ANÁLISIS DE FLUIDOS DE CROMATOGRAFÍA LIQUIDA
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se encuentra en el campo del análisis de sacáridos . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los in unógenos que comprenden antígenos sacáridos capsulares bacterianos conjugados a proteínas portadoras, son bien conocidos en la técnica. La conjugación convierte los antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, con lo cual se mejoran las respuestas de memoria y se permite que se desarrolle una inmunidad protectora, y la vacuna conjugada prototipo fue para Haemophilus influenzae TIPO B
(Hib) [por ejemplo, ver capítulo 14 de la ref. 1] . Desde la vacuna de Hib, han sido desarrolladas las vacunas de sacárido conjugado para proteger contra Neisseria meningi tidis
(meningococos) y contra Streptococcus pneumoniae
(pneumococos) . Otros organismos donde las vacunas conjugadas son de interés, son Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B) [2], Pseudomonas aeruginosa [3] y Staphylococcus
aureus [4] . Donde son incluidos los sacáridos en vacunas y otros productos biológicos, entonces las autoridades regulatorias requieren en general su caracterización. Una técnica común, utilizada para la caracterización del sacárido es la REFU77891 cromatografía aniónica, y en particular la cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC por sus siglas en ingles) , usualmente con detección amperométrica pulsada (PAD por sus siglas en ingles) [2,3]. Los sistemas HPAEC-PAD adecuados son proporcionados por la Corporación Dionex"11 (Sunnyvale, California) por ejemplo el sistema BioLC? Estos sistemas pueden analizar cuantitativamente sacáridos individuales dentro de mezclas sin la necesidad para la derivatización o la separación pre-análisis, y el análisis de los sacáridos mixtos puede ser utilizado en el perfilamiento de sacáridos . Cuando se analizan sacáridos, el eluído proveniente de una columna HPAEC es típicamente analizado utilizando un detector ampero étrico pulsado (PAD) por ejemplo la detección está basada en la corriente eléctrica. A pH adecuado (alto) , los carbohidratos pueden ser electrocatalíticamente oxidados en la superficie de los electrodos, mediante aplicación de un potencial positivo. La corriente generada de esta manera es proporcional a la concentración de carbohidrato, permitiendo la detección y cuantificación del carbohidrato por amperometría. En comparación con la detección amperométrica simple, la técnica PAD intercala pulsos cortos de un potencial de limpieza y de regeneración con el potencial de detección estándar, con lo cual se evitan dificultades que surgen cuando los productos de oxidación de los analitos incrustan los electrodos. Así como también se usa para el análisis HPAEC, PAD es también utilizado para el análisis por cromatografía de intercambio catiónico HP [4] y otras separaciones de HPLC. Para obtener información analítica adicional, particularmente cuando se tratan compuestos que no se activan amperométricamente y con compuestos químicamente modificados, los inventores decidieron analizar los eluidos por medios espectroscópicos. Desafortunadamente, el alto pH utilizado durante el análisis de HPAEC de los sacáridos capsulares significa que los iones hidróxido están presentes en el eluído, y la alta absorbancia de estos iones (particularmente en la región ultravioleta) significa que la adición del análisis espectroscópico no fue fácil . Los iones hidróxido podrían ser eliminados mediante el uso de un dispositivo supresor químico de miero-membrana, pero esto produjo nuevos problemas, ya que el acetato típicamente utilizado como un "agente de empuje" para eluir los sacáridos capsulares es convertido por el supresor a ácido acético altamente absorbente . Un objetivo de la invención es proporcionar métodos y sistemas adicionales y mejorados para realizar la caracterización por cromatografía aniónica de los sacáridos. En particular, un objetivo es superar las dificultades en el análisis • espectroscópico de los eluidos que surgen de la presencia ya sea de iones hidróxido o, después de la conversión de los iones hidróxido, ácido acético. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Para superar estas dificultades provocadas por el uso de eluyentes basados en hidróxido/acetato, los inventores utilizaron dos procedimientos. Primeramente, ellos eligieron utilizar soportes de intercambio aniónico más débiles que no requieren un agente de empuje de acetato. Tales columnas no son actualmente utilizadas para analizar carbohidratos, sino que son más típicamente utilizadas para resolver un gran número de aniones de ácido inorgánico y orgánico [5] . En segundo lugar, ellos eligieron utilizar agentes de empuje con baja absorbancia espectroscópica. Estos dos procedimientos permitieron que la detección espectroscópica fuera combinada con la detección PAD. Además, ellos fueron también compatibles con los protocolos HPAEC-PAD normales y éstos pueden ser ventajosamente utilizados incluso donde no se desea la detección espectroscópica, particularmente ya que ellos permiten la mejor resolución de oligosacáridos largos. De acuerdo a un primer aspecto de la invención, por lo tanto, la detección amperométrica es acoplada con la detección espectroscópica, tal que son utilizados ambos métodos de detección. De este modo, la invención proporciona un método para analizar el eluido de una columna de cromatografía líquida, en donde el eluido es analizado por a perometría y espectroscopia. La invención también proporciona un aparato para analizar una muestra, en donde el aparato comprende (i) una columna de cromatografía líquida,
