化を生じさせるサンプリングコーン電圧である。分析する糖タンパク質に応じて、このコーン電圧を最適化する必要があり得る。

６）取得されたデータの処理。データ処理は、製造業者の提供されるソフトウェアパッケージ（例えばＭａｓｓＬｙｎｘ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用することにより実行される。まず、溶出された糖タンパク質を表す主クロマトグラフィピーク（ＴＩＣ ＭＳ機能）にわたるスペクトルを結合する。ＬＣ－ＭＳ取得パラメータが適宜最適化された場合、インソース断片化は、分析される糖タンパク質の多糖鎖由来の高比質量ピークを生じさせる（図１Ａ参照）。６つの異なるＥＰＡ複合糖質を含む試料の結果を上述したのと同様に（図１Ｂ参照）処理することができる。グリカン構造及び最適化されたパラメータに応じて、多糖類の反復単位に関連する質量を観測し得る。比質量ピークを使用して、分析される糖タンパク質の特定名を確認することができる。

第２に、次のステップで、識別された比質量ピークの抽出クロマトグラムを使用する：主クロマトグラフィピーク（溶出された糖タンパク質を表す）における曲線下面積は、参照材料の注入され結合された多糖類の量に対応する。較正曲線（多糖類量ｖｓ曲線下面積；図２参照）を用いて、未知の試料中の（主クロマトグラフィピークにおける）多糖類含有量の絶対量を特定することができる。

任意選択的に、識別された比質量ピークの抽出クロマトグラムを更に使用して、遊離多糖類の相対量を特定することができる：主クロマトグラフィピーク以外の全ての曲線下面積の和を主クロマトグラフィピーク（溶出された糖タンパク質を表す）の曲線下面積と比較する。試料内の遊離多糖類の特定は、多糖鎖の異なる断片（例えば単糖類、二糖類断片、修飾サッカリド、多糖類特異性オキソニウムイオン等）のクロマトグラムを抽出することにより更に最適化し得る。

任意選択的に、クロマトグラフィ主ピーク（溶出した糖タンパク質を表す）にわたる結合スペクトルを用いて多糖類の修飾の程度を特定する。Ｏ－アセチル化多糖鎖の例では、識別された比質量ピークは、グリカンの脱アセチル化形態を表す４２Ｄａの質量差を有する近隣ピークを有し得る（図３参照）。これら２つのピークの曲線下面積を比較することにより、修飾の程度を特定することができる。

任意選択的に、取得されたＵＶクロマトグラム及び／又はＴＩＣクロマトグラムを使用して、分析された試料の相対純度を特定することができる。主クロマトグラフィピーク以外の全ての曲線下面積の和を主クロマトグラフィピーク（溶出された糖タンパク質を表す）の曲線下面積と比較する。

ＩＩＩ．結論
多価複合糖質ワクチン（現在、例えば、各々が独立してＥＰＡ担体タンパク質に共有結合される１０の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ－抗原多糖類を含む、即ち１０の薬剤物質を含む１０価大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）ワクチンが開発中である）について、本発明より前の個々の薬剤物質の各々のリリースは典型的には、ＰＳ含有量アッセイ（上記ステップＩ．２と同様）を含む幾つかの異なるアッセイ並びに続けて（即ちＰＳ含有量アッセイの結果に応じて）遊離ＰＳ含有量アッセイ（上記ステップＩ．３と同様）及び血清型によってはＯ－アセチル化を特定するためのアッセイ（上記ステップＩ．４と同様）を必要としたことに留意されたい。２つの他のアッセイのこの系列依存性は、品質管理（「ＱＣ」）リリース中の低スループットに繋がる。加えて、特定名及び純度アッセイ（それぞれ上記ステップＩ．１及びＩ．５と同様）も典型的には、各薬剤物質のリリースのために実行されるべきである。

本発明の方法の利点の１つは、これらの５つの異なるアッセイがここでは全て１つの分析手順（上記セクションＩＩ）にまとめることができ、試料準備は希釈ステップだけであり、それにより化学分析をテストするＱＣに必要な時間を約２週間から約２日に短縮することができ、同じ関連情報を得るために必要な時間、材料、及びオペレータの低減に繋がることである。したがって、本方法は、バッチリリース時間をより低コストで大きく短縮させる。

