JP7814932B2 - 化学修飾されたＲＮＡｉコンストラクト及びその使用 - Google Patents

化学修飾されたＲＮＡｉコンストラクト及びその使用

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年１２月１０日出願の米国仮特許出願第６２／７７７，６７７号の利益を主張する。
電子提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年１２月９日に作成されたコンピュータ読み取り可能フォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ－２３２７－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５であり、サイズが２４．７キロバイトである。
本発明は、インビボで標的遺伝子の発現を低減するための化学修飾されたＲＮＡｉコンストラクトに関する。具体的には、本発明は、インビボでＲＮＡｉコンストラクトの改善された効力及び安定性を付与する修飾ヌクレオチドの特異的パターンに関する。こうしたＲＮＡｉコンストラクトは、治療目的で標的遺伝子の発現を阻害するのに有用である。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ほぼ全ての門で見出される転写後遺伝子サイレンシング機構であり、進化的に保存された細胞防御機構であると考えられている（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９１；８０６－８１１，１９９８；Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１５： ３５８－３６３，１９９９；及びＨａｍｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８６，９５０－９５２，１９９９）。生理学的には、ＲＮＡｉの機構は、ダイサー酵素によって媒介される、より長い非コードＲＮＡに由来する１８～２５の塩基対の二重鎖の生成により開始される。これらの短いＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に入れられ、ここでセンス鎖又はパッセンジャー鎖が廃棄されて、アンチセンス鎖又はガイド鎖が完全に又は部分的に相補的なｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｒｅｖ．ＲＮＡ，Ｖｏｌ．７：６３７－６６０，２０１６）。続いてＡｇｏ２媒介分解又は翻訳抑制を介してｍＲＮＡのサイレンシングが誘導される（Ｂｏｂｂｉｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，Ｖｏｌ．５６：１０３－１２２，２０１６）。
ＲＮＡｉ技術及び送達方法の進歩により、ＲＮＡｉベース治療の肯定的な結果が増え続けている。こうした治療は、特に、小分子又は生物学的モダリティによって「創薬不可能（ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」であると見なされてきた標的に対する有望な療法のクラスを表す。化学修飾の開発及び改善された送達方法により、天然ＲＮＡの固有の代謝不安定性を克服するために大きな進歩がなされてきたが、当技術分野において、治療目的の投与に好適な改善されたインビボ効力及び安定性を備えるＲＮＡｉ剤に対する必要性が依然として存在する。
Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９１；８０６－８１１，１９９８ Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１５：３５８－３６３，１９９９ Ｈａｍｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８６，９５０－９５２，１９９９ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｒｅｖ．ＲＮＡ，Ｖｏｌ．７：６３７－６６０，２０１６ Ｂｏｂｂｉｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，Ｖｏｌ．５６：１０３－１２２，２０１６
本発明は、一部には、インビボでコンストラクトの遺伝子サイレンシング活性の効力及び／又は期間を改善するＲＮＡｉコンストラクトのための化学修飾パターンの設計に基づく。本明細書で説明される修飾パターンは、異なる配列及び標的を有する様々なＲＮＡｉコンストラクトに広く適用され得る。ＲＮＡｉコンストラクトは、例えば治療目的で、インビボで標的遺伝子の発現を阻害するのに有用である。
したがって、本発明は、標的遺伝子配列の発現を阻害するＲＮＡｉコンストラクトを提供し、ここでＲＮＡｉコンストラクトはセンス鎖及びアンチセンス鎖を備え、アンチセンス鎖は、標的遺伝子配列に相補的な配列を備え、センス鎖は、二重鎖領域を形成するのに十分にアンチセンス鎖の配列に相補的な配列を備え、ＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載される式のうちの１つによって表される構造を備える。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載されるようにＰ１～Ｐ３０として指定されるパターンのうちの１つから選択される化学修飾パターンを有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ａ）によって表される構造を備える：
５’－（ＮＡ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＭＮＬＮＭＮＬＮＴ（ｎ）ｙ－３’
３’－（ＮＢ）ｚＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＭＮＬＮＭＮＬＮＬＮＦＮＭＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬ－５’
（Ａ）
式（Ａ）においては、５’から３’への方向で列記される上鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）はセンス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）はアンチセンス鎖であり、各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、各ＮＬは、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表す。ｘが１、２、３、又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上が独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｘは０～４の整数であり得る。ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上は、アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり得る。ｙが１、２、３、又は４であるとき、１つ以上のｎヌクレオチドが、アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しない修飾又は非修飾のオーバーハングヌクレオチドであることを条件に、ｙは０～４の整数であり得る。ｚが１、２、３、又は４であるとき、ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上が、独立して２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｚは０～４の整数であり得る。ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上は、センス鎖中に存在するときＮＡヌクレオチドに相補的であり得、又はセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しないオーバーハングヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、長さが１９～２３ヌクレオチドのセンス鎖と、長さが１９～２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、を備え、アンチセンスストランド及びセンス鎖の配列は、１９～２１塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的であり、アンチセンス鎖中の２、７、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の８～１１、及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも、それぞれ７を超える合計２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有しない。ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端のうちの一方又は両方にヌクレオチドオーバーハングを有し得る。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
本発明のその他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ｄ）によって表される構造を備える：
５’－（ＮＡ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＭＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＴ（ｎ）ｙ－３’
３’－（ＮＢ）ｚＮＬＮＬＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬＮＭＮＬＮＬＮＭＮＭＮＭＮＭＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬ－５’
（Ｄ）
式（Ｄ）においては、５’から３’への方向で列記される上鎖はセンス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖はアンチセンス鎖であり、各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、各ＮＬは、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表す。ｘが１、２、３、又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上が独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｘは０～４の整数であり得る。ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上は、アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり得る。ｙが１、２、３、又は４であるとき、１つ以上のｎヌクレオチドが、アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しない修飾又は非修飾のオーバーハングヌクレオチドであることを条件に、ｙは０～４の整数であり得る。ｚが１、２、３、又は４であるとき、ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上が、独立して２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｚは０～４の整数であり得る。ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上は、センス鎖中に存在するときＮＡヌクレオチドに相補的であり得、又はセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しないオーバーハングヌクレオチドであり得る。
本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、長さが１９～２３ヌクレオチドのセンス鎖と、長さが１９～２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、を備え、アンチセンスストランド及びセンス鎖の配列は、１９～２１塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的であり、アンチセンス鎖中の２、１４、及び１６位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の１０～１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも、それぞれ７を超える合計２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有しない。ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有し得る。或いは、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端の両方にヌクレオチドオーバーハングを有し得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、修飾されたヌクレオチド間又はヌクレオシド間結合などの少なくとも１つの骨格修飾を含み得る。ある種の実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’又は５’末端に配置され得る。
ＲＮＡｉコンストラクトは、肝臓細胞などの特定の組織又は細胞へのＲＮＡｉコンストラクトの送達又は取り込みを促進するリガンドを更に含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、肝細胞へのＲＮＡｉコンストラクトの送達を標的とする。これら及び他の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン又はＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含み得る。ある種の実施形態では、リガンドは、三価又は四価のガラクトース又はＧａｌＮＡｃ部分などの多価ガラクトース又は多価ＧａｌＮＡｃ部分を含む。リガンドは、任意選択的にリンカーを介してＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’又は３’末端に共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載の式Ｉ～ＩＸのいずれかの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式ＶＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式ＶＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式ＩＸの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。
本発明は、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクト、及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のいずれかを含む医薬組成物も提供する。こうした医薬組成物は、特に対象中の標的遺伝子産物の過剰発現が病理学的表現型を伴う場合に、対象の細胞（例えば肝臓細胞）中の標的遺伝子の発現を低減又は阻害するのに特に有用である。
本発明は、細胞、組織、又は対象中の標的遺伝子の発現を低減又は阻害するための方法を含む。一実施形態では、方法は、細胞又は組織を、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトのうちのいずれか１つと接触させることを含む。細胞又は組織はインビトロ又はインビボであり得る。別の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトのうちのいずれか１つを対象に投与することを含む。ＲＮＡｉコンストラクトは、非経口で（例えば静脈内又は皮下で）対象に投与され得る。
ＲＮＡｉコンストラクトの化学修飾パターンのいくつかの代表的な実施形態を示す。概略図のそれぞれにおいて、上鎖は５’から３’への方向におけるセンス鎖を表し、下鎖は３’から５’への方向におけるアンチセンス鎖を表す。無地の黒色円は２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを表し、縞模様の円は２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを表し、白色の円は逆位脱塩基ヌクレオチド（ｉｎｖＡｂ）又は逆位デオキシリボヌクレオチド（ｉｎｖｄＮ）を表す。円を接続する淡灰色の線はホスホジエステル結合を表し、円を接続する黒色の線はホスホロチオエート結合を表す。黒色の四角形は、ＲＮＡｉコンストラクト内の推定されるＡｇｏ２切断部位を意味する。 ヒトＰＮＰＬＡ３変異体をコードするＡＡＶを注射され、Ｐ１～ＣＭ１化学修飾パターンを有する示されるＲＮＡｉコンストラクトの５ｍｇ／ｋｇ皮下注射で処置された、マウス肝臓中のヒトＰＮＰＬＡ３変異体の発現レベルの棒グラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３発現はｑＰＣＲによって測定されており、ビヒクル処置動物と比較した発現レベルとして報告する。発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクト投与後８日目において示す。 ヒトＰＮＰＬＡ３変異体をコードするＡＡＶを注射され、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、又はＰ４化学修飾パターンを有する示されるＲＮＡｉコンストラクトの５ｍｇ／ｋｇ皮下注射で処置された、マウス肝臓中のヒトＰＮＰＬＡ３変異体の発現レベルの棒グラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３発現はｑＰＣＲによって測定されており、ビヒクル処置動物と比較した発現レベルとして報告する。発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクト投与後１５日目において示す。 ビヒクル、又はＰ９化学修飾パターンを有する示されるＲＮＡｉコンストラクトの皮下注射を１ｍｇ／ｋｇ（図４Ａ）若しくは３ｍｇ／ｋｇ（図４Ｂ）の用量で受けたマウス中の全光束（光子／秒）対ＲＮＡｉコンストラクト注射後の週数を示す線グラフである。全光束は、マウスによって発現される、ＲＮＡｉコンストラクトの配列に相補的な配列を含むルシフェラーゼレポーターからの信号を表す。全光束の低減は、ルシフェラーゼレポーターの発現の低減を示す。 ヒトＰＮＰＬＡ３変異体をコードするＡＡＶを注射され、Ｐ９（二重鎖番号７３１８及び８７０９）、ＣＭ２（二重鎖番号８１０３）、ＣＭ３（二重鎖番号８１０４）、又はＣＭ４（二重鎖番号８１０５）化学修飾パターンを有する示されるＲＮＡｉコンストラクトの３ｍｇ／ｋｇ皮下注射で処置された、マウス肝臓中のヒトＰＮＰＬＡ３変異体の発現レベルの棒グラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３発現はｑＰＣＲによって測定されており、ビヒクル処置動物と比較した発現レベルとして報告する。発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクト投与後２８日目において示す。 示されるＡＳＧＲ１ ＲＮＡｉコンストラクトの５ｍｇ／ｋｇ皮下注射で処置されたマウス肝臓中のマウスＡＳＧＲ１発現レベルの棒グラフである。マウスＡＳＧＲ１発現はｑＰＣＲによって測定されており、Ｇａｐｄｈ発現レベルによって正規化された発現レベルとして報告する。発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクト又は緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）投与後４日目、８日目、及び１５日目におけるものを示す。 示されるＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトの０．５ｍｇ／ｋｇ皮下注射を投与された二重トランスジェニックマウス中の、ベースラインと比較した血清Ｌｐ（ａ）レベルのパーセント変化を示す線グラフである。両方のＲＮＡｉコンストラクトが同じ配列を有し、化学修飾のパターンのみが異なっていた：二重鎖番号３６３２はＣＭ１修飾パターンを有し、二重鎖番号３６３５はＰ１修飾パターンを有した。Ｌｐ（ａ）血清レベルのパーセント変化は、ＲＮＡｉコンストラクトの単一の皮下注射後１４日目（Ｄ１４）及び２８日目（Ｄ２８）におけるものを示す。
本発明は、一部には、様々な配列及び標的にわたりインビボで標的遺伝子発現の効力及び持続性のあるノックダウンをもたらすＲＮＡｉコンストラクトのための化学修飾パターンの設計に基づく。本明細書で説明される化学修飾されたＲＮＡｉコンストラクトは、代替的な化学修飾パターンを有する従来記載されているＲＮＡｉ治療剤と比較して、インビボでの遺伝子サイレンシング活性における改善された効力及び／又は持続期間を有することが示されている。本発明の修飾ＲＮＡｉコンストラクトは、例えば、様々な病状を治療又は改善するための、インビボでの標的遺伝子発現の阻害に有用である。したがって、本発明は、標的遺伝子配列の発現を阻害するＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
本明細書で使用するとき、用語「ＲＮＡｉコンストラクト」は、細胞に導入されるとＲＮＡ干渉機構を介して標的遺伝子の発現を下方制御することができるＲＮＡ分子を含む薬剤を指す。ＲＮＡ干渉は、核酸分子が、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、配列特異的な様式で標的ＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子）の切断及び分解を誘導するプロセスである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するのに十分に互いに十分に相補的な、連続したヌクレオチドの２本の逆平行鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子を含む。「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には、２つのポリヌクレオチドにおける相補的な塩基間の水素結合（例えば、ワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した相補的なポリヌクレオチドの対合を指す。標的配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）と実質的に相補的な配列を有する領域を含む鎖は、「アンチセンス鎖」と称される。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的配列と実質的に同一の配列を有する領域を含み得る。
二本鎖ＲＮＡ分子は、本明細書に記載のもの又は当技術分野で知られるものなど、リボース糖、塩基又はリボヌクレオチドの骨格構成要素に対する修飾を含む、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）で使用されるような任意のそのような修飾は、本開示の目的のための用語「二本鎖ＲＮＡ」によって包含される。
本明細書で使用する場合、生理的条件などのある種の条件下において、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖領域を形成することができる場合、第１の配列は、第２の配列に「相補的」である。他のそのような条件は、当業者に知られる中程度の又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むことができる。第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドとミスマッチすることなく１つ又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成する場合、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。配列が少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％標的配列と相補的である場合、配列は、標的配列と「実質的に相補的」である。相補性パーセントは、第２の配列又は標的配列の対応する位置の塩基と相補的な第１の配列の塩基の数を第１の配列の全体長で割ることによって計算することができる。２つの配列がハイブリダイズするとき、３０塩基対の二重鎖領域にわたって５、４、３又は２個以下のミスマッチが存在する場合、配列は他方の配列に対して実質的に相補的であると言われ得る。一般に、本明細書に定義される任意のヌクレオチドオーバーハングが存在する場合、このようなオーバーハングの配列は、２つの配列間の相補性の程度の決定において考慮されない。例として、ハイブリダイズして、各鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９塩基対二重鎖領域を形成する、２１ヌクレオチド長のセンス鎖及び２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖は、この用語が本明細書に使用される場合、完全に相補的であるとみなされる。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の領域は、標的遺伝子配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）の領域と完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と完全に相補的な配列を含み得る。他のこうした実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と実質的に相補的な配列、例えばセンス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域に１、２、３、４又は５個のミスマッチを有する配列を含み得る。ある種の実施形態では、任意のミスマッチが末端領域内（例えば、鎖の５’及び／又は３’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド以内）に生じることが好ましい。一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域における任意のミスマッチは、アンチセンス鎖の５’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド以内に生じる。
ある種の実施形態では、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、この領域を除いて繋がっていない２つの別々の分子であり得る。２つの別々の鎖から形成されるこうした二本鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と称される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトはｓｉＲＮＡを含む。
他の実施形態では、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の一部であってもよく、すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一ＲＮＡ分子の自己相補的領域の一部である。そのような場合、単一ＲＮＡ分子は、二重鎖領域（ステム領域とも称される）及びループ領域を含む。センス鎖の３’末端は、ループ領域を形成することになる不対ヌクレオチドの隣接配列によってアンチセンス鎖の５’末端に結合される。アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対形成して二重鎖又はステム領域を形成することができるように、ループ領域は、通常、ＲＮＡ分子がそれ自体で折り返すことを可能にする十分な長さのものである。ループ領域は、約３～約２５、約５～約１５又は約８～約１２個の不対ヌクレオチドを含むことができる。少なくとも部分的に自己相補的な領域を有するこのようなＲＮＡ分子は、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）と称される。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈＲＮＡを含む。単一の少なくとも部分的に自己相補的なＲＮＡ分子の長さは、約４０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチド、又は約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドであり得、本明細書に列記される長さをそれぞれ有する二重鎖領域及びループ領域を含み得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、標的遺伝子配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含む。標的遺伝子配列とは、一般的には、ポリペプチドの部分的又は完全なコード配列を含む核酸配列を指す。標的遺伝子配列は、５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）などの非コード領域も含み得る。ある種の実施形態では、標的遺伝子配列はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列である。ｍＲＮＡ配列は、任意の種（例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒト）に由来するタンパク質、タンパク質変異体、又はアイソフォームをコードするスプライス変異体を含む任意のメッセンジャーＲＮＡ配列を指す。一実施形態では、標的遺伝子配列は、ヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列である。標的遺伝子配列はまた、ｔＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡ配列、又はウイルスＲＮＡ配列などの、ｍＲＮＡ配列以外のＲＮＡ配列であってもよい。
ＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖の領域は、標的遺伝子配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと実質的に相補的又は完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖が相補性の領域を含む遺伝子配列の標的領域は、約１５～約３０個の連続したヌクレオチド、約１６～約２８個の連続したヌクレオチド、約１８～約２６個の連続したヌクレオチド、約１７～約２４個の連続したヌクレオチド、約１９～約３０個の連続したヌクレオチド、約１９～約２５個の連続したヌクレオチド、約１９～約２３個の連続したヌクレオチド、又は約１９～約２１個の連続したヌクレオチドの範囲であり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、通常、２本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するようにアンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン－クリック塩基対合又は他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対形成して、２つのポリヌクレオチド間で二重鎖を生成する２つの相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチドの領域を指す。ＲＮＡｉコンストラクトの二重鎖領域は、例えば、ダイサー酵素及び／又はＲＩＳＣ複合体が結合することにより、ＲＮＡｉコンストラクトがＲＮＡ干渉経路に入ることを可能にする十分な長さのものであるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、約１５～約３０塩基対長である。この範囲内の二重鎖領域の他の長さ、例えば約１５～約２８塩基対、約１５～約２６塩基対、約１５～約２４塩基対、約１５～約２２塩基対、約１７～約２８塩基対、約１７～約２６塩基対、約１７～約２４塩基対、約１７～約２３塩基対、約１７～約２１塩基対、約１９～約２５塩基対、約１９～約２３塩基対、又は約１９～約２１塩基対も好適である。一実施形態では、二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である。ある種の実施形態では、二重鎖領域は、約１９塩基対長である。他の実施形態では、二重鎖領域は、約２１塩基対長である。
センス鎖及びアンチセンス鎖が２種の別々の分子である（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含む）実施形態の場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同じ長さである必要はない。例えば、一方又は両方の鎖は、二重鎖領域よりも長く、二重鎖領域に隣接する１個以上の不対ヌクレオチド又はミスマッチを有してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」は、鎖の末端における不対ヌクレオチド又は二重鎖領域を越えて延在するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは、通常、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延在する場合、又は一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、１～６ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、又は２～４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１、２、３、４、５又は６ヌクレオチドを含む。特定の一実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１～４ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、２ヌクレオチドを含む。ある種の他の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、単一のヌクレオチドを含む。
オーバーハング中のヌクレオチドは、本明細書に記載されるリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、２’－修飾ヌクレオチド（例えば２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）、デオキシリボヌクレオチド、逆位ヌクレオチド（例えば逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド）、又はこれらの組み合わせである。例えば、一実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンである。別の実施形態では、オーバーハング中のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－ウリジン－ウリジン－３’（５’－ＵＵ－３’）ジヌクレオチドを含む。こうした実施形態では、ＵＵジヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド、例えば２’－修飾ヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－デオキシチミジン－デオキシチミジン－３’（５’－ｄＴｄＴ－３’）ジヌクレオチドを含む。ヌクレオチドオーバーハングがアンチセンス鎖中に存在する場合、オーバーハング中のヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的である場合もあり、標的遺伝子配列とミスマッチを形成する場合もあり、又は何らかの他の配列を含む場合もある（例えばポリピリミジン又はポリプリン配列、例えばＵＵ、ＴＴ、ＡＡ、ＧＧなど）。
ヌクレオチドオーバーハングは、一方又は両方の鎖の５’末端又は３’末端に存在することができる。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、もう一方の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、分子の末端においてセンス鎖及びアンチセンス鎖が完全に塩基対形成しており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドが存在しないことを意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の両端に平滑末端を含む。こうした実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、二重鎖領域は、センス鎖及びアンチセンス鎖と同じ長さである（すなわち、分子は、その全長にわたって二本鎖である）。
本発明のＲＮＡｉコンストラクト中のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、約１５～約３０ヌクレオチド長、約１９～約３０ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１９～約２７ヌクレオチド長、約１９～約２５ヌクレオチド長、約１９～約２３ヌクレオチド長、約１９～約２１ヌクレオチド長、約２１～約２５ヌクレオチド長、又は約２１～約２３ヌクレオチド長であり得る。ある種の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが２つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有するが、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）１９塩基対長である二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、その長さ全体にわたって二重鎖領域を形成する。このような一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２１塩基対長である二重鎖領域を含む。別のこのような実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長であるセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２３塩基対長である二重鎖領域を含む。
他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトが少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むように、センス鎖又はアンチセンス鎖は、他方の鎖よりも長く、この２つの鎖は、短い方の鎖の長さに等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）１９ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２１ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２１ヌクレオチド長であるセンス鎖、（ｉｉ）２３ヌクレオチド長であるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、好ましくは修飾ヌクレオチドを含む。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環又はホスフェート基に対する１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用するとき、修飾ヌクレオチドは、アデノシンモノホスフェート、グアノシンモノホスフェート、ウリジンモノホスフェート、及びシチジンモノホスフェートを含有するリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子の一方又は両方の鎖への修飾ヌクレオチドの組み込みは、例えば、ヌクレアーゼ及び他の分解プロセスに対する分子の感受性を低下させることにより、ＲＮＡ分子のインビボ安定性を向上させることができる。ＲＮＡｉコンストラクトが標的遺伝子の発現を低減させる効力は、修飾ヌクレオチドを組み込むことによっても強化することができる（特に、本明細書でより詳細に説明される特異的パターンで組み込まれた場合）。
ある種の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。このような糖修飾としては、ペントース環の２’及び／又は５’位における修飾、並びに二環式糖修飾が挙げられ得る。２’－修飾ヌクレオチドは、ＯＨ以外の置換基を２’位に備えるペントース環を有するヌクレオチドを指す。こうした２’－修飾としては、２’－Ｈ（例えばデオキシリボヌクレオチド）、２’－Ｏ－アルキル（例えば、Ｏ－Ｃ１－Ｃ１０又はＯ－Ｃ１－Ｃ１０置換アルキル）、２’－Ｏ－アリル（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ又は２’－フルオロとも称される）、２’－Ｏ－メチル（ＯＣＨ３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（Ｏ－（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’－ＯＣＦ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－アミノ（例えば、ＮＨ２）、２’－Ｏ－エチルアミン、及び２’－アジドが挙げられるがこれらに限定されない。ペントース環の５’位置における修飾としては、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、５’－ビニル、及び５’－メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
「二環式糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋が環の２つの原子を接続して、二環式糖構造をもたらす第２の環を形成する。いくつかの実施形態では、二環式糖修飾は、ペントース環の４’及び２’炭素間の架橋を含む。二環式糖修飾を備える糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書で二環式核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環式糖修飾としては、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）二環式核酸（ＢＮＡ）；β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ（ロック核酸又はＬＮＡとも称される）；エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束エチル（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ）又はｃＥｔとも称される）；メチレン－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ；メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ２）３－２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ＭＯＥ）又はｃＭＯＥとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込まれ得るこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、それら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。ある種の実施形態では、センス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。ある種の他の実施形態では、センス鎖中の全てのヌクレオチド及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。これら及び他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせであり得る。
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方又は両方の鎖に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基（本明細書では「塩基」とも称される）の修飾を有する。「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成又は天然の修飾であってもよく、これとしては、ユニバーサル塩基、５ーメチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン（Ｘ）、ヒポキサンチン（Ｉ）、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、修飾塩基は、ユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、結果として生じる二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、ＲＮＡ及びＤＮＡの天然の塩基の全てと無差別に塩基対を形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基は、当業者に知られており、イノシン、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル及び他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミド並びに３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール及び６－ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含むが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる他の好適な修飾塩基としては、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１０：２９７－３１０，２０００、及びＰｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７６：７２９５－７３００，２０１１に記載されているものが挙げられ、これらの文献はどちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシルは、上述の修飾核酸塩基などの他の核酸塩基により、こうした置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変えることなく置換され得ることを当業者は十分に認識している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、１つ以上の脱塩基ヌクレオチドを含み得る。「脱塩基ヌクレオチド」又は「脱塩基ヌクレオシド」は、リボース糖の１’位で核酸塩基を欠いているヌクレオチド又はヌクレオシドである。ある種の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の末端に組み込まれる。一実施形態では、センス鎖は、その３’末端、その５’末端、又はその３’末端及び５’末端の両方で末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、その３’末端、その５’末端、又はその３’末端及び５’末端の両方で末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。脱塩基ヌクレオチドが末端ヌクレオチドであるこうした実施形態では、これは逆位ヌクレオチドであり得、つまり、これは、天然の３’－５’ヌクレオチド間結合ではなく、３’－３’ヌクレオチド間結合（鎖の３’末端上にある場合）を介して、又は５’－５’ヌクレオチド間結合（鎖の５’末端上にある場合）を介して、隣接するヌクレオチドと結合する。脱塩基ヌクレオチドはまた、上記に記載される糖修飾のうちのいずれかなどの糖修飾を含み得る。ある種の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、又は２’－Ｈ（デオキシ）修飾などの２’－修飾を含む。一実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を含む。別の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは２’－Ｈ修飾を含む（すなわち、デオキシ脱塩基ヌクレオチド）。
本発明者らは、修飾ヌクレオチドを特定のパターンに従ってＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことにより、改善されたインビボ遺伝子サイレンシング活性を備えたＲＮＡｉコンストラクトがもたらされることを発見した。例えば、一実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１５塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的な配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、
・アンチセンス鎖中の２、７、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
・アンチセンス鎖中の８～１１、及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
・センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも、それぞれ７を超える合計２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有しない。
他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１９塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的な配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、
・アンチセンス鎖中の２、７、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、４、６、１０、及び１２位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、任意選択的に２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の他の全てのヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド以外の修飾ヌクレオチドであり、
・アンチセンス鎖中の８～１１、及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の３及び５位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、任意選択的に２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、センス鎖中の他の全てのヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド以外の修飾ヌクレオチドである。
こうした実施形態では、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド以外の修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択され得る。これら及びその他の実施形態では、センス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方における末端ヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであり得る。こうした実施形態では、脱塩基ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドは逆位であり得、すなわち、天然の３’－５’ヌクレオチド間結合ではなく、３’－３’ヌクレオチド間結合（鎖の３’末端上にある場合）を介して、又は５’－５’ヌクレオチド間結合（鎖の５’末端上にある場合）を介して、隣接するヌクレオチドと結合し得る。
上記の実施形態のうちいずれにおいても、アンチセンス鎖中の２、７、１２、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の２、４、７、１２、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。なお他の実施形態では、アンチセンス鎖中の２、４、６、７、１２、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。更に他の実施形態では、アンチセンス鎖中の２、４、６、７、１０、１２、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。代替的な実施形態では、アンチセンス鎖中の２、７、１０、１２、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ある種の他の実施形態では、アンチセンス鎖中の２、４、７、１０、１２、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。
上記の実施形態のいずれにおいても、アンチセンス鎖中の３、８～１１、及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖中の５、８～１１、及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の３、５、８～１１、及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。
本発明のある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトはセンス鎖及びアンチセンス鎖を備え、アンチセンス鎖は、標的遺伝子配列に相補的な配列を備え、センス鎖は、二重鎖領域を形成するのに十分にアンチセンス鎖の配列に相補的な配列を備え、ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ａ）によって表される構造を備え：
５’－（ＮＡ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＭＮＬＮＭＮＬＮＴ（ｎ）ｙ－３’
３’－（ＮＢ）ｚＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＭＮＬＮＭＮＬＮＬＮＦＮＭＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬ－５’
（Ａ）
式中、
５’から３’への方向で列記される上鎖はセンス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖はアンチセンス鎖であり、
各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、
各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
各ＮＬは、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
ｘが１、２、３、又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上が独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｘは０～４の整数であり、ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上は、アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり得、
ｙが１、２、３、又は４であるとき、１つ以上のｎヌクレオチドが、アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しない修飾又は非修飾のオーバーハングヌクレオチドであることを条件に、ｙは０～４の整数であり、