(ii) un detector amperométrico, y (iii) un detector espectroscópico, en donde los dos detectores están acomodados para recibir el eluido de la columna. El uso separado de detección por PAD o UV para analizar la salida de las columna de HPAEC, ha sido reportado [6], pero el uso de ambas técnicas amperométricas y espectroscópicas para analizar el mismo eluido, es nuevo. El contenido de información derivable de utilizar ambas clases de detección, excede ventajosamente aquel derivable ya sea de los dos métodos de detección solos, por ejemplo, como se observa en la Figura 1, algunos picos dan un mejor intervalo dinámico en UV que en PACD, y algunos picos son mejores en PAD que en UV. En un segundo aspecto, la invención también proporciona un método para eluir un analito de sacárido capsular a partir de una columna de cromatografía de intercambio aniónico, en donde el analito es eluido utilizando un eluyente que comprende un anión diferente de un acetato o un hidróxido . El eluyente comprende preferentemente un anión seleccionado del grupo que consiste de: un nitrato; un cloruro; un carbonato; y un borato. Las sales de sodio de estos aniones pueden ser convenientemente utilizadas. Este método es particularmente útil cuando el eluyente es básico (por ejemplo pH >9), aún más si un supresor químico de iones hidróxido está siendo utilizado, y proporciona mejor resolución de los oligosacáridos largos. Además, este método es particularmente útil para el análisis de sacáridos acetilados. En un tercer aspecto, la invención también proporciona un método para analizar un sacárido mediante cromatografía de intercambio aniónico, en donde la cromatografía es realizada utilizando una columna que tiene una capacidad de menos de 50 µeq (por ejemplo =40 µeq, <30 µeq, <20 µeq, etc.) . El uso de una columna de baja capacidad significa que la elución es rápida y los agentes de empuje no necesitan ser utilizados. La supresión del hidróxido puede ser de este modo utilizada sin generar ácido acético. Un eluyente de hidróxido libre de acetato será típicamente utilizado, y la evitación de los iones acetato es particularmente útil para el análisis de los sacáridos acetilados. Las columnas de baja capacidad permiten la mejor resolución de los oligosacáridos largos . El segundo y tercer aspectos de la invención pueden ser ventajosamente utilizados conjuntamente, por ejemplo la invención proporciona un método para analizar un analito de sacárido capsular mediante cromatografía de intercambio aniónico, en donde la cromatografía es realizada utilizando una columna que tiene una capacidad de menos de 50 µeq, y en donde la elución de la columna utiliza un eluyente que comprende un ion seleccionado del grupo que consiste de un nitrato y un cloruro. La invención también proporciona el eluido de un método cromatográfico de la invención. La invención proporciona además un producto farmacéutico que comprende como un ingrediente activo una sustancia que ha sido analizada utilizando un método de la invención. En particular, la invención proporciona una composición inmunogénica, tal como una vacuna, que comprende un sacárido capsular bacteriano que ha sido analizado utilizando un método de la invención. La columna, de cromatografía líquida El primer aspecto de la invención es útil para analizar la salida proveniente de una columna de cromatografía líquida. Este aspecto puede ser aplicado a diversas columnas de cromatografía líquida, pero es preferentemente utilizada con la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC por sus siglas en ingles). La invención es particularmente útil para analizar los resultados de la separación mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC) o mediante cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución (HPCEC) . Las columnas preferidas son aquellas que espontáneamente conservan los sacáridos tal que los sacáridos tienen que ser eluidos de la columna. La elución a partir de la columna de cromatografía puede ser una elución isocrática o una elución en gradiente. Los eluyentes que incluyen hidróxido de sodio y/o acetato de sodio son eluyentes típicos utilizados durante el análisis HPAEC-PAD de los sacáridos. En el segundo aspecto de la invención, no obstante, son utilizados los eluyentes de sal de nitrato y/o de cloruro (típicamente sales de sodio) , usualmente de manera sustancial en ausencia de cualquier