JP7827623B2 - ＬＰＡ発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクト及び方法 - Google Patents

ＬＰＡ発現を阻害するためのＲＮＡｉコンストラクト及び方法

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１２月９日出願の米国仮特許出願第６２／９４５，７７７号の利益を主張する。
電子提出されたテキストファイルの説明
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１２月８日に作成されたコンピュータ読み取り可能フォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ－２４２５－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＴ２５であり、サイズが１９０キロバイトである。
本発明は、アポリポタンパク質（ａ）（ａｐｏ（ａ））をコードするＬＰＡ遺伝子の肝臓発現を調節するための組成物及び方法に関する。詳細には、本発明は、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の血中レベルを低減させ、心血管疾患を治療又は予防するために、ＲＮＡ干渉を介してＬＰＡ遺伝子発現を低減するための核酸をベースにした治療薬、及びそのような核酸をベースにした治療薬を使用する方法に関する。
Ｌｐ（ａ）は、ＬＤＬ粒子、及びジスルフィド結合によってＬＤＬ粒子のアポリポタンパク質Ｂに結合した糖タンパク質であるａｐｏ（ａ）からなる低密度リポタンパク質である。ａｐｏ（ａ）は、ＬＰＡ遺伝子によってコードされ、ヒトを含む霊長類でほとんど独占的に発現する。ａｐｏ（ａ）は、プラスミノーゲンと相同性を示し、可変数のクリングルＩＶタイプ２（ＫＩＶ－２）ドメインリピートに起因する遺伝子内のサイズ多形により、様々なアイソフォームで存在する（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２７３：６－３０，２０１３を参照されたい）。ａｐｏ（ａ）アイソフォームのサイズとＬｐ（ａ）粒子の血漿濃度との間には、逆相関関係が観察されている（Ｓａｎｄｈｏｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．８６；６０７－６１４，１９９１）。
Ｌｐ（ａ）の生理学的機能は不明であるが、Ｌｐ（ａ）は、アテローム性動脈硬化症及び血栓症の形成において病因的役割があることが示されている（Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ ａｎｄ Ｌａｎｇｓｔｅｄ，Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５７：１９５３－７５，２０１６）。Ｌｐ（ａ）レベルと冠動脈疾患、心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患、及び大動脈弁狭窄症との間の関係は、いくつかの遺伝子研究及び観測研究で説明されてきた（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５７：１３３９－１３５９，２０１６）。このリスクの関係は連続的なものであり、Ｌｐ（ａ）レベルが高いほど、それに比例して影響が大きくなることが知られている。他の脂質パラメータを収集した後もこの関連性は存続する（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ，ＪＡＭＡ，Ｖｏｌ．３０２：４１２－４２３，２００９）。
血漿Ｌｐ（ａ）濃度の高さは遺伝的に確定されたものであり、安定したレベルで保持され、習慣の変更（食事、運動、又は他の環境要因）によってコントロールすることは不可能であり、現在利用可能な脂質低減薬のいずれかによって効果的にコントロールされることはない。現時点で、Ｌｐ（ａ）を低減させることによって心血管事象のリスクを低減することを示す、承認された療法が存在しない。プロタンパク質転換酵素であるサブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）阻害剤、ナイアシン、及びミポメルセンによって、Ｌｐ（ａ）を穏やかに低減させることが観察されている（Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３５：６８９－６９９，２０１５；Ｙｅａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．，Ｖｏｌ．２６：１６９－１７８，２０１５；及びＬａｎｄｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３７１：２０３－２１２，２０１４）。アフェレーシスは、Ｌｐ（ａ）を低下させるのに有効ではあるが、利用を制限した数カ国でしか現在使用されていない（Ｊｕｌｉｕｓ，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｅｖ．Ｄｉｓ．，Ｖｏｌ．５：２７－３７，２０１８）。加えて、アフェレーシスは非侵襲的であり、頻繁に来院することが必要となる極めて高価な処置であるため、生涯にわたる治療を必要とする対象が長期治療として利用することができない（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，Ｖｏｌ．３８：１５６１－１５６９，２０１７；Ｒｏｅｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３６：２０１９－２０２７，２０１６；Ｌｅｅｂｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１２８：２５６７－２５７６，２０１３；Ｓａｆａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｓｕｐｐｌ．，Ｖｏｌ．１４：９３－９９，２０１３）。
従って、心血管疾患に対して更なる保護を与えるための、長期間にわたって高いＬｐ（ａ）濃度を強力に低下させる新規の薬剤が、当技術分野で求められている。
Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２７３：６－３０，２０１３ Ｓａｎｄｈｏｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．８６；６０７－６１４，１９９１ Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ ａｎｄ Ｌａｎｇｓｔｅｄ，Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５７：１９５３－７５，２０１６ Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５７：１３３９－１３５９，２０１６ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ，ＪＡＭＡ，Ｖｏｌ．３０２：４１２－４２３，２００９ Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３５：６８９－６９９，２０１５ Ｙｅａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．，Ｖｏｌ．２６：１６９－１７８，２０１５ Ｌａｎｄｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３７１：２０３－２１２，２０１４ Ｊｕｌｉｕｓ，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｅｖ．Ｄｉｓ．，Ｖｏｌ．５：２７－３７，２０１８ Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，Ｖｏｌ．３８：１５６１－１５６９，２０１７ Ｒｏｅｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３６：２０１９－２０２７，２０１６ Ｌｅｅｂｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１２８：２５６７－２５７６，２０１３ Ｓａｆａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｓｕｐｐｌ．，Ｖｏｌ．１４：９３－９９，２０１３
本発明は、ＬＰＡ遺伝子を標的化し、且つ肝臓細胞においてコードされるａｐｏ（ａ）タンパク質の発現を低減させるＲＮＡｉコンストラクトの設計及び生成に部分的に基づく。ＬＰＡ遺伝子発現を配列特異的に阻害することは、心血管疾患などの上昇したＬｐ（ａ）レベルと関連する病態を治療又は予防するのに有用である。従って、一実施形態では、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、アンチセンス鎖は、ＬＰＡのｍＲＮＡ配列と相補的な配列を有する領域を含む、ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列のいずれかから選択される配列を含むか又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、約１５～約３０塩基対長の二重鎖領域を形成するように、アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。これらの及び他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して約１９～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１個又は２個の平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１個又は２個のヌクレオチドオーバーハングを含む。このようなヌクレオチドオーバーハングは、１～６個の不対ヌクレオチドを含んでもよく、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の３’末端、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置し得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端に２個の不対ヌクレオチドのオーバーハングを含み、且つセンス鎖の３’末端／アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リボース環、核酸塩基又はホスホジエステル骨格に対する修飾を有するヌクレオチドを含む、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－修飾ヌクレオチドを含む。このような２’－修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含み得る。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに、例えば、センス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に、末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを組み込んでもよい。このような実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは逆位であってよく、例えば、３’－３’ヌクレオチド間結合又は５’－５’ヌクレオチド間結合を介して隣接するヌクレオチドと結合されていてもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド間結合又はヌクレオシド間結合などの少なくとも１つの骨格修飾を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端又は５’末端に配置されてもよい。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖及び／又はセンス鎖は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列及びセンス配列由来の配列を含むか又はそれからなっていてもよい。特定の実施形態において、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１～表１５のいずれか１つに列記される二重鎖化合物のいずれか１つであり得る。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、４６０１、４６１３、４９３０、４９７０、６１５０、６１８２、６２４７、８３９５、８４０１、１０９２７、１１３１８、１１３４４、１１３５１、１１３７４、１１５８０、１７１８８、１７２０５、１８４３６、１８４４４、又は１８４４６である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、４６０１、４６１３、１０９２７、１１３５１、１１３７４、１１５８０、１８４３６、又は１８４４４である。
ＲＮＡｉコンストラクトは、肝臓細胞などの特定の組織又は細胞へのＲＮＡｉコンストラクトの送達又は取り込みを促進するリガンドを更に含み得る。特定の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトの肝細胞への送達を標的化する。これら及び他の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン又はＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含み得る。特定の実施形態では、リガンドは、三価又は四価のガラクトース又はＧａｌＮＡｃ部分などの多価ガラクトース又は多価ＧａｌＮＡｃ部分を含む。リガンドは、任意選択によりリンカーを介してＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’末端又は３’末端に共有結合されていてもよい。特定の実施形態では、リガンドは、本明細書に記載されるように、構造１の構造を含む。このような一実施形態では、この構造を有するリガンドは、任意選択によりアミノヘキシルリンカーなどのリンカーを介してセンス鎖の５’末端に共有結合される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載の式Ｉ～ＩＸのいずれか１つの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式ＶＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、式ＩＶの構造を有するリガンド及びリンカーを含む。
本発明はまた、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト、及び薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤のいずれかを含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、それを必要とする患者の細胞（例えば、肝臓細胞）においてＬＰＡ遺伝子の発現を低減させるのに特に有用である。本発明の医薬組成物を投与される可能性のある患者としては、心筋梗塞の病歴を有する患者、冠動脈疾患若しくは他の形態の心血管疾患と診断されるか、又はそのリスクを有する患者、及び血清Ｌｐ（ａ）若しくは血漿Ｌｐ（ａ）レベルが上昇した患者を挙げることができる。従って、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は医薬組成物を投与することにより、それを必要とする患者の心血管疾患を治療又は予防する方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト又は医薬組成物を投与することにより、それを必要とする患者のＬｐ（ａ）レベルを低減させるための方法を提供する。
本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトの使用、又は本明細書に記載の方法によって投与するための医薬の調製のためのＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトの使用が具体的に企図される。例えば、本発明は、それを必要とする患者の冠動脈疾患、末梢動脈疾患、心筋梗塞、又は脳卒中を含む心血管疾患を治療又は予防するための方法に使用するための、ＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトを含む。本発明はまた、それを必要とする患者のＬｐ（ａ）レベルを低減させるための方法に使用するための、ＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする患者の心筋梗塞のリスクを低減させるための方法に使用するための、ＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
本発明はまた、それを必要とする患者の冠動脈疾患、末梢動脈疾患、心筋梗塞、又は脳卒中を含む心血管疾患を治療又は予防するための医薬の調製における、ＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトの使用を包含する。特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者のＬｐ（ａ）レベルを低減させるための医薬の調製における、ＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。特定の他の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者の心筋梗塞のリスクを低減させるための医薬の調製における、ＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトの使用を提供する。
ヒトＬＰＡ（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５７７．４、配列番号１）の転写物のヌクレオチド配列を示す。転写物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 ヒトＬＰＡ（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５７７．４、配列番号１）の転写物のヌクレオチド配列を示す。転写物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 ヒトＬＰＡ（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５７７．４、配列番号１）の転写物のヌクレオチド配列を示す。転写物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 ヒトＬＰＡ（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５７７．４、配列番号１）の転写物のヌクレオチド配列を示す。転写物配列は、ウラシル塩基をチミン塩基に置き換えた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として示される。 カニクイザルの投与前のベースラインレベル、その後、１日目に２ｍｇ／ｋｇの指示されたＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトを皮下注射で単回投与したものと比較した、残存血清Ｌｐ（ａ）の割合を示す。 カニクイザルの投与前のベースラインレベル、その後、１日目に２ｍｇ／ｋｇの指示されたＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトを皮下注射で単回投与したものと比較した、残存血清Ｌｐ（ａ）の割合を示す。 カニクイザルの投与前のベースラインレベル、その後、１日目に２ｍｇ／ｋｇの指示されたＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトを皮下注射で単回投与したものと比較した、残存血清Ｌｐ（ａ）の割合を示す。
本発明は、細胞又は哺乳動物においてＬＰＡ遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ａｐｏ（ａ）タンパク質をコードするＬＰＡ遺伝子から転写されるｍＲＮＡを標的化し、且つ細胞又は哺乳動物においてａｐｏ（ａ）発現を低減させるＲＮＡｉコンストラクトを含む。このようなＲＮＡｉコンストラクトは、Ｌｐ（ａ）血清レベルを低減させ、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、大動脈弁狭窄症などの様々な形態の心血管疾患を治療又は予防し、心筋梗塞又は脳卒中のリスクを低減させるのに有用である。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡｉコンストラクト」という用語は、細胞に導入されるとＲＮＡ干渉機構を介して標的遺伝子（例えば、ＬＰＡ遺伝子）の発現を下方制御することができるＲＮＡ分子を含む薬剤を指す。ＲＮＡ干渉は、核酸分子が、例えば、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、配列特異的な様式で標的ＲＮＡ分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ又はｍＲＮＡ分子）の切断及び分解を誘導するプロセスである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するのに十分なほど互いに相補的な、連続したヌクレオチドの２本の逆平行鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子を含む。「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、典型的には、２つのポリヌクレオチドにおける相補的な塩基間の水素結合（例えば、ワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した相補的なポリヌクレオチドの対合を指す。標的配列（例えば、標的ｍＲＮＡ）と実質的に相補的な配列を有する領域を含む鎖は、「アンチセンス鎖」と称される。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む鎖を指す。いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的配列と実質的に同一の配列を有する領域を含み得る。
二重鎖ＲＮＡ分子は、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含んでよく、リボース糖、塩基、又はリボヌクレオチドの骨格構成要素に対する修飾、例えば、本明細書に記載されるもの、又は当該技術において知られているものが挙げられる。二本鎖ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）で使用されるような任意のこのような修飾は、本開示の目的上、「二本鎖ＲＮＡ」という用語によって包含される。
本明細書で使用する場合、生理的条件などの特定の条件下において、第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖領域を形成することができる場合、第１の配列は第２の配列に「相補的」である。他のこのような条件としては、中程度又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を挙げることができ、これらは当業者に公知である。第１の配列を含むポリヌクレオチドが、第２の配列を含むポリヌクレオチドと、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたっていかなるミスマッチもなく塩基対形成する場合、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。配列が標的配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相補的である場合、配列は、標的配列と「実質的に相補的」である。相補性パーセントは、第２の配列又は標的配列内の対応する位置の塩基と相補的な第１の配列内の塩基の数を第１の配列の全長で割ることによって算出することができる。２つの配列がハイブリダイズする場合、３０塩基対の二重鎖領域にわたって５、４、３又は２個以下のミスマッチが存在する場合、配列は他方の配列に対して実質的に相補的であると言うこともできる。一般に、本明細書で定義されるようなヌクレオチドオーバーハングが存在する場合、そのようなオーバーハングの配列は、２つの配列間の相補性の程度を判断する際に考慮されない。例として、ハイブリダイズして各鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する１９塩基対の二重鎖領域を形成する、２１ヌクレオチド長のセンス鎖及び２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖は、この用語が本明細書に使用される場合、完全に相補的であるとみなされることになる。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の領域は、標的ＲＮＡ配列（例えば、ＬＰＡのｍＲＮＡ）の領域と実質的に又は完全に相補的な配列を含む。このような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と完全に相補的な配列を含み得る。他のこのような実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列と実質的に相補的な配列、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖によって形成される二重鎖領域に１、２、３、４又は５個のミスマッチを有する配列を含み得る。特定の実施形態では、任意のミスマッチが末端領域内（例えば、鎖の５’末端及び／又は３’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド以内）に生じることが好ましい。一実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖から形成される二重鎖領域における任意のミスマッチは、アンチセンス鎖の５’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド以内に生じる。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するが、そうでなければ分離している別々の２つの分子であり得る。別々の２つの鎖から形成されるこのような二本鎖ＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）と称される。従って、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトはｓｉＲＮＡを含む。
他の実施形態では、ハイブリダイズして二重鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のＲＮＡ分子の一部であってもよく、すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖は、単一のＲＮＡ分子の自己相補的領域の一部である。このような場合、単一のＲＮＡ分子は、二重鎖領域（ステム領域とも称される）及びループ領域を含む。センス鎖の３’末端は、不対ヌクレオチドの隣接配列によってアンチセンス鎖の５’末端に結合され、これがループ領域を形成することになる。ループ領域は、通常、アンチセンス鎖がセンス鎖と塩基対を形成して二重鎖又はステム領域を形成することができるように、ＲＮＡ分子がそれ自身で再度折り畳まれることが可能なほど十分な長さを有する。ループ領域は、約３～約２５個、約５～約１５個又は約８～約１２個の不対ヌクレオチドを含み得る。少なくとも部分的に自己相補的な領域を有するこのようなＲＮＡ分子は、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）と称される。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ｓｈＲＮＡを含む。単一の、少なくとも部分的に自己相補的なＲＮＡ分子の長さは、約４０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約８５ヌクレオチド、又は約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドであってよく、本明細書に列記される長さをそれぞれ有する二重鎖領域及びループ領域を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＬＰＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含む。本明細書で使用する場合、「ＬＰＡのｍＲＮＡ配列」は、任意の種（例えば、非ヒト霊長類、ヒト）由来のａｐｏ（ａ）タンパク質のバリアント又はアイソフォームを含む、ａｐｏ（ａ）タンパク質をコードする対立遺伝子バリアント及びスプライスバリアントを含む任意のメッセンジャーＲＮＡ配列を指す。ＬＰＡ遺伝子（ＡＫ３８、ＡＰＯＡ、及びＬＰとしても公知である）は、リポタンパク質（ａ）又はＬｐ（ａ）として公知の低密度リポタンパク質粒子の主要な構成成分である。ヒトの場合、ＬＰＡ遺伝子は、遺伝子座６ｑ２５．３－ｑ２６の６番染色体に見られる。ＬＰＡ遺伝子は、遺伝子の対立遺伝子が、２～４０コピー以上の範囲となる可能性のあるクリングルＩＶタイプ２（ＫＩＶ－２）ドメインのコピー数が個体間で異なることにより、高度の多型性を有する（例えば、Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２７３：６－３０，２０１３を参照されたい）。
ＬＰＡのｍＲＮＡ配列はまた、その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列として発現する転写物配列を含む。ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、ウラシル、及びシトシン）ではなく、ＤＮＡ塩基（例えば、グアニン、アデニン、チミン、及びシトシン）として表される、ｍＲＮＡ転写物の配列を指す。従って、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、標的のＬＰＡのｍＲＮＡ配列又はＬＰＡのｃＤＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を有する領域を含み得る。ＬＰＡのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００５５７７．４（ヒト、図１、配列番号１）、ＸＭ＿０１５４４８５２０．１（カニクイザル）、ＸＭ＿０２８８４７００１．１（アカゲザル）、ＸＭ＿０２４３５７４８９．１（チンパンジー）、及びＸＭ＿０３１０１２２４４．１（ゴリラ）から選択される任意のＬＰＡのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＬＰＡのｍＲＮＡ配列は、参照配列ＮＭ＿００５５７７．４（図１、配列番号１を参照されたい）としてＮＣＢＩデータベースに列記されるヒト転写物である。
アンチセンス鎖の領域は、ＬＰＡのｍＲＮＡ配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと実質的に又は完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖が相補的な領域を含むＬＰＡのｍＲＮＡ配列の標的領域は、約１５～約３０個の連続したヌクレオチド、約１６～約２８個の連続したヌクレオチド、約１８～約２６個の連続したヌクレオチド、約１７～約２４個の連続したヌクレオチド、約１９～約３０個の連続したヌクレオチド、約１９～約２５個の連続したヌクレオチド、約１９～約２３個の連続したヌクレオチド、又は約１９～約２１個の連続したヌクレオチドの範囲であり得る。特定の実施形態では、ＬＰＡのｍＲＮＡ配列と実質的に又は完全に相補的な配列を含むアンチセンス鎖の領域は、いくつかの実施形態では、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列由来の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、アンチセンス配列は、表１又は表２に列記されるアンチセンス配列由来の少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、又は少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、通常、２本の鎖が生理的条件下でハイブリダイズして二重鎖領域を形成するように、アンチセンス鎖の配列と十分に相補的な配列を含む。「二重鎖領域」は、ワトソン－クリック塩基対合又は他の水素結合相互作用のいずれかによって互いに塩基対形成し、２つのポリヌクレオチド間で二重鎖を生成する２つの相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチドの領域を指す。ＲＮＡｉコンストラクトの二重鎖領域は、例えば、ダイサー酵素及び／又はＲＩＳＣ複合体が会合することによってＲＮＡｉコンストラクトがＲＮＡ干渉経路に入ることができるほど十分な長さでなければならない。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖領域は、約１５～約３０塩基対長である。この範囲内の二重鎖領域の他の長さ、例えば約１５～約２８塩基対、約１５～約２６塩基対、約１５～約２４塩基対、約１５～約２２塩基対、約１７～約２８塩基対、約１７～約２６塩基対、約１７～約２４塩基対、約１７～約２３塩基対、約１７～約２１塩基対、約１９～約２５塩基対、約１９～約２３塩基対又は約１９～約２１塩基対も好適である。特定の実施形態では、二重鎖領域は、約１７～約２４塩基対長である。他の実施形態では、二重鎖領域は、約１９～約２１塩基対長である。一実施形態では、二重鎖領域は、約１９塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖領域は、約２１塩基対長である。
センス鎖及びアンチセンス鎖が２つの別々の分子である（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトがｓｉＲＮＡを含む）実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖領域の長さと同じ長さである必要はない。例えば、一方又は両方の鎖が二重鎖領域よりも長く、二重鎖領域に隣接する１つ以上の不対ヌクレオチド又はミスマッチを有してもよい。従って、いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含む。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチドオーバーハング」は、鎖の末端における不対ヌクレオチド又は二重鎖領域を越えて延在するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドオーバーハングは、通常、一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延在するか、又は一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端を越えて延在する場合に生成される。ヌクレオチドオーバーハングの長さは、一般に、１～６ヌクレオチド、１～５ヌクレオチド、１～４ヌクレオチド、１～３ヌクレオチド、２～６ヌクレオチド、２～５ヌクレオチド、又は２～４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１、２、３、４、５又は６ヌクレオチドを含む。特定の一実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１～４ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、２ヌクレオチドを含む。特定の他の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、単一のヌクレオチドを含む。
オーバーハング内のヌクレオチドは、本明細書に記載されるようなリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、２’－修飾ヌクレオチド（例えば、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド）、デオキシリボヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆位ヌクレオチド（例えば、逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位デオキシリボヌクレオチド）、又はこれらの組み合わせである。例えば、一実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンである。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－ウリジン－ウリジン－３’（５’－ＵＵ－３’）ジヌクレオチドを含む。このような実施形態では、ＵＵジヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド、例えば２’－修飾ヌクレオチドを含み得る。他の実施形態では、オーバーハングは、５’－デオキシチミジン－デオキシチミジン－３’（５’－ｄＴｄＴ－３’）ジヌクレオチドを含む。ヌクレオチドオーバーハングがアンチセンス鎖に存在する場合、オーバーハング内のヌクレオチドは、標的遺伝子配列に相補的である場合もあり、標的遺伝子配列とミスマッチを形成する場合もあり、又は何らかの他の配列を含む場合もある（例えばポリピリミジン又はポリプリン配列、例えばＵＵ、ＴＴ、ＡＡ、ＧＧなど）。
ヌクレオチドオーバーハングは、一方又は両方の鎖の５’末端又は３’末端に存在してもよい。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及び３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトは、二重鎖ＲＮＡ分子の一方の末端に単一のヌクレオチドオーバーハングを含み、且つ他の末端に平滑末端を含み得る。「平滑末端」は、センス鎖及びアンチセンス鎖が分子の末端で完全に塩基対を形成しており、二重鎖領域を越えて延在する不対ヌクレオチドがないことを意味する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチドオーバーハングを含み、且つアンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端に平滑末端を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、二本鎖ＲＮＡ分子の両末端に平滑末端を含む。このような実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は同じ長さを有し、二重鎖領域はセンス鎖及びアンチセンス鎖と同じ長さである（すなわち、分子は、その全長にわたって二本鎖である）。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して約１５～約３０ヌクレオチド長、約１９～約３０ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１９～約２７ヌクレオチド長、約１９～約２５ヌクレオチド長、約１９～約２３ヌクレオチド長、約１９～約２１ヌクレオチド長、約２１～約２５ヌクレオチド長、又は約２１～約２３ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ独立して約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、又は約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有するが、ＲＮＡｉコンストラクトが２つのヌクレオチドオーバーハングを有するように、これらの鎖よりも短い二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、（ｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、並びに（ｉｉｉ）センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の３’末端の両方における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さを有し、二本鎖分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないように、その全長にわたって二重鎖領域を形成する。このような一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２１ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域を含む。別のこのような実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは平滑末端であり、（ｉ）それぞれ２３ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）２３塩基対長の二重鎖領域を含む。更に別のこのような実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは平滑末端であり、（ｉ）それぞれ１９ヌクレオチド長のセンス鎖及びアンチセンス鎖、並びに（ｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域を含む。
他の実施形態では、センス鎖又はアンチセンス鎖は、ＲＮＡｉコンストラクトが少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを含むように、他方の鎖よりも長く、２本の鎖が短い方の鎖の長さに等しい長さを有する二重鎖領域を形成する。例えば、一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）１９ヌクレオチド長のセンス鎖、（ｉｉ）２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）１９塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２１ヌクレオチド長のセンス鎖、（ｉｉ）２３ヌクレオチド長のアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）２１塩基対長の二重鎖領域、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端における２個の不対ヌクレオチドのヌクレオチドオーバーハングを含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのアンチセンス鎖は、表１若しくは表２に列記されるアンチセンス配列、これらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド１～１９の配列、又はこれらのアンチセンス配列のいずれかのヌクレオチド２～１９の配列のいずれか１つの配列を含むか又はそれからなっていてもよい。従って、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１３４～２４１、４３７～６０１、６１１、又は６１７～６１９から選択される配列を含むか又はそれからなる。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１３４～２４１、４３７～６０１、６１１、又は６１７～６１９のいずれか１つのヌクレオチド１～１９の配列を含むか又はそれからなる。更に他の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１３４～２４１、４３７～６０１、６１１、又は６１７～６１９のいずれか１つのヌクレオチド２～１９の配列を含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１３７、配列番号１４５、配列番号１６４、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８９、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０５、配列番号２１６、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７１、配列番号４９２、配列番号４９７、配列番号４９９、配列番号５１５、配列番号５２５、配列番号５３０、配列番号５３６、配列番号５４０、配列番号５４６、配列番号５４７、配列番号５５０、配列番号５６８、配列番号５７６、又は配列番号５７７から選択される配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１４５、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号４４８、配列番号４９２、配列番号４９７、配列番号５２５、配列番号５３０、配列番号５３６、又は配列番号５４０から選択される配列を含むか又はそれからなる。
これら及び他の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖は、表１若しくは表２に列記されるセンス配列、これらのセンス配列のいずれかのヌクレオチド１～１９の配列、又はこれらのセンス配列のいずれかのヌクレオチド２～１９の配列のいずれか１つの配列を含むか又はそれよりなっていてもよい。従って、いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号２～１３３、２４２～４３６、６１０、又は６１２～６１６から選択される配列を含むか又はそれからなる。他の実施形態では、センス鎖は、配列番号２～１３３、２４２～４３６、６１０、又は６１２～６１６のいずれか１つのヌクレオチド１～１９の配列を含むか又はそれからなる。更に他の実施形態では、センス鎖は、配列番号２～１３３、２４２～４３６、６１０、又は６１２～６１６のいずれか１つのヌクレオチド２～１９の配列を含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、センス鎖は、配列番号５、配列番号１３、配列番号３５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号７１、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９１、配列番号１０６、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号２４５、配列番号２５３、配列番号２８２、配列番号３０４、配列番号３０７、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３４１、配列番号３５０、配列番号３５７、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号４０４、配列番号４１３、又は配列番号４１５から選択される配列を含むか又はそれからなる。特定の他の実施形態では、センス鎖は、配列番号１３、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、配列番号１０６、配列番号２５３、配列番号３０４、配列番号３０７、配列番号３１２、配列番号３５０、配列番号３５７、配列番号３６２、配列番号３７０、又は配列番号４０４から選択される配列を含むか又はそれからなる。
本発明の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）２～１３３、２４２～４３６、６１０、又は６１２～６１６から選択される配列を含むか又はそれからなるセンス鎖、及び（ｉｉ）配列番号１３４～２４１、４３７～６０１、６１１、又は６１７～６１９から選択される配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号５、配列番号１３、配列番号３５、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号７１、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９１、配列番号１０６、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号２４５、配列番号２５３、配列番号２８２、配列番号３０４、配列番号３０７、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３４１、配列番号３５０、配列番号３５７、配列番号３６２、配列番号３６４、配列番号３７０、配列番号３７２、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号４０４、配列番号４１３、又は配列番号４１５から選択される配列を含むか又はそれからなるセンス鎖、及び（ｉｉ）配列番号１３７、配列番号１４５、配列番号１６４、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１８９、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０５、配列番号２１６、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７１、配列番号４９２、配列番号４９７、配列番号４９９、配列番号５１５、配列番号５２５、配列番号５３０、配列番号５３６、配列番号５４０、配列番号５４６、配列番号５４７、配列番号５５０、配列番号５６８、配列番号５７６、又は配列番号５７７から選択される配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号１３、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８５、配列番号１０６、配列番号２５３、配列番号３０４、配列番号３０７、配列番号３１２、配列番号３５０、配列番号３５７、配列番号３６２、配列番号３７０、又は配列番号４０４から選択される配列を含むか又はそれからなるセンス鎖、及び（ｉｉ）配列番号１４５、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号４４８、配列番号４９２、配列番号４９７、配列番号５２５、配列番号５３０、配列番号５３６、又は配列番号５４０から選択される配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖を含む。