ｚが１、２、３、又は４であるとき、ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上が、独立して２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｚは０～４の整数であり、ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上は、センス鎖中に存在するときＮＡヌクレオチドに相補的であり得、又はセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しないオーバーハングヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ａ）によって表される構造を備えるいくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングが存在する（すなわち、ｙは、１、２、３、又は４である）。１つのこうした実施形態において、ｙは２である。センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングが存在する（すなわち、ｙが２である）実施形態では、ｘは０であり且つｚは２であるか、或いはｘは１であり且つｚは２である。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ａ）によって表される構造を備える他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を備える（すなわち、ｙは０である）。センス鎖の３’末端にヌクレオチドのオーバーハングが存在しない（すなわち、ｙが０である）こうした実施形態では、（ｉ）ｘは２であり、且つｚは４であるか、（ｉｉ）ｘは３であり、且つｚは４であるか、（ｉｉｉ）ｘは０であり、且つｚは２であるか、（ｉｖ）ｘは１であり、且つｚは２であるか、或いは（ｖ）ｘは２であり、且つｚは２である。ｘが０超である実施形態のいずれにおいても、センス鎖の５’末端の末端ヌクレオチドであるＮＡヌクレオチドは、逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドなどの逆位ヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ａ）によって表される構造を備えるある種の実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６、及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。なお他の実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６、１０、及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ａ）によって表される構造を備える代替的な実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて１０及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。関連する実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、１０、及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ａ）によって表される構造を備える他の代替的な実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６、及び１０位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて１２位のＮＭは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ａ）によって表される構造を備えるいくつかの実施形態では、センス鎖中の各ＮＭは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。他の実施形態では、センス鎖中の各ＮＭは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ａ）によって表される構造を備える更に他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ａ）によって表される構造を備える上記の実施形態のいずれにおいても、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。これらの実施形態、及び上記の実施形態のいずれにおいても、式（Ａ）中のＮＴは、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、又は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。
本発明のある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトはセンス鎖及びアンチセンス鎖を備え、アンチセンス鎖は、標的遺伝子配列に相補的な配列を備え、センス鎖は、二重鎖領域を形成するのに十分にアンチセンス鎖の配列に相補的な配列を備え、ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ｂ）によって表される構造を備え：
５’－（ＮＡ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＴ（ｎ）ｙ－３’
３’－（ＮＢ）ｚＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＦＮＬＮＦＮＬＮＦＮＬ－５’
（Ｂ）
式中、
５’から３’への方向で列記される上鎖はセンス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖はアンチセンス鎖であり、
各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、
各ＮＬは、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
ｘが１、２、３、又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上が独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｘは０～４の整数であり、ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上は、アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり得、
ｙが１、２、３、又は４であるとき、１つ以上のｎヌクレオチドが、アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しない修飾又は非修飾のオーバーハングヌクレオチドであることを条件に、ｙは０～４の整数であり、
ｚが１、２、３、又は４であるとき、ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上が、独立して２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｚは０～４の整数であり、ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上は、センス鎖中に存在するときＮＡヌクレオチドに相補的であり得、又はセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しないオーバーハングヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｂ）によって表される構造を備えるいくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングが存在する（すなわち、ｙは、１、２、３、又は４である）。１つのこうした実施形態において、ｙは２である。センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングが存在する（すなわち、ｙが２である）実施形態では、ｘは０であり且つｚは２であるか、或いはｘは１であり且つｚは２である。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｂ）によって表される構造を備える他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を備える（すなわち、ｙは０である）。センス鎖の３’末端にヌクレオチドのオーバーハングが存在しない（すなわち、ｙが０である）こうした実施形態では、（ｉ）ｘは２であり、且つｚは４であるか、（ｉｉ）ｘは３であり、且つｚは４であるか、（ｉｉｉ）ｘは０であり、且つｚは２であるか、（ｉｖ）ｘは１であり、且つｚは２であるか、或いは（ｖ）ｘは２であり、且つｚは２である。ｘが０超である実施形態のいずれにおいても、センス鎖の５’末端の末端ヌクレオチドであるＮＡヌクレオチドは、逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドなどの逆位ヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｂ）によって表される構造を備える上記の実施形態のいずれにおいても、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。こうした実施形態、及び上記の実施形態のいずれにおいても、式（Ｂ）中のＮＴは、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、又は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。
本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトはセンス鎖及びアンチセンス鎖を備え、アンチセンス鎖は、標的遺伝子配列に相補的な配列を備え、センス鎖は、二重鎖領域を形成するのに十分にアンチセンス鎖の配列に相補的な配列を備え、ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ｃ）によって表される構造を備え：
５’－（Ａｂ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＭＮＬＮＭＮＬＮＴ－３’
３’－ＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬ－５’
（Ｃ）
式中、
５’から３’への方向で列記される上鎖はセンス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖はアンチセンス鎖であり、
各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、
各ＮＬは、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
ｘは０又は１であり、Ａｂは逆位脱塩基ヌクレオチドである。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｃ）によって表される構造を備えるある種の実施形態では、アンチセンス鎖中のＮＭは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。これら及び他の実施形態において、センス鎖中の各ＮＭは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。代替的な実施形態では、センス鎖中の各ＮＭは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｃ）によって表される構造を備えるいくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｃ）によって表される構造を備える上記の実施形態のいずれにおいても、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。これらの実施形態、及び上記の実施形態のいずれにおいても、式（Ｃ）中のＮＴは、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、又は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、一実施形態では、ＮＴは逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドであり、ｘは０である。別の実施形態では、ＮＴは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、ｘは１である。なお別の実施形態では、ＮＴは逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドであり、ｘは１である。
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトはセンス鎖及びアンチセンス鎖を備え、アンチセンス鎖は、標的遺伝子配列に相補的な配列を備え、センス鎖は、二重鎖領域を形成するのに十分にアンチセンス鎖の配列に相補的な配列を備え、ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ｄ）によって表される構造を備え：
５’－（ＮＡ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＭＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＴ（ｎ）ｙ－３’
３’－（ＮＢ）ｚＮＬＮＬＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬＮＭＮＬＮＬＮＭＮＭＮＭＮＭＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬ－５’
（Ｄ）
式中、
５’から３’への方向で列記される上鎖はセンス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖はアンチセンス鎖であり、
各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、
各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
各ＮＬは、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
ｘが１、２、３、又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上が独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｘは０～４の整数であり、ＮＡヌクレオチドのうち１つ以上は、アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり得、
ｙが１、２、３、又は４であるとき、１つ以上のｎヌクレオチドが、アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しない修飾又は非修飾のオーバーハングヌクレオチドであることを条件に、ｙは０～４の整数であり、
ｚが１、２、３、又は４であるとき、ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上が、独立して２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであることを条件に、ｚは０～４の整数であり、ＮＢヌクレオチドのうち１つ以上は、センス鎖中に存在するときＮＡヌクレオチドに相補的であり得、又はセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しないオーバーハングヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｄ）によって表される構造を備えるいくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングが存在する（すなわち、ｙは、１、２、３、又は４である）。１つのこうした実施形態において、ｙは２である。センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングが存在する（すなわち、ｙが２である）実施形態では、ｘは０であり且つｚは２であるか、或いはｘは１であり且つｚは２である。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｄ）によって表される構造を備える他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を備える（すなわち、ｙは０である）。センス鎖の３’末端にヌクレオチドのオーバーハングが存在しない（すなわち、ｙが０である）こうした実施形態では、（ｉ）ｘは２であり、且つｚは４であるか、（ｉｉ）ｘは３であり、且つｚは４であるか、（ｉｉｉ）ｘは０であり、且つｚは２であるか、（ｉｖ）ｘは１であり、且つｚは２であるか、或いは（ｖ）ｘは２であり、且つｚは２である。ｘが０超である実施形態のいずれにおいても、センス鎖の５’末端の末端ヌクレオチドであるＮＡヌクレオチドは、逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドなどの逆位ヌクレオチドであり得る。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｄ）によって表される構造を備えるある種の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、８、９、及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。その他の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から数えて４及び６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７～９位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。更に他の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、８、９、及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｄ）によって表される構造を備える代替的な実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６、８、９、及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて７及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｄ）によって表される構造を備えるある種の他の実施形態では、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて７、８、９、及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の５’末端から数えて４、６、及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｄ）によって表される構造を備えるこれら及び他の実施形態では、センス鎖中のＮＭは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。代替的な実施形態では、センス鎖中のＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである。
ＲＮＡｉコンストラクトが式（Ｄ）によって表される構造を備える上記の実施形態のいずれにおいても、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。これらの実施形態、及び上記の実施形態のいずれにおいても、式（Ｄ）中のＮＴは、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、又は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり得る。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾されたヌクレオチド間結合も含み得る。本明細書で使用する場合、用語「修飾されたヌクレオチド間結合」は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート（例えば、メチルホスホナート、３’－アルキレンホスホナート）、ホスフィナート、ホスホロアミダート（例えば、３’－アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、２’－５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態では、修飾されたヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であり、従って、修飾されたヌクレオシド間結合と呼ばれ得る。こうしたリン非含有結合としては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；スルフィド、スルホキシド及びスルホン結合；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）及びメチレンヒドラジノ結合；スルホン酸及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、修飾されたヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書に記載されているものなど、ペプチド核酸又はＰＮＡを生成させるためのペプチドに基づく結合（例えばアミノエチルグリシン）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクト中に採用され得る他の好適な修飾されたヌクレオチド間及びヌクレオシド間結合は、全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されている。
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖に存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。更に他の実施形態では、両方の鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’末端に約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む（すなわち、アンチセンス鎖の３’末端の第１及び第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合）。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。更に別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む（すなわちアンチセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及びセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートヌクレオチド間結合）。なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一方又は両方の鎖が１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかにおいて、鎖内の残りのヌクレオチド間結合は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。
ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング中の不対ヌクレオチドの２つ以上は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合され得る。ある種の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。他の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の５’末端のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。更に他の実施形態では、任意のヌクレオチドオーバーハングにおける全ての不対ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって結合される。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、図１に示される化学修飾パターンＰ１～Ｐ３０のうちのいずれか１つを有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、長さが１９～２３ヌクレオチドのセンス鎖と、長さが１９～２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、を備え、アンチセンスストランド及びセンス鎖の配列は、１９～２１塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的であり、アンチセンス鎖中の２、７、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の８～１１、及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも、それぞれ７を超える合計２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有さず、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有する。
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６、８、及び１３～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングを有する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２２ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド、８及び１０～１３位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに２～７、９、及び１４～２２位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０位及び２１位のヌクレオチド間、並びに２１及び２２位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の３’末端に１～２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、を有する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６、８、及び１３～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１０、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８、９、１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングを有する。
なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６、８、及び１３～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１０、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８、９、１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングを有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６、８、及び１３～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングを有する。
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、長さが１９～２１ヌクレオチドのセンス鎖と、長さが２１～２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、を備え、アンチセンスストランド及びセンス鎖の配列は、１９～２１塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的であり、アンチセンス鎖中の２、７、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の８～１１、及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも、それぞれ７を超える合計２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有さず、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、アンチセンス鎖の５’末端／センス鎖の３’末端に平滑末端を有する。
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９及び１１～１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、及び１５～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８～１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２２ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド、１０及び１２～１５位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに２～９、１１、及び１６～２２位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２１位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２１及び２２位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８～１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に１～２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９及び１１～１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８～１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
