JPH01100193A - ポリマーに固定されたコフアクターを有する酵素リアクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素反応に必要なコファクターをポリマーに固
定させるための改良された方法、および１種またはそれ
以上の酵素に加えて、ポリマーに固定された本発明によ
るコファクターの１棟またはそれ以上を含有する酵素リ
アクターに関する。

酵素反応は選択性が高く収量が良いので価値ある化学的
化合物の製造において益々重要になってきていることは
知られている。その場合酵素は種々の方法で固定されそ
して次に不均一相触媒として使用される。これらは次に
反応混合物から容易に分離することができそして再使用
できる。

酵素または酵素複合物が低分子量コファクターの存在下
においてのみ活性である場合はコファクターを同じく固
定する必要があった。なぜなら、さもなければ反応混合
物にコファクターを常に新たに添加する必要があったか
らである。

容易に溶解する低分子量コファクターは反応生成物から
簡単な膜ｐ過によっては分離できず、このことが高価な
コファクターの完全な損失と同時に、得られる最終生成
物の汚染をもたらしていた。それゆえかかるコファクタ
ーをポリマーに固定するだめの多くの研究が報告されて
いる（　Ｐ、　−０，Ｌａｒｓｓｏｎおよびに、　Ｍｏ
５ｂａｃｈ氏のＢｉｏｔｅｏｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ
ｔ　１３　（１９７１）、３９３；Ｊ、　Ｇｒｕｎｗａ
ｌｄおよびＴｈ、　Ｍ、　８．　Ｃｈａｎｇ氏のＢｉｏ
ｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　８１　
（１９７８）　、５６５　；西ドイツ特許第２６３１０
４５号；西ドイツ特許第２８４１４１４号；および　西
ドイツ特許公開第２９３００８７号参照）。

アデニン環系を有し、固形担体あるいは可溶性ポリマー
に共有結合されているコファクター例えばニコチンアミ
ド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ　／ＮＡＤＨ）、
ニコチンアミドーアデニンジヌクレオチドホスヘート（
ＮＡＤＰ　／ＮＡＤＰＨ）、アデノシン１燐酸（ＡＭＰ
　）　、アデノシン２燐酸（ＡＤＰ　）、アデノシン３
燐酸（Ａ’ｒＰ　）、フラビン−アデニンジヌクレオチ
ド（ＦＡＤ／ＦＡＤＨ２）　、および補酵素Ａはすでに
大規模に用いられている。従って固形担体に結合された
コファクターはアフイニテイクロマトグラフイーにおけ
るリガンドとして用いられる。共有結合されたコファク
ターを有する水溶性ポリマーはアフイニテイ分別におい
て非常に有用である。ＮＡＤ　／ＮＡＤＨおよびＮＡＤ
Ｐ　／ＮＡＤＰＨのようなコファクターは再生できそし
て酵素系中において再循環使用されうる。

アデニン環系を含有しかつポリマーに結合されたコアア
クタ−を製造するには初めに、高分子の官能基と反応し
うる反応性の基に６位のＮ原子を結合させる。その場合
初めにアデニン環系を高分子との反応を可能にすべき他
の官能基を有するアルキル化剤とＮ（１）原子上で反応
させる。アルキル化剤としてはヨード酢酸のようなハロ
ゲノカルボン酸、３，４−エポキシ酪酸のようなエポキ
シド、プロピオノラクトンのようなラクトンあるいはエ
チレンイミンのようなアジリジンが適当である。

ＡＭＰ　、ＡＤＰおよびＡＴＰの場合はアルキル化に続
いて直ちにジムロー（Ｄｉｍｒｏｔｈ　）転位によりＮ
（６）形が生成される。ジムロー転位に続き高分子との
反応が行われる。ＮＡＤ　およびＮＡＤＰの場合ジムロ
ー転位に先立ち還元がそしてジムロー転位の後にニコチ
ンアミド環の再酸化が行われる。

しかしながら、ポリマーへのコファクターの固定に必要
なこれら反応順序は満足できるものでないことがすでに
西ドイツ特許第２，８４１，４１４号に記載されている
。何故なら必要な多数の反応により収量の低下が生じ従
って高価なコファクターが１２〜４０％の少量でしかポ
リマーに固定され得ないからである。それゆえ収量を収
容するには１−位がアルキル化されたアデニン誘導体を
ポリマーに付加したのちにジムロー転位にかけることが
提案された。それにより収量損失は低下されうるが、し
かし必要とされる反応工程数は同じままであり、モして
ＮＡＤ　および＋ ＮＡＤＰ　誘導体の場合にはなおニコチンアミド環の還
元および再、酸化を行う必要がある。