eluyente de acetato. Para eluir analitos a partir de columnas de intercambio aniónico, entonces el eluyente en general será básico, por ejemplo el pH será >8, >9, >10, >11, >12, >13, etc. Las sales de hidróxido (por ejemplo NaOH) pueden ser utilizadas para alcanzar el pH deseado, y los iones hidróxido son típicos para el uso en los eluyentes de intercambio aniónico. Los eluidos pueden ser sometidos a supresión química de los iones hidróxido, particularmente donde los iones interfieren con una técnica de detección analítica que está siendo utilizada. Un supresor de micromembrana puede ser convenientemente utilizado, tales como los productos MMS de Dionex"11. • El producto "MMS III" utiliza supresión química normal para aumentar las conductividades de los analitos, mientras que disminuye la conductividad del eluyente, y hace posible la detección de la conductividad directa con aplicaciones de intercambio iónico utilizando elución isocrática o en gradiente sobre intervalos de concentración amplios. Los supresores que generan ácido acético a partir de los iones acetato son preferentemente evitados cuando los iones acetato son incluidos en el eluyente, y el ácido acético generado interfiere con una técnica de detección analítica que está siendo utilizada. Las columnas HPAEC preferidas para el uso con el primero y segundo aspectos de la invención son las columnas "CarboPac" comercializadas por Dionex, tal como la columna PAl [sustrato de poliestireno de 10 µm de diámetro 2% reticulado con divinilbenceno, aglomerado con látex funcionalizado con amonio cuaternario MicroBead de 500 nm (5% reticulado)], PA100, PA20, PA10 [sustrato de etilvinilbenceno de 10 µm de diámetro, 55% reticulado con divinilbenceno, aglomerado con el ion amonio cuaternario difuncional MicroBead de 460 nm (5% reticulado)], las columnas PA200 o MAl . Las columnas de HPCEC preferidas son las columnas "ionPac" también comercializadas por Dionex, incluyendo la columna CS10. Como una alternativa al uso de la cromatografía líquida, el primer aspecto de la invención puede ser utilizado para analizar la salida de una separación de electroforesis capilar, por ejemplo, el sistema Beckman-Coulter P/ACE. Para el tercer aspecto de la invención, la columna de intercambio aniónico tiene una capacidad iónica menor de 50 µeq (miliequivalentes de carga) por ejemplo <40 µeq, <30 µeq, <20 µeq, etc. Las columnas HPAEC preferidas son las columnas "IonPac AS" selectivas de hidróxido, comercializadas por Dionex, tal como la columna AS11, con los grupos funcionales de alcanol-amonio cuaternario. Cuando se utiliza en su formato analítico de 2 x 250 mm, la columna AS11 tiene una capacidad de 11 µeq, la cual se incrementa a 45 µeq cuando se utiliza en un formato de 4 x 250 mm. Son preferidas las columnas selectivas de hidróxido, de baja capacidad. Detección amperométrica y espectroscópica El primer aspecto de la invención analiza el eluido de una columna de cromatografía líquida tanto amperométrica como espectroscópicamente. El material que eluye desde una columna puede ser dividido, con una porción que es analizada amperométricamente y otra porción más que es analizada espectroscópicamente. Como una alternativa, el material que eluye desde una columna puede ser analizado en series sin división, ya sea amperométricamente y luego espectroscópicamente, o espectroscópicamente y luego amperométricamente. Estos dos métodos generales diferentes son ilustrados en las Figuras 2 y 3. Donde se utiliza el análisis en serie entonces puede ser preferido realizar la detección espectroscópica antes de la detección amperométrica, particularmente si la detección espectroscópica es no destructiva con relación a la detección amperométrica. La detección amperométrica es preferentemente una detección amperométrica pulsada (PAD) . Pueden ser utilizadas diversas formas de onda en PAD [7], incluyendo cualquiera de aquellas con los perfiles mostrados en la Figura 4. El uso de un potencial negativo para limpiar el electrodo, es preferido. La forma de onda de la Figura 4A utiliza un potencial negativo para la limpieza del electrodo, y mejora la reproducibilidad a largo plazo y reduce el desgaste del electrodo. El electrodo utilizado para la detección amperométrica es preferentemente un electrodo de oro. La detección espectroscópica está frecuentemente basada en la absorción y/o emisión de la radiación electromagnética, preferentemente con una longitud de onda entre 100 nm y 900 nm (por ejemplo, con una longitud de onda en el intervalo de 100 a 200 nm, 150 a 250 nm, 200 a 300 nm, 250 a 350 nm, 300 a 400 nm, 350 a 450 nm, 400 a 500 nm, 450 a 550 nm, 500 a 600 nm, 550 a 650 nm, 600 a 700 nm, 650 a 750 nm, 700 a 800 nm, 750 a 850 nm, 800 a 900 nm) . La longitud de onda de la luz utilizada, puede ser seleccionada de acuerdo al o a los analitos que van a ser detectados. La espectroscopia de adsorción ultravioleta (UV) (por ejemplo a 200 nm) y la espectroscopia de absorción de luz visible son dos métodos particularmente preferidos