更に別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２２ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１～２２位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド、１０及び１２～１５位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに２～９、１１、及び１６～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２１及び２２位のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８～１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に１～２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６、８、及び１３～１９位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１７位及び１８位のヌクレオチド間、並びに１８及び１９位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６、８、及び１３～１８位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに１９位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１７位及び１８位のヌクレオチド間、並びに１８及び１９位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９及び１１～１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、及び１５～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２２ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド、１０及び１２～１５位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに２～９、１１、及び１６～２２位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０位及び２１位のヌクレオチド間、並びに２１及び２２位のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に１～２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
更に別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９及び１１～１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、及び１５～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、６、８～１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９、１１～１４、１７、及び１９位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、１５、１６、１８、及び２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、６、８～１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６、８、及び１３～１８位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに１９位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１８位及び１９位のヌクレオチド間、並びに任意選択的に１７及び１８位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９及び１１～１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、及び１５～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、７、１０、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、８、９、１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９及び１１～１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、及び１５～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１０、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８、９、１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９、１１～１４、１７、及び１９位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、１５、１６、１８、及び２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１０、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８、９、１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９及び１１～１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、及び１５～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、７、１０、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、６、８、９、１１、１３、及び１５～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、長さが１９～２３ヌクレオチドのセンス鎖と、長さが１９～２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、を備え、アンチセンスストランド及びセンス鎖の配列は、１９～２１塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的であり、アンチセンス鎖中の２、１４、及び１６位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の１０～１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも、それぞれ７を超える合計２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有しない。こうした実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、アンチセンス鎖の５’末端／センス鎖の３’末端に平滑末端を有する。代替的な実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端の両方にヌクレオチドオーバーハングを有する。
特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６、８、及び１３～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、８、９、１４、及び１６位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、７、１０～１３、１５、及び１７～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６、８、及び１３～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１４、及び１６位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１３、１５、及び１７～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７及び９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、６、及び１３～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、１４、及び１６位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、７～１３、１５、及び１７～２３位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、２１位及び２２位のヌクレオチド間、並びに２２位及び２３位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）５及び７～１０位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～４、６、及び１１～１８位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに１９位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１８及び１９位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、４、６、８、９、１４、及び１６位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３、５、７、１０～１３、１５、及び１７～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２０ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド、８～１１位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに２～７、及び１２～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１８位及び１９位のヌクレオチド間、並びに１９及び２０位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１４、及び１６位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１３、１５、及び１７～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に１～２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端と、を有する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２２ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド、８～１１位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに２～７、及び１２～２２位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０位及び２１位のヌクレオチド間、並びに２１及び２２位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１４、及び１６位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１３、１５、及び１７～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の３’末端に１～２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、を有する。
本発明のある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、長さが１９～２３ヌクレオチドのセンス鎖と、長さが１９～２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、を備え、アンチセンスストランド及びセンス鎖の配列は、１９～２１塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的であり、アンチセンス鎖中の２、７、１２、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の１０～１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも、それぞれ７を超える合計２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有さず、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有する。
例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）７～１０位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～６及び１１～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、を有する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２２ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド、８～１１位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに２～７、及び１２～２２位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０位及び２１位のヌクレオチド間、並びに２１及び２２位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端に２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、アンチセンス鎖の３’末端に１～２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングと、を有する。
本発明のある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、長さが１９～２１ヌクレオチドのセンス鎖と、長さが１９～２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、を備え、アンチセンスストランド及びセンス鎖の配列は、１９～２１塩基対の二重鎖領域を形成するのに十分に互いに相補的であり、アンチセンス鎖中の２、７、１２、及び１４位（５’末端から数えて）のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中の１０、１１、及び１３位（５’末端から数えて）と対をなす位置のセンス鎖中のヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれも、それぞれ７を超える合計２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有しない。こうした一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９及び１１～１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８、１０、及び１５～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは２つの平滑末端を有する。
別のこうした実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、
（ａ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）９～１２位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１～８及び１３～２０位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、並びに２１位に逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）２０及び２１位（５’末端から数えて）のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するセンス鎖と、
（ｂ）
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）２、７、１２、及び１４位に２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、並びに１、３～６、８～１１、１３、及び１５～２１位に２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド（５’末端から数えて）、並びに、
（ｉｉｉ）１位及び２位のヌクレオチド間、２位及び３位のヌクレオチド間、１９位及び２０位のヌクレオチド間、並びに２０位及び２１位のヌクレオチド間（５’末端から数えて）にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するアンチセンス鎖と、を含み、
ＲＮＡｉコンストラクトは２つの平滑末端を有する。
本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方の５’末端は、ホスフェート部分を含む。本明細書で使用する場合、用語「ホスフェート部分」は、非修飾ホスフェート（－Ｏ－Ｐ＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨ）及び修飾ホスフェートを含む末端ホスフェート基を指す。修飾ホスフェートは、Ｏ及びＯＨ基の１つ以上がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）又はアルキルで置換されており、ＲがＨ、アミノ保護基又は非置換若しくは置換アルキルであるホスフェートを含む。例示的なホスフェート部分は、５’－モノホスフェート；５’－ジホスフェート；５’－トリホスフェート；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化若しくは非メチル化）；５’－アデノシンキャップ又は任意の他の修飾若しくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造；５’－モノチオホスフェート（ホスホロチオエート）；５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート）；５’－α－チオトリホスフェート；５’－γ－チオトリホスフェート；５’－ホスホロアミダート；５’－ビニルホスフェート；５’－アルキルホスホナート（例えば、アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）；及び５’－アルキルエーテルホスホナート（例えば、アルキルエーテル＝メトキシメチル、エトキシメチルなど）を含むが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載の２つ以上の化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖への修飾及び核酸塩基への修飾を有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾（例えば、２’－フルオロ又は２’－Ｏ－メチル）を含み得、修飾塩基（例えば、５－メチルシトシン又はプソイドウラシル）を含み得る。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれたとき、修飾されたヌクレオチド間又はヌクレオシド間結合を生成するであろう、５’ホスフェートへの修飾と組み合わされた糖修飾を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾又は二環式糖修飾及び５’ホスホロチオエート基などの糖修飾を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方又は両方の鎖は、２’修飾ヌクレオチド又はＢＮＡ及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の鎖は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクト中のアンチセンス鎖の５’末端から数えて１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、又はｄＴを含み得る。いくつかの実施形態では、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’末端から最初の３つの塩基対のうちの少なくとも１つはＡＵ塩基対である。特定の一実施形態では、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’末端から１つ目の塩基対はＡＵ塩基対である。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、当技術分野で知られる手法、例えば従来の核酸固相合成を使用して容易に作製することができる。ＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチドは、標準のヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えば、ホスホラミダイト）を利用する好適な核酸合成装置上で構築することができる。自動核酸合成装置はいくつかのベンダーによって市販されており、これとしては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）のＭｅｒＭａｄｅ合成装置、及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置が挙げられる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトを合成するための例示的な方法を実施例１で説明する。
リボヌクレオシドの５’位で酸解離性ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）とともに２’シリル保護基を使用して、ホスホラミダイト化学を介してオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。合成は全て、大規模、中規模又は小規模で何らかの自動又は手動合成装置において行われ得る。合成は、複数のウェルプレート、カラム又はスライドガラスにおいても実行され得る。
２’－Ｏ－シリル基は、フッ化物イオンへの曝露を介して除去することができ、フッ化物イオンは、フッ化物イオンの任意の供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム又は有機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムを含むことができる。クラウンエーテル触媒は、脱保護反応において無機フッ化物と組み合わせて利用され得る。好ましいフッ素イオン供給源は、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミノヒドロフルオリド（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミドにおいてトリエチルアミンと水性ＨＦを組み合わせる）である。
亜リン酸トリエステル及びホスホトリエステルに対して使用するための保護基の選択により、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変えることができる。ホスホトリエステル又は亜リン酸トリエステルのメチル保護は、フッ化物イオンに対する結合を安定化し、プロセス収率を向上させることができる。
リボヌクレオシドは、反応性の２’ヒドロキシル置換基を有するため、ＲＮＡにおける反応性の２’位を、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基、例えば酸処理に対して安定であるもので保護することが望ましい場合がある。シリル保護基は、この条件を満たし、最小のＲＮＡ分解をもたらし得る最終のフッ化物脱保護工程において容易に除去することができる。
テトラゾール触媒は、標準的なホスホラミダイトカップリング反応において使用することができる。好ましい触媒は、例えば、テトラゾール、Ｓ－エチル－テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、ｐ－ニトロフェニルテトラゾールを含む。
当業者によって理解され得るように、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトを合成するさらなる方法は、当業者に明らかである。加えて、様々な合成工程を代替の順番又は順序で実施して、所望の化合物を得てもよい。本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトの合成において有用な他の合成化学転換、保護基（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのための）及び保護基の手法（保護及び脱保護）は、当技術分野で知られており、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）並びにそれらの後続版に記載のものなどを含む。ＲＮＡｉ薬剤のカスタム合成も、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むいくつかの民間のベンダーから入手可能である。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リガンドを含み得る。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、別の化合物又は分子と直接的又は間接的に相互作用することができる任意の化合物又は分子を指す。別の化合物又は分子とリガンドとの相互作用は、生物学的応答を誘発し得るか（例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体媒介性のエンドサイトーシスを誘導する）、又はまさに物理的会合であり得る。リガンドは、結合する二本鎖ＲＮＡ分子の１つ以上の特性、例えばＲＮＡ分子の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞内取り込み、電荷及び／又はクリアランス特性を修飾することができる。
リガンドは、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン）、コレステロール部分、ビタミン（ビオチン、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２）、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸（例えば、コール酸）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン若しくはヒアルロン酸）、グリコシド、リン脂質又は抗体若しくはその結合断片（例えば、肝臓などの特定の細胞型に対するＲＮＡｉコンストラクトを標的化する抗体若しくは結合断片）を含み得る。リガンドの他の例は、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばアダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン）、ペプチド（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ポリアミノ酸及びポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン）を含む。
ある種の実施形態では、リガンドは、エンドソーム不安定化特性を有する。エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム不安定化リガンドは、ｐＨ依存性膜活性及び膜融合性を示すポリカチオンペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態では、エンドソーム不安定化リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型コンフォメーションをとる。「活性型」コンフォメーションは、エンドソーム不安定化リガンドが、エンドソームの溶解及び／又は本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進するコンフォメーションである。例示的なエンドソーム不安定化リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６：２９６４－２９７２，１９８７）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１８：１５８１－１５８６，１９９６）、及びこれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１５５９：５６－６８，２００２）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム不安定化構成要素は、ｐＨの変化に応答して電荷又はプロトン化に変化を起こすことになる化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム不安定化構成要素は、直鎖状又は分枝状であり得る。
いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質又は他の疎水性分子を含む。一実施形態では、リガンドは、コレステロール部分又は他のステロイドを含む。コレステロールコンジュゲート型オリゴヌクレオチドは、それらの非コンジュゲート型の対応物よりも活性であると報告されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２：１０３－２２８，２００２）。核酸分子へのコンジュゲーションのためのコレステロール部分及び他の脂質を含むリガンドは、米国特許第７，８５１，６１５号明細書；同第７，７４５，６０８号明細書；及び同第７，８３３，９９２号明細書にも記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、リガンドは、葉酸部分を含む。葉酸部分とコンジュゲートしたポリヌクレオチドは、受容体媒介性のエンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれ得る。このような葉酸－ポリヌクレオチドコンジュゲートは、米国特許第８，１８８，２４７号明細書に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