それゆえ高価なコファクターの収量損失および活性損失
を低下させるためにコファクターをポリマーに結合させ
る方法を簡単化するというａ題が存在していた。

本発明により、芳香族アミノ基またはベンジルアミノ基
を有するコファクターをはじめに例えばチオホスゲンと
の反応により相当するインチオシアネートに変換し、そ
して次にこれを官能基を有する適描なポリマーに付加す
ることにより前記目的が達成された。例えばコファクタ
ーとしてＮＡＤ）！を使用しそしてアミン基を有するポ
リマーを用いた場合は、一般式 を有するチオ尿素誘導体が生成される。ヒドロキシル基
を有するポリマーを使用する場合は相当するチオカルバ
メートが生成される。インチオシアネートおよびアミノ
−またはヒドロキシル−基を有する化合物からのチオ尿
素およびチオカルバメートの製造は現在知られている（
Ｌ。

Ｄｒｏｂｎｉｃａ　、　Ｐ、　Ｋｒ１ｓｉａｎ、　Ｊ、
　Ａｕｇｕｓｔｉｎ　ｉｎ　”　ＴｈｅＣｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ｏｆ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｒｏｕｐｓ″（
Ｐａｔａｉ　。

Ｅｄ、）ｐａｒｔ　２　：Ｃｙａｎａｔｅｓ　ａｎｄ　
ｔｈｅｉｒ　Ｄｅｒｉｖａ−ｔｉｖｅｓ”、Ｗｉｌｅｙ
、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｃｈａｐｔｅｒ　２２　．１
００る参照）。

コファクターの結合用に選択すべきポリマーは水溶性で
なければならない、何故ならコファクターを水不溶性ポ
リマーに結合させた場合は結合されたＮＡＤを完全に還
元することがもはや不可能であり、それゆえにかなりの
活性損失が生ずるからである（Ｈ，−Ｌ、　Ｓｃｈｍｉ
ｄｔ氏他、Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６７．２９５−３０２（１９
７６）　参照）。

コファクターを固定するには、第１または第２アミノ基
をイする水溶性ポリマーが好ましい。

ビニルアミンとビニルメチルアセトアミドとのまたはビ
ニルメチルアミンとビニルメチルアセトアミドとの共重
合体であって、モノマーの比が１：９９から４０：６０
ｋＲＨｋ％であることができる共重合体が特に良いこと
が判明した。

これら共重合体を製造するにはＮ−ビニルホルムアミド
またはＮ−ビニル−Ｎ−メチルホルムアミドを他の水溶
性Ｎ−ビニルアミド、例えばＮ−ビニル−Ｎ−メチルア
セドア之ドまたはＮ−ビニルピロリドンと反応させそし
て組み込まれたＮ−ビニルホルムアミド単位またはＮ−
ビニル−Ｎ−メチルホルムアミド単位を強酸好ましくは
塩酸を用いて水溶液中で加水分解してＮ−ビニルアミン
またはＮ−ビニル−Ｎ−メチルアミン鎖構成員となす。

他のビニルアミドと対照的にこれらホルムアミドは非常
に容易に加水分解されつる結果、他の重合されたＮ−ビ
二ルアミドが可なりの程度に同時に加水分解を受けるこ
とはない。最後に、脱離された蟻酸および用いられた塩
酸をイオン交換により除去する。

重合されるＮ−ビニルホルムアミド量またはＮ−ビニル
−Ｎ−メチルホルムアミド量を変動させることにより塩
基の含量が任意に調整されうる。Ｎ−ビニルホルムアミ
ドを共重合に用いるならばｆ＆終主生成物Ｎ−ビニルア
ミン単位を含有し、モしてＮ−ビニル−Ｎ−メチルホル
ムアミドを共重合さ、せる場合は最終生成物はＮ−ビニ
ル−Ｎ−メチルアミン鎖構成員を含有する。

しか゛しながら例えばＮ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビ
ニル−Ｎ−メチルホルムアミドおよびＮ−ビニル−Ｎ−
メチルアセトアミドからなる三元共重合を行うこともで
きる。これらポリマーを加水分解することにより第１お
よび第２ビニルアミン単位すなわち異なる塩基反応性を
有し、同様にコファクターの固定に適するポリマー状担
体物質を得ることができる。