para el análisis de los sacáridos. Como una alternativa al uso de la detección amperométrica, la invención puede utilizar la detección por conductividad (incluyendo la detección por conductividad suprimida) . Analitos La invención es utilizada para analizar el eluido proveniente de una columna de cromatografía líquida. El eluido resultará de la separación cromatográfica de uno o más analitos en una muestra. La invención es particularmente útil para analizar analitos de sacáridos. Éstos pueden ser polisacáridos (por ejemplo con un grado de polimerización de al menos 10, por ejemplo 20, 30, 40, 50, 60 ó más), los oligosacáridos (por ejemplo con un grado de polimerización de 2 a 10) , o los monosacáridos. Los oligosacáridos y monosacáridos pueden ser el resultado de la despolimerización y/o la hidrólisis de un polisacárido progenitor, por ejemplo el analito puede ser un fragmento que contiene el sacárido de un sacárido más grande. Los analitos de sacárido preferidos son sacáridos bacterianos, y particularmente sacáridos capsulares bacterianos por ejemplo de Neisseria meningi tidis (serogrupos A, B, C, W135 o Y) , Streptococcus pneumoniae (serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, o 23F) , Streptococcus agalactiae (tipos la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII o VIII), Haemophilus influenzae (cepas tipificables : a, b, c, d, e, o f) , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, etc. Otros analitos de sacáridos incluyen glucanos (por ejemplo glucanos de hongos tales como aquellos en Candida albicans) , y sacáridos capsulares fúngicos por ejemplo de la cápsula de Cryptococcus neoformans . La cápsula del serogrupo A de N. meningi tidis es un homopolímero de ?-acetil-D-mannosamina-1-fosfato (al- 6)-enlazado. La cápsula del serogrupo B de N. meningi tidis es un homopolímero de ácidos siálicos (a2->8) -enlazados . El sacárido capsular del serogrupo C de N. meningi tidis es un homopolímero del ácido siálico (a2->9) -enlazado. El sacárido del serogrupo 135 de N. meningi tidis es un polímero que consiste de unidades disacáridas de ácido siálico-galactosa [->4)-D-?eu?5Ac(7/90Ac)-a- (2-»6) -D-Gal-a- (l->] . El sacárido del serogrupo Y de N. meningi tidis es similar al sacárido del serogrupo W135, excepto que la unidad repetitiva del disacárido incluye glucosa en vez de galactosa [- 4)-D-?eup5Ac (7/90Ac) -oc- (2- 6) -D-Glc-a- (l- ] . El sacárido capsular tipo b de H. Influenzae es un polímero de ribosa, ribitol y fosfato ['PRP', (poli-3-ß-D-ribosa-(l,l)-D-ribitol-5-fosfato) ] . Además de ser útil para el análisis de sacáridos capsulares de longitud completa, la invención puede ser utilizada con fragmentos de oligosacáridos de los mismos. Otros antígenos sacáridos preferidos son aquellos escindidos con los glucoconjugados por ejemplo de los antígenos de vacuna conjugados sacarido-proteína. Una de las tres vacunas conjugadas de N. meningi tidis serogrupo C que han sido aprobadas para el uso en humanos, Menjugate^ [8] y Meningitec101 están basadas en oligosacáridos, mientras que ?eisVac-C" utiliza el polisacárido de longitud completa. Otros antígenos sacáridos preferidos son sacáridos eucarióticos, por ejemplo sacáridos fúngicos, sacáridos vegetales, sacáridos humanos (por ejemplo antígenos del cáncer) , etc. Los sacáridos que están cargados (por ejemplo aniónicos) a pH neutro son analitos preferidos. Los analitos de sacárido son múltiples grupos fosfato y/o múltiples grupos carboxilato pueden ser analizados utilizando los métodos de la invención. La invención es de este modo particularmente útil para el análisis de analitos de sacárido polianiónico. Otros analitos preferidos son lipopolisacáridos y lipooligosacáridos . La invención es particularmente útil para el uso con analitos que incluyen diversos sacáridos de diferentes longitudes, por ejemplo diferentes fragmentos del mismo sacárido progenitor. El analito en general será una solución acuosa, y esta solución tendrá un pH alto y una alta concentración salina, como resultado de HPAEC. Los analitos típicos son aquellos que pueden ser detectados mediante técnicas amperométricas y espectroscópicas . Así como contienen uno o varios analitos de interés, las muestras que van a ser analizadas pueden incluir otros materiales. Éstos pueden o no ser retenidos por columna cromatofgráfica, y así pues pueden estar o no presentes en el eluido. Típicamente, tales componentes no se enlazarán a la columna. De este modo, los eluidos analizados por los métodos de la invención incluirán estos analitos o estarán sospechosos de incluirlos. El analito puede ser un producto que va a ser probado antes de la liberación (por ejemplo durante la fabricación o prueba de control de calidad) , o puede ser un producto que va a ser probado después de la liberación (por ejemplo para evaluar la estabilidad, la vida en anaquel, etc . ) . Pasos adicionales Antes de analizar el eluido a partir de una columna de cromatografía líquida, el método de la invención puede involucrar la adición