リガンドは、特定の組織又は細胞型における標的遺伝子の発現を選択的に阻害するために、ＲＮＡｉコンストラクトを特定の組織又は細胞型に標的化させることができる。一実施形態では、リガンドは、以下でより詳細に記載するような様々な手段を用いてＲＮＡｉコンストラクトの肝臓細胞（例えば、肝細胞）への特異的な送達を標的化する。ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表面に発現したアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）又はそのコンポーネント（例えばＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２）に結合するリガンドにより、肝臓細胞に標的化される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、肝臓細胞の表面に発現されるタンパク質と結合又は相互作用するリガンドを採用することにより、肝臓に特異的に標的化され得る。例えば、ある種の実施形態では、リガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体及びＬＤＬ受容体などの肝細胞で発現される受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ））含み得る。特定の一実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体又はその結合断片を含む。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を含む。「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（すなわち軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））並びに１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）から構成される。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体の単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ断片）を含む。「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在し、任意選択により、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨ領域とＶＬ領域との間のペプチドリンカーを含む。本発明のＲＮＡｉコンストラクトを肝臓に標的化するためのリガンドとして使用することができる、ＡＳＧＲ１に特異的に結合する例示的な抗体及びその結合断片は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０５８９４４号パンフレットに記載される。本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるリガンドとしての使用に好適である、ＡＳＧＲ１、ＬＤＬ受容体又は他の肝臓の表面に発現されるタンパク質に特異的に結合する他の抗体又はその結合断片は、市販されている。
ある種の実施形態では、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、各炭素原子に結合される酸素、窒素又は硫黄原子を伴う少なくとも６個の炭素原子（鎖状、分岐状又は環状であり得る）を有する１つ以上の単糖単位で構成される化合物を指す。炭水化物は、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖及び約４、５、６、７、８又は９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース及び多糖類ガムなどの多糖を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソース又はヘプトースから選択される単糖並びにこのような単糖単位を含む二糖及び三糖である。他の実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン及びＮ－アセチルグルコサミンなどのアミノ糖である。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ヘキソース又はヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース又はフルクトースから選択され得る。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミン又はマンノサミンから選択され得る。ある種の実施形態では、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミン又はグルコサミンを含む。一実施形態では、リガンドは、グルコース、グルコサミン又はＮ－アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。特定の実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトース及びＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むリガンドは、このようなリガンドが肝細胞の表面に発現されるＡＳＧＲに結合するため、化合物を肝臓細胞に標的化するのに特に有効である。例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｄｅｖａｒａｊａｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２０３：１２６－１３９，２０１５を参照されたい。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるＧａｌＮＡｃ又はガラクトース含有リガンドの例は、米国特許第７，４９１，８０５号明細書；同第８，１０６，０２２号明細書；及び同第８，８７７，９１７号明細書；米国特許出願公開第２００３０１３０１８６号明細書；並びに国際公開第２０１３１６６１５５号パンフレットに記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態では、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書で使用する場合、「多価炭水化物部分」は、独立して他の分子と結合又は相互作用することができる２つ以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、２つ以上の異なる分子又は同じ分子の２つ以上の異なる部位に結合することができる炭水化物で構成される２つ以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を意味する。例えば、炭水化物部分に関する用語「一価」、「二価」、「三価」及び「四価」は、それぞれ１、２、３及び４個の結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分、多価Ｎ－アセチル－グルコサミン部分、多価マンノース部分又は多価フコース部分を含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態では、リガンドは、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む。これら及び他の実施形態では、多価炭水化物部分は、二価、三価、又は四価であり得る。このような実施形態では、多価炭水化物部分は、二分岐又は三分岐であり得る。特定の一実施形態では、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価又は四価である。別の特定の実施形態では、多価ガラクトース部分は、三価又は四価である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトへの組み込みのための例示的な三価又は四価のＧａｌＮＡｃ含有リガンドは、以下に詳述される。
リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのＲＮＡ分子に直接的又は間接的に結合又はコンジュゲートされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に直接結合される。他の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合的に結合される。リガンドは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド（例えば、センス鎖若しくはアンチセンス鎖）の核酸塩基、糖部分又はヌクレオチド間結合に結合され得る。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合は、環内及び環外の原子を含む任意の位置で起こり得る。ある種の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位又は８位がリガンドに結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合も任意の位置で起こり得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位及び６位がリガンドに結合され得る。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーション又は結合は、任意の炭素原子で起こり得る。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子としては、２’、３’及び５’の炭素原子が挙げられる。１’位も脱塩基ヌクレオチドなどにおいてリガンドに結合され得る。ヌクレオチド間結合もリガンドの結合を促進し得る。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなど）について、リガンドは、リン原子又はリン原子に結合したＯ、Ｎ若しくはＳ原子に直接結合され得る。アミン又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）について、リガンドは、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合され得る。
ある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの３’又は５’末端に結合され得る。ある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端に共有結合的に結合される。こうした実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドに結合される。これら及び他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’位で結合される。逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドが、センス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、５’－５’ヌクレオチド間結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される実施形態では、リガンドは、逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドの３’位に結合され得る。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に共有結合的に結合される。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドに結合される。こうしたある種の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’位で結合される。逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドが、センス鎖の３’末端ヌクレオチドであり、３’－３’ヌクレオチド間結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される実施形態では、リガンドは、逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドの５’位に結合され得る。代替的な実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端近傍であるが、１つ以上の末端ヌクレオチドの前（すなわち１、２、３又は４個の末端ヌクレオチドの前）に結合される。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。
ある種の実施形態では、リガンドは、リンカーを介してセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合される。「リンカー」は、リガンドをＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド構成要素に共有結合的に結合する原子又は原子の基である。リンカーは、約１～約３０の原子長、約２～約２８の原子長、約３～約２６の原子長、約４～約２４の原子長、約６～約２０の原子長、約７～約２０の原子長、約８～約２０の原子長、約８～約１８の原子長、約１０～約１８の原子長及び約１２～約１８の原子長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、通常、２個の官能基を有するアルキル部分を含む二官能性の結合部分を含み得る。官能基の一方が選択されて目的の化合物（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖）に結合し、さらに他方が選択されて、本明細書に記載のようなリガンドなどの任意の選択された基に基本的に結合する。ある種の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール又はアミノ酸単位などの繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能性結合部分において通常採用される官能基の例は、求核性基と反応するための求電子剤及び求電子性基と反応するための求核剤を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二官能性結合部分は、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、二重結合又は三重結合）などを含む。
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するために使用され得るリンカーは、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート、６－アミノヘキサン酸、置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルケニル又は置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルキニルを含むが、これらに限定されない。このようなリンカーのための好ましい置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含むが、これらに限定されない。
ある種の実施形態では、リンカーは、切断可能である。切断可能なリンカーは、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞内への進入後に切断されて、リンカーが一体に保持している２つの部分を放出するものである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、標的細胞中又は第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下において、対象の血液中又は第２の参照条件（例えば、血液若しくは血清に見出される条件を模倣するか、又はそれに相当するように選択され得る）下よりも少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍若しくは９０倍以上又は少なくとも１００倍速く切断される。
切断可能なリンカーは、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部において優勢であるか又は高いレベル若しくは活性で見出される。こうした分解性薬剤の例としては、例えば、細胞内に存在して還元によって酸化還元切断可能なリンカーを分解することができる、メルカプタンなどの酸化酵素若しくは還元酵素又は還元性薬剤を含む、特定の基質のために選択されるか又は基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を作ることができる薬剤、例えば５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸として作用することにより酸切断可能なリンカーを加水分解又は分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。
切断可能なリンカーは、ｐＨに対して感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のｐＨは、７．４であるが、平均的な細胞内ｐＨは、わずかにより低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、およそ５．０のさらにより酸性であるｐＨを有する。一部のリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な基を有し、それにより細胞内部又は細胞の所望の区画内にリガンドからＲＮＡ分子を放出することになる。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化される細胞に依存する場合がある。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してＲＮＡ分子に結合され得る。肝臓細胞は、エステラーゼに富んでおり、したがって、リンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型においてよりも肝臓細胞において効率的に切断されることになる。エステラーゼに富む他の種類の細胞としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。ペプチド結合を含有するリンカーは、肝臓細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合に使用され得る。
一般に、切断可能なリンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤（又は条件）の能力を試験することによって評価することができる。血液中又は非標的組織と接触する場合の切断に抵抗する能力に関しても切断可能なリンカー候補を試験することが望ましい。したがって、標的細胞における切断を示すように選択される第１の条件と、他の組織又は生体液、例えば血液又は血清における切断を示すように選択される第２の条件との間で切断に対する相対的感受性を決定することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器若しくは組織培養又は動物全体において実行することができる。無細胞又は培養条件において初期評価を行い、動物全体におけるさらなる評価によって確認することが有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用なリンカー候補は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）において少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍、又は１００倍速く切断される。
他の実施形態では、酸化還元切断可能なリンカーが利用される。酸化還元切断可能なリンカーは、還元又は酸化に際して切断される。還元的に切断可能な基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能なリンカー候補が、好適な「還元的に切断可能なリンカー」であるかどうか、又は例えば特定のＲＮＡｉコンストラクト及び特定のリガンドとともに使用するのに好適であるかどうかを判定するために、本明細書に記載の１つ以上の方法を使用することができる。例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は例えば標的細胞などの細胞中で観察されるであろう切断速度を模倣する当技術分野で知られる他の還元剤とともにインキュベーションすることにより、リンカー候補を評価することができる。リンカー候補は、血液又は血清条件を模倣するように選択される条件下でも評価することができる。特定の実施形態では、リンカー候補は、血液中において最大で１０％切断される。他の実施形態では、有用なリンカー候補は、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）において少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍又は１００倍速く分解される。
なお他の実施形態では、ホスフェート基を分解又は加水分解する剤によって切断されるホスフェート系切断可能リンカーを用いて、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリガンドを共有結合する。細胞内でホスフェート基を加水分解する薬剤の一例は、細胞内におけるホスファターゼなどの酵素である。ホスフェート系の切断可能な基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－及び－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－であり、ここで、Ｒｋは、水素又はアルキルであり得る。特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－及び－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－を含む。別の特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、酸性条件下で切断される基である、酸切断可能な基を含み得る。いくつかの実施形態では、酸切断可能な基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境中において、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内において、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラは、酸切断可能な基のための切断環境をもたらし得る。酸切断可能な連結基の例は、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルを含むが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ又は－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素（アルコキシ基）に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基又はジメチル、ペンチル若しくはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、細胞中のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素によって切断されるエステル系の切断可能な基を含み得る。エステル系の切断可能な基の例は、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルを含むが、これらに限定されない。エステル切断可能な基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらのリンカー候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
さらなる実施形態では、リンカーは、細胞中のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素によって切断されるペプチド系の切断可能な基を含み得る。ペプチド系の切断可能な基は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生じるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含む。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、一般に、ペプチド及びタンパク質を産生するアミノ酸間に形成されるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定される。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接するアミノ酸の側鎖である。これらの候補は、上に記載されているものに類似した方法を用いて評価することができる。
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するのに好適な他の種類のリンカーが当技術分野で知られており、米国特許第７，７２３，５０９号明細書；同第８，０１７，７６２号明細書；同第８，８２８，９５６号明細書；同第８，８７７，９１７号明細書；及び同第９，１８１，５５１号明細書に記載されるリンカーを含むことができ、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合的に結合されるリガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば多価のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、三価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。なお他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の３’末端に結合される。更に他の実施形態では、多価のＧａｌＮＡｃ部分は、四価のＧａｌＮＡｃ部分であり、且つセンス鎖の５’末端に結合される。
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは以下の構造を有するリガンドを含む。
好適な実施形態では、この構造を有するリガンドは、本明細書に記載されるリンカーなどのリンカーを介してセンス鎖の５’末端に共有結合される。一実施形態では、リンカーはアミノヘキシルリンカーである。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトにおける二本鎖ＲＮＡ分子に結合することができる三価及び四価のＧａｌＮＡｃ部分並びにリンカーの例が以下の構造式Ｉ～ＩＸにおいて提供される。本明細書に列記される式中の「Ａｃ」はアセチル基を表す。
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式Ｉの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは、独立して１～３であり、ｋは、１～３であり、ｍは、１又は２であり、ｊは、１又は２であり、且つリガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、ｍは１又は２であり、ｊは１又は２であり、且つリガンドは二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
更に別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＶの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式Ｖの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、且つリガンドは二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、且つリガンドは二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、Ｘ＝Ｏ又はＳであり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、且つリガンドは二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
ある種の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＸの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、リガンドは二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