ポリ−Ｎ−ビニルホルムアミドホモポリマーまたはポリ
−Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルホルムアミドホモポリマーの
部分加水分解によっても非常に類似したポリマーが得ら
れる。その場合酸の量および加水分解時間を変動させる
ことにより同様に塩基の割合が任意按調整されうる。Ｎ
−ビニルホルムアミドおよびＮ−ビニル−Ｎ−メチルホ
ルムアミドを共重合させ次に部分加水分解することによ
っても異なる塩基反応性を有する水溶性のポリマー状担
体物質を合成することができる。

塩基性で、水溶性の担体物質を所望の平均分子寸法に調
整するには、多数の手段例えば重合−度、溶媒および開
始剤濃度を選択することにより広い範囲（分子ｆｆ１１
０，０００〜５００，０００）で変動させることができ
る。

部分的にアルキルアミンで置換されたα、β−ポ！Ｊ−
（２−ヒドロキシエチル）　−Ｄ、Ｌ−アスパルタミド
を用いても同様に良好に実施できた。

しかしながらインチオシアネートと反応する官能基を有
する他の水溶性ポリマーも使用されうる。例えばポリエ
チレンイミンまたは水溶液炭水化物も使用されうる。

本発明による方法を用いて、コファクターを活性損失を
伴うことなく実際上定量的収量でポリマーにうまく固定
することができ、その上これまで必要とみなされてきた
多段階の反応工程を回避できる。かくして得られたポリ
マーに固定されたコファクターは種々の方法で使用され
うる。これらは例えば１種またはそれ以上の酵素と一緒
にマイクロカプセル中に封入されうる。

基質および反応生成物の透過を許容するがしかし酵素（
類）および結合されたコファクターは保持する半透過性
壁を有するかかるマイクロカプセルの製造は以前から知
られている（　Ｔｈ、Ｍ、Ｓ。

Ｃｈａｎｇ、　Ｂｉｏｍｅｄｉｏａｌ　Ａｐｐｌ、、　
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ＥｎｚｙｍｅＰｒｏｔｅｉｎ
ｓ、　Ｖｏｌ、　１　（１９７７）、６９、Ｐｌｅｎｕ
ｍ、　ＮｅｗＹｏｒｋ１９７７参照）。

これら酵素は、用いられた酵素およびコファクターをリ
アクター中に保持するが、しかし低分子量生成物および
未反応の基質を透過せしめる役目をする限外濾過膜を備
えた換りアクタ−中においても、ポリマーに固定された
コファクターと一緒に使用されうる。かかる膜リアクタ
ーはすでに現在性われており、例えば西ドイツ特許公開
第２．９３０．０７８号に記載されている。

コファクター（類）が数種の反応を順次触媒できそして
その際再びそれらの当初の状態に戻されるならば、手透
過性マイクロカプセルを用いても、そしてまた限外濾過
セル中でも酵素反応は継続的に行われつる。例えば、Ｎ
ＡＤはりんご酸デヒドロゲナーゼによりマレートをオキ
サロアセテートに変換しうる。その際生成されるＮＡＤ
Ｈは次にアルコールデヒドロゲナーゼによりアセトアル
デヒドをエタノールに還元しつる。

そのあとに再びＮＡＤか残り、これが再び還元に利用さ
れうる。かくしてかかる系は恒常的に再生され、この反
応は理論上無期限に実施されうる。しかしながら実際上
は数種の酵素およびコファクターからなるかかる系はそ
れらの活性を次第に失うことが見出されている。しかし
ながら実施例において詳細に記載される実験により明ら
かであるように、本発明により調製された酵素リアクタ
ーにおいては、何らの活性損失も観察されない。さらに
、本発明によりコファクターは１容器反応で固定されか
つほとんど定量的収率で得られている。

実施例　１ ６−インチオシアナトーニコチンアミドーアデニンジヌ
クレオチド（”　ＮＡＤ−ＮＣ８”）の調製２ミリモル
のＮＡＤを気泡計数器を備えた丸底フラスコ中でＨ２Ｏ
１０−中に溶解させそして少量のＮａ２ＣＯ！ｉを加え
た。はげしく攪拌しなからＣＨＣＬ３１０　ｒｎｔ中の
チオホスゲン２０ミリモルの溶液を２０℃でこれに加え
た。ｐＨは１０分毎に検査し、少量の炭酸ナトリウムの
添加により５．５〜８．５に保持した。３．５時間後に
はｐＨは最早や変化せずそして何らそれ以上のガス発生
が観察されなくなった。この混合物を真空下に蒸発乾固
させそして凍結乾燥した。淡帯褐色の生成物混合物は溶
離剤として水／アセトニトリルを用いシリカゲル上のカ
ラムクロマトグラフィーにより副生物から精製した。し
かしながら、生成物の混合物を未精製のままポリマーと
の反応に使用することが好ましい（実施例２参照）、何
故ならポリマーに固定された生成物は限外濾過により実
質上より簡単に精製でき、またＮＡＤ−ＮＣ８の感度は
精製期間中に二量化および三量化による損失を生ずるか
らである。