de una muestra que contiene analito (o sospechosa de contener un analito) a la columna. De este modo, la invención proporciona un método para detectar la presencia de un analito en una muestra, que comprende los pasos de: (a) aplicar la muestra a una columna de cromatografía líquida tal que el analito en la muestra es retenido por la columna; (b) eluir el analito de la columna; y (c) analizar el eluido como se describe anteriormente. Para el análisis de sacáridos, puede ser deseado filtrar al menos algunos compuestos no analitos a partir de la muestra, antes de entrar a la columna, y Dionex*1 produce trampas y protecciones pre-columna, para este propósito, por ejemplo, una trampa de amino para eliminar aminoácidos, una trampa de borato, etc. Después de la elución y el análisis, la invención puede incluir el paso adicional de determinar una característica de un analito detectado por ejemplo su DP
(típicamente un DP promedio) , su peso molecular, su pureza, etc. Después de los detectores amperométricos y espectroscópicos, el eluido puede ser acoplado en un espectrómetro de masa por ejemplo FAB/MS o ESI/MS. Uso de la invención para seleccionar sacáridos deseados La invención es particularmente útil antes de la conjugación en una etapa en donde es necesario asegurar que las cadenas sacáridas de tamaño correcto sean seleccionadas para la producción del conjugado. La invención permite el progreso de la fragmentación de un polisacárido de longitud completa antes de que sea verificada o monitorizada la conjugación. Donde los oligosacáridos de una longitud particular (o intervalo de longitudes) son deseados, entonces es importante que la fragmentación del polisacárido no deba ser tan extensa como para tomar la despolimerización más allá del punto deseado (por ejemplo, en el extremo, para dar monosacáridos) . La invención permite que el progreso de esta despolimerización parcial sea monitorizado, mediante la medición de la longitud promedio de la cadena, sobre el tiempo. De este modo, la invención proporciona un proceso para analizar el o los sacáridos en una composición, que comprende los pasos de: (a) iniciar la despolimerización del o de los sacáridos en la composición; y, en uno o más puntos después de esto, (b) analizar el o los sacáridos como se describe en la presente. En una corrida inicial de experimentos será entonces usual analizar en varios puntos de tiempo, con el fin de determinar el progreso sobre el tiempo, pero después de que han sido establecidas las condiciones estándares entonces es usual analizar en un punto de tiempo establecido para fines confirmatorios. Una vez que ha sido alcanzado el punto final deseado, entonces el proceso puede comprender el paso adicional de: (c) detener la despolimerización, por ejemplo, mediante lavado, separación, enfriamiento, etc. El proceso puede también comprender el paso adicional de conjugación del sacárido despolimerizado a una proteína portadora, después de la activación química opcional . La invención también permite la selección de cadenas oligosacáridas de una longitud deseada después de la fragmentación. De este modo, la invención proporciona un proceso para seleccionar sacáridos para el uso en la preparación de un glucoconjugado, que comprende los pasos de: (a) obtener una composición que comprende una mezcla de diferentes fragmentos de polisacáridos; (b) separar la mezcla en sub-mezclas; (c) analizar un ao más sub-mezclas utilizando un proceso como se describe en la presente; y (d) utilizar los resultados del paso (c) para seleccionar una o más submezclas para el uso en la conjugación. El proceso puede involucrar la fragmentación del polisacárido antes del paso (a) o puede iniciar con una mezcla ya preparada. Los fragmentos pueden ser fragmentos del mismo polisacárido, por ejemplo, del mismo serogrupo. Después del paso (d) , el proceso puede comprender el paso de conjugación a una proteína portadora, después de la activación química opcional . Antes de la conjugación, es usual que un sacárido sea químicamente activado con el fin de introducir un grupo funcional que pueda reaccionar con el portador. Las condiciones para la activación del sacárido pueden provocar hidrólisis, y así pues es útil para analizar un sacárido después de la activación. El término "sacárido" donde sea apropiado, debe ser considerado para incluir estos sacáridos activados. Además, la invención proporciona un proceso para preparar un sacárido activado para el uso en la preparación de un glucoconjugado, que comprende los pasos de: (a) obtener un sacárido; (b) activar químicamente el sacárido para introducir un grupo funcional que pueda reaccionar con una proteína portadora; y (c) analizar el producto del paso (b) como se describió anteriormente. El proceso puede incluir el paso adicional de: (d) hacer reaccionar el sacárido activado con la proteína portadora (que puede por sí misma ser activada) para dar el glucoconjugado. El proceso puede involucrar la fragmentación de un polisacárido antes del paso (a) o