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号１３の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１４５の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉ）配列番号３５の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１６４の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）配列番号５３の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１７７の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｖ）配列番号９１の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号２０５の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｖ）配列番号４９の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１７５の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉ）配列番号７１の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１８９の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉ）配列番号５１の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１７５の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉｉ）配列番号７９の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１９４の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｘ）配列番号８５の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１９８の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘ）配列番号１０６の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号２１６の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉ）配列番号８３の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号２００の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｉ）配列番号７８の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１９６の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｉｉ）配列番号５の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１３７の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｖ）配列番号１１７の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号２２５の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖ）配列番号１１５の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号２２４の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖｉ）配列番号５４の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１７８の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、或いは（ｘｖｉｉ）配列番号８６の配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号１９８の配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、（ｉ）配列番号２５３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号４４８による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉ）配列番号２８２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号４７１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｉｉ）配列番号３１２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号４９７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｖ）配列番号３７８による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５４７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｖ）配列番号３０４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号４９２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉ）配列番号３４１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５１５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉ）配列番号３７７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５５０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｖｉｉｉ）配列番号３０７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号４９２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｉｘ）配列番号３５０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５２５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘ）配列番号３６２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５３６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉ）配列番号４０４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５６８による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｉ）配列番号３７０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５４０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｉｉ）配列番号３５７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５３０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｖ）配列番号２４５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号４４０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖ）配列番号４１５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５７７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖｉ）配列番号４１３による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５７６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖｉｉ）配列番号３１４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号４９９による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｖｉｉｉ）配列番号３７７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５４６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、（ｘｉｘ）配列番号３６４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５３６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖、或いは（ｘｘ）配列番号３７２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるセンス鎖及び配列番号５４０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか又はそれからなるアンチセンス鎖を含む。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、表１～１５に列記される二重鎖化合物（化合物の未修飾ヌクレオチド配列及び／又は修飾ヌクレオチド配列を含む）のいずれか１つであってよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表１に列記される二重鎖化合物のいずれかである。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表２に列記される二重鎖化合物（化合物の未修飾ヌクレオチド配列及び／又は修飾ヌクレオチド配列を含む）のいずれかである。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、４６０１、４６１３、４９３０、４９７０、６１５０、６１８２、６２４７、８３９５、８４０１、１０９２７、１１３１８、１１３４４、１１３５１、１１３７４、１１５８０、１７１８８、１７２０５、１８４３６、１８４４４、又は１８４４６である。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、４６０１である。別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、４６１３である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１０９２７である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１１３５１である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１１３７４である。更に別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１１５８０である。なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１８４３６である。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１８４４４である。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環又はホスフェート基に対して１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。本明細書で使用する場合、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチドを包含しない。しかしながら、ＲＮＡｉコンストラクトは、修飾ヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせを含み得る。二本鎖ＲＮＡ分子の一方又は両方の鎖に対する修飾ヌクレオチドの組み込みは、例えば、ヌクレアーゼ及び他の分解プロセスに対する分子の感受性を低減させることにより、ＲＮＡ分子のインビボ安定性を向上させることができる。修飾ヌクレオチドの組み込みにより、標的遺伝子の発現を低減させるためのＲＮＡｉコンストラクトの効力を増強させることもできる。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。これらの糖修飾には、ペントース環の２’位及び／又は５’位における修飾並びに二環式糖修飾が含まれ得る。２’－修飾ヌクレオチドは、ＯＨ以外の置換基を２’位に有するペントース環を有するヌクレオチドを指す。このような２’－修飾としては、２’－Ｈ（例えば、デオキシリボヌクレオチド）、２’－Ｏ－アルキル（例えば、Ｏ－Ｃ１～Ｃ１０又はＯ－Ｃ１～Ｃ１０置換アルキル）、２’－Ｏ－アリル（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ又は２’－フルオロとも称される）、２’－Ｏ－メチル（ＯＣＨ３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（Ｏ－（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’－ＯＣＦ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－アミノ（例えば、ＮＨ２）、２’－Ｏ－エチルアミン、及び２’－アジドが挙げられるがこれらに限定されない。ペントース環の５’位における修飾としては、５’－メチル（Ｒ又はＳ）、５’－ビニル及び５’－メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
「二環式糖修飾」は、架橋により環の２つの原子を連結して第２の環を形成し、二環式糖構造を生じさせる、ペントース環の修飾を指す。いくつかの実施形態では、二環式糖修飾は、ペントース環の４’炭素と２’炭素との間に架橋を含む。二環式糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書では二環式核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環式糖修飾としては、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）二環式核酸（ＢＮＡ）；β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ（ロックド核酸又はＬＮＡとも称される）；エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束エチル又はｃＥｔとも称される）；メチレン－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ；メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ２）３－２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ又はｃＭＯＥとも称される）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載され、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。
ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、どちらも１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の修飾ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。特定の他の実施形態では、センス鎖の全てのヌクレオチド及びアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。これら及び他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせであり得る。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの鎖の一方又は両方に組み込まれる修飾ヌクレオチドは、核酸塩基（本明細書では「塩基」とも称される）の修飾を有する。「修飾核酸塩基」又は「修飾塩基」は、天然に存在するプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）以外の塩基を指す。修飾核酸塩基は、合成又は天然に生じる修飾であってもよく、ユニバーサル塩基、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン（Ｘ）、ヒポキサンチン（Ｉ）、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル並びに他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル並びに他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、修飾塩基は、ユニバーサル塩基である。「ユニバーサル塩基」は、得られた二重鎖領域の二重らせん構造を変えることなく、ＲＮＡ及びＤＮＡの天然の塩基の全てと無差別に塩基対を形成する塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基は当業者に公知であり、イノシン、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル及び他の芳香族誘導体、アゾールカルボキサミド、並びに３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール及び６－ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含むが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる他の好適な修飾塩基としては、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１０：２９７－３１０，２０００、及びＰｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．７６：７２９５－７３００，２０１１に記載されているものが挙げられ、これらの両方が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。グアニン、シトシン、アデニン、チミン及びウラシルを、そのような置換核酸塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変えることなく、上述の修飾核酸塩基などの他の核酸塩基で置換してもよいことを、当業者は十分に認識している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、１つ以上の脱塩基ヌクレオチドを含み得る。「脱塩基ヌクレオチド」又は「脱塩基ヌクレオシド」は、リボース糖の１’位に核酸塩基がないヌクレオチド又はヌクレオシドである。特定の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の末端に組み込まれる。一実施形態では、センス鎖は、その３’末端、その５’末端、又はその３’末端及び５’末端の両方に、末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、その３’末端、その５’末端、又はその３’末端及び５’末端の両方に、末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む。脱塩基ヌクレオチドが末端ヌクレオチドであるこのような実施形態では、末端ヌクレオチドが逆位ヌクレオチドであってよく、すなわち、天然の３’－５’ヌクレオチド間結合ではなく、３’－３’ヌクレオチド間結合（鎖の３’末端上にある場合）を介して、又は５’－５’ヌクレオチド間結合（鎖の５’末端上にある場合）を介して、隣接するヌクレオチドに結合される。脱塩基ヌクレオチドはまた、上記に記載される糖修飾のいずれかなどの糖修飾を含み得る。特定の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、又は２’－Ｈ（デオキシ）修飾などの２’－修飾を含む。一実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。別の実施形態では、脱塩基ヌクレオチドは２’－Ｈ修飾を含む（すなわち、デオキシ脱塩基ヌクレオチド）。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトはまた、１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合を含み得る。本明細書で使用する場合、「修飾ヌクレオチド間結合」という用語は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート、３’－アルキレンホスホネート）、ホスフィネート、ホスホロアミダート（例えば、３’－アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、２’－５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であり、従って修飾ヌクレオシド間結合と称する場合もある。このようなリン非含有結合としては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン結合（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；スルフィド結合、スルホキシド結合及びスルホン結合；ホルムアセチル結合及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）結合及びメチレンヒドラジノ結合；スルホネート及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書に記載されているような、ペプチド核酸すなわちＰＮＡを生成するためのペプチドベースの結合（例えば、アミノエチルグリシン）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに使用され得る他の好適な修飾ヌクレオチド間結合及びヌクレオシド間結合は、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、同第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されており、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖に存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。更に他の実施形態では、両方の鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の３’末端に、約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖の５’末端に、約１個～約６個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６個以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわち、アンチセンス鎖の３’末端の第１及び第２のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の５’末端に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。更に別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートヌクレオチド間結合、並びにセンス鎖の５’末端及び３’末端の両方の第１及び第２のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖の３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一方又は両方の鎖が１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む実施形態のいずれかでは、鎖内の残りのヌクレオチド間結合が、天然の３’－５’ホスホジエステル結合であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。
ＲＮＡｉコンストラクトがヌクレオチドオーバーハングを含む実施形態では、オーバーハング内の不対ヌクレオチドの２つ以上が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されていてもよい。特定の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端のヌクレオチドオーバーハング内の全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の５’末端のヌクレオチドオーバーハング内の全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。更に他の実施形態では、あらゆるヌクレオチドオーバーハング内の全ての不対ヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結されている。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいくつかの実施形態では、センス鎖、アンチセンス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方の５’末端は、ホスフェート部分を含む。本明細書で使用する場合、「ホスフェート部分」という用語は、非修飾ホスフェート（－Ｏ－Ｐ＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨ）及び修飾ホスフェートを含む末端ホスフェート基を指す。修飾ホスフェートとしては、Ｏ及びＯＨ基の１つ以上がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）又はアルキル（ここで、Ｒは、Ｈ、アミノ保護基又は非置換若しくは置換アルキルである）で置換されているホスフェートが挙げられる。例示的なホスフェート部分としては、５’－モノホスフェート；５’－ジホスフェート；５’－トリホスフェート；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化若しくは非メチル化）；５’－アデノシンキャップ又は任意の他の修飾若しくは非修飾ヌクレオチドキャップ構造；５’－モノチオホスフェート（ホスホロチオエート）；５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート）；５’－α－チオトリホスフェート；５’－γ－チオトリホスフェート；５’－ホスホロアミダート；５’－ビニルホスフェート；５’－アルキルホスホネート（例えば、アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）；及び５’－アルキルエーテルホスホネート（例えば、アルキルエーテル＝メトキシメチル、エトキシメチルなど）を含むが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載される２つ以上の化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、リボース糖に対する修飾と、核酸塩基に対する修飾とを有し得る。例として、修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾（例えば、２’－フルオロ又は２’－Ｏ－メチル）を含んでもよく、修飾塩基（例えば、５－メチルシトシン又はプソイドウラシル）を含んでもよい。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれたときに、修飾ヌクレオチド間結合又はヌクレオシド間結合を生成することになる、５’ホスフェートに対する修飾と組み合わされた糖修飾を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、又は二環式糖修飾、及び５’ホスホロチオエート基などの糖修飾を含み得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの一方又は両方は、２’修飾ヌクレオチド又はＢＮＡ及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の鎖は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含む。修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチド間結合を含む例示的なＲＮＡｉコンストラクトを表２に示す。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、当技術分野において公知の技術を用いて、例えば従来の核酸固相合成法を用いて容易に作製することができる。ＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えば、ホスホラミダイト）を使用して、好適な核酸合成装置で構築することができる。自動核酸合成装置は、いくつかのベンダーによって市販されており、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）社製のＭｅｒＭａｄｅ合成装置、及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）社製のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置が挙げられる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトを合成するための例示的な方法を、実施例１で説明する。