さらに、アッセイは個々の薬剤物質で実行することができるが、個々の薬剤物質が混合されたより複雑な製剤になった後であっても実行することができ、例えば最終的な多価複合糖質ワクチン組成物に対して実行することさえも可能できる。

さらに、分光検出器の高い特異性により、試料純度が一般にはるかに低い進行中の間試料定量が可能である。これは、プロセス最適化中のコスト及び時間を低下させ、したがって、商業的に製造される糖タンパク質系ワクチンの全体開発コストを低下させる。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］
試料中の糖タンパク質の多糖類成分を分析する方法であって、それにより、
前記分析は、
・前記多糖類成分の同定と、
・前記多糖類成分の絶対定量と、
を含み、
前記方法は、
（ａ）ＬＣ－ＭＳシステムによって前記多糖類成分の較正曲線を確立するステップと、
（ｂ）同じＬＣ－ＭＳシステムで前記試料を測定するステップと、
（ｃ）（ａ）と（ｂ）との結果を比較するステップであって、それにより、前記試料中の前記多糖類成分を分析する、比較するステップと、
を含み、前記糖タンパク質はその天然状態である、方法。
［２］
前記糖タンパク質は、１つの担体タンパク質と、前記担体タンパク質に共有結合する１つ又は複数の多糖類とを含む、［１］に記載の方法。
［３］
前記担体タンパク質は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜蛋白質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィリスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄからなる群から選択され、好ましくは緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記多糖類は１～１００、好ましくは５～２０の反復単位を含み、
前記反復単位は非修飾単糖類及び／又は修飾単糖類を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記試料は、
・水溶性マトリックスであって、前記マトリックスは任意選択的に、バッファー類、無機塩類、糖アルコール類、及び非イオン性界面活性剤の１つ又は複数を含む、水溶性マトリックス、
・任意選択的に、多糖類を含有しない担体タンパク質、
・任意選択的に、担体タンパク質に結合していない多糖類（「遊離ＰＳ」）、
・任意選択的に、非関連タンパク質
を更に含む、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記試料は多数の異なる糖タンパク質、好ましくは２～２０、例えば４～１０の糖タンパク質を含み、前記糖タンパク質は、前記多糖類成分及び／又は前記担体タンパク質において異なる、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
前記ステップ（ａ）は、参照材料を準備すること（ステップａ１～ａ３及び任意選択的にａ４、ａ５）及び前記参照材料を用いてＬＣ－ＭＳシステムを較正すること（ステップａ６）：
（ａ１）前記糖タンパク質の特定名を特定すること、
（ａ２）前記参照材料中の前記糖タンパク質の総多糖類（ＰＳ）含有量を特定すること、（ａ３）前記参照材料中の遊離ＰＳ含有量を特定すること、
（ａ４）任意選択的に、前記参照材料中の前記糖タンパク質の修飾の程度、特にＯ－アセチル化の程度を特定すること、
（ａ５）任意選択的に、前記参照材料中の前記糖タンパク質の純度を特定することであって、
それにより、糖タンパク質の前記多糖類成分を含む参照材料を取得する、純度を特定すること、その後、
（ａ６）ＬＣ－ＭＳシステムによって前記参照材料のアリコートを測定することであって、
それにより、前記較正曲線を確立する、測定すること
を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
・ステップ（ａ１）において、前記糖タンパク質の前記特定名は、ウェスタンブロット電気泳動又はＭＳによって特定され、且つ／又は
・ステップ（ａ２）において、前記総ＰＳ含有量は、加水分解後、ＩＣ－ＰＡＤによって特定され、且つ／又は
・ステップ（ａ３）において、前記遊離ＰＳ含有量は、加水分解並びに結合ＰＳと非結合ＰＳとの分離後、ＩＣ－ＰＡＤによって特定され、且つ／又は
・ステップ（ａ４）において、前記修飾の程度、特にＯ－アセチル化の程度は、修飾基のリリース後、特に加水分解によるＯ－アセチル基のリリース後、イオンクロマトグラフィＩＣ－ＣＤによって特定され、且つ／又は
・ステップ（ａ５）において、前記糖タンパク質の純度は、ＲＰ－ＨＰＬＣ及び／又はＳＥＣによって特定され、且つ／又は