puede iniciar con una mezcla ya preparada. La invención puede ser también utilizada después de la conjugación. Después de la conjugación, las composiciones pueden ser analizadas utilizando la invención de tres maneras: primeramente, los sacáridos totales en una composición pueden ser medidos, por ejemplo antes del mezclado de los diferentes conjugados, o antes de la liberación de una vacuna (para fines regulatorios del control de calidad) ; en segundo lugar, el sacárido no conjugado libre en una composición puede ser medido por ejemplo para verificar la conjugación incompleta, o para seguir la hidrólisis del conjugado por monitoreo del incremento del sacárido libre sobre el tiempo; en tercer lugar, el sacárido conjugado en una composición puede ser medido, por las mismas razones. La primera y tercera formas requieren que el sacárido sea liberado del conjugado antes del análisis. Para evaluar separadamente los sacáridos conjugados y no conjugados, éstos deben ser separados. El sacárido libre (por ejemplo no conjugado) en una composición acuosa puede ser separado del sacárido conjugado en varias formas . La reacción de conjugación cambia varios parámetros químicos y físicos para el sacárido, y las diferencias pueden ser explotadas para la separación. Por ejemplo, la separación por tamaño puede ser utilizada para separar el sacárido libre y conjugado, ya que el material conjugado tiene una masa mayor debido a la proteína portadora. La ultrafiltración es un método de separación por tamaño preferido. Como una alternativa adicional, si los conjugados han sido adsorbidos a un adyuvante, entonces la centrifugación separará el conjugado adsorbido (pella) del sacárido libre (sobrenadante) que se desorbe después de la hidrólisis. La invención proporciona un método para analizar un glucoconjugado, que comprende los pasos de: (a) tratar el glucoconjugado para liberar el sacárido del portador; y (b) analizar el sacárido liberado como se describe en la presente. La invención proporciona un método para analizar una composición de glucoconjugado, que comprende los pasos de: (a) separar el sacárido no conjugado en la composición del sacárido conjugado; y (b) analizar el sacárido no conjugado y/o conjugado como se describe anteriormente. La invención también proporciona un método para liberar una vacuna para el uso por los médicos, que comprende los pasos de: (a) fabricar una vacuna, que incluye un paso de análisis como se describe en la presente; y, si los resultados del paso (a) indican que la vacuna es aceptable para el uso clínico, (b) se libera la vacuna para el uso por los médicos. El paso (a) puede ser realizado sobre una vacuna envasada, sobre una vacuna a granel antes del envasado, sobre sacáridos antes de la conjugación, etc. La invención también proporciona un lote de vacunas, en donde una vacuna dentro del lote ha sido analizada utilizando un método de la invención. General El término "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste" por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y. La palabra "sustancialmente" no excluye
"completamente", por ejemplo, una composición que está
"sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x, significa, por ejemplo, x ± 10%. Los métodos de la invención pueden ser utilizados para propósitos analíticos y/o preparativos. Las referencias a "analizar", "análisis", etc. no deben ser consideradas como excluyentes de los métodos preparativos. El grado de polimerización (DP) de un sacárido es definido como el número de unidades repetidas en ese sacárido. Para un homopolímero, el SP es de este modo el mismo que el número de unidades monosacáridas . Para un heteropolímero, no obstante, el SP es el número de unidades monosacáridas en la cadena completa, divido entre el número de unidades monosacáridas en la unidad repetida mínima, por ejemplo el DP de (Glc-Gal)?o es 10 en vez de 20 y DP de (Glc-Gal-Neu) ?0 es 10 en vez de 30. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el resultado de una HPAEC analizada en serie por medios amperométricos (perfil superior) y por espectroscopia de UV20onm (perfil inferior) . Las unidades de medición en el perfil superior son nC; el perfil superior utiliza unidades arbitrarias. La Figura 2 muestra un arreglo en serie para las detecciones amperométricas y espectroscópicas, mientras que. La Figura 3 muestra un arreglo paralelo. La Figura 4 muestra tres formas de onda de PAD. El eje x muestra el tiempo en segundos. El eje y muestra el potencial en voltios con relación a un electrodo de referencia Ag/AgCl. Las tres formas de onda tienen un periodo de retraso (primera barra) , un periodo de detección (segunda barra) , y luego un periodo de limpieza.