ホスホロチオエート結合は、リガンド及びリンカーを核酸鎖と共有結合させるために、式Ｉ～ＩＸのうちいずれか１つに示すホスホジエステル結合と置き換えることができる。
本発明は、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物及び製剤も含む。このような組成物及び製剤は、標的遺伝子の発現の低減を、それを必要とする対象において行うのに有用である。臨床上の用途を考える場合、医薬組成物及び製剤は、目的の用途に適切な形態で作製されることになる。一般に、これは、パイロジェン及びヒト又は動物に有害になる可能性のある他の不純物を本質的に含まない組成物を作製することを必然的に伴うことになる。
語句「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」は、動物又はヒトに投与される場合の有害なアレルギー性の又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤」は、ヒトへの投与に好適な薬剤などの薬剤の製剤化における使用に許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で知られている。任意の従来の媒体又は薬剤が本発明のＲＮＡｉコンストラクトと適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分は、それらが組成物のＲＮＡｉコンストラクトを不活性化しないという条件で組成物に組み込むこともできる。
医薬組成物の製剤の組成及び方法は、投与経路、治療される疾患若しくは障害の種類及び程度又は投与される用量を含むがこれらに限定されない、いくつかの条件に依存する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、目的の送達経路に基づいて製剤化される。例えば、ある種の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達のために製剤化される。非経口の送達形態は、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入を含む。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内送達のために製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、脂質ベースの送達ビヒクルを含み得る。別の実施形態では、医薬組成物は、皮下送達のために製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、標的化リガンド（例えば、本明細書に記載のＧａｌＮＡｃ含有又は抗体含有リガンド）を含み得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、有効量の本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトを含む。「有効量」は、有利な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量とは、対象の特定の組織又は細胞型（例えば肝臓又は肝細胞）中で標的遺伝子の発現を低減させるのに十分な量である。
本発明の医薬組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の一般的な経路を介するものであり得る。このような経路は、非経口（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内）、経口、経鼻、頬側、皮内、経皮及び舌下経路又は肝臓組織への直接注射若しくは肝門脈を介する送達を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口で投与される。例えば、ある種の実施形態では、医薬組成物は、静脈内に投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下に投与される。
水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースの系などのコロイド分散系は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのための送達ビヒクルとして使用され得る。本発明の核酸を送達するのに好適な市販の脂肪エマルションは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）及び他の類似の脂質エマルションを含む。インビボにおける送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リポソーム内に封入され得るか、又はリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成し得る。代わりに、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成し得る。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））並びにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））を含む。このようなコロイド分散系の調製及び使用は、当技術分野でよく知られている。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号明細書、同第６，２１７，９００号明細書、同第６，３８３，５１２号明細書、同第５，７８３，５６５号明細書、同第７，２０２，２２７号明細書、同第６，３７９，９６５号明細書、同第６，１２７，１７０号明細書、同第５，８３７，５３３号明細書、同第６，７４７，０１４号明細書、及び国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにも開示される。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、例えば脂質製剤に完全に封入されて、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸－脂質粒子を形成する。本明細書で使用する場合、用語「ＳＮＡＬＰ」は安定な核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質及び粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、且つ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身投与のために極めて有用である。核酸－脂質粒子は、通常、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、核酸－脂質粒子中に存在する場合の核酸は、水溶液中においてヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書、同第５，９８１，５０１号明細書、同第６，５３４，４８４号明細書、同第６，５８６，４１０号明細書、同第６，８１５，４３２号明細書、及び国際公開第９６／４０９６４号パンフレットにおいて開示される。
注射用途に好適な医薬組成物は、例えば、滅菌水溶液又は分散体及び注射用滅菌溶液又は分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能である程度の流体である。調製物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されているべきである。適切な溶媒又は分散媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、好適なその混合物、及び植物油を含有し得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散体の場合に必要とされる粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸及びチメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によってもたらすことができる。
注射用滅菌溶液は、活性化合物を適切な量で所望の任意の他の成分（例えば、上で列記されるとおり）とともに溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散体は、塩基性分散媒体及び所望の他の成分、例えば上で列記された成分を含有する滅菌ビヒクルに滅菌された様々な活性成分を組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる真空乾燥及びフリーズドライの手法を含む。
本発明の組成物は、一般に、中性又は塩形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する酸付加塩（遊離アミノ基によって形成される）を含む。遊離カルボキシル基によって形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄）又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。
水溶液における非経口投与のために、例えば、溶液は、通常、適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば、十分な生理食塩水又はグルコースにより最初に等張にされる。このような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に使用され得る。好ましくは、特に本開示を考慮すれば、当業者に知られるような滅菌水性媒体が採用される。例として、単一用量が等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解され、皮下注入液１０００ｍｌに添加されるか、又は提案された注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。ヒトへの投与に関して、調製物は、ＦＤＡ標準が要件とする無菌性、発熱性、全般的安全性及び純度標準を満たすべきである。ある種の実施形態では、本発明の医薬組成物は、滅菌生理食塩水及び本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトを含むか又はそれらからなる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクト及び滅菌水（例えば、注射用水、ＷＦＩ）を含むか又はそれらからなる。更に他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクト及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか又はそれらからなる。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与用デバイスでパッケージ化されるか又はその中に保存される。注射用製剤のためのデバイスは、注射ポート、プレフィルドシリンジ、自動注入装置、注射ポンプ、装着型注射器及び注射ペンを含むが、これらに限定されない。エアロゾル化又は粉末製剤のためのデバイスは、インヘラー、吸入器、吸引器などを含むが、これらに限定されない。したがって、本発明は、１つ以上の疾患又は障害を治療又は予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。
本発明は、細胞を本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトのうちのいずれか１つと接触させることにより細胞中で標的遺伝子の発現を低減又は阻害するための方法を提供する。細胞はインビトロ又はインビボであり得る。標的遺伝子発現は、標的ｍＲＮＡ、標的タンパク質、又は標的遺伝子の発現に関連する別のバイオマーカーの量又はレベルを測定することによって評価することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞又は動物における標的遺伝子発現の低減は、ＲＮＡｉコンストラクトで処理されていないか又は対照ＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞又は動物における標的遺伝子発現と比較して決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減又は阻害は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞中の標的ｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、細胞中で発現しないＲＮＡ分子又はナンセンス若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを対象とするＲＮＡｉ薬剤）で、又はコンストラクトなしで処理された細胞中の標的ｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）において処理された細胞から測定された標的ｍＲＮＡレベルと、（ｂ）において対照細胞から測定された標的ｍＲＮＡレベルとを比較することによって評価される。比較前に、処理された細胞及び対照細胞における標的ｍＲＮＡレベルを対照遺伝子（例えば、１８ＳリボソームＲＮＡ又はハウスキーピング遺伝子）に対するＲＮＡレベルに正規化することができる。標的ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ドロップレットデジタルＰＣＲなどを含む様々な方法によって測定することができる。
他の実施形態では、標的遺伝子発現の低減又は阻害は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処理された細胞中の標的タンパク質の量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、細胞中で発現しないＲＮＡ分子又はナンセンス若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを対象とするＲＮＡｉ薬剤）で、又はコンストラクトなしで処理された細胞中の標的タンパク質の量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）において処理された細胞から測定された標的タンパク質レベルと、（ｂ）において対照細胞から測定された標的タンパク質レベルとを比較することによって評価される。標的タンパク質レベルを測定する方法は、当業者に知られており、これとしてはウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、及びフローサイトメトリーが挙げられる。
本発明は、標的遺伝子の発現を低減又は阻害することを、それを必要とする対象において行うための方法も提供し、方法は、本明細書に記載されるＲＮＡｉコンストラクトのうちのいずれか１つを対象に投与することを含む。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、例えば、遺伝子産物の過剰発現が病理学的表現型を生じさせる場合に、異常な標的遺伝子発現又は活性に伴う病気、疾患、又は障害を治療又は改善するために用いられ得る。例示的な標的遺伝子としては、ＬＰＡ、ＰＮＰＬＡ３、ＡＳＧＲ１、Ｆ７、Ｆ１２、ＦＸＩ、ＡＰＯＣＩＩＩ、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＬ１、ＴＴＲ、ＰＣＳＫ９、ＳＣＡＰ、ＫＲＡＳ、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１、Ｃ５、ＡＬＡＳ１、ＨＡＯ１、ＬＤＨＡ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＧＴ、ＨＡＭＰ、ＬＥＣＴ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＫＩＦ１１、ＡＴ３、ＣＴＮＮＢ１、ＨＭＧＢ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＳＴＡＴ３が挙げられるがこれらに限定されない。標的遺伝子としては、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎ウイルス遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子、ヘルペスウイルス遺伝子などといったウイルス遺伝子も挙げることができる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はヒトマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする遺伝子である。
ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、標的遺伝子の発現は、細胞又は対象中で少なくとも５０％低減する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、細胞又は対象中で少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％低減する。他の実施形態では、標的遺伝子の発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトにより、肝臓細胞中で約９０％以上、例えば約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上低減する。標的遺伝子発現の低減パーセントは、本明細書に記載の方法のいずれか及び当技術分野で知られる他の方法によって測定することができる。
実施された実験及び得られた結果を含む以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１．異なる化学修飾パターンを用いたＰＮＰＬＡ３ＲＮＡｉコンストラクトのインビボ活性
ＲＮＡｉコンストラクトのインビボ効力に対する異なる化学修飾パターンの効果を評価するために、下記でより詳しく説明するように、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド及び２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドの様々なパターンを用いて合成し、ＰＮＰＬＡ３を発現するヒト化マウスモデル中で評価した。
固相ホスホラミダイト化学を用いてＲＮＡｉコンストラクトを合成した。合成はＭｅｒＭａｄｅ１２（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）機器上で実施した。
材料
アセトニトリル（ＤＮＡ合成等級、ＡＸＯ１５２－２５０５、ＥＭＤ）
キャッピング試薬Ａ（８０：１０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン／ルチジン／無水酢酸、ＢＩＯ２２１／４０００、ＥＭＤ）
キャッピング試薬Ｂ（１６％１－メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン、ＢＩＯ３４５／４０００、ＥＭＤ）
活性剤溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍの５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、ＢＩＯ１５２／０９６０、ＥＭＤ）
脱トリチル化試薬（ジクロロメタン中３％ジクロロ酢酸、ＢＩＯ８３０／４０００、ＥＭＤ）
酸化試薬（７０：２０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン／ピリジン／水中０．０２Ｍヨウ素、ＢＩＯ４２０／４０００、ＥＭＤ）
ジエチルアミン溶液（アセトニトリル中２０％ＤＥＡ、ＮＣ００１７－０５０５、ＥＭＤ）
チオール化試薬（４０：６０（ｖ／ｖ）ピリジン／アセトニトリル中０．０５Ｍ５－Ｎ－［（ジメチルアミノ）メチレン］アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＢＩＯＳＵＬＩＩ／１６０Ｋ））
アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンの５’－アミノヘキシルリンカーホスホラミダイト、リン酸化ホスホラミダイト、２’－デオキシチミジンホスホラミダイト、並びに２’－メトキシ及び２’－フルオロホスホラミダイト（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、約１０ｍＬの分子ふるい（３Å，Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）上、アセトニトリル中０．１０Ｍ
ＣＰＧ支持体（高負荷汎用支持体、５００Ａ（ＢＨ５－３５００－Ｇ１）、７９．６μｍｏｌ／ｇ、０．１２６ｇ（１０μｍｏｌ））
水酸化アンモニウム（高濃度、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）
合成
試薬溶液、ホスホラミダイト溶液、及び溶媒をＭｅｒＭａｄｅ１２機器に接続した。各カラム（上下フリットを備える４ｍＬのＳＰＥ管）に固体支持体を添加し、カラムを機器に貼り付けた。カラムをアセトニトリルで２回洗浄した。ホスホラミダイト及び試薬溶液ラインをパージした。Ｐｏｓｅｉｄｏｎソフトウェアを使用して合成を開始した。合成は、脱保護／カップリング／酸化／キャッピングの合成サイクルの反復によって行われた。具体的には、固体支持体に脱トリチル化試薬を添加して５’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を除去した。固体支持体をアセトニトリルで洗浄した。支持体にホスホラミダイト及び活性剤溶液を添加し、続いてインキュベートして、入ってくるヌクレオチドを遊離５’－ヒドロキシル基に結合した。支持体をアセトニトリルで洗浄した。支持体に酸化又はチオール化試薬を添加して亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステル又はホスホロチオエートに変換した。支持体にキャッピング試薬Ａ及びＢを添加して任意の未反応オリゴヌクレオチド鎖を終端させた。支持体をアセトニトリルで洗浄した。最終反応サイクル後、レジンをジエチルアミン溶液で洗浄して２－シアノエチル保護基を除去した。支持体をアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥させた。
ＧａｌＮＡｃコンジュゲーション
三価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分（下記の式ＶＩＩに示す構造）にコンジュゲーションするためのセンス鎖を、５’－アミノヘキシルリンカーを用いて調製した。自動合成後、カラムを機器から除去し、フード内の真空マニホールドに移した。５’－モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）保護基を、真空濾過を用いてジクロロメタン（ＤＣＭ）中の１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の２ｍＬアリコートで連続的に処理することにより固体支持体から除去した。溶出液中で橙色／黄色がこれ以上観察されなくなったら、レジンをジクロロメタンで洗浄した。レジンを５ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２％ジイソプロピルエチルアミンで洗浄した。別のバイアル中で、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中ＧａｌＮＡｃ３－Ｌｙｓ２－Ａｈｘ（６７ｍｇ、４０μｍｏｌ）溶液（その構造及び合成は下記に記載する）を、１，１，３，３－テトラメチル ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＡＴＵ、１２．８３ｍｇ、４０μｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１０．５μＬ、３６０μｍｏｌ）を用いて調製した。活性化されたカップリング溶液をレジンに添加し、カラムに蓋をして室温で終夜インキュベートした。レジンをＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥させた。
切断
合成カラムを、合成装置又は真空マニホールドから除去した。各カラムからの固体支持体を１０ｍＬバイアルに移した。固体支持体に４ｍＬの高濃度水酸化アンモニウムを添加した。キャップをボトルに堅く取り付け、混合物を５５℃で４時間加熱した。ボトルを冷凍庫に移動し、フード内で２０分間冷却してから開封した。混合物を８ｍＬのＳＰＥ管で濾過して固体支持体を除去した。バイアル及び固体支持体を１ｍＬの５０：５０エタノール／水ですすいだ。
分析及び精製
合わせた濾液の一部を分析し、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。プールした画分をサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩し、イオン対逆相高速液体クロマトグラフ質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）によって分析した。プールした画分を凍結乾燥して白色の非晶質粉末を得た。
分析的アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）：
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００ＲＳ（４．６×５０ｍｍ、４μｍ）
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５、１Ｍ臭化ナトリウム
流速：４０℃で１ｍＬ／分
勾配： ６．２分で２０～６５％Ｂ
分取アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）：
カラム：Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ２１×１５０ｍｍ、１３μｍ
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５、１Ｍ臭化ナトリウム
流速：８ｍＬ／分
注入量：５ｍＬ
勾配：２０分にわたって３５～５５％Ｂ
分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：
カラム：ＧＥ Ｈｉ－Ｐｒｅｐ ２６／１０
機器：ＧＥ ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ
緩衝液：２０％エタノール水溶液
流速：１０ｍＬ／分
注入量：試料負荷ポンプを用いて１５ｍＬ
イオン対逆相（ＩＰ－ＲＰ）ＨＰＬＣ：
カラム：Ｗａｔｅｒ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＯＳＴ Ｃ１８、２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：水中の１５．７ｍＭのＤＩＥＡ、５０ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）
緩衝液Ｂ：５０：５０の水／アセトニトリル中の１５．７ｍＭ ＤＩＥＡ、５０ｍＭ ＨＦＩＰ
流速：０．５ｍＬ／分
勾配：６分にわたって１０～３０％Ｂ
アニーリング
少量のセンス鎖及びアンチセンス鎖を個々のバイアル内に量り取った。バイアルにｓｉＲＮＡ再構成緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加して、乾燥重量を基準として約２ｍＭの濃度にした。実際の試料濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（ｓｓＤＮＡ、吸光係数＝３３μｇ／ＯＤ２６０）上で測定した。次に、２つの鎖を等モル比で混合し、試料を９０℃の水浴で５分間加熱し、室温までゆっくりと冷却した。試料をＡＥＸによって分析した。二重鎖を登録し、下記でより詳細に説明されるようにインビボ試験に供した。
ＧａｌＮＡｃ３－Ｌｙｓ２－Ａｈｘの調製
式ＶＩＩ
式中、Ｘ＝Ｏ又はＳである。波線はＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドに対する結合点を表す。
５０ｍＬのｆａｌｃｏｎ管に、ＤＣＭ（３０ｍＬ）中Ｆｍｏｃ－Ａｈｘ－ＯＨ（１．１３ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（２．２３ｍＬ、１２．７８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を５０ｍＬ遠心分離管中の２－Ｃｌ塩化トリチルレジン（３．０３ｇ、４．７９ｍｍｏｌ）に添加し、振とう器上に２時間投入した。溶媒を排出し、レジンを１７：２：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ（３０ｍｌ×２）、ＤＣＭ（３０ｍＬ×４）で洗浄してから乾燥させた。２９０ｎｍのＵＶ分光光度検出で、投入量は０．７６ｍｍｏｌ／ｇであると決定された。
３ｇの投入された２－Ｃｌトリチルレジンを、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中２０％の４－メチルピペリジンに懸濁させ、３０分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に１回繰り返し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×３）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で洗浄した。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ（３．４５ｇ、６ｍｍｏｌ）溶液に、ＴＡＴＵ（１．９４ｇ、６ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（１．８３ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。続いて溶液を上記の脱保護されたレジンに添加し、懸濁液を振とう器上に終夜置いた。溶媒を排出し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×３）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で洗浄した。