２’シリル保護基を、リボヌクレオシドの５’位で酸に不安定なジメトキシトリチル（ＤＭＴ）と共に使用し、ホスホラミダイト化学特性によってオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。全ての合成は、任意の自動又は手動の合成装置中で大規模、中規模又は小規模に実行することができる。合成は、複数のウェルプレート、カラム又はスライドガラス中で実行することもできる。
２’－Ｏ－シリル基は、フッ化物イオンに曝露することによって除去することができ、フッ化物イオンとしては、フッ化物イオンのあらゆる源、例えば無機対イオンと対形成されるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム、又は有機対イオンと対形成されるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムを挙げることができる。脱保護反応では、クラウンエーテル触媒を無機フッ化物と組み合わせて使用することができる。好ましいフッ素イオン源は、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミノヒドロフルオリドである（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミド中で水性ＨＦをトリエチルアミンと混合する）。
亜リン酸トリエステル及びホスホトリエステルに使用する保護基を選択することにより、フッ化物に対するトリエステルの安定性を変化させることができる。ホスホトリエステル又は亜リン酸トリエステルをメチル保護することにより、フッ化物イオンに対して結合を安定化させ、且つプロセス収率を向上させることができる。
リボヌクレオシドは、反応性の２’ヒドロキシル置換基を有するため、ＲＮＡの反応性の２’位を、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル保護基に対して直交性である保護基、例えば酸処理に対して安定な保護基で保護することが望ましい場合がある。シリル保護基はこの条件を満たし、最終的なフッ化物脱保護工程において容易に除去することが可能であり、これによりＲＮＡ分解を最小減に抑えることが可能となる。
標準的なホスホラミダイトカップリング反応に、テトラゾール触媒を使用することができる。好ましい触媒としては、例えば、テトラゾール、Ｓ－エチル－テトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、ｐ－ニトロフェニルテトラゾールが挙げられる。
当業者によって理解され得るように、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを合成する更なる方法は、当業者には明らかであろう。加えて、様々な合成工程を代替の順番又は順序で実施して、所望の化合物を得てもよい。本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの合成に有用な他の合成化学転換、保護基（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのための）、及び保護基の方法論（保護及び脱保護）は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにそれらの後続の版に記載されているものなどが挙げられる。ＲＮＡｉ薬剤のカスタム合成は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含むいくつかの民間のベンダーからも入手可能である。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リガンドを含み得る。本明細書で使用する場合、「リガンド」は、別の化合物又は分子と直接的又は間接的に相互作用することができる任意の化合物又は分子を指す。リガンドの別の化合物又は分子との相互作用は、生物学的応答を誘発する（例えば、シグナル伝達カスケードを惹起する、受容体依存性エンドサイトーシスを誘導する）ものであってよく、又は単に物理的会合であってよい。リガンドは、結合する二本鎖ＲＮＡ分子の１つ以上の特性、例えばＲＮＡ分子の薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取込み、電荷及び／又はクリアランス特性を改変することができる。
リガンドは、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、グロブリン）、コレステロール部分、ビタミン（ビオチン、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２）、葉酸部分、ステロイド、胆汁酸（例えば、コール酸）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、若しくはヒアルロン酸）、グリコシド、リン脂質、又は抗体若しくはその結合断片（例えば、肝臓などの特定の細胞型に対してＲＮＡｉコンストラクトを標的化する抗体若しくは結合断片）を含み得る。リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル又はフェノキサジン、ペプチド（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）などのポリマー、ポリアミノ酸、及びポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン）が挙げられる。
特定の実施形態では、リガンドは、エンドソーム溶解特性を有する。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解、及び／又は、本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性膜活性及び膜融合性を示すポリカチオンペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性立体配座をとる。「活性」立体配座は、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解、及び／又は、本発明のＲＮＡｉコンストラクト若しくはその構成要素のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体配座である。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６：２９６４－２９７２，１９８７）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｒｎ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１８：１５８１－１５８６，１９９６）、及びこれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１５５９：５６－６８，２００２）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム溶解構成分は、ｐＨの変化に応答して電荷又はプロトン化に変化を起こす化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖状又は分枝状であってよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質又は他の疎水性分子を含む。一実施形態では、リガンドは、コレステロール部分又は他のステロイドを含む。コレステロールコンジュゲート型オリゴヌクレオチドは、それらの非コンジュゲート型オリゴヌクレオチドよりも活性であることが報告されている（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２：１０３－２２８，２００２）。核酸分子にコンジュゲートするためのコレステロール部分及び他の脂質を含むリガンドは、米国特許第７，８５１，６１５号明細書；同第７，７４５，６０８号明細書；及び同第７，８３３，９９２号明細書にも記載されており、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、リガンドは、葉酸部分を含む。葉酸部分とコンジュゲートしたポリヌクレオチドは、受容体依存性エンドサイトーシス経路を介して細胞に取り込まれることが可能となる。このような葉酸－ポリヌクレオチドコンジュゲートは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１８８，２４７号明細書に記載されている。
ＬＰＡ遺伝子は、主に肝臓に発現する。従って、特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを肝臓細胞に特異的に送達することが望ましい。従って、特定の実施形態では、リガンドは、以下でより詳細に記載するように、様々な手段を用いてＲＮＡｉコンストラクトの肝臓細胞（例えば、肝細胞）への特異的な送達を標的化する。特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、表面に発現したアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＲ）又はその構成成分（例えば、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２）に結合するリガンドにより、肝臓細胞に標的化される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、肝臓細胞の表面上に発現するタンパク質と結合又は相互作用するリガンドを用いることによって、肝臓に特異的に標的化され得る。例えば、特定の実施形態では、リガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体及びＬＤＬ受容体などの肝細胞に発現する受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ））を含み得る。特定の一実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体又はその結合断片を含む。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を含む。「Ｆａｂ断片」は、１つの免疫グロブリン軽鎖（すなわち、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ））、並びに１つの免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域及び可変領域（ＶＨ）から構成される。別の実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＲ１及び／又はＡＳＧＲ２に特異的に結合する、抗体の単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ断片）を含む。「ｓｃＦｖ断片」は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を含み、これらの領域は単鎖ポリペプチドに存在しており、任意選択により、Ｆｖが抗原結合に望ましい構造を形成することができるＶＨ領域とＶＬ領域との間にペプチドリンカーを含む。本発明のＲＮＡｉコンストラクトを肝臓に標的化するためのリガンドとして使用することができる、ＡＳＧＲ１に特異的に結合する例示的な抗体及びその結合断片は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０５８９４４号パンフレットに記載されている。本発明のＲＮＡｉコンストラクトのリガンドとして使用するのに好適なＡＳＧＲ１、ＬＤＬ受容体、又は他の肝臓の表面に発現するタンパク質に特異的に結合する他の抗体又はその結合断片は市販されている。
特定の実施形態では、リガンドは、炭水化物を含む。「炭水化物」は、酸素、窒素又は硫黄原子が各炭素原子に結合された、少なくとも６個の炭素原子（鎖状、分枝状又は環状であってよい）を有する１つ以上の単糖単位から構成される化合物を指す。炭水化物としては、糖（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及び約４、５、６、７、８又は９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）、並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース及び多糖類ガムなどの多糖が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ペントース、ヘキソース、又はヘプトースから選択される単糖、並びにこのような単糖単位を含む二糖及び三糖である。他の実施形態では、リガンドに組み込まれる炭水化物は、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、及びＮ－アセチルグルコサミンなどのアミノ糖である。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ヘキソース又はヘキソサミンを含む。ヘキソースは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、又はフルクトースから選択してもよい。ヘキソサミンは、フルクトサミン、ガラクトサミン、グルコサミン、又はマンノサミンから選択してもよい。特定の実施形態では、リガンドは、グルコース、ガラクトース、ガラクトサミン、又はグルコサミンを含む。一実施形態では、リガンドは、グルコース、グルコサミン、又はＮ－アセチルグルコサミンを含む。別の実施形態では、リガンドは、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。特定の実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンを含む。グルコース、ガラクトース、及びＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むリガンドは、このようなリガンドが肝細胞の表面に発現するＡＳＧＲに結合するため、化合物を肝臓細胞に標的化するのに特に有効である。例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｄｅｖａｒａｊａｎ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．２０３：１２６－１３９，２０１５を参照されたい。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むことができるＧａｌＮＡｃ又はガラクトース含有リガンドの例は、米国特許第７，４９１，８０５号明細書；同第８，１０６，０２２号明細書；及び同第８，８７７，９１７号明細書；米国特許出願公開第２００３０１３０１８６号明細書；並びに国際公開第２０１３１６６１５５号パンフレットに記載されており、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、リガンドは、多価炭水化物部分を含む。本明細書で使用する場合、「多価炭水化物部分」は、独立して他の分子と結合又は相互作用することができる２つ以上の炭水化物単位を含む部分を指す。例えば、多価炭水化物部分は、２つ以上の異なる分子又は同じ分子の２つ以上の異なる部位に結合することが可能な炭水化物からなる２つ以上の結合ドメインを含む。炭水化物部分の価数は、炭水化物部分内の個々の結合ドメインの数を示す。例えば、炭水化物部分に関する「一価」、「二価」、「三価」及び「四価」という用語は、それぞれ１、２、３及び４個の結合ドメインを有する炭水化物部分を指す。多価炭水化物部分は、多価ラクトース部分、多価ガラクトース部分、多価グルコース部分、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分、多価Ｎ－アセチル－グルコサミン部分、多価マンノース部分、又は多価フコース部分を含み得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース部分を含む。他の実施形態では、リガンドは、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む。これら及び他の実施形態では、多価炭水化物部分は、二価、三価、又は四価であり得る。このような実施形態では、多価炭水化物部分は、二分岐又は三分岐であり得る。特定の一実施形態では、多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分は、三価又は四価である。別の特定の実施形態では、多価ガラクトース部分は、三価又は四価である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトに組み込むための例示的な三価又は四価ＧａｌＮＡｃ含有リガンドを以下に詳述する。
リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのＲＮＡ分子に直接的又は間接的に結合又はコンジュゲートされていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に直接共有結合されている。他の実施形態では、リガンドは、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリンカーを介して共有結合されている。リガンドは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオチド間結合に結合されていてもよい。プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合は、環内原子及び環外原子を含む任意の位置で起こり得る。特定の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位又は８位がリガンドに結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーション又は結合もまた、任意の位置で起こり得る。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位及び６位がリガンドに結合されていてもよい。ヌクレオチドの糖部分へのコンジュゲーション又は結合は、任意の炭素原子で起こり得る。リガンドに結合され得る糖部分の例示的な炭素原子としては、２’、３’及び５’炭素原子が挙げられる。例えば、脱塩基ヌクレオチドでは、１’位もリガンドに結合することができる。ヌクレオチド間結合もリガンドの結合を促進することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートなど）の場合、リガンドは、リン原子又はリン原子に結合したＯ、Ｎ若しくはＳ原子に直接結合されていてもよい。アミン含有ヌクレオシド間結合又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、リガンドは、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合されていてもよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの３’末端又は５’末端に結合されていてもよい。特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端に共有結合されている。このような実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドに結合される。これら及び他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’位で結合される。逆位脱塩基ヌクレオチドがセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、５’－５’ヌクレオチド間結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される実施形態では、リガンドは、逆位脱塩基ヌクレオチドの３’位に結合されていてもよい。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に共有結合されている。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドに結合される。このような特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’位で結合される。逆位脱塩基ヌクレオチドがセンス鎖の３’末端ヌクレオチドであり、３’－３’ヌクレオチド間結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される実施形態では、リガンドは、逆位脱塩基ヌクレオチドの５’位に結合されていてもよい。代替的な実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端近傍に結合されるが、１つ以上の末端ヌクレオチドの前（すなわち、１、２、３又は４個の末端ヌクレオチドの前）で結合される。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。他の実施形態では、リガンドは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドの糖の２’位で結合される。
特定の実施形態では、リガンドは、リンカーを介してセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合される。「リンカー」は、リガンドをＲＮＡｉコンストラクトのポリヌクレオチド構成要素に共有結合させる原子又は原子団である。リンカーは、約１～約３０原子長、約２～約２８原子長、約３～約２６原子長、約４～約２４原子長、約６～約２０原子長、約７～約２０原子長、約８～約２０原子長、約８～約１８原子長、約１０～約１８原子長、及び約１２～約１８原子長であってよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、一般に、２つの官能基を有するアルキル部分を含む二官能性結合部分を含み得る。官能基の一方は、目的の化合物（例えば、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖）に結合するように選択され、他方は、本明細書に記載されるようなリガンドなどの任意の選択された基に実質的に結合するように選択される。特定の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール単位又はアミノ酸単位などの繰返し単位からなる鎖構造又はオリゴマーを含む。二官能性結合部分に通常用いられる官能基の例としては、求核性基と反応させるための求電子剤及び求電子性基と反応させるための求核剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二官能性結合部分としては、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、及び不飽和（例えば、二重結合又は三重結合）などが挙げられる。
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合するために使用してもよいリンカーとしては、ピロリジン、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミジル、６－アミノヘキサン酸、置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、又は置換若しくは非置換Ｃ２～Ｃ１０アルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなリンカーに好ましい置換基としては、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、リンカーは切断可能である。切断可能リンカーは、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞に入ると切断されて、リンカーが一体に保持している２つの部分を放出する。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、対象の血液中又は第２の参照条件下（例えば、血液若しくは血清中で見られる条件を模倣するか又はその条件を表すように選択され得る）よりも、標的細胞中又は第１の参照条件下（例えば、細胞内条件を模倣するか又は細胞内条件を表すように選択され得る）では、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、又は少なくとも１００倍速く切断される。