・ステップ（ａ６）において、前記較正曲線は、ＬＣを介して前記アリコートを分離し、イオン化電圧を調整することによって前記ＬＣの溶出液をＭＳ検出器内部でのインソース断片化に付すことによって確立される、［７］に記載の方法。
［９］
前記ステップ（ｂ）は、
（ｂ１）試料を提供することと、
（ｂ２）同じＬＣ－ＭＳシステムを用いて（ａ６）と同じパラメータを使用して前記試料を測定することと、
を含む、［７］又は［８］に記載の方法。
［１０］
前記測定すること（ｂ２）は、前記試料の特定名の特定と、以下：
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量の特定、又は
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定、又は
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量の特定及び試料純度の特定、又は
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに試料純度の特定、又は
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量の特定及び遊離ＰＳ含有量の特定、又は
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに遊離ＰＳ含有量の特定、又は
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに遊離ＰＳ含有量及び遊離アセチル化ＰＳ含有量の特定、
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量の特定並びに前記試料の遊離ＰＳ含有量及び純度の特定、又は
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに前記試料の遊離ＰＳ含有量及び純度の特定、又は
・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに前記試料の遊離ＰＳ含有量及び遊離アセチル化ＰＳ含有量及び純度の特定
の１つとを含む、［９］に記載の方法。
［１１］
前記ステップ（ｃ）は、
（ｃ１）前記試料中の各ＰＳの特徴ピークを識別することと、
（ｃ２）そのようなピークのＡＵＣを前記較正曲線と比較することと、
を含む、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
試料中の糖タンパク質の多糖類成分を分析するための液体クロマトグラフィ－質量分析システム（「ＬＣ－ＭＳシステム」）の使用であって、前記分析することは、
・前記多糖類成分を同定することと、
・前記多糖類成分を絶対定量することと、
を含み、
前記糖タンパク質はその天然状態である、使用。
［１３］
前記ＬＣ－ＭＳシステムは、前記液体クロマトグラフィから取得された溶出液のインソース断片化を用いるＬＣ－ＭＳシステムである、［１２］に記載の使用。
［１４］
前記ＬＣ－ＭＳシステムは、ＭＳ検出器の前方に切替弁を更に備える、［１２］又は［１３］に記載の使用。
［１５］
前記糖タンパク質は、１つの担体タンパク質と、前記担体タンパク質に共有結合する１つ又は複数の多糖類とを含む、［１２］～［１４］のいずれかに記載の使用。
［１６］
前記糖タンパク質は、担体タンパク質を含み、前記担体タンパク質は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜蛋白質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィリスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄからなる群から選択され、好ましくは緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａであり、且つ／又は
前記多糖類は１～１００、好ましくは５～２０の反復単位を含み、前記反復単位は非修飾単糖類及び／又は修飾単糖類を含む、［１２］～［１５］のいずれかに記載の使用。
［１７］
前記試料は、
・水溶性マトリックスであって、前記マトリックスは任意選択的に、バッファー類、無機塩類、糖アルコール類、及び非イオン性界面活性剤を含む、水溶性マトリックス、
・任意選択的に、多糖類を含有しない担体タンパク質、
・任意選択的に、担体タンパク質に結合していない多糖類、並びに
・任意選択的に、非関連タンパク質
を更に含む、［１２］～［１６］のいずれかに記載の使用。
［１８］
・複合糖質の生産におけるインプロセス制御、
・生産された複合糖質のリリース制御、
・貯蔵された複合糖質の安定性制御、及び／又は
・複合糖質の生産におけるプロセス最適化
のための［１２］～［１７］のいずれかに記載の使用。

Claims (19)

1. 試料中の糖タンパク質の多糖類成分を分析する方法であって、
   前記糖タンパク質は、１つの担体タンパク質と、前記担体タンパク質に共有結合した１つ又は複数の多糖類とを含み、
   前記分析は、
   ・前記多糖類成分の同定と、
   ・前記多糖類成分の絶対定量と、
   を含み、
   前記方法は、
   （ａ）ＬＣ－ＭＳシステムに前記糖タンパク質を含む参照材料を導入することを含む、前記多糖類成分の較正曲線を確立するステップと、
   （ｂ）同じＬＣ－ＭＳシステムで前記試料を測定するステップと、
   （ｃ）（ａ）と（ｂ）との結果を比較するステップであって、それにより、前記試料中の前記多糖類成分を分析する、比較するステップと、
   を含み、ステップａ及びｂは、糖タンパク質又はそこから得られた糖ペプチドを前記ＬＣ－ＭＳシステムに注入し、それらをグリカン反復単位を分離するコーン電圧で質量分光計においてインソース断片化に付すことを含む、方法。
2. 前記糖タンパク質は、前記ＬＣ－ＭＳシステムに前記糖タンパク質を導入する前に、前記多糖類成分を前記担体タンパク質から除去する酵素を用いた酵素消化を受けず、かつ、前記ＬＣ－ＭＳシステムに前記糖タンパク質を導入する前の前記糖タンパク質を化学反応にかけない、請求項１に記載の方法。
3. 前記担体タンパク質は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜蛋白質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィリスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄからなる群から選択され、好ましくは緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記多糖類は１～１００、好ましくは５～２０の反復単位を含み、
   前記反復単位は非修飾単糖類及び／又は修飾単糖類を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記試料は、
   ・水溶性マトリックスであって、前記マトリックスは任意選択的に、バッファー類、無機塩類、糖アルコール類、及び非イオン性界面活性剤の１つ又は複数を含む、水溶性マトリックス、
   ・任意選択的に、多糖類を含有しない担体タンパク質、
   ・任意選択的に、担体タンパク質に結合していない多糖類（「遊離ＰＳ」）、
   ・任意選択的に、非関連タンパク質
   を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記試料は多数の異なる糖タンパク質、好ましくは２～２０、例えば４～１０の糖タンパク質を含み、前記糖タンパク質は、前記多糖類成分及び／又は前記担体タンパク質において異なる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ステップ（ａ）は、参照材料を準備すること（ステップａ１～ａ３及び任意選択的にａ４、ａ５）及び前記参照材料を用いてＬＣ－ＭＳシステムを較正すること（ステップａ６）：
   （ａ１）前記糖タンパク質の特定名を特定すること、
   （ａ２）前記参照材料中の前記糖タンパク質の総多糖類（ＰＳ）含有量を特定すること、（ａ３）前記参照材料中の遊離ＰＳ含有量を特定すること、
   （ａ４）任意選択的に、前記参照材料中の前記糖タンパク質の修飾の程度、特にＯ－アセチル化の程度を特定すること、
   （ａ５）任意選択的に、前記参照材料中の前記糖タンパク質の純度を特定することであって、
   それにより、糖タンパク質の前記多糖類成分を含む参照材料を取得する、純度を特定すること、その後、
   （ａ６）ＬＣ－ＭＳシステムによって前記参照材料のアリコートを測定することであって、
   それにより、前記較正曲線を確立する、測定すること
   を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. ・ステップ（ａ１）において、前記糖タンパク質の前記特定名は、ウェスタンブロット電気泳動又はＭＳによって特定され、且つ／又は
   ・ステップ（ａ２）において、前記総ＰＳ含有量は、加水分解後、ＩＣ－ＰＡＤによって特定され、且つ／又は
   ・ステップ（ａ３）において、前記遊離ＰＳ含有量は、加水分解並びに結合ＰＳと非結合ＰＳとの分離後、ＩＣ－ＰＡＤによって特定され、且つ／又は
   ・ステップ（ａ４）において、前記修飾の程度、特にＯ－アセチル化の程度は、修飾基のリリース後、特に加水分解によるＯ－アセチル基のリリース後、イオンクロマトグラフィＩＣ－ＣＤによって特定され、且つ／又は
   ・ステップ（ａ５）において、前記糖タンパク質の純度は、ＲＰ－ＨＰＬＣ及び／又はＳＥＣによって特定され、且つ／又は
   ・ステップ（ａ６）において、前記較正曲線は、ＬＣを介して前記アリコートを分離し、イオン化電圧を調整することによって前記ＬＣの溶出液をＭＳ検出器内部でのインソース断片化に付すことによって確立される、請求項７に記載の方法。
9. 前記ステップ（ｂ）は、
   （ｂ１）試料を提供することと、
   （ｂ２）同じＬＣ－ＭＳシステムを用いて（ａ６）と同じパラメータを使用して前記試料を測定することと、
   を含む、請求項７又は８に記載の方法。
10. 前記測定すること（ｂ２）は、前記試料の特定名の特定と、以下：
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量の特定、又は
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定、又は
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量の特定及び試料純度の特定、又は
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに試料純度の特定、又は
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量の特定及び遊離ＰＳ含有量の特定、又は
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに遊離ＰＳ含有量の特定、又は
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに遊離ＰＳ含有量及び遊離アセチル化ＰＳ含有量の特定、
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量の特定並びに前記試料の遊離ＰＳ含有量及び純度の特定、又は
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに前記試料の遊離ＰＳ含有量及び純度の特定、又は
    ・前記糖タンパク質のＰＳ含有量及びアセチル化ＰＳ含有量の特定並びに前記試料の遊離ＰＳ含有量及び遊離アセチル化ＰＳ含有量及び純度の特定
    の１つとを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記ステップ（ｃ）は、
    （ｃ１）前記試料中の各ＰＳの特徴ピークを識別することと、
    （ｃ２）そのようなピークのＡＵＣを前記較正曲線と比較することと、
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 液体クロマトグラフィ－質量分析システム（「ＬＣ－ＭＳシステム」）の液体クロマトグラフィから取得された試料を含む溶出液を前記液体クロマトグラフィ－質量分析システムの質量分光計に注入し、前記試料をインソース断片化に付すことで試料中の糖タンパク質の多糖類成分を分析するＬＣ－ＭＳシステムの使用であって、前記糖タンパク質は、１つの担体タンパク質と、前記担体タンパク質に共有結合した１つ又は複数の多糖類とを含み、
    前記分析することは、
    ・糖タンパク質を前記ＬＣ－ＭＳシステムに注入し、それらをグリカン反復単位を分離するコーン電圧で質量分光計においてインソース断片化に付すことと、
    ・前記糖タンパク質を含む参照材料を用いて前記ＬＣ－ＭＳシステムによって前記多糖類成分の較正曲線を確立することと、
    ・前記多糖類成分を同定することと、
    ・前記多糖類成分を絶対定量することと、
    を含む、使用。
13. 前記糖タンパク質は、前記ＬＣ－ＭＳシステムに前記糖タンパク質を導入する前に、前記多糖類成分を前記担体タンパク質から除去する酵素を用いた酵素消化を受けず、かつ、前記ＬＣ－ＭＳシステムに前記糖タンパク質を導入する前の前記糖タンパク質を化学反応にかけない、請求項１２に記載の使用。
14. 前記ＬＣ－ＭＳシステムは、ＭＳ検出器の前方に切替弁を更に備える、請求項１２又は１３に記載の使用。
15. 前記担体タンパク質は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａ（ＥＰＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フラジェリン（ＦｌｉＣ）、ＣＲＭ１９７、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素の無毒化バリアント、コレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシン、コレラトキシンの無毒化バリアント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＡＴタンパク質のパッセンジャードメイン、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ニューモリシン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰｃｒＶ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜蛋白質（ＯＭＰＣ）、及び分類不能型ヘモフィリスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）からのタンパク質Ｄからなる群から選択され、好ましくは緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の無毒化外毒素Ａであり、且つ／又は
    前記多糖類は１～１００、好ましくは５～２０の反復単位を含み、前記反復単位は非修飾単糖類及び／又は修飾単糖類を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の使用。
16. 前記試料は、
    ・水溶性マトリックスであって、前記マトリックスは任意選択的に、バッファー類、無機塩類、糖アルコール類、及び非イオン性界面活性剤を含む、水溶性マトリックス、
    ・任意選択的に、多糖類を含有しない担体タンパク質、
    ・任意選択的に、担体タンパク質に結合していない多糖類、並びに
    ・任意選択的に、非関連タンパク質
    を更に含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の使用。
17. ・複合糖質の生産におけるインプロセス制御、
    ・生産された複合糖質のリリース制御、
    ・貯蔵された複合糖質の安定性制御、及び／又は
    ・複合糖質の生産におけるプロセス最適化
    のための請求項１２～１６のいずれか一項に記載の使用。
18. 前記コーン電圧が３７Ｖである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記コーン電圧が３７Ｖである、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の使用。