レジンをＤＭＦ（１５ｍＬ）の２０％４－メチルピペリジンで処理し、１０分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に１回繰り返し、レジンをＤＭＦ（１５ｍＬ×４）及びＤＣＭ（１５ｍＬ×４）で洗浄した。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ（３．５４ｇ、６ｍｍｏｌ）溶液に、ＴＡＴＵ（１．９４ｇ、６ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（１．８３ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。続いて溶液を上記の脱保護されたレジンに添加し、懸濁液を振とう器上に終夜置いた。溶媒を排出し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×３）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で洗浄した。
レジンをＤＭＦ（２０ｍＬ）の５％ヒドラジンで処理し、５分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に４回繰り返し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×４）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×４）で洗浄した。
ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の５－（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ペンタン酸（４．４７ｇ、１０ｍｍｏｌ）溶液にＴＡＴＵ（３．２２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を５分間撹拌した。ＤＩＥＡ（２．９６ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、続いて混合物を上記のレジンに添加した。懸濁液を室温で終夜保持し、溶媒を排出した。レジンをＤＭＦ（３×３０ｍＬ）及びＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で洗浄した。
レジンをＤＣＭ（３０ｍＬ、３％トリイソプロピルシランを含む）中１％ＴＦＡで処理し、５分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に３回繰り返し、合わせた濾液を減圧下で濃縮した。残滓をジエチルエーテル（５０ｍＬ）で粉砕し、懸濁液を濾過し、乾燥させて粗生成物を得た。粗生成物を逆相クロマトグラフィーで精製し、水中０～２０％のＭｅＣＮで溶出した。画分を合わせ、凍結乾燥することによって白色固体として生成物を得た。
下記の表１は、修飾ＰＮＰＬＡ３ＲＮＡｉコンストラクトの各々のセンス配列及びアンチセンス配列における修飾の位置を示す。ヌクレオチド配列は、以下の表記法に従って列記される。ｄＴ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ＝対応するデオキシリボヌクレオチド；ａ、ｕ、ｇ、及びｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、Ｇｆ、及びＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）リボヌクレオチド；Ｐｈｏｓ＝末端ヌクレオチドがその５’末端にモノホスフェート基を有する；ｉｎｖＡｂ＝逆位脱塩基ヌクレオチド（すなわち、鎖の３’末端上にあるときはその３’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合し（３’－３’結合）、又は鎖の５’末端上にあるときはその５’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合した（５’－５’ヌクレオチド間結合）脱塩基ヌクレオチド）；並びにｉｎｖｄＸ＝逆位デオキシリボヌクレオチド（すなわち、鎖の３’末端上にあるときはその３’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合し（３’－３’結合）、又は鎖の５’末端上にあるときはその５’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合した（５’－５’ヌクレオチド間結合）デオキシリボヌクレオチド）。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって結合されることを示す。特に指示がない限り、全ての他のヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって結合される。全てのＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端を介して式ＶＩＩに示されるＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされる。表１は、各ＲＮＡｉコンストラクトのパターン指定及び配列ファミリー指定も列記する。パターン指定は、図１に概略的に表示される。ＲＮＡｉコンストラクトが別のＲＮＡｉコンストラクトと同じ配列ファミリー指定を有する場合、２つのコンストラクトは同じコア配列を有するが、化学修飾パターンが異なる。
実験の初期設定では、異なる配列を備えた１３の異なるＰＮＰＬＡ３ＲＮＡｉコンストラクトが、Ｐ１化学修飾パターン又はＣＭ１対照化学修飾パターンを有するように合成された。ＣＭ１対照化学修飾パターンを有するｓｉＲＮＡ分子は、インビボで効力及び長期の遺伝子サイレンシング効果を有すると報告された。Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１３６：１６９５８－１６９６１，２０１４を参照されたい。野生型ヒトＰＮＰＬＡ３又はヒトＰＮＰＬＡ３の変異型を発現するヒト化マウスモデルにおけるＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の阻害における化学修飾されたＲＮＡｉコンストラクトの効力を評価した。マウスモデルを作製するために、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１４１９０－１３６）中で１動物あたり１×１０１２ウイルス粒子に希釈された随伴アデノウイルス（ＡＡＶ；血清型ＡＡＶ８又はＡＡＶ７；エンドトキシン非含有）を、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）の尾静脈に静脈注射し、ヒトＰＮＰＬＡ３、ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９、又はＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９－ｒｓ７３８４０８遺伝子の発現を促進した。マウスは一般に１０～１２週齢であり、一処置群当たり４～６の動物のｎが含まれた。
全てのＲＮＡｉコンストラクトは、ＡＡＶ－ＰＮＰＬＡ３、ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９、及び／又はＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９－ｒｓ７３８４０８を注射したマウス中で試験した。少なくとも２つのビヒクル処置対照群：ビヒクルで処置されたＡＡＶ空ベクター、及びＡＡＶ－ＰＮＰＬＡ３、ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９、又はＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９－ｒｓ７３８４０８も含まれた。ＡＡＶ注射の２週間後、マウスを、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４１９０－１３６）中で希釈された単一用量のＲＮＡｉコンストラクト（０．５ｍＭ）で、動物１キログラム当たり０．５、１．０、３．０、又は５．０ミリグラムでの皮下注射を介して処置した。ＲＮＡｉコンストラクト注射後の８、１５、２２、２８、又は４２日目に、動物から肝臓を収集し、液体窒素中で急速凍結させ、ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴ機器（９００１７９３）及びＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴキット（７４１７１）を製造業者の指示書に従って使用して精製ＲＮＡに関して処理した。試料は、ＱＩＡｘｐｅｒｔシステム（９００２３４０）を使用して分析された。ＲＮＡをＰｒｏｍｇｅａ ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｍ６１０１）で処置し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＴａｑＭａｎＴＭ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴＴＭ １－Ｓｔｅｐキット（４３９２６５３）を使用してリアルタイムｑＰＣＲのために調製した。リアルタイムｑＰＣＲは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲ装置上で実施された。結果は、マウスＧａｐｄｈ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ、それぞれｈｓ００２２８７４７＿ｍ１及び４３５２９３２Ｅ）に正規化されたヒトＰＮＰＬＡ３の遺伝子発現を基準とし、ビヒクル処置対照動物と比較したヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡ発現の相対的ノックダウンとして示される。
Ｐ１化学修飾パターン（二重鎖番号４５４４、３５５２、２３９３、３４６４、３９１８、２３９０、２３９１、２３９２、３４６５、３４６７、２３９４、３５３９、及び３９１６）を備えるＲＮＡｉコンストラクトとＣＭ１対照修飾パターン（二重鎖番号２１１８、２１１９、２１２５、２１２０、２１２１、２１２４、２３７０、２３７１、２１２２、２３６８、２３６９、２１２３、及び３５５８）を備えるＲＮＡｉコンストラクトとを比較する、この実験の初期設定からの結果を図２に示す。ＲＮＡｉコンストラクトがヒトＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９変異体遺伝子を発現するマウスに５ｍｇ／ｋｇで皮下投与された場合、Ｐ１パターンを有するコンストラクトは、配列にかかわらずＣＭ１パターンを有するコンストラクトと比較して、注射後８日目に測定して一般にＰＮＰＬＡ３発現を大幅に低減させた。
鎖長、ＲＮＡｉコンストラクトの末端（すなわちオーバーハング対平滑末端）の性質を修飾するため、且つ／又はセンス鎖の５’又は３’末端に逆位脱塩基ヌクレオチドを含めるためのＰ１修飾パターンの変種を作製し、同じコア配列を有するＲＮＡｉコンストラクトに適用した。新規なパターンを備えたＲＮＡｉコンストラクトを、ヒト化マウスモデルにおいてインビボ効力の改善に関して評価した。具体的には、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、又はＰ４化学修飾パターン（二重鎖番号３５４０、５２４１、５６１４、及び５６１５）を備えたＲＮＡｉコンストラクトを、ヒトＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９変異体遺伝子を発現するマウスに５ｍｇ／ｋｇ用量で皮下投与した。ＲＮＡｉコンストラクトの投与後１５日目に、肝臓中のヒトＰＮＰＬＡ３の発現レベルを評価した。結果を図３に示す。Ｐ２、Ｐ３、又はＰ４パターンを備えるＲＮＡｉコンストラクトは、Ｐ１パターンを備えるＲＮＡｉコンストラクトと比較してより高いＰＮＰＬＡ３発現の平均低減をもたらした。
インビボでのｍＲＮＡノックダウンの効力及び期間を増加させるためにＰ３パターンの更なる変種を作製した。Ｐ３パターン中（二重鎖番号６１９１）でアンチセンス鎖中の５’末端から数えて４及び６位の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドに変更してＰ９パターンを生成させた（二重鎖番号６２６７）。センス鎖の３’末端に逆位脱塩基ヌクレオチドの代わりに逆位アデノシンデオキシリボヌクレオチドを備えるＰ９パターン（二重鎖番号７３２０）を有するＲＮＡｉコンストラクトも合成した。３つのコンストラクトは全て上記のヒト化マウスモデル中で評価した。５ｍｇ／ｋｇの二重鎖番号６２６７で処置した動物中では、ヒトＰＮＰＬＡ３の肝臓発現は、投与後２２日目で９７％減少し、一方で５ｍｇ／ｋｇの二重鎖番号６１９１で処置した動物は、同時点で９２％のヒトＰＮＰＬＡ３の肝臓発現レベルの低減を示した。３ｍｇ／ｋｇの二重鎖番号７３２０で処置した動物は、投与後２８日目で９５％のヒトＰＮＰＬＡ３の肝臓発現レベルの低減を示したため、二重鎖番号７３２０はより効力があり、二重鎖番号６１９１及び６２６７よりも長期間の遺伝子ノックダウンをもたらした。
Ｐ９パターンを、２つの異なるコア配列を備えるＰＮＰＬＡ３ＲＮＡｉコンストラクトに適用し（二重鎖番号７３１８、７３２０、７０６２、８５１３、及び８７０９）、インビボで生物発光画像法アッセイにおいて１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの用量でインビボ効力を評価した。生物発光画像法アッセイのために、ネズミサイトメガロウイルスプロモーター、ホタルルシフェラーゼの全配列、及び続いて、ホタルルシフェラーゼ終止コドンからすぐ下流で、試験されるＲＮＡｉコンストラクトに特異的なｍＲＮＡ配列の合成鎖を含有するように随伴アデノウイルス（ＡＡＶ）ベクターを設計した。ｍＲＮＡ配列の各末端に、１０個の追加のヌクレオチドが隣接した。ベクター「ＰＰ３Ａ（ＤＭ）」を、ＡＡＶ血清型のＡＡＶＤＪ８（エンドトキシン非含有）中にパッケージングした。注射前に、ＰＰ３Ａ（ＤＭ）を、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１４１９０－１３６）中で１動物あたり５×１０１１ウイルス粒子に希釈し、ＢＡＬＢ／ｃ雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）の尾静脈に静脈注射した。マウスは一般に１０～１２週齢であり、１群当たりｎ＝５の動物が含まれた。
ＡＡＶ注射から２週間後、製造業者の指示書に従い、ＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－ルシフェリン生物発光基質（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，７７０５０４）をマウスに注射した。１０分間のパルス後、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上でマウスを撮像した。続いて、肝臓を包含する定められた対象領域からのベースライン全光束スコアに従い、マウスをグループに無作為抽出した。一旦無作為抽出されたら、マウスを、皮下注射を介して、リン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１４１９０－１３６）で希釈した、体重１キログラム当たり１．０又は３．０ミリグラムの単一用量のＲＮＡｉコンストラクト（０．５ｍＭ）で処置するか、又はリン酸緩衝生理食塩水のみ（「ビヒクル」と指定される）で処置した。マウスは、全光束スコアに対して同じゲーティング制約を適用する同じプロトコルに従い毎週撮像した。データは、全光束（１秒当たり光子、ｙ軸）対ＲＮＡｉコンストラクト注射後の週（ｘ軸）として表す。全光束の低減は、ルシフェラーゼレポーターの発現の低減を示す。
この実験の結果を図４Ａ及び４Ｂに示す。Ｐ９パターンを有する様々なＲＮＡｉコンストラクトで処置された動物からのルシフェラーゼレポーターからの信号は、ＲＮＡｉコンストラクトの１ｍｇ／ｋｇの単一用量後少なくとも３週間（図４Ａ）、及び３ｍｇ／ｋｇの単一用量の場合は少なくとも５週間（図４Ｂ）にわたり、ビヒクル処置動物からの信号と比較して著しく低減した。ＲＮＡｉコンストラクトの多くで、単一の３ｍｇ／ｋｇ用量は、最大で６週間にわたりルシフェラーゼレポーターの発現を阻害するのに十分であった。
これらのＲＮＡｉコンストラクト（二重鎖番号７３１８、７３２０、７０６２、８５１３、及び８７０９）も、上記のヒト化マウスモデル中で評価した。具体的には、ＲＮＡｉコンストラクトを、０．５、１、又は３ｍｇ／ｋｇで、ヒト化ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９－ｒｓ７３８４０８変異体遺伝子を発現するマウスに皮下投与した。ＲＮＡｉコンストラクトの投与後２８日又は４２目に、ｑＰＣＲによって肝臓中のヒトＰＮＰＬＡ３の発現レベルを評価した。結果を、ビヒクル処置対照動物と比較したヒトＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡ発現の相対的ノックダウンとして表し、以下の表２に示す。
Ｐ９修飾パターンを有するＲＮＡｉコンストラクトは、より効力があり、過去に試験されたパターンよりも長期間の遺伝子ノックダウンをもたらす。０．５ｍｇ／ｋｇの単一用量でのＲＮＡｉコンストラクトの投与は、単一用量の投与後４週間でヒトＰＮＰＬＡ３の肝臓発現を約５０％低減させ、一方で１ｍｇ／ｋｇの用量でのコンストラクトの投与は、単一用量の投与後４週間でヒトＰＮＰＬＡ３の肝臓発現を約７０％低減させた。１ｍｇ／ｋｇの用量は、単一用量から６週間にわたるＰＮＰＬＡ３発現の５５％超の低減を維持するのに十分であった。３ｍｇ／ｋｇの単一用量のＲＮＡｉコンストラクトの投与は、単一用量の投与から４週間でヒトＰＮＰＬＡ３の肝臓発現を９０％以上低減させた。ヒトＰＮＰＬＡ３の肝臓発現は、３ｍｇ／ｋｇ用量の投与後６週間でもなお約７５％以上低減した。遺伝子ノックダウンの改善された効力及び期間は、２つの異なる配列を有するＲＮＡｉコンストラクトで観察され、これは、Ｐ９化学修飾パターンは、核酸塩基配列から少なくとも部分的に独立してＲＮＡｉコンストラクトの安定化に有効であることを示す。
続いて、Ｐ９化学修飾パターンを有するＰＮＰＬＡ３ＲＮＡｉコンストラクトのインビボ効力を、３つの異なる対照修飾パターンのうちの１つを有するＰＮＰＬＡ３ＲＮＡｉコンストラクトと比較した。ＣＭ２、ＣＭ３、及びＣＭ４修飾パターンは、ｓｉＲＮＡ分子の代謝安定性を改善させ遺伝子サイレンシングの効力及び期間の改善をもたらすことがこれまでに報告されている。Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．２６：７０８－７１７，２０１８を参照されたい。全てのＲＮＡｉコンストラクトがセンス鎖及びアンチセンス鎖中で同じコアヌクレオチド配列を有し、化学修飾パターンのみが異なっていた。Ｐ９修飾パターンを有する２つの異なるコンストラクトを合成し、１つはセンス鎖の３’末端に逆位脱塩基を有し（二重鎖番号７３１８）、１つはセンス鎖の３’末端に逆位デオキシチミジンを有した（二重鎖番号８７０９）。ＣＭ２、ＣＭ３、又はＣＭ４修飾パターンのうちの１つを有するＲＮＡｉコンストラクトも合成した（それぞれ二重鎖番号８１０３、８１０４、及び８１０５）。続いてＲＮＡｉコンストラクトのそれぞれを、３ｍｇ／ｋｇの用量で、ヒト化ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９－ｒｓ７３８４０８変異体遺伝子を発現するマウスに皮下投与した。ＲＮＡｉコンストラクトの投与後２８日に、ｑＰＣＲによって肝臓中のヒトＰＮＰＬＡ３の発現レベルを評価した。結果を図５に示す。センス鎖の３’末端に逆位脱塩基を有するＰ９修飾パターン（二重鎖番号７３１８）を有するＲＮＡｉコンストラクトは、試験された全てのコンストラクトの中でも最高の肝臓ＰＮＰＬＡ３発現の低減をもたらした。センス鎖の３’末端に逆位デオキシチミジンを有するＰ９修飾パターン（二重鎖番号８７０９）を有するＲＮＡｉコンストラクトは、ＣＭ４パターン（二重鎖番号８１０５）を有するコンストラクトよりもり高い肝臓ＰＮＰＬＡ３発現の低減、及びＣＭ２及びＣＭ３パターン（それぞれ二重鎖番号８１０３及び８１０４）を有するコンストラクトに匹敵する肝臓ＰＮＰＬＡ３発現の低減もたらした。
実験の別の設定では、Ｐ３修飾パターンの代替的変種を設計し、ヒト化ＰＮＰＬＡ３マウスモデルにおけるインビボ効力を評価した。Ｐ３パターンの変種を、２つの異なる配列を備えるＲＮＡｉコンストラクトに適用した。ＲＮＡｉコンストラクトのそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を表１に示し、修飾パターンを図１に概略的に示す。ＲＮＡｉコンストラクトを、３ｍｇ／ｋｇの用量で、ヒト化ＰＮＰＬＡ３ｒｓ７３８４０９－ｒｓ７３８４０８変異体遺伝子を発現するマウスに皮下投与した。ＲＮＡｉコンストラクトの投与後２８日に、ｑＰＣＲによって肝臓中のヒトＰＮＰＬＡ３の発現レベルを評価した。結果を下記の表３に示す。全てのＲＮＡｉコンストラクトは、３ｍｇ／ｋｇの単一皮下注射から４週間後に、ヒトＰＮＰＬＡ３の肝臓発現を約９０％以上低減させた。
実施例２．異なる化学修飾パターンを用いたＡＳＧＲ１ＲＮＡｉコンストラクトのインビボ活性
実施例１に示す通り、ヒトＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡを標的化する異なる配列を備える１３の異なるＲＮＡｉコンストラクトに適用されたＰ１化学修飾パターンは、コンストラクトの遺伝子サイレンシング効力を改善させた。Ｐ１化学修飾パターンが、別の肝臓遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトの効力を強化するか否かを精査するために、実施例１に記載される方法に従い、Ｐ１化学修飾パターンを用いて、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）ｍＲＮＡを標的化するＲＮＡｉコンストラクトを合成した。同じ配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを、ＣＭ１対照化学修飾パターンを用いて合成した。ＲＮＡｉコンストラクトの配列を、上記の表１に記載される同じ表記を用いて以下の表４に提供する。式ＶＩＩに示される構造を備えるＧａｌＮＡｃ部分は、二重鎖番号１５２０として指定されるＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’末端にコンジュゲートし、式ＩＸに示される構造を備えるＧａｌＮＡｃ部分は、二重鎖番号１４２１として指定されるＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’末端にコンジュゲートした。ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖に対するＧａｌＮＡｃ部分のコンジュゲーションを、式ＩＸに示される構造を備えるＧａｌＮＡｃ部分に関してはＧａｌＮＡｃ部分を以下の通りに調製したことを除き、実施例１に記載される通りに実施した。ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の２－（２－（２－（２－（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）酢酸（５．３７ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＡＴＵ（３．２２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を５分間撹拌した。ＤＩＥＡ（２．９６ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、続いて混合物を上記の実施例１に記載したレジンに添加した。懸濁液を室温で終夜保持し、溶媒を排出した。レジンをＤＭＦ（３×３０ｍＬ）及びＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で洗浄した。
肝臓マウスＡＳＧＲ１発現（ｌｉｖｅｒ ｍｏｕｓｅ ＡＳＧＲ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の阻害におけるＲＮＡｉコンストラクトのインビボ効力を、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＲＮＡｉコンストラクトを投与することによって評価した。１０～１２週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６動物（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に標準の固形飼料（２０２０×Ｔｅｋｌａｄ ｇｌｏｂａｌ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒｅｅ ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ；Ｈａｒｌａｎ）を与えた。０日目に、マウスは、緩衝液、又は０．２５ｍｌ緩衝液中の体重１ｋｇ当たり５ｍｇの指定されたＲＮＡｉコンストラクトの皮下注射を受けた（１群当たりｎ＝９）。４日目に３体の動物、８日目に３体の動物、及び１５日目に３体の動物を、更なる分析のために捕獲した。捕獲された動物の肝臓の全ＲＮＡをｑＰＣＲ分析のために処理した。ＲＮＡｉコンストラクトで処置した動物の肝臓組織中のＡＳＧＲ１ｍＲＮＡの量を、緩衝液を注射した動物の肝臓組織中のＡＳＧＲ１ｍＲＮＡの量と比較することによって、ＲＮＡｉコンストラクトの効力を評価した。結果は、Ｐ１修飾パターン（二重鎖番号１５２０）を有するＲＮＡｉコンストラクトを受けた動物は、全ての測定時点において、ＣＭ１対照修飾パターンを有するＲＮＡｉコンストラクトを受けた動物よりも高い肝臓ＡＳＧＲ１発現の低減を示したことを示す（図６）。ヒトＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡを標的化するＲＮＡｉコンストラクトを用いた実施例１に記載される結果と同様に、Ｐ１化学修飾パターンは、ＲＮＡｉコンストラクトの効力を増加させる。
実施例３．異なる化学修飾パターンを用いたＬＰＡ ＲＮＡｉコンストラクトのインビボ活性
本明細書に記載される化学修飾パターンの、ＲＮＡｉコンストラクトのインビボ効力を増加させる能力を更に評価するために、実施例１に記載される方法に従って、第３の肝臓遺伝子であるＬＰＡ遺伝子を標的化するＲＮＡｉコンストラクトを合成し、式ＶＩＩに示される構造を備えるＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートした。ＲＮＡｉコンストラクトの配列を、上記の表１に記載される同じ表記を用いて以下の表５に提供する。表５は、各ＲＮＡｉコンストラクトのパターン指定及び配列ファミリー指定も列記する。パターン指定は、図１に概略的に表示される。ＲＮＡｉコンストラクトが別のＲＮＡｉコンストラクトと同じ配列ファミリー指定を有する場合、２つのコンストラクトは同じコア配列を有するが、化学修飾パターンが異なる。
初期実験では、同じヌクレオチド配列を有するＲＮＡｉコンストラクトを、ＣＭ１対照化学修飾パターン（二重鎖番号３６３２）又はＰ１化学修飾パターン（二重鎖番号３６３５）のいずれを有するように合成した。２つのコンストラクトのインビボ効力を、平均で約５０～６０ｍｇ／ｄＬの血清ベースラインＬｐ（ａ）レベルを有する完全機能的ヒトＬｐ（ａ）粒子を発現する二重トランスジェニックマウスモデル中で評価した。Ｌｐ（ａ）は、ＬＤＬ粒子、及びジスルフィド結合によってＬＤＬ粒子のアポリポタンパク質Ｂに結合した糖タンパク質のアポリポタンパク質（ａ）（ａｐｏ（ａ））からなる低濃度リポタンパク質である。Ａｐｏ（ａ）はＬＰＡ遺伝子によってコードされ、ＬＰＡ遺伝子の発現の変化を反映して血清Ｌｐ（ａ）レベルを変化させる。完全ヒトＬＰＡ遺伝子を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）からヒトａｐｏ（ａ）を発現するトランスジェニックマウス（Ｆｒａｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．９：４２４－４３１，１９９５）をヒトａｐｏＢ－１００を発現するトランスジェニックマウス（Ｌｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．９２：３０２９－３０３７，１９９３）と交配させることにより、二重トランスジェニックマウスを生み出した。ＬＰＡ ＲＮＡｉコンストラクトを、０．５ｍｇ／ｋｇ用量の単一皮下注射として投与した。注射前、続いて注射後の１４日目及び２８日目に血清試料を採取した。Ｌｐ（ａ）ＥＬＩＳＡアッセイ（カタログ番号１０－１１０６－０１、Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて血清中のＬｐ（ａ）濃度を測定した。動物のベースラインＬｐ（ａ）レベルに基づき、特定の時点における各動物のＬｐ（ａ）レベルのパーセント変化を計算した。結果を図７に示す。注射後２週間で、統計的に有意ではないものの、Ｐ１修飾パターンを有する二重鎖３６３５の投与により、対照ＣＭ１修飾パターンを有する二重鎖番号３６３２（－３５％）と比較して、血清Ｌｐ（ａ）レベルのより高い平均低減がもたらされた（－４９％）。
実験の第２シリーズでは、Ｐ１化学修飾パターン又はそのパターンの変種を用いて、実験の最初のセットにおけるものとは異なるＬＰＡｍＲＮＡの領域を標的化するＬＰＡ ＲＮＡｉコンストラクトを合成した。新規なパターンを有するＲＮＡｉコンストラクトを、二重トランスジェニックマウスモデルにおいて、インビボでのＬＰＡ遺伝子発現の抑制の大きさ及び期間の両方の増加に関して評価した。具体的には、Ｐ１修飾パターン、又はパターン変種（例えばＰ２、Ｐ４、Ｐ６、又はＰ７化学修飾パターン）のうちの１つを有する３つの異なる配列ファミリー由来のＬＰＡ ＲＮＡｉコンストラクトを、上記の二重トランスジェニックマウスに２ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。ベースラインレベルを得るため注射前に、並びにＬＰＡ ＲＮＡｉコンストラクトの投与後第１、２、及び４週に、動物中の血清Ｌｐ（ａ）レベルを測定した。実験のこのセットの結果を下記の表６に示す。３つの配列ファミリー全体にわたり、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、又はＰ７修飾パターンを有するＲＮＡｉコンストラクトは、Ｐ１修飾パターンを有するＲＮＡｉコンストラクトと比較して、Ｌｐ（ａ）血清レベルのより高い低減及び期間をもたらした。Ｐ６又はＰ７化学修飾パターンを有するＲＮＡｉコンストラクトは、２ｍｇ／ｋｇの単一皮下注射後に、最大で４週間、血清Ｌｐ（ａ）レベルの８０％超の低減をもたらした。
次に、化学修飾パターンの代替的変種を設計し、二重トランスジェニックマウスモデルにおけるインビボ効力に関して評価した。化学修飾パターンの変種を、５つの異なる配列ファミリー由来の配列を備えたＲＮＡｉコンストラクトに適用した。ＲＮＡｉコンストラクトのそれぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を表５に示し、修飾パターンを図１に概略的に示す。ＲＮＡｉコンストラクトを、ヒトＬｐ（ａ）粒子を発現する二重トランスジェニックマウスに１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。ベースラインレベルを得るため注射前に、並びにＬＰＡ ＲＮＡｉコンストラクトの投与後第２、３、及び４週に、動物中の血清Ｌｐ（ａ）レベルを測定した。結果を下記の表７に示す。Ｐ９、Ｐ１９、Ｐ２２、Ｐ２４、Ｐ２７、Ｐ２８、及びＰ２９などのパターン変種のうちいくつかは、１ｍｇ／ｋｇの単一皮下注射後４週間で５０％超のＬｐ（ａ）血清レベルの低減をもたらした。Ｐ２７化学修飾パターンを有するＲＮＡｉコンストラクトは、単一の注射後４週間で約７５％のＬｐ（ａ）レベルの持続的低減をもたらしたため、Ｌｐ（ａ）血清レベルを抑制するのに特に効果的であった。
本明細書において論じ、引用してきた全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは、変化し得ることが理解される。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
当業者は、本明細書中で記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を、単なる日常的な実験を使用して認識するか、又は確認可能であろう。このような同等物は、続く特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (52)

  1. センス鎖及びアンチセンス鎖を備える、標的遺伝子配列の発現を阻害するＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、前記標的遺伝子配列に相補的な配列を備え、前記センス鎖は、二重鎖領域を形成するのに十分に前記アンチセンス鎖の前記配列に相補的な配列を備え、前記ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ａ）によって表される構造を備え：
    ５’－（ＮＡ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＭＮＬＮＭＮＬＮＴ（ｎ）ｙ－３’
    ３’－（ＮＢ）ｚＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＭＮＬＮＭＮＬＮＬＮＦＮＭＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬ－５’
    （Ａ）
    式中、
    ５’から３’への方向で列記される上鎖は前記センス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖は前記アンチセンス鎖であり、
    各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、
    各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、及び２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
    各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを表し、
    ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
    ｘは０～４の整数であり、ただし、ｘが１、２、３、又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドの各々が独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであり、
    ｙは０～４の整数であり、ただし、ｙが１，２、３、又は４であるとき、ｎヌクレオチドは、独立して、前記アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しない修飾又は非修飾のオーバーハングヌクレオチドであり、
    ｚは０～４の整数であり、ただし、ｚが１、２、３、又は４であるとき、ＮＢヌクレオチドの各々は、独立して２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドである、ＲＮＡｉコンストラクト。
  2. 前記Ｎ Ａ ヌクレオチドのうち１つ以上は、前記アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり、前記Ｎ Ｂ ヌクレオチドのうち１つ以上は、前記センス鎖中に存在するときＮ Ａ ヌクレオチドに相補的であり、又は前記センス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しないオーバーハングヌクレオチドである、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  3. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ独立して１９～２３ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  4. （ｉ）ｘは０であり、ｙは２であり、ｚは２である、
    （ｉｉ）ｘは２であり、ｙは０であり、ｚは４である、
    （ｉｉｉ）ｘは２であり、ｙは０であり、ｚは２である、又は
    （ｉｖ）ｘは０であり、ｙは０であり、ｚは２である、
    請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  5. （ｉ）ｘは１であり、ＮＡは逆位脱塩基ヌクレオチドであり、ｙは２であり、ｚは２である、
    （ｉｉ）ｘは３であり、５’末端のＮＡは逆位脱塩基ヌクレオチドであり、ｙは０であり、ｚは４である、
    （ｉｉｉ）ｘは１であり、ＮＡは逆位脱塩基ヌクレオチドであり、ｙは０であり、ｚは２である、
    請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  6. ｘは２であり、各ＮＡヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、ｙは０であり、ｚは４であり、各ＮＢヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  7. ＮＴは、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、又は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  8. （ｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて４及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、
    （ｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、
    （ｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、１０及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、
    （ｉｖ）前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて１０及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、又は
    （ｖ）前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、１０及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、
    請求項１～７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  9. 前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、及び１０位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて１２位のＮＭは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１～７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  10. 前記センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項１～７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  11. 前記センス鎖中の各ＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項１～９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  12. 前記センス鎖中の各ＮＭは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１～９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  13. センス鎖及びアンチセンス鎖を備える、標的遺伝子配列の発現を阻害するＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、前記標的遺伝子配列に相補的な配列を備え、前記センス鎖は、二重鎖領域を形成するのに十分に前記アンチセンス鎖の前記配列に相補的な配列を備え、前記ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ｂ）によって表される構造を備え：
    ５’－（ＮＡ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＴ（ｎ）ｙ－３’
    ３’－（ＮＢ）ｚＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＦＮＬＮＦＮＬＮＦＮＬ－５’
    （Ｂ）
    式中、
    ５’から３’への方向で列記される上鎖は前記センス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖は前記アンチセンス鎖であり、
    各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、
    各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを表し、
    ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
    ｘは０～４の整数であり、ただし、ｘが１、２、３、又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドの各々は、独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであり、
    ｙは０～４の整数であり、ただし、ｙが１、２、３、又は４であるとき、ｎヌクレオチドが、独立して、前記アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しない修飾又は非修飾のオーバーハングヌクレオチドであり、
    ｚは０～４の整数であり、ただし、ｚが１、２、３、又は４であるとき、ＮＢヌクレオチ各々は、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであり、ＲＮＡｉコンストラクト。
  14. 前記Ｎ Ａ ヌクレオチドのうち１つ以上は、前記アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり、前記Ｎ Ｂ ヌクレオチドのうち１つ以上は、前記センス鎖中に存在するときＮ Ａ ヌクレオチドに相補的であり、又は前記センス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しないオーバーハングヌクレオチドである、請求項１３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  15. （ｉ）ｘは０であり、ｙは２であり、ｚは２である、
    （ｉｉ）ｘは０であり、ｙは０であり、ｚは２である、
    （ｉｉｉ）ｘは１であり、ＮＡは逆位脱塩基ヌクレオチドであり、ｙは２であり、ｚは２である、
    （ｉｖ）ｘは２であり、ｙは０であり、ｚは４である、又は
    （ｖ）ｘは３であり、５’末端のＮＡは逆位脱塩基ヌクレオチドであり、ｙは０であり、ｚは４である、
    請求項１３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  16. ｘは２であり、各ＮＡヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、ｙは０であり、ｚは４であり、各ＮＢヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項１３に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  17. ＮＴは、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、又は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  18. センス鎖及びアンチセンス鎖を備える、標的遺伝子配列の発現を阻害するＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、前記標的遺伝子配列に相補的な配列を備え、前記センス鎖は、二重鎖領域を形成するのに十分に前記アンチセンス鎖の前記配列に相補的な配列を備え、前記ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ｃ）によって表される構造を備え：
    ５’－（Ａｂ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＭＮＬＮＭＮＬＮＴ－３’
    ３’－ＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＦＮＬＮＬＮＬＮＬＮＦＮＬＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬ－５’
    （Ｃ）
    式中、
    ５’から３’への方向で列記される上鎖は前記センス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖は前記アンチセンス鎖であり、
    各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、
    各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを表し、
    各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、及び２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
    ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
    ｘは０又は１であり、Ａｂは逆位脱塩基ヌクレオチドである、ＲＮＡｉコンストラクト。
  19. 前記センス鎖及びアンチセンス鎖の両方中の各ＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項１８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  20. ＮＴは逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドであり、ｘは０である、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  21. ＮＴは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、ｘは１である、請求項１９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  22. 前記アンチセンス鎖中のＮＭは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  23. 前記センス鎖中の各ＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項２２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  24. 前記センス鎖中の各ＮＭは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項２２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  25. ＮＴは逆位脱塩基ヌクレオチド又は逆位デオキシリボヌクレオチドであり、ｘは０である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  26. センス鎖及びアンチセンス鎖を備える、標的遺伝子配列の発現を阻害するＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、前記標的遺伝子配列に相補的な配列を備え、前記センス鎖は、二重鎖領域を形成するのに十分に前記アンチセンス鎖の前記配列に相補的な配列を備え、前記ＲＮＡｉコンストラクトは、式（Ｄ）によって表される構造を備え：
    ５’－（ＮＡ）ｘＮＬＮＬＮＬＮＬＮＭＮＬＮＦＮＦＮＦＮＦＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＬＮＴ（ｎ）ｙ－３’
    ３’－（ＮＢ）ｚＮＬＮＬＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬＮＭＮＬＮＬＮＭＮＭＮＭＮＭＮＬＮＭＮＬＮＦＮＬ－５’
    （Ｄ）
    式中、
    ５’から３’への方向で列記される上鎖は前記センス鎖であり、３’から５’への方向で列記される下鎖は前記アンチセンス鎖であり、
    各ＮＦは２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、
    各ＮＭは、独立して、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、及び２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
    各ＮＬは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを表し、
    ＮＴは、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを表し、
    ｘは０～４の整数であり、ただし、ｘが１、２、３、又は４であるとき、ＮＡヌクレオチドの各々は、独立して、脱塩基ヌクレオチド、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドであり、
    ｙは０～４の整数であり、ただし、ｙが１、２、３、又は４であるとき、ｎヌクレオチドが、独立して、前記アンチセンス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しない修飾又は非修飾のオーバーハングヌクレオチドであり、
    ｚは０～４の整数であり、ただし、ｚが１、２、３、又は４であるとき、ＮＢヌクレオチドの各々が、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びデオキシリボヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドである、ＲＮＡｉコンストラクト。
  27. 前記Ｎ Ａ ヌクレオチドのうち１つ以上は、前記アンチセンス鎖中のヌクレオチドに相補的であり、前記Ｎ Ｂ ヌクレオチドのうち１つ以上は、前記センス鎖中に存在するときＮ Ａ ヌクレオチドに相補的であり、又は前記センス鎖中のヌクレオチドと塩基対合しないオーバーハングヌクレオチドである、請求項２６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  28. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、それぞれ独立して１９～２３ヌクレオチド長である、請求項２６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  29. （ｉ）ｘは２であり、ｙは０であり、ｚは４である、
    （ｉｉ）ｘは１であり、ＮＡは逆位脱塩基ヌクレオチドであり、ｙは２であり、ｚは２である、
    （ｉｉｉ）ｘは１であり、ＮＡは逆位脱塩基ヌクレオチドであり、ｙは０であり、ｚは２である、
    （ｉｖ）ｘは０であり、ｙは０であり、ｚは２である、又は
    （ｖ）ｘは２であり、ｙは０であり、ｚは２である、
    請求項２６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  30. ｘは２であり、各ＮＡヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、ｙは０であり、ｚは４であり、各ＮＢヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項２６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  31. ＮＴは、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド、又は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項２６～３０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  32. 前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、８、９、及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて７及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  33. 前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、８、９、及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて７及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  34. 前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、８、９、及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて７及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  35. 前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて７、８、９、及び１２位のＮＭは、それぞれ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、６、及び１６位のＮＭは、それぞれ２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  36. 前記センス鎖中のＮＭは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項２６～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  37. 前記センス鎖中のＮＭは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドである、請求項２６～３５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  38. 前記センス鎖、前記アンチセンス鎖、又は前記センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  39. 前記アンチセンス鎖は、３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項３８に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  40. 前記センス鎖は、３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項３８又は３９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  41. 前記センス鎖は、３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項３８又は３９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  42. リガンドをさらに含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  43. 前記リガンドは、コレステロール部分、ビタミン、ステロイド、胆汁酸、葉酸部分、脂肪酸、炭水化物、グリコシド、又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む、請求項４２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  44. 前記リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む、請求項４２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  45. 前記リガンドは、多価ガラクトース部分又は多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む、請求項４４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  46. 前記多価ガラクトース部分又は前記多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価又は四価である、請求項４５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  47. 前記リガンドは、任意選択的にリンカーを介して、前記センス鎖に共有結合的に結合される、請求項４２～４６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  48. 前記リガンドは、前記センス鎖の５’末端に共有結合的に結合される、請求項４７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  49. 請求項１～４８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトと、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
  50. 細胞中の標的遺伝子の発現を阻害するためのインビトロの方法であって、前記細胞を、請求項１～４８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトと接触させることを含む、方法。
  51. 対象中の標的遺伝子の発現を阻害するために前記対象に投与される請求項４９に記載の医薬組成物。
  52. 非経口投与経路を介して前記対象に投与される、請求項５１に記載の医薬組成物。
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