切断可能リンカーは、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に対して感受性である。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内部で優勢であるか、又は高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解性薬剤の例としては、例えば、細胞内に存在し、還元によって酸化還元切断可能リンカーを分解することができるメルカプタンなどの酸化酵素若しくは還元酵素又は還元剤を含む、特定の基質のために選択されるか、又は基質特異性のない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を生成することができる薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；一般的な酸として作用することによって酸切断可能リンカーを加水分解又は分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）及びホスファターゼが挙げられる。
切断可能リンカーは、ｐＨに対して感受性のある部分を含み得る。ヒト血清のｐＨは７．４だが、平均的な細胞内のｐＨはそれより僅かに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームのｐＨは、５．５～６．０の範囲でより酸性であり、リソソームのｐＨは、約５．０でより一層酸性である。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、それによってリガンドから細胞内部に、又は細胞の所望の区画にＲＮＡ分子を放出する切断可能な基を有する。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能となる切断可能な基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な基の種類は、標的化される細胞に依存し得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してＲＮＡ分子に結合されてもよい。肝臓細胞がエステラーゼに富んでいるため、このリンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型よりも肝臓細胞でより効果的に切断されることになる。エステラーゼに富む他の種類の細胞としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。肝細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞を標的化する場合に、ペプチド結合を含有するリンカーを用いることができる。
一般に、切断可能リンカー候補の適合性は、リンカー候補を切断する分解性薬剤の能力（又は条件）を試験することによって評価することができる。切断可能リンカー候補を血液中、又は他の非標的組織と接触させた場合に、切断に抵抗する能力について試験することも望ましい。従って、標的細胞内で切断を示すように選択される第１の条件と、他の組織又は体液、例えば血液又は血清内で切断を示すように選択される第２の条件との間で、切断に対する相対的感受性を判断することができる。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養物、臓器若しくは組織培養物中で、又は動物全体で実行することができる。無細胞又は培養条件で初期評価を行い、更に動物全体で評価することによって確認することが有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用なリンカー候補は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）内では少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍又は１００倍速く切断される。
他の実施形態では、酸化還元切断可能リンカーが使用される。酸化還元切断可能リンカーは、還元又は酸化されると切断される。還元的に切断可能な基の一例は、ジスルフィド結合基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能リンカー候補が、好適な「還元的な切断可能リンカー」であるかどうか、又は例えば特定のＲＮＡｉコンストラクト及び特定のリガンドと共に使用するのに好適であるかどうかを判断するために、本明細書に記載の１つ以上の方法を使用することができる。例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又は細胞、例えば標的細胞中で観察される切断速度を模倣する、当技術分野で公知の他の還元剤とインキュベートすることにより、リンカー候補を評価することができる。リンカー候補は、血液条件又は血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。特定の実施形態では、リンカー候補は、血液中で最大１０％切断される。他の実施形態では、有用なリンカー候補は、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して、細胞（又は細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）内では少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍又は１００倍速く分解される。
なお他の実施形態では、ホスフェート基を分解又は加水分解する薬剤によって切断されるホスフェート系切断可能リンカーを用いて、ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖にリガンドを共有結合する。細胞内でホスフェート基を加水分解する薬剤の例としては、細胞内のホスファターゼなどの酵素がある。ホスフェート系の切断可能な基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、及び－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－であり、ここで、Ｒｋは、水素又はアルキルであり得る。特定の実施形態としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、及び－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－が挙げられる。別の特定の実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらのリンカー候補は、上記に記載されるものに類似する方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、酸性条件下で切断される基である、酸切断可能な基を含み得る。いくつかの実施形態では、酸切断可能な基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境で、又は一般的な酸として作用することができる酵素などの薬剤によって切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨオルガネラが、酸切断可能な基に切断環境を提供することができる。酸切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル及びアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。特定の実施形態は、エステルの酸素（アルコキシ基）に結合した炭素が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチル、ペンチル若しくはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上記に記載したものに類似する方法を用いて評価することができる。
他の実施形態では、リンカーは、細胞内のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素によって切断される、エステル系の切断可能な基を含み得る。エステル系の切断可能な基の例としては、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能な基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、又は－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらのリンカー候補は、上記に記載されるものに類似する方法を用いて評価することができる。
更なる実施形態では、リンカーは、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素によって切断される、ペプチド系の切断可能な基を含み得る。ペプチド系の切断可能な基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを生じるような、アミノ酸間で形成されたペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含む。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間に形成されていてもよい。ペプチド結合は、ペプチド及びタンパク質を生じるような、アミノ酸間で形成される特殊なタイプのアミド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、一般に、ペプチド及びタンパク質を生じさせる、アミノ酸間で形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定される。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接するアミノ酸の側鎖である。これらの候補は、上記に記載したものに類似する方法を用いて評価することができる。
リガンドを本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させるのに好適な他の種類のリンカーは、当技術分野において公知であり、米国特許第７，７２３，５０９号明細書；同第８，０１７，７６２号明細書；同第８，８２８，９５６号明細書；同第８，８７７，９１７号明細書；及び同第９，１８１，５５１号明細書に記載されるリンカーを挙げることができ、これらの全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖又はアンチセンス鎖に共有結合されるリガンドは、ＧａｌＮＡｃ部分、例えば多価ＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は三価ＧａｌＮＡｃ部分であり、センス鎖の３’末端に結合される。他の実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は三価ＧａｌＮＡｃ部分であり、センス鎖の５’末端に結合される。なお他の実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は四価ＧａｌＮＡｃ部分であり、センス鎖の３’末端に結合される。更に他の実施形態では、多価ＧａｌＮＡｃ部分は四価ＧａｌＮＡｃ部分であり、センス鎖の５’末端に結合される。
特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、構造１：
の構造を有するリガンドを含む。
好ましい実施形態では、この構造を有するリガンドは、本明細書に記載のリンカーなどのリンカーを介してセンス鎖の５’末端に共有結合される。一実施形態では、リンカーはアミノヘキシルリンカーである。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトの二本鎖ＲＮＡ分子に結合することができる、例示的な三価及び四価ＧａｌＮＡｃ部分とリンカーとを以下の構造式Ｉ～ＩＸに示す。本明細書に列記される式中の「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式Ｉの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、ｍは１又は２であり、ｊは１又は２であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、ｍは１又は２であり、ｊは１又は２であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
なお別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
更に別の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＶの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の３’末端に結合される。
特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式Ｖの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
他の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、ｋは１～３であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
特定の一実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、Ｘ＝Ｏ又はＳであり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＶＩＩＩの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、各ｎは独立して１～３であり、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
特定の実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトは、以下の式ＩＸの構造を有するリガンド及びリンカーを含み、式中、リガンドは、二本鎖ＲＮＡ分子（実線の波線で表される）のセンス鎖の５’末端に結合される。
リガンド及びリンカーを核酸鎖に共有結合させるために、ホスホロチオエート結合を式Ｉ～ＩＸのいずれか１つに示されるホスホジエステル結合と置き換えることができる。
本発明はまた、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物及び製剤を含む。このような組成物及び製剤は、それを必要とする患者においてＬＰＡ遺伝子の発現を低減させるのに有用である。臨床上の用途が想定される場合、医薬組成物及び製剤は、目的の用途に適切な形態で調製される。一般に、このことは、パイロジェンだけでなく、ヒト又は動物に有害となる可能性のある他の不純物も実質的に含まない組成物の調製を伴う。
「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」という語句は、動物又はヒトに投与された場合、有害反応、アレルギー反応、又は他の不都合な反応をもたらすことのない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤」としては、ヒトに投与するのに好適な薬剤などの薬剤を製剤するのに使用するために許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。従来のあらゆる媒体又は薬剤が本発明のＲＮＡｉコンストラクトと適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分を、それらが組成物のＲＮＡｉコンストラクトを不活性化しないという条件で組成物に組み込むこともできる。
医薬組成物を製剤化するための組成及び方法は、投与経路、治療を受ける疾患若しくは傷害の種類及び程度、又は投与される用量が挙げられるが、これらに限定されないいくつかの基準によって決まる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、目的の送達経路に基づいて製剤化される。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達用に製剤化される。非経口の送達形態としては、静脈内、動脈内、皮下、髄腔内、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入が挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内送達用に製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、脂質ベースの送達ビヒクルを含み得る。別の実施形態では、医薬組成物は、皮下送達用に製剤化される。このような実施形態では、医薬組成物は、標的化リガンド（例えば、本明細書に記載のＧａｌＮＡｃ含有リガンド又は抗体含有リガンド）を含み得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、有効量の本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含む。「有効量」は、有益な又は所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象の特定の組織又は細胞型（例えば、肝臓又は肝細胞）においてＬＰＡ遺伝子の発現を低減させるのに十分な量である。有効量の本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重であってよく、毎日、毎週、毎月、又はそれよりも長い間隔で投与してもよい。有効量及び有効な投与頻度とみなされるものを正確に判断することは、患者の身長、年齢、及び全身状態、治療を受ける障害の種類（例えば、心筋梗塞、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳卒中）、使用される特定のＲＮＡｉコンストラクト、並びに投与経路を含むいくつかの要因に基づき得る。
本発明の医薬組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、一般的なあらゆる経路を介するものであってよい。そのような経路としては、非経口（例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内）、経口、経鼻、頬側、皮内、経皮、及び舌下経路、又は肝臓組織への直接注射若しくは肝門脈を介する送達が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与される。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与される。
水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベース系などのコロイド分散系を、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの送達ビヒクルとして使用してもよい。本発明の核酸を送達するのに好適な市販の脂肪エマルションとしては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ（Ｈｏｓｐｉｒａ）、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、及び他の類似の脂質エマルションが挙げられる。インビボにおける送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、リポソーム内に封入してもよく、又はリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。或いは、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体を形成してもよい。好適な脂質及びリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、並びにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。このようなコロイド分散系の調製及び使用は、当技術分野においてよく知られている。例示的な製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号明細書、米国特許第６，２１７，９００号明細書；米国特許第６，３８３，５１２号明細書；米国特許第５，７８３，５６５号明細書；米国特許第７，２０２，２２７号明細書；米国特許第６，３７９，９６５号明細書；米国特許第６，１２７，１７０号明細書；米国特許第５，８３７，５３３号明細書；米国特許第６，７４７，０１４号明細書；及び国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにも開示されている。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、脂質製剤内に完全に封入されており、例えばＳＮＡＬＰ又は他の核酸脂質粒子を形成する。本明細書で使用する場合、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定な核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰは、静脈内注射後に長期間の循環寿命を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積されるため、全身投与に極めて有用である。核酸脂質粒子は、通常、平均直径が約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、実質的に非毒性である。加えて、核酸脂質粒子中に存在しているときの核酸は、水溶液中におけるヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書、同第５，９８１，５０１号明細書、同第６，５３４，４８４号明細書、同第６，５８６，４１０号明細書、同第６，８１５，４３２号明細書、及び国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。
注射用途に好適な医薬組成物としては、例えば、滅菌水溶液又は分散体、及び滅菌注射溶液又は分散体の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。一般に、これらの調製物は、滅菌済みであり、容易に注射可能である程度の流体である。調製物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。適切な溶媒又は分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合液及び植物油を含有してもよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合に必要とされる粒径を維持することにより、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによって実現することができる。
滅菌注射溶液は、活性化合物を適切な量で所望の（例えば、上記に列挙したような）他の任意の成分と共に溶媒中に加えた後に、濾過滅菌することによって調製してもよい。一般に、分散体は、例えば、上記に列挙したような塩基性分散媒及び所望の他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌した種々の活性成分を加えることによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法としては、それらの予め滅菌濾過した溶液から、活性成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥及び凍結乾燥技術が挙げられる。
本発明の組成物は、一般に、中性又は塩形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマンデル酸など）から誘導される酸付加塩（遊離アミノ基により形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄）から誘導することもでき、又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することもできる。いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、ナトリウム塩として製剤化される。
例えば、水溶液中で非経口投与するために、溶液は一般に適切に緩衝化され、液体希釈剤は、例えば十分な生理食塩水又はグルコースによって最初に等張化される。このような水溶液を、例えば、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に使用してもよい。特に本開示を考慮すれば、当業者に知られているような滅菌水性媒体を使用することが好ましい。実例として、単回用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解して皮下注入液１０００ｍｌに添加してもよく、又は提示された注入部位に注射してもよい（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ基準に要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度の基準を満たさなければならない。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、滅菌生理食塩水及び本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含むか又はそれらからなる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及び滅菌水（例えば、注射用水、ＷＦＩ）を含むか又はそれらからなる。更に他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクト及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか又はそれらからなる。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与用デバイスによりパッケージ化されるか、又はその内部に貯蔵される。注射用製剤用のデバイスとしては、注射ポート、プレフィルドシリンジ、自動注入装置、注射ポンプ、オンボディインジェクター、及び注射ペンが挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾル化製剤又は粉末製剤用のデバイスとしては、インヘラー、吸入器、吸引器などが挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、本明細書に記載される障害又は疾患の１つ以上を治療又は予防するための本発明の医薬組成物を含む投与デバイスを含む。
本発明は、細胞を本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれか１つと接触させることによって、細胞（例えば、肝臓細胞）におけるＬＰＡ遺伝子の発現、従ってａｐｏ（ａ）タンパク質の生成を低減又は阻害するための方法を提供する。細胞は、インビトロ又はインビボであってよい。ＬＰＡ遺伝子発現は、ＬＰＡのｍＲＮＡ、ａｐｏ（ａ）タンパク質、又はＬｐ（ａ）の血清レベルなどのＬＰＡ発現に関連する別のバイオマーカーの量又はレベルを測定することによって評価することができる。本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置した細胞又は動物におけるＬＰＡ発現の低減は、ＲＮＡｉコンストラクトで処置しない、又は対照ＲＮＡｉコンストラクトで処置した細胞又は動物におけるＬＰＡ発現と比較して判断することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＬＰＡ発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置した肝臓細胞におけるＬＰＡのｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝臓細胞に発現しないＲＮＡ分子を対象とするＲＮＡｉコンストラクト、又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクト）で処置した肝臓細胞、或いはコンストラクトなしで処置した肝臓細胞におけるＬＰＡのｍＲＮＡの量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）で処置した細胞から測定したＬＰＡのｍＲＮＡレベルを、（ｂ）の対照細胞から測定したＬＰＡのｍＲＮＡレベルと比較することによって評価する。比較前に、処置した細胞及び対照細胞のＬＰＡのｍＲＮＡレベルを、対照遺伝子（例えば、１８ＳリボソームＲＮＡ又はハウスキーピング遺伝子）のＲＮＡレベルに正規化してもよい。ＬＰＡのｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ドロップレットデジタルＰＣＲなどを含む様々な方法で測定することができる。
他の実施形態では、ＬＰＡ発現の低減は、（ａ）本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置した肝臓細胞におけるａｐｏ（ａ）タンパク質の量又はレベルを測定すること、（ｂ）対照ＲＮＡｉコンストラクト（例えば、肝臓細胞で発現しないＲＮＡ分子を対象とするＲＮＡｉコンストラクト、又はナンセンス配列若しくはスクランブル配列を有するＲＮＡｉコンストラクト）で処置した肝臓細胞、或いはコンストラクトなしで処置した肝臓細胞におけるａｐｏ（ａ）タンパク質の量又はレベルを測定すること、及び（ｃ）（ａ）で処置した細胞から測定したａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを、（ｂ）の対照細胞から測定したａｐｏ（ａ）タンパク質レベルと比較することによって評価する。ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを測定する方法は当業者に公知であり、ウエスタンブロット、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）及びフローサイトメトリーが挙げられる。ＬＰＡのｍＲＮＡ又はａｐｏ（ａ）タンパク質を測定することができる任意の方法を使用して、本発明のＲＮＡｉコンストラクトの有効性を評価することができる。
いくつかの実施形態では、ＬＰＡ発現レベルを評価するための方法は、ＬＰＡ遺伝子を自然に発現する細胞（例えば、肝臓細胞）、又はＬＰＡ遺伝子を発現するように操作された細胞においてインビトロで実施される。特定の実施形態では、本方法は、肝臓細胞においてインビトロで実施される。好適な肝臓細胞としては、初代肝細胞（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類の肝細胞）、ＨｅｐＡＤ３８細胞、ＨｕＨ－６細胞、ＨｕＨ－７細胞、ＨｕＨ－５－２細胞、ＢＮＬＣＬ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、又はＨｅｐＧ２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、肝臓細胞は、ＨｕＨ－７細胞である。別の実施形態では、肝臓細胞は、ヒト初代肝細胞である。
他の実施形態では、ＬＰＡ発現レベルを評価するための方法は、インビボで実施される。ＲＮＡｉコンストラクト及び任意の対照ＲＮＡｉコンストラクトを動物（例えば、ＬＰＡ遺伝子を発現するトランスジェニック動物又は非ヒト霊長類）に投与して、処置後の動物から採取した膵臓組織におけるＬＰＡのｍＲＮＡレベル又はａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを評価することができる。或いは、又は更に、ＬＰＡ発現に関連するバイオマーカー又は機能表現型を、処置した動物で評価することができる。例えば、ａｐｏ（ａ）タンパク質は、血清又は血漿中に存在するＬｐ（ａ）の主成分である。従って、Ｌｐ（ａ）の血清又は血漿レベルを本発明のＲＮＡｉコンストラクトで処置した動物で測定し、ＬＰＡ発現の低減の機能的有効性を評価することができる。血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルの例示的な測定方法は、実施例３及び４に記載されている。
特定の実施形態では、ＬＰＡの発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって、肝臓細胞で少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％低減する。いくつかの実施形態では、ＬＰＡの発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって、肝臓細胞で少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％低減する。他の実施形態では、ＬＰＡの発現は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトによって、肝臓細胞で約９０％以上、例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上低減する。ＬＰＡ発現の低減率は、本明細書に記載の方法のいずれか、及び当技術分野で公知の他の方法によって測定することができる。
本発明は、それを必要とする患者におけるＬＰＡ遺伝子の発現、従ってａｐｏ（ａ）タンパク質の生成を低減又は阻害するための方法、及びＬＰＡ発現若しくはａｐｏ（ａ）活性に関連する病態、疾患、又は障害を治療又は予防する方法を提供する。「ＬＰＡ発現に関連する病態、疾患、又は障害」は、ＬＰＡ発現レベルが変化するか、又はＬＰＡの発現レベルの上昇が、病態、疾患、若しくは障害の発症リスクの増大に関連する病態、疾患、又は障害を指す。ＬＰＡ発現に関連する病態、疾患、又は障害はまた、Ｌｐ（ａ）、コレステロール、脂質、トリグリセリドなどの異常な若しくは上昇したレベルを生じる変化、又はこれらの分子のクリアランス障害を生じる変化などの、リポタンパク質代謝の異常な変化から生じた病態、疾患、又は障害を含み得る。ａｐｏ（ａ）タンパク質はＬｐ（ａ）の主成分であり、Ｌｐ（ａ）レベルの上昇は心血管疾患のリスクの増大に関連付けられている（例えば、Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，Ｖｏｌ．３１；２８４４－２８５３，２０１０；Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２７３：６－３０，２０１３；Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５７：１９５３－１９７５，２０１６；及びＴｓｉｍｉｋａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６９：６９２－７１１，２０１７を参照されたい）。従って、特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、心血管疾患（例えば、冠動脈疾患及び心筋梗塞）の治療又は予防、並びにＬｐ（ａ）の血中レベルを低減させるのに特に有用である。
本発明の方法に従って治療又は予防することができるＬＰＡ発現に関連する病態、疾患、及び障害としては、心筋梗塞、心不全、脳卒中（虚血性及び出血性）、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）、脳血管疾患、脆弱性プラーク、及び大動脈弁狭窄症などの心血管疾患；家族性高コレステロール血症；静脈血栓症；高コレステロール血症；高脂血症；並びに脂質異常症が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者のＬＰＡの発現を低減するための方法であって、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することを含む方法を提供する。本明細書で使用する場合、「患者」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を指し、「対象」という用語と互換的に使用することができる。好ましくは、患者の肝細胞におけるＬＰＡの発現レベルは、ＲＮＡｉコンストラクトを与えられていない患者のＬＰＡ発現レベルと比較して、又はＲＮＡｉコンストラクトを投与する前の患者のＬＰＡ発現レベルと比較して、ＲＮＡｉコンストラクトの投与後に低減する。いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与した後の患者におけるＬＰＡの発現は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低減する。ＬＰＡ発現の低減率は、本明細書に記載の方法のいずれか、及び当技術分野で公知の他の方法によって測定することができる。特定の実施形態では、ＬＰＡ発現の低減率は、本明細書に記載の方法に従って患者の血清又は血漿中のＬｐ（ａ）レベルを評価することによって決定する。
いくつかの実施形態では、ＬＰＡ発現を低減することが必要な患者は、心筋梗塞を患うリスクのある患者である。心筋梗塞を患うリスクのある患者は、心筋梗塞の病歴を有する（例えば、以前に心筋梗塞を患ったことがある）患者であり得る。心筋梗塞を患うリスクのある患者はまた、心筋梗塞の家族歴を有するか、又は１つ以上の心筋梗塞のリスク因子を有する患者であり得る。このようなリスク因子としては、高血圧、非ＨＤＬコレステロールのレベルの上昇、トリグリセリドのレベルの上昇、糖尿病、肥満症、又は自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、狼瘡）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、心筋梗塞を患うリスクのある患者は、冠動脈疾患を患っているか、又は冠動脈疾患と診断された患者である。これら及び他の患者の心筋梗塞のリスクは、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することによって低減させることができる。従って、本発明は、それを必要とする患者の心筋梗塞のリスクを低減させるための方法であて、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトを患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする患者の心筋梗塞のリスクを低減するための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者の心筋梗塞のリスクを低減させるための方法に使用するための、ＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。
特定の実施形態では、ＬＰＡ発現を低減することが必要な患者は、心血管疾患と診断されるか、又は心血管疾患のリスクのある患者である。従って、本発明は、本発明のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを投与することによって、それを必要とする患者の心血管疾患を治療又は予防するための方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする患者の心血管疾患を治療又は予防するための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者の心血管疾患を治療又は予防するための方法に使用するための、ＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。心血管疾患としては、心筋梗塞、心不全、脳卒中（虚血性及び出血性）、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）、脳血管疾患、脆弱性プラーク、及び大動脈弁狭窄症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って治療又は予防される心血管疾患は、冠動脈疾患である。他の実施形態では、本発明の方法に従って治療又は予防される心血管疾患は、心筋梗塞である。なお他の実施形態では、本発明の方法に従って治療又は予防される心血管疾患は、脳卒中である。更に他の実施形態では、本発明の方法に従って治療又は予防される心血管疾患は、末梢動脈疾患である。特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの投与は、非致死性の心筋梗塞、致死性及び非致死性の脳卒中、特定の種類の心臓手術（例えば、血管形成、バイパス）、心不全のための入院、心疾患患者における胸痛、並びに／又は確定した心疾患患者における心血管事象（例えば、心筋梗塞の既往、心臓手術の既往、及び／若しくは動脈閉塞の徴候がある胸痛）のリスクを低減させる。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従った本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトの投与は、再発性の心血管事象のリスクを低減させるために使用することができる。
特定の他の実施形態では、ＬＰＡ発現を低減することが必要な患者は、Ｌｐ（ａ）の血中レベルが上昇した患者である。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかを患者に投与することによって、それを必要とする患者のＬｐ（ａ）の血清又は血漿レベルを低減させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする患者のＬｐ（ａ）の血清又は血漿レベルを低減させるための医薬の調製における、本明細書に記載のＲＮＡｉコンストラクトのいずれかの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者のＬｐ（ａ）の血清又は血漿レベルを低減させるための方法に使用するための、ＬＰＡ標的化ＲＮＡｉコンストラクトを提供する。上記に記載したように、血中のＬｐ（ａ）レベルの上昇は、心血管疾患のリスクの増大と関連付けられている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉコンストラクトを投与する前の患者の血清又は血漿中のＬｐ（ａ）レベルと比較して、又はＲＮＡｉコンストラクトを与えられていない患者の血清又は血漿中のＬｐ（ａ）レベルと比較して、ＲＮＡｉコンストラクトを投与した後の患者の血清又は血漿中のＬｐ（ａ）レベルが低減する。特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトを投与した後に、患者の血清又は血漿中のＬｐ（ａ）レベルが、約１５０ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約１２５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約１００ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約７５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約７０ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約６５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約６０ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約５５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約５０ｎｍｏｌ／Ｌ、約４５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約４０ｎｍｏｌ／Ｌ以下、約３５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、又は約３０ｎｍｏｌ／Ｌ以下まで低減する。粒子濃度の単位（例えば、ｎｍｏｌ／Ｌ）において測定されたＬｐ（ａ）レベルに優先傾向があるが（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３；３７４－３９２，２０１９を参照されたい）、Ｌｐ（ａ）レベルを質量濃度の単位（例えば、ｍｇ／ｄＬ）で計算してもよい。このような実施形態では、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、患者の血清又は血漿中のＬｐ（ａ）レベルを、投与後に約１００ｍｇ／ｄＬ以下、約９０ｍｇ／ｄＬ以下、約８０ｍｇ／ｄＬ以下、約７０ｍｇ／ｄＬ以下、約６０ｍｇ／ｄＬ以下、約５０ｍｇ／ｄＬ以下、約４５ｍｇ／ｄＬ以下、約４０ｍｇ／ｄＬ以下、約３５ｍｇ／ｄＬ以下、約３０ｍｇ／ｄＬ以下、約２５ｍｇ／ｄＬ以下、約２０ｍｇ／ｄＬ以下、又は約１５ｍｇ／ｄＬ以下まで低減させることができる。血漿又は血清試料中のＬｐ（ａ）レベルは、Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）社製のＬｐ（ａ）ＥＬＩＳＡアッセイキット、Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．（Ｃｒｕｍｌｉｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）社製のＬｐ（ａ）免疫比濁アッセイ、若しくはＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ．（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）社製のＴｉｎａ－ｑｕａｎｔ（登録商標）Ｌｐ（ａ）アッセイなどの市販のキットを使用して、又はＭａｒｃｏｖｉｎａ ａｎｄ Ａｌｂｅｒｓ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５７：５２６－５３７，２０１６に記載されるような、当技術分野において公知の他の方法を使用して測定することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って治療を受ける患者は、Ｌｐ（ａ）の血中レベルが上昇した（例えば、Ｌｐ（ａ）の血清又は血漿レベルが上昇した）患者である。本発明の方法に従って治療を受ける患者は、約５０ｎｍｏｌ／Ｌ以上、約５５ｎｍｏｌ／Ｌ以上、約６０ｎｍｏｌ／Ｌ以上、約６５ｎｍｏｌ／Ｌ以上、約７０ｎｍｏｌ／Ｌ以上、約７５ｎｍｏｌ／Ｌ以上、約１００ｎｍｏｌ／Ｌ以上、約１２５ｎｍｏｌ／Ｌ以上、約１５０ｎｍｏｌ／Ｌ以上、約１７５ｎｍｏｌ／Ｌ以上、又は約２００ｎｍｏｌ／Ｌ以上の血中Ｌｐ（ａ）レベルを有し得る。特定の実施形態では、患者が約１００ｎｍｏｌ／Ｌ以上の血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルを有する場合、患者に本発明のＲＮＡｉコンストラクトが投与される。一実施形態では、患者が約１２５ｎｍｏｌ／Ｌ以上の血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルを有する場合、患者に本発明のＲＮＡｉコンストラクトが投与される。別の実施形態では、患者が約１５０ｎｍｏｌ／Ｌ以上の血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルを有する場合、患者に本発明のＲＮＡｉコンストラクトが投与される。血中Ｌｐ（ａ）レベルが質量濃度単位で測定される実施形態では、本発明の方法に従って治療を受ける患者は、約３０ｍｇ／ｄＬ以上、約３５ｍｇ／ｄＬ以上、約４０ｍｇ／ｄＬ以上、約４５ｍｇ／ｄＬ以上、約５０ｍｇ／ｄＬ以上、約５５ｍｇ／ｄＬ以上、約６０ｍｇ／ｄＬ以上、約６５ｍｇ／ｄＬ以上、約７０ｍｇ／ｄＬ以上、約７５ｍｇ／ｄＬ以上、又は約１００ｍｇ／ｄＬ以上の血中Ｌｐ（ａ）レベルを有し得る。一実施形態では、患者が約５０ｍｇ／ｄＬ以上の血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルを有する場合、患者に本発明のＲＮＡｉコンストラクトが投与される。別の実施形態では、患者が約７０ｍｇ／ｄＬ以上の血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルを有する場合、患者に本発明のＲＮＡｉコンストラクトが投与される。
特定の実施形態では、本発明の方法に従って治療を受ける患者は、脆弱性プラーク（不安定プラークとも称する）を患う患者である。脆弱性プラークは、動脈壁の内皮内膜の下にマクロファージ及び主にコレステロールを含有する脂質が蓄積したものである。これらの脆弱性プラークは、破裂して血栓の形成が生じる可能性があり、場合によりこの血栓が動脈を流れる血流を遮断し、心筋梗塞又は脳卒中を引き起こす可能性がある。脆弱性プラークは、血管内超音波及びコンピュータ断層撮影を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の方法によって識別することができる（Ｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２５；２０２６－２０３３，２００４；Ｂｕｄｈｏｆｆ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４８；３１９－３２１，２００６；Ｈａｕｓｌｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４８；３１２－３１８，２００６）。
実施した実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１．ＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトの設計及び合成
ヒトＬＰＡ転写物のバイオインフォマティクス解析によって、ヒトＬＰＡ遺伝子を標的化する治療用のｓｉＲＮＡ分子の設計のための候補配列を同定し、その配列を配列番号１として本明細書に示す（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５７７．４、図１を参照されたい）。ヒトＬＰＡ遺伝子は、遺伝子の対立遺伝子でクリングルＩＶ－２（ＫＩＶ－２）ドメインリピート数が個体間で異なることにより、高度の多型性を有する。ＫＩＶ－２ドメインリピートは、個体間で２～４３コピーの範囲であり得る。配列番号１として本明細書に示される転写物は、１５コピーのＫＩＶ－２ドメインを含有する対立遺伝子のバリアントである。インハウスのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムを使用して配列を分析し、特定の基準を満たす場合に選択する。配列を、カニクイザル由来のＬＰＡ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列番号ＸＭ＿０１５４４８５２０．１）との交差反応性、他のヒト遺伝子配列との配列相同性、及びオフターゲット効果を予測するためのヒトマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列とのシード配列の一致、並びに公知の一塩基多型との重複についても評価した。バイオインフォマティクス解析の結果に基づいて４６５個の配列を選択し、そのうちの３２０個の配列を最初の合成及びインビトロ検査に優先させた。
固相ホスホラミダイト化学特性を用いてＲＮＡｉコンストラクトを合成した。合成は、ＭｅｒＭａｄｅ１２又はＭｅｒＭａｄｅ１９２Ｘ（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）機器で実施した。２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む種々の化学修飾を分子に組み込んだ。ＲＮＡｉコンストラクトは、一般に、アンチセンス鎖及び／又はセンス鎖の３’末端にオーバーハングがない状態（二重鎖ブラントマー（ｄｏｕｂｌｅ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）、又は２ヌクレオチドの１個若しくは２個のオーバーハングを有する状態のいずれかでアニーリングした場合、１９～２１塩基対の二重鎖に形式化される。ＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖を、更に下記に記載される三価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分にコンジュゲートした。
材料
アセトニトリル（ＤＮＡ合成等級、ＡＸＯ１５２－２５０５、ＥＭＤ）
キャッピング試薬Ａ（８０：１０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン／ルチジン／無水酢酸、ＢＩＯ２２１／４０００、ＥＭＤ）
キャッピング試薬Ｂ（１６％１－メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン、ＢＩＯ３４５／４０００、ＥＭＤ）
活性剤溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍの５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、ＢＩＯ１５２／０９６０、ＥＭＤ）
脱トリチル化試薬（ジクロロメタン中３％ジクロロ酢酸、ＢＩＯ８３０／４０００、ＥＭＤ）
酸化試薬（７０：２０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン／ピリジン／水中０．０２Ｍのヨウ素、ＢＩＯ４２０／４０００、ＥＭＤ）
ジエチルアミン溶液（アセトニトリル中２０％ＤＥＡ、ＮＣ００１７－０５０５、ＥＭＤ）
チオール化試薬（４０：６０（ｖ／ｖ）ピリジン／アセトニトリル中０．０５Ｍの５－Ｎ－［（ジメチルアミノ）メチレン］アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＢＩＯＳＵＬＩＩ／１６０Ｋ））
約１０ｍＬのモレキュラーシーブ（３Å、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）上のアセトニトリル中のアデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンの５’－アミノヘキシルリンカーホスホラミダイト、リン酸化ホスホラミダイト、２’－デオキシチミジンホスホラミダイト、並びに２’－メトキシ及び２’－フルオロホスホラミダイト（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１０Ｍ
ＣＰＧ支持体（高負荷汎用支持体、５００Ａ（ＢＨ５－３５００－Ｇ１）、７９．６μｍｏｌ／ｇ、０．１２６ｇ（１０μｍｏｌ））
水酸化アンモニウム（高濃度、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）
合成
ＭｅｒＭａｄｅ１２機器に、試薬溶液、ホスホラミダイト溶液、及び溶媒を接続した。各カラム（上下フリットを備える４ｍＬのＳＰＥチューブ）に固体支持体を添加し、このカラムを機器に取り付けた。カラムをアセトニトリルで２回洗浄した。ホスホラミダイト及び試薬溶液ラインをパージした。Ｐｏｓｅｉｄｏｎソフトウェアを使用して合成を開始した。合成は、脱保護／カップリング／酸化／キャッピングの合成サイクルを繰り返すことによって実行した。具体的には、固体支持体に脱トリチル化試薬を添加し、５’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を除去した。固体支持体をアセトニトリルで洗浄した。支持体にホスホラミダイト及び活性剤溶液を添加した後、入ってくるヌクレオチドを遊離５’－ヒドロキシル基に結合させるためにインキュベートした。支持体をアセトニトリルで洗浄した。支持体に酸化試薬又はチオール化試薬を添加して、亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステル又はホスホロチオエートに変換した。支持体にキャッピング試薬Ａ及びＢを添加して、あらゆる未反応のオリゴヌクレオチド鎖を終結させた。支持体をアセトニトリルで洗浄した。最終反応サイクル後、レジンをジエチルアミン溶液で洗浄し、２－シアノエチル保護基を除去した。支持体をアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥させた。
ＧａｌＮＡｃコンジュゲーション
５’－アミノヘキシルリンカーを用いて、三価ＧａｌＮＡｃ部分（下記の式ＶＩＩに示す構造）にコンジュゲートするためのセンス鎖を調製した。自動合成後、機器からカラムを取り出し、フード内で真空マニホールドに移した。５’－モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）保護基を、真空濾過でジクロロメタン（ＤＣＭ）中１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の２ｍＬのアリコートによって連続的に処理することで固体支持体から除去した。溶出液中で橙色／黄色がこれ以上観察されなくなったら、レジンをジクロロメタンで洗浄した。レジンを５ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２％のジイソプロピルエチルアミンで洗浄した。別のバイアル中で、ＧａｌＮＡｃ３－Ｌｙｓ２－Ａｈｘ（６７ｍｇ、４０μｍｏｌ）（その構造及び合成を下記に記載する）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液を、１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＡＴＵ、１２．８３ｍｇ、４０μｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１３．９μＬ、８０μｍｏｌ）を用いて調製した。活性化したカップリング溶液をレジンに添加し、カラムに蓋をして室温で一晩インキュベートした。レジンをＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥させた。
切断
合成装置又は真空マニホールドから合成カラムを取り出した。各カラムから固体支持体を１０ｍＬバイアルに移した。固体支持体に４ｍＬの高濃度水酸化アンモニウムを添加した。ボトルにキャップをしっかりと取り付け、混合物を５５℃で４時間加熱した。ボトルを冷凍庫に移し、２０分間冷却してからフード内で開封した。混合物を８ｍＬのＳＰＥチューブで濾過し、固体支持体を除去した。バイアル及び固体支持体を、１ｍＬの５０：５０エタノール／水ですすいだ。
分析及び精製
陰イオン交換クロマトグラフィーにより、合わせた濾液の一部を分析及び精製した。プールした画分を、サイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩し、イオン対逆相高速液体クロマトグラフ質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）によって分析した。プールした画分を凍結乾燥し、白色の非晶質粉末を得た。
分析的アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）：
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ２００ＲＳ（４．６×５０ｍｍ、４μｍ）
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５、１Ｍ臭化ナトリウム
流速：４０℃で１ｍＬ／分
勾配：６．２分で２０～６５％Ｂ
分取陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）：
カラム：東ソー株式会社 ＴＳＫ Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１×１５０ｍｍ、１３μｍ
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、ｐＨ８．５、１Ｍ臭化ナトリウム
流速：８ｍＬ／分
注入量：５ｍＬ
勾配：２０分にわたって３５～５５％Ｂ
分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：
カラム：ＧＥ Ｈｉ－Ｐｒｅｐ ２６／１０
機器：ＧＥ ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ
緩衝液：水中２０％エタノール
流速：１０ｍＬ／分
注入量：試料負荷ポンプを用いて１５ｍＬ
イオン対逆相（ＩＰ－ＲＰ）ＨＰＬＣ：
カラム：Ｗａｔｅｒ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＯＳＴ Ｃ１８、２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ
緩衝液Ａ：水中１５．７ｍＭのＤＩＥＡ、５０ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）
緩衝液Ｂ：５０：５０水／アセトニトリル中１５．７ｍＭのＤＩＥＡ、５０ｍＭのＨＦＩＰ
流速：０．５ｍＬ／分
勾配：６分にわたって１０～３０％Ｂ
アニーリング
少量のセンス鎖及びアンチセンス鎖を個々のバイアルに秤量した。バイアルにｓｉＲＮＡ再構成緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加して、乾燥重量を基準として約２ｍＭの濃度にした。実際の試料濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（ｓｓＤＮＡ、吸光係数＝３３μｇ／ＯＤ２６０）で測定した。続いて、２つの鎖を等モル比で混合し、試料を９０℃のインキュベーターで５分間加熱し、室温となるまでゆっくりと冷却させた。試料をＡＥＸによって分析した。二重鎖を登録し、下記でより詳細に記載するようにインビトロ及びインビボ試験に供した。
ＧａｌＮＡｃ３－Ｌｙｓ２－Ａｈｘの調製
式中、Ｘ＝Ｏ又はＳである。波線はＲＮＡｉコンストラクトのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドに結合する箇所を表す。
５０ｍＬのｆａｌｃｏｎチューブに、ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ａｈｘ－ＯＨ（１．１３ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（２．２３ｍＬ、１２．７８ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を５０ｍＬの遠心チューブ内の２－Ｃｌ塩化トリチルレジン（３．０３ｇ、４．７９ｍｍｏｌ）に添加し、振とう器に２時間投入した。溶媒を排出し、レジンを１７：２：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ（３０ｍｌ×２）、ＤＣＭ（３０ｍＬ×４）で洗浄して乾燥させた。２９０ｎｍのＵＶ分光光度検出により、投入量を０．７６ｍｍｏｌ／ｇと測定した。
投入した３ｇの２－Ｃｌトリチルレジンを、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中２０％の４－メチルピペリジンに懸濁させ、３０分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に１回繰り返し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×３）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で洗浄した。
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ（３．４５ｇ、６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、ＴＡＴＵ（１．９４ｇ、６ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（１．８３ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。続いて、溶液を上記の脱保護されたレジンに添加し、懸濁液を振とう器上に一晩置いた。溶媒を排出し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×３）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で洗浄した。
レジンをＤＭＦ（１５ｍＬ）中２０％の４－メチルピペリジンで処理し、１０分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に１回繰り返し、レジンをＤＭＦ（１５ｍＬ×４）及びＤＣＭ（１５ｍＬ×４）で洗浄した。
Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ（３．５４ｇ、６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、ＴＡＴＵ（１．９４ｇ、６ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（１．８３ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。続いて、溶液を上記の脱保護されたレジンに添加し、懸濁液を振とう器上に一晩置いた。溶媒を排出し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×３）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で洗浄した。
レジンをＤＭＦ（２０ｍＬ）中５％のヒドラジンで処理し、５分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に４回繰り返し、レジンをＤＭＦ（３０ｍＬ×４）及びＤＣＭ（３０ｍＬ×４）で洗浄した。
５－（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）－３－アセトアミド－４，５－ジアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ペンタン酸（４．４７ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４０ｍＬ）溶液にＴＡＴＵ（３．２２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を５分間撹拌した。この溶液にＤＩＥＡ（２．９６ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）を添加し、続いてこの混合物を上記のレジンに添加した。懸濁液を一晩室温に保ち、溶媒を排出した。レジンをＤＭＦ（３×３０ｍＬ）及びＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で洗浄した。
レジンをＤＣＭ（３０ｍＬ、３％トリイソプロピルシランを含む）中１％のＴＦＡで処理し、５分後に溶媒を排出した。このプロセスを更に３回繰り返し、合わせた濾液を減圧下で濃縮した。残渣をジエチルエーテル（５０ｍＬ）で粉砕し、懸濁液を濾過し、乾燥させて粗生成物を得た。粗生成物を逆相クロマトグラフィーで精製し、水中０～２０％のＭｅＣＮで溶出した。画分を合わせて凍結乾燥し、白色固体として生成物を得た。
実施例２に記載するようなインビトロ細胞ベースアッセイ、及び実施例３に記載するようなインビトロトランスジェニックマウス試験の活性に基づき、ヒトＬＰＡ転写物の特定の領域を標的化する１３７個の配列を構造活性相関（ＳＡＲ）試験用に選択した。下記の表１には、１３７個の配列のファミリーのそれぞれの分子の未修飾のセンス配列及びアンチセンス配列が列記されている。また、ヒトＬＰＡ転写物（配列番号１）内のそれぞれの配列ファミリーのｓｉＲＮＡ分子によって標的化されるヌクレオチドの範囲が表１に示されている。上述のように、ヒトＬＰＡ遺伝子は、ＫＩＶ－２ドメインリピートを含有するため、標的部位がＫＩＶ－２ドメイン又は他のＫＩＶドメイン中の保存領域内に存在する場合、ｓｉＲＮＡ分子は転写物内に２つ以上の標的部位を有する可能性がある。明確にするために、転写物内の最初の標的部位のみが示されている。
表２には、ＳＡＲ試験から生じた例示的な二重鎖に化学修飾を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列が示されている。ヌクレオチド配列を、以下の表記法に従って列記する：ａ、ｕ、ｇ、及びｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、Ｇｆ、及びＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）リボヌクレオチド；Ｐｈｏｓ＝末端ヌクレオチドがその５’末端にモノホスフェート基を有する；及びｉｎｖＡｂ＝逆位脱塩基ヌクレオチド（すなわち、鎖の３’末端上にあるときはその３’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合し（３’－３’結合）、又は鎖の５’末端上にあるときはその５’位の置換基を介して隣接するヌクレオチドに結合した（５’－５’ヌクレオチド間結合）脱塩基ヌクレオチド）。配列中の「ｓ」の挿入は、２つの隣接するヌクレオチドがホスホロチオジエステル基（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）によって結合されていることを示す。別段の指示がない限り、全ての他のヌクレオチドは、３’－５’ホスホジエステル基によって結合されている。［ＧａｌＮＡｃ３］は、式ＶＩＩに示されるＧａｌＮＡｃ部分を表し、「ｓ」が［ＧａｌＮＡｃ３］表記に続く場合、センス鎖の５’末端にホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合を介して共有結合されている。
実施例２．細胞ベースアッセイにおけるＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトのインビトロ評価
最初に、実施例１に記載されているバイオインフォマティクス解析によって優先順位を付けた３２０個の異なる配列に基づき、４００個のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＰＡのｓｉＲＮＡ分子を、インビトロ初代ヒト肝細胞アッセイでＬＰＡのｍＲＮＡ合成を阻害するかどうかについて単一の濃度（１２ｎＭ）で評価した。製造業者のプロトコルに従って、ヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ／Ｓｅｋｉｓｕｉドナーロット番号ＨＣ１０－２３）を、ＯｐｔｉＴｈａｗ培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈカタログ番号Ｋ８０００）中で解凍した。細胞を遠心分離し、培地吸引後、ＯｐｔｉＰｌａｔｅ肝細胞培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈカタログ番号Ｋ８２００）に再懸濁し、９６ウェルのコラーゲンコーティングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒカタログ番号６５５９５０）に蒔いた。３～４時間のインキュベーション期間の後、培地を除去し、ＯｐｔｉＣｕｌｔｕｒｅ肝細胞培地（Ｘｅｎｏｔｅｃｈカタログ番号Ｋ８３００）に置き換えた。ＯｐｔｉＣｕｌｔｕｒｅ培地を添加して３～５時間後、単一点（１２ｎＭ）又は用量反応形式（０．２μＭ～４μＭ）のいずれかでＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡを自由取り込みによって（トランスフェクション試薬なしで）細胞に送達した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で約６６～７２時間インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴ（９００１７９３）機器又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ（５４００６３０）機器のいずれかでＲＮＡ抽出を実行した。Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴシステムを使用して、１％２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍ－３１４８）を加えたＱｉａｇｅｎ ＲＬＴ緩衝液（７９２１６）で細胞を溶解し、溶解物を－２０℃で保存した。Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴ機器のＱｉａｇｅｎ ＱＩＡＣｕｂｅ ＨＴキット（７４１７１）を使用して、製造業者の指示書に従ってＲＮＡを精製した。ＱＩＡｘｐｅｒｔシステム（９００２３４０）を使用して試料を分析した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘシステムによって、溶解／結合濃縮物（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＡＭ８５００）を使用して細胞を溶解した。細胞溶解物を－２０℃で保存するか、又は場合によっては細胞を溶解した直後にＲＮＡ抽出を実行した。Ｆｌｅｘ機器上でＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭａｇＭＡＸＴＭ－９６トータルＲＮＡ分離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＡＭ１８３０）を使用して、製造業者の指示書に従ってＲＮＡを精製した。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（４３６８８１３）を使用してＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成し、反応物を製造業者の指示書に従って組み立て、インプットＲＮＡの濃度を試料によって変動させた。逆転写は、ＢｉｏＲａｄの４つ組のサーマルサイクラー（モデル番号ＰＴＣ－０２４０Ｇ）で以下の条件で実行した：２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５分、その後（任意選択で）４℃で保持し続ける。ＢｉｏＲａｄのＱＸ２００ ＡｕｔｏＤＧドロップレットデジタルＰＣＲシステムを使用して、製造業者の指示書に従ってドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を実施した。プローブ用ＢｉｏＲａｄ ｄｄＰＣＲスーパーミックス（１８６３０１０）、ＬＰＡ（ＩＤＴ Ｈｓ．ＰＴ．５８．１１４５１１０、プライマー対プローブ比 ３．６：１、各４５ナノモルの順方向プライマー及び逆方向プライマー、１２．５ナノモルの６－ＦＡＭ／ＺＥＮ／ＩＢＦＱ標識プローブで注文）用の蛍光標識ｑＰＣＲアッセイ、並びにＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）（ＩＤＴ Ｈｓ．ＰＴ．５３ａ．２０１０５４８６、プライマー対プローブ比 ３．６：１、各４５ナノモルの順方向プライマー及び逆方向プライマー、１２．５ナノモルのＨＥＸ／ＺＥＮ／ＩＢＦＱ標識プローブで注文）、並びにＲＮａｓｅフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９９３７）を使用して、反応物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆの透明９６ウェルＰＣＲプレート（９５１０２０３０３）に組み立てた。プライマー／プローブ配列を以下に示す。プライマー／プローブの最終濃度は、それぞれ９００ｎＭ／２５０ｎＭであり、インプットｃＤＮＡの濃度をウェル間で変動させた。
製造業者によって推奨される消耗品（ＢｉｏＲａｄ ＤＧ３２カートリッジ１８６４１０８、ＢｉｏＲａｄチップ１８６４１２１、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ青色９６ウェルＰＣＲプレート９５１０２０３６２、ＢｉｏＲａｄプローブ用ドロップレット生成オイル１８６４１１０及びＢｉｏＲａｄドロップレットプレート組立品）と共に設置されたＢｉｏＲａｄ Ａｕｔｏ ＤＧドロップレット生成器（１８６４１０１）を使用して、ドロップレットを形成した。ドロップレットは、ＢｉｏＲａｄ Ｃ１０００ ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー（１８５１１９７）上で以下の条件を用いて増幅した：酵素活性化に９５℃で１０分、変性に９４℃で３０秒、その後アニーリング／伸長に６０℃で１分間、２℃／秒のランプ速度を用いて４０サイクル、酵素不活性化に９８℃で１０分間、その後（任意選択により）４℃で保持し続ける。続いて、ＢｉｏＲａｄ ＱＸ２００ドロップレットリーダー上で試料を読み取り、ＬＰＡ又はＴＢＰのｍＲＮＡ濃度とそれぞれ相関するＦＡＭ／ＨＥＸシグナルを測定した。ＢｉｏＲａｄのＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアパッケージを使用してデータを分析した。試料をチャネル（蛍光標識）によりゲーティングして、試料当たりの濃度を測定した。続いて、試料負荷量における差異を調節するために、各試料を目的遺伝子（ＬＰＡ）の濃度／ハウスキーピング遺伝子（ＴＢＰ）の濃度の比として表した。続いて、データをＧｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒにインポートし、各試験のｓｉＲＮＡを中立対照ウェル（緩衝液のみ又は対照ｓｉＲＮＡ）の中央値に正規化し、ＰＯＣ（対照の割合）として表した。
ｄｄＰＣＲアッセイ配列
ＬＰＡ：
プライマー１：５’－ＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴ－３’（配列番号６０２）
プライマー２：５’－ＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧ－３’（配列番号６０３）
プローブ：５’－／５６－ＦＡＭ／ＣＡＴＧＧＣＴＴＴ（配列番号６０４）／ＺＥＮ／ＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣ（配列番号６０５）／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’
ＴＢＰ：
プライマー１：５’－ＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＴＣＣＴ－３’（配列番号６０６）
プライマー２：５’－ＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＴＴＣＡＣＴＧ－３’（配列番号６０７）
プローブ：５’－／５ＨＥＸ／ＡＧＣＴＧＣＧＧＴ（配列番号６０８）／ＺＥＮ／ＡＣＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＴＣ（配列番号６０９）／３ＩＡＢｋＦＱ／－３’
単一濃度アッセイの結果に基づき、初代ヒト肝細胞のｄｄＰＣＲアッセイの１０点用量反応形式（０．２μＭ～４μＭ）で更に試験するため、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＰＡのｓｉＲＮＡ分子のサブセットを選択した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＰＡのｓｉＲＮＡ分子と肝細胞との７２時間のインキュベーション期間の後に、ＬＰＡのｍＲＮＡの濃度とＴＢＰのｍＲＮＡの濃度の比率を測定した。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＬＰＡのｓｉＲＮＡ分子のそれぞれのＥＣ５０値を用量反応曲線から算出し、残存するＬＰＡのｍＲＮＡの割合（すなわち、対照の割合）として表したそれぞれの分子の最大アンタゴニスト活性と共に下記の表３に示す。