実施例　２ ビニルアミン／ビニルメチルアセトアミド共重合体（４
，８：　９５．２重量％）と６−インチオシアナト−ニ
コチンアミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ−ＮＣ
８）との反応 Ｈ２Ｏ５ｍｊ中の８６３’ｌｆのポリＹ　−（ＮＨ２基
９１ミリモル）に５０ｄの丸底フラスコ中２０℃で水２
〇−中のＮＡＤ−ＮＣ８２ミリモルの溶液１〇−を加え
、ｌＮＮａＯＨを用いてｐＨ８に調整しそしてこの溶液
を２０℃で１５時間攪拌した。次にこの溶液を限外ｐ過
セル中セルロースアセテート膜（排除限界二分子量５ｏ
ｏｏ）を通し３バールの加圧下に限外濾過し、その際水
５０ゴずつを充填して再び濾過する操作を１０回反復し
た。

残留物および１０個の透過物を石分光計でλ＝２５７　
ｎｍで測定した（吸光度測定）。透過物は限外濾過が進
行するにつれて小さくなる吸収、すなわち漸減してゆ（
ＮＡＤ含量を示した。残留物は使用されたＮＡＤの７０
〜９０％を含有していた。

この結果は、凍結乾燥された残留物を秤量し、水に溶解
した試料の吸光を測定しそして純粋なＮＡＤ＋を用いて
作成された標準曲線と比較することにより確認された。

残留物を凍結乾燥すると１２２の生成物が得られた（ポ
リマーに基づき８５％）。

この生成物はベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）社の標準アッセイにお
いてりんご酸デヒドロゲナーゼを用いるマレートの測定
、アルコールデヒドロゲナーゼを用いるエタノールの測
定および乳酸デヒドロゲナーゼを用いるラクテートの測
定にコファクターとしてＮＡＤ　の代りに用いられた。

ＮＡＤ　　をポリマーに固定された等価量のＮＡＤで置
き代えた場合でも酵素活性および従ってコファクター活
性はすべての場合に無変化であった。

実施例　３ アミノエチル基で部分置換されたα、β−ポリ−（２−
ヒドロキシエチル）　−Ｄ、Ｌ　−７スパルタミド（Ｈ
２Ｎ−ＰＨＥＡ　）のこれらアミノ基を介す灯―−ＮＣ
８への・結合 Ｈ２Ｎ−ＰＨＥＡは−１０モル／ｇのアミノ基を含有し
た。ここに用いられる条件下にインチオシアナートと反
応するのは主に７ミノ基であるので、ＮＡＤ−ＮＣ８は
このアミノ基数に対して化学ｍ論的に使用された。１６
ｇのポリマー（アミノ基１．５Ｘ１０　　モル）を１０
０−の丸底フラスコ中２０℃で約２５−のＨ２Ｏ中に溶
解させそして１．４Ｘ１０−’モルのＮＡＤ−ＮＣ８の
溶液を加えた。ＮａＯＨを用いてｐＨを８に調整した。

この混合物を２０℃で２０時間攪拌しそして次にセルロ
ースアセテート膜（排除限界：分子１ｉ　５０００　）
を通し３バールで限外濾過し、その際すれぞれ６０−ず
つ水を充填しそして再び濾過する工程を６回反復した。

透過物および残留物の２５７　ｎｍでのＵ′ｖｇ＆収を
比較することにより生成物中のＮＡＤ含量を測定した。

用いられた量の８０％であった。残留物を凍結乾燥して
総数ｆｆｉ１４ｇ（９２％）を得た。従って有効な接合
収率は８７％であった。

実施例　４ ポリマーに固定されたＮＡＤを有する酵素系のマイクロ
カプセル化 酵素系としてはペーリンガー・マンハイム社から販売さ
れているマレートアッセイと同様にして、りんご酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＭＤＩ）をグルタミン酸−オキサロ酢酸
トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）と組み合せて用いた。こ
こではＬ−マレートはＭＤＨによりＮＡＤを用いてオキ
サロアセテー）　、ＮＡＤ