La Figura 5 muestra el análisis del eluyente a partir de una columna PAl, detectada por PAD (trazo inferior) o por UV (trazo superior) . La Figura 6 muestra el análisis del eluido a partir de una columna de PAl de una muestra del serogrupo A almacenada bajo diferentes condiciones. El programa de elución fue el mismo que para la Figura 19. Las Figuras 7 y 8 muestran el análisis del eluido de los sacáridos del serogrupo W135 sobre una columna PA100 utilizando diferentes eluyentes. La Figura 9 muestra la elución del mismo analito sobre una columna PAl, y la Figura 10 muestra el mismo analito sobre una columna PA200. La Figura 11 muestra el análisis del eluido de los oligosacáridos Hib sobre una columna PA100. La Figura 12 muestra el análisis de eluido de un combinado del sacárido Hib hidrolizado sobre una columna ASll. La Figura 13 muestra el análisis del eluido de un polisacárido del serogrupo A sobre una columna AS11. El mismo análisis después de la hidrólisis del sacárido es mostrado en la Figura 14. La Figura 15 muestra la espectrometría de masa
MALDI-TOF de un estándar del serogrupo C, y la Figura 16 muestra el análisis del eluido del mismo estándar sobre una columna PAl. El estándar fue también analizado por una columna Asll, como se muestra en la Figura 17. La Figura 18 muestra el análisis de un polisacárido hidrolizado del serogrupo C sobre una columna AS11. La Figura 19 muestra el perfil de elución del agua, medido a 214 nm utilizando un eluyente de acetato/hidróxido y nitrato/h'idróxido sobre una columna PAl, con supresión de micromembrana . El programa de elución fue el mismo que para la Figura 6. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Detección de ultravioleta de la salida de HPAEC El alto pH utilizado durante el análisis HPAEC de los sacáridos capsulares, significa que los iones hidróxido están presentes en el eluido, pero estos iones tienen alta absorbancia en la región de ultravioleta. Como se muestra en la Figura 19, el uso de un eluyente estándar de acetato/hidróxido solo con agua sobre una columna CarboPac PAl da un perfil de elución en la región de UV que oscurecerá cualesquiera analitos de interés. Con el fin de agregar detección de UV al análisis de los eluyentes de HPAEC, se requirió por lo tanto una estrategia diferente. Análisis combinado de PAD y UV del eluyente de HPAEC El sacárido capsular de meningococos del serogrupo A fue sometido a despolimerización, para dar un combinado de los sacáridos cargados (fosfato, a partir de los monómeros de manosamina-1-fosfato) de longitud mixta (DP alto) . En vez de utilizar una columna PAl para la separación por HPAEC, la mezcla se separó sobre una columna Dionex IonPac AS11 con la protección sugerida por el fabricante, utilizando un gradiente de hidróxido de sodio como el eluyente (velocidad de flujo 1.0 ml/minuto) . El eluido proveniente de la columna HAPEC fue analizado en serie mediante detectores electroquímicos (PAD, electrodo de oro) y de UV. La salida proveniente de la detección amperométrica integrada se muestra en el perfil superior de la Figura 1, y la salida proveniente de la detección de UV-visible (a 200 nm) está en el perfil inferior. La columna ASll tiene una baja capacidad (11 µeq) .
El mismo analito fue aplicado a una columna Dionex CarboPac
PAl de alta capacidad (100 µeq) , y se utilizó cloruro de sodio como el agente de empuje en el eluyente. Como se muestra en la Figura 5, el eluyente proveniente de la columna PAl no pudo ser detectado por PAD (trazo inferior) pero fue detectable por UV (trazo superior) . La detección por UV permite por lo tanto que sean utilizadas columnas AEC de baja capacidad para el análisis de los sacáridos capsulares . Comparación de los eluyentes de nitrato y acetato Un combinado de fragmentos oligosacáridos del sacárido capsular de meningococos del serogrupo W135 fue analizado por HPAEC-PAD convencional, utilizando una columna CarboPac PA100 con una elución en gradiente utilizando acetato de sodio con hidróxido de sodio 100 mM. Los resultados se muestran en la Figura 7. Para fines de comparación, se realizó el mismo análisis pero con nitrato de sodio en el eluyente en lugar de acetato de sodio. Como se muestra en la Figura 8, el intervalo dinámico de la salida fue mucho mayor, y la resolución de los fragmentos de alto DP fue mejor. Los fragmentos DP50 pudieron ser detectados. El cambio a una columna CarboPac PAl incrementó el intervalo dinámico aún más (Figura 9) y los fragmentos DP40 pudieron ser detectados. Con una columna PA200 de 5 µm, pudieron ser observados fragmentos DP80 (Figura 10) . Las sales de nitrato son por lo tanto útiles para eluir los sacáridos capsulares de diferentes longitudes a partir de las columnas de intercambio aniónico. Eluyente de nitrato para la detección de DP sobre el tiempo El componente sacárido de las vacunas conjugadas puede ser sometido a hidrólisis gradual, y esto conduce a una reducción en el DP sobre el tiempo, y a una menor cantidad de sacárido enlazado a la proteína portadora. La despolimerización de los sacáridos meningocócicos del serogrupo a bajo diferentes condiciones de pH fue monitorizada por HPAEC-PAD utilizando una columna CarboPac PAl. El eluyente fue una mezcla de acetato de sodio y nitrato de sodio en hidróxido de sodio 100 mM, con una velocidad de flujo de 1.0 ml/minuto.