ＬＰＡのｓｉＲＮＡ分子のいくつかは、ｓｉＲＮＡ分子で処置しなかった肝細胞と比較して、ＬＰＡのｍＲＮＡレベルの８５％以上の最大限の低減を示しており、一桁のナノモル範囲のＥＣ５０値を有していた。
表３からより効力のあるｓｉＲＮＡ分子のサブセットを選択し、デュアルルシフェラーゼレポーター系を使用する第２のインビトロアッセイで更に試験した。加えて、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイをＳＡＲ試験で実施例３に記載されるトランスジェニックマウスモデルと組み合わせて使用した。このアッセイでは、ＬＰＡ遺伝子発現の阻害の大きさ及び程度を最適化するような配列ファミリーを選択するために、ｓｉＲＮＡ分子の配置及び化学修飾の数及び／又は構成（例えば、鎖の長さ及び末端の性質）が変更されている。
ウミシイタケルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼの両方のコーディングＤＮＡ配列（ＣＤＳ）を含む市販のｐｓｉＣＨＥＣＫプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から、デュアルルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＭＩＲ０６６０）を構築した。このプラスミドにＫＩＶ－３～ＫＩＶ－１０を含むヒトＬＰＡのＣＤＳの一部をクローニングして、ウミシイタケルシフェラーゼのＣＤＳとヒトＬＰＡのＣＤＳとの融合体を生成した。ＬＰＡ標的配列の翻訳をｓｉＲＮＡを媒介して阻害することにより、融合体のｍＲＮＡが分解され、ウミシイタケルシフェラーゼのシグナルが低下する。ＬＰＡ遺伝子のノックダウンを、プラスミドによって恒常的に発現したホタルルシフェラーゼレベルに正規化したウミシイタケルシフェラーゼレベルを測定することによって評価した。ヒト肝細胞癌細胞株であるＨｕｈ７細胞を、９６ウェルプレートに蒔いた。一晩インキュベートした後、細胞をデュアルレポータープラスミドｐＭＩＲ０６６０でコトランスフェクトし、製造業者の指示書に従って異なる濃度のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション試薬でｓｉＲＮＡ分子を試験した。８～１１点用量漸増法（０～１０ｎＭ）を実行した（３回）。２度目に一晩インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ照度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）でデュアルルシフェラーゼ活性を測定した。評価されたＬＰＡのｓｉＲＮＡ分子のそれぞれのＥＣ５０値及び最大アンタゴニスト活性（ウミシイタケルシフェラーゼレベルとホタルルシフェラーゼレベルの最も低い割合として測定した）を下記の表４に報告する。
実施例３．ヒトアポリポタンパク質を発現するトランスジェニックマウスにおけるＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトのインビボ有効性
ＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトのインビボ有効性を評価するために、ダブルトランスジェニックマウスモデルを使用した。マウスにはＬＰＡ遺伝子のオーソログが存在せず、ａｐｏ（ａ）（ＬＰＡ遺伝子によってコードされる）は一般に、霊長類のみに発現する。完全ヒトＬＰＡ遺伝子を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）からヒトａｐｏ（ａ）を発現するトランスジェニックマウス（Ｆｒａｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．９：４２４－４３１，１９９５）を、ヒトａｐｏＢ－１００を発現するトランスジェニックマウス（Ｌｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．９２：３０２９－３０３７，１９９３）と交配させた。得られたダブルトランスジェニックマウスは、血清のベースラインのＬｐ（ａ）レベルが平均で約５０～６０ｍｇ／ｄＬの完全に機能的なヒトＬｐ（ａ）粒子を発現する。雌のダブルトランスジェニックマウスを、ベースラインのＬｐ（ａ）血清レベル、体重、及び年齢に基づいて各試験の異なる処置群にランダム化した。生理食塩水又はＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトを、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は２ｍｇ／ｋｇの用量で単回皮下注射として投与した。注射前に、続いて注射後の１、２、３、４、６、８、１０、及び１２週目に、又は血清Ｌｐ（ａ）レベルがベースラインレベルに戻るまで血清試料を採取した。Ｌｐ（ａ）ＥＬＩＳＡアッセイ（カタログ番号１０－１１０６－０１、Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて血清中のＬｐ（ａ）濃度を測定した。動物のベースラインのＬｐ（ａ）レベルに基づき、特定の時点の各動物のＬｐ（ａ）レベルの変化率を算出した。異なるＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトによるトランスジェニックマウスの１１回の個別の試験の結果を、下記の表５～１５に示す。データは、各治療群のベースラインからの平均変化率として表す（ｎ＝４又は５動物／群、ｎ＝６動物／群である試験１０及び１１を除く）。
試験したＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトの大部分は、トランスジェニック動物において１ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇの用量での単回皮下注射の２週間後に血清Ｌｐ（ａ）レベルを少なくとも５０％低減させた。生成されたいくつかのＲＮＡｉコンストラクトは、Ｌｐ（ａ）血清レベルの阻害を単回注射で４週目まで持続させた。例えば、コンストラクト４６０１、４６１３、４９３０、４９７０、６１５０、６１８２、６２４７、８３９５、８４０１、１０９２７、１１３１８、１１３４４、１１３５１、１１３７４、１１５８０、１７１８８、１８４３６、１８４４４、及び１８４４６の１ｍｇ／ｋｇ又は２ｍｇ／ｋｇの単回注射後に、Ｌｐ（ａ）血清レベルがなお４週目に約５０％以上低減した。
実施例４．非ヒト霊長類におけるＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトのインビトロ有効性
選択されたＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトの有効性を、個々の３つの試験でカニクイザルにおいて評価した。このＲＮＡｉコンストラクトは、カニクイザルＬＰＡ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列番号ＸＭ＿０１５４４８５２０．１）の配列と交差反応させた配列を有していた。第１の試験では、カニクイザル（治療群当たりｎ＝３）に、ＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクト４６０１、４６１３、又は４９７０の２ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射を受けさせた。血液試料を－１日目（投与前）、及び１日目の投与後の４、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１、９８、１０５、１１２、１１９、１２６、１３３、及び１４０日目に採取した。Ｌｐ（ａ）ＥＬＩＳＡアッセイ（カタログ番号１０－１１０６－０１、Ｍｅｒｃｏｄｉａ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、各試料のＬｐ（ａ）血清レベルを分析した。第１の試験の結果を図２に示す。データは、投与前のベースラインと比較した残存Ｌｐ（ａ）血清レベルの割合として表す。コンストラクト４６０１及び４６１３は、ベースラインレベルと比較して少なくとも６週間（例えば、少なくとも４２日目まで）の間に血清Ｌｐ（ａ）レベルを８０％以上抑制した。
第２の試験では、カニクイザル（治療群当たりｎ＝３）に、ＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクト８４０１、１０９２７、１１３１８、１１３４４、又は１１３５１の２ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射を受けさせた。血液試料を第１の試験と同じ時点で採取し、上記に記載したように血清中のＬｐ（ａ）レベルを分析した。第２の試験の結果を図３に示す。データは、投与前のベースラインと比較した残存Ｌｐ（ａ）血清レベルの割合として表す。注目すべきことに、コンストラクト１０９２７及び１１３５１は、８週目までにＬｐ（ａ）血清レベルの抑制がほぼ完了した。なお、血清Ｌｐ（ａ）レベルの大幅な低減は、単回用量を注射した後の１１２日、ほぼ４ヵ月まで観察された。対照的に、コンストラクト８４０１及び１１３４４では、血清Ｌｐ（ａ）レベルにより穏やかで一時的な低減が生じた。コンストラクト１１３１８は、血清中のＬｐ（ａ）をベースラインの約４０％のレベルまで抑制し、この低減したレベルは数週間持続した。
第３の試験では、カニクイザル（治療群当たりｎ＝３）に、ＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクト１１３７４、１１５８０、１７２０５、１８４４４、又は１８４３６の２ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射を受けさせた。血液試料を同じ時点で採取し、上記に記載したような前述の２つの試験のように血清中のＬｐ（ａ）レベルを分析した。第３の試験の結果を図４に示す。データは、投与前のベースラインと比較した残存Ｌｐ（ａ）血清レベルの割合として表す。この分子の群のうちでコンストラクト１１３７４が最も有効性があり、単回皮下注射後の約６週間の間にＬｐ（ａ）血清レベルをベースラインレベルの２０％まで抑制した。
実施例５．ＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトの粘度評価
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクト１１３７４の粘度を異なる濃度で評価した。凍結乾燥した１１３７４をＰＢＳで製剤化し、原液を調製した。ＰＢＳで原液を希釈して、１５０～３５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で、異なる１１３７４コンストラクトの製剤を調製した。比較のために、ＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトＡＤ０３８５１（国際公開第２０１７／０５９２２３号パンフレットに記載されている）の粘度も並行して評価した。ＡＤ０３８５１の修飾ヌクレオチド配列を下記に記載する：
センス配列：５’－ｃｓａｇｃｃｃｃｕＵｆＡｆＵｆｕｇｕｕａｕａｃｇｓ（ｉｎｖｄＡ）－３’（配列番号６２０）
アンチセンス配列：５’－ｕｓＣｆｓｇＵｆａＵｆａａｃａａＵｆａＡｆｇＧｆｇＧｆｃｓＵｆｓｇ－３’（配列番号６２１）
（式中、ａ、ｕ、ｇ、及びｃ＝対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド；Ａｆ、Ｕｆ、Ｇｆ、及びＣｆ＝対応する２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド；ｉｎｖｄＡ＝逆位デオキシアデノシンヌクレオチド（すなわち、３’－３’結合）；並びにｓ＝ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）。センス鎖の５’末端を、ホスホロチオエート結合を介して三価ＧａｌＮＡｃ部分（ＮＡＧ２５であって、その構造は国際公開第２０１７／０５９２２３号パンフレットに記載されている）に共有結合させた。
１１３７４製剤の濃度を算出するために、Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３ Ｇ１１０３Ａ紫外可視分光光度計を使用して、試料の２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。２６０ｎｍにおけるＡＤ０３８５１の測定された減衰係数である１９．１ ｍＬ＊ｍｇ－１＊ｃｍ－１の近似減衰係数、及び１ｃｍの通路長を使用し、続いてベールの法則を用いて製剤の濃度を算出した。
Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＭＣＲ ３０２コーンプレートレオメーターを用いて、各製剤の粘度を１０００ｓ－１の剪断速度にて、２５℃で測定した。ＰＢＳ中の異なる濃度の２つのＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクトの粘度の測定値を下記の表１６に示す。
ＬＰＡのＲＮＡｉコンストラクト１１３７４は、基準となるＲＮＡｉコンストラクトであるＡＤ０３８５１と比較すると、濃度に応じて低い粘度を有し、これによってより高濃度の製剤と低減した注入量が可能となる。
本明細書で説明及び引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書により組み込まれる。開示される発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料が変化する可能性があるため、これらの方法論、プロトコル及び材料に限定されるものではないことが理解される。また、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではないことが理解される。
当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態との多数の等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。このような等価物は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (35)

  1. センス鎖及びアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉコンストラクトであって、前記アンチセンス鎖は、ＬＰＡのｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する領域を含み、
    （ｉ）前記センス鎖が、配列番号７９の配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号１９４の配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｉｉ）前記センス鎖が、配列番号８０の配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号１９４の配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｉｉｉ）前記センス鎖が、配列番号７８の配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号１９６の配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｉｖ）前記センス鎖が、配列番号８５の配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号１９８の配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｖ）前記センス鎖が、配列番号８６の配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号１９８の配列を含むか若しくはそれからなり、又は
    （ｖｉ）前記センス鎖が、配列番号８３の配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号２００の配列を含むか若しくはそれからなる、
    ＲＮＡｉコンストラクト。
  2. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  3. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－修飾ヌクレオチドである、請求項２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  4. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  5. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全てが、修飾ヌクレオチドである、請求項２に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  6. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  7. 前記センス鎖が、その３’末端、その５’末端、又はその３’末端及び５’末端の両方に、末端ヌクレオチドとして脱塩基ヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  8. 前記脱塩基ヌクレオチドが、３’－３’ヌクレオチド間結合又は５’－５’ヌクレオチド間結合を介して隣接するヌクレオチドと結合されている、請求項７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  9. 前記センス鎖、前記アンチセンス鎖、又は前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の両方は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  10. 前記アンチセンス鎖が、３’末端及び５’末端の両方の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項９に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  11. 前記センス鎖が、３’末端の末端ヌクレオチド間に単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項９又は１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  12. 前記センス鎖が、３’末端の末端ヌクレオチド間に２つの連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項９又は１０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  13. （ｉ）前記センス鎖が、配列番号３５０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号５２５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｉｉ）前記センス鎖が、配列番号３５４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号５２５による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｉｉｉ）前記センス鎖が、配列番号３５１による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号５３０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｉｖ）前記センス鎖が、配列番号３５７による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号５３０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｖ）前記センス鎖が、配列番号３６２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号５３６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｖｉ）前記センス鎖が、配列番号３６６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号５３６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｖｉｉ）前記センス鎖が、配列番号３６４による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号５３６による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、
    （ｖｉｉｉ）前記センス鎖が、配列番号３７０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号５４０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、又は
    （ｉｘ）前記センス鎖が、配列番号３７２による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなり、且つ、前記アンチセンス鎖が、配列番号５４０による修飾ヌクレオチドの配列を含むか若しくはそれからなる、
    請求項１に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  14. 前記ＲＮＡｉコンストラクトが、リガンドを更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  15. 前記リガンドが、コレステロール部分、ビタミン、ステロイド、胆汁酸、葉酸部分、脂肪酸、炭水化物、グリコシド、又は抗体若しくはその抗原結合断片を含む、請求項１４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  16. 前記リガンドが、ガラクトース、ガラクトサミン、又はＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む、請求項１５に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  17. 前記リガンドが、多価ガラクトース部分又は多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分を含む、請求項１６に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  18. 前記多価ガラクトース部分又は前記多価Ｎ－アセチル－ガラクトサミン部分が、三価又は四価である、請求項１７に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  19. 前記リガンドが、以下の構造：


    を含む、請求項１４に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  20. 前記リガンドが、リンカーを介して前記センス鎖に共有結合されている、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  21. 前記リガンドが、前記センス鎖の５’末端に共有結合されている、請求項２０に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  22. リンカーを介して前記センス鎖の５’末端に共有結合したリガンドをさらに含み、前記リガンド及びリンカーが、以下の式ＶＩＩの構造：


    （式中、Ｘ＝Ｏ又はＳである）を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト。
  23. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクト、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
  24. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含む、患者においてＬＰＡの発現を低減させるための医薬組成物。
  25. 前記患者が、心血管疾患と診断されるか、又は心血管疾患のリスクを有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記患者が、１００ｎｍｏｌ／Ｌ以上の血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルを有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
  27. 前記患者が、心筋梗塞の病歴を有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
  28. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含む、患者の血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルを低減させるための医薬組成物。
  29. 前記患者が、心血管疾患と診断されるか、又は心血管疾患のリスクを有する、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 前記患者が、１００ｎｍｏｌ／Ｌ以上の血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルを有する、請求項２８に記載の医薬組成物。
  31. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含む、患者の心血管疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
  32. 前記心血管疾患が、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、心筋梗塞、又は脳卒中である、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉコンストラクトを含む、患者の心筋梗塞のリスクを低減させるための医薬組成物。
  34. 前記患者が、冠動脈疾患と診断されている、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 前記患者が、１００ｎｍｏｌ／Ｌ以上の血清又は血漿Ｌｐ（ａ）レベルを有する、請求項３３に記載の医薬組成物。
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