Se utilizaron tres diferentes condiciones de almacenamiento: (1) pH aproximadamente 9 a 37°C por 4 días;
(2) pH aproximadamente 4 a 37 °C por 4 días; y (3) pH aproximadamente 7 a -20°C por ejemplo condiciones de almacenamiento recomendadas . Como se muestra en la Figura 6, la adición de nitrato al eluyente permite el PAD para el eluido, y los fragmentos de bajo DP pueden ser detectados después de la despolimerización. Los fragmentos cortos son visibles para el material almacenado a 37°C en posiciones donde no son observados picos para el material almacenado por debajo de cero (línea superior) . Análisis de H. Influenzae con baja capacidad de columna Un combinado de oligosacáridos Hib (DP 2 a 6) fue analizado mediante HPAEC-PAD convencional sobre una columna CarboPac PA100. El eluyente fue un gradiente de acetato de sodio de 30 mM a 100 mM con hidróxido de sodio 100 mM, en 24 minutos a una velocidad de flujo de 0.8 ml /minuto. Los resultados están en la Figura 11. Únicamente los oligómeros de cadena corta eluidos a partir de CarboPac PA-100, y la elución requirieron un alto porcentaje de acetato de sodio como un agente de empuje. Incluso entonces, los oligómeros DP5 y DP6 fueron pobremente resueltos y con baja sensibilidad. La columna CarboPac PA-100 es de este modo no adecuada para el perfilamiento de un combinado de oligosacáridos Hib con DP>4. En consecuencia, fue investigada una columna cromatográfica diferente. Una columna IonPac AS11 fue utilizada para analizar un combinado de sacárido Hib hidrolizado con un DP promedio de 12.44. Esta columna tiene una alta selectividad por el hidróxido, permitiendo de este modo la elución de aniones altamente cargados a menores concentraciones de hidróxido que las que son previamente utilizadas para los polianiones fuertemente retenidos (por ejemplo los fragmentos Hib) . El eluyente fue hidróxido de sodio 3 mM a 150 M en 15 minutos. Los resultados están en la Figura 12, mostrando nuevamente que las columnas de baja capacidad pueden ser utilizadas para analizar los sacáridos capsulares bacterianos. La elución fue muy rápida y necesitó únicamente un gradiente de hidróxido. Todos los componentes provenientes del combinado de Hib pudieron ser resueltos en una corrida cromatográfica que duró menos de 10 minutos. Sacárido de meningococo del serogrupo A con baja capacidad de columna La columna IonPac Asll fue utilizada para analizar la distribución de peso molecular del polisacárido capsular meningocócico del serogrupo A. La Figura 13 muestra un cromatograma obtenido para una muestra del polisacárido con un DP de aproximadamente 200, utilizando un gradiente de hidróxido de 10 a 150 mM en 19 minutos. Sorprendentemente, la columna fue capaz de separar este polianión de alto peso molecular, y la eficiencia de la columna es tan alta que el analito eluyó solo en 17 minutos en un pico relativamente angosto. Este resultado es muy superior a los métodos tales como la cromatografía de permeación en gel . La misma columna fue utilizada para perfilar los oligosacáridos obtenidos después de la hidrólisis acida del polisacárido. Como se muestra en la Figura 14, los oligosacáridos de DP cada vez mayor pudieron ser resueltos, con una correlación entre DP y el tiempo de retención sobre
HPAEC-PAD. Sacárido de meningococos del serogrupo C con columna de baja capacidad El polisacárido del serogrupo C es un homopolímero de los ácidos N-acetil-neuramínicos a-2 , 9-enlazados, que están parcialmente O-acetilados . Éste es así un anión de policarboxilato. El patrón cromatográfico del sacárido del serogrupo C es complicado por la presencia de los grupos O-acetilo, ya que cada oligómero da origen a un número de picos, dependiendo de la distribución de los grupos acetilo en la estructura. Un estándar de DP5 purificado fue analizado mediante espectrometría de masa MALDI-TOF, y se observó que contenía una distribución de múltiples oligómeros diferentes (Figura 15) . El análisis del mismo estándar con HPAEC-PAD sobre una columna CarboPac PAl se muestra en la Figura 16. La elución a partir de la columna requirió condiciones fuertes (acetato de sodio 500 mM, hidróxido de sodio 100 mM) , y las diferencias entre las Figuras 15 y 16 muestran que este tratamiento con acetato altera la distribución natural de los grupos acetilo en el sacárido. El uso de columnas AEC fuertes de alta capacidad para analizar los sacáridos acetilados, es por lo tanto no óptimo . Una columna IonPac Asll acoplada con detección de conductividad suprimida fue por lo tanto utilizada. Como se muestra en la Figura 17, utilizando un gradiente de hidróxido de sodio de 10 mM a 60 mM (sin acetato) fue posible eluir el estándar de DP5 con un perfil que muestra los diferentes oligosacáridos y la distribución de los grupos O-acetilo. La interpretación del patrón cromatográfico es mucho más simple que para el patrón MALDI-TOF, que es complicado por la presencia de diferentes cantidades de sodio como ion contrario, que tiene un peso molecular igual a la mitad del peso del grupo acetilo. El patrón de elución observado para el estándar de
DP5 fue también observado repetido a diferentes longitudes para el producto de hidrólisis del polisacárido capsular (Figura 18) . Se entenderá que la invención ha sido descrita a manera de ejemplo únicamente, y pueden ser realizadas modificaciones mientras que se permanezca dentro del alcance y espíritu de la invención. REFERENCIAS (los contenidos de las cuales se incorporan por referencia en la presente) [1] Vaccines (eds. Plotkin et al.) 4a edición, ISBN: 0721696880. [2] Ardí et al. (1988) Anal Biochem 170: 54-62. [3] Wang et al. (1990) Anal Biochem 190: 182-187. [4] Mellor et al. (2000) Anal Biochem 284: 136-142. [5] Product Manual por IonPacm AS column. Dionex"11 documento 034791, revisión 08. [6] Gert-Jan et al. (2002) J Biol Chem 277. 25929-25936. [7] LaCourse & Johnson (1993) Anal Biochem 65: 50-55. [8] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2 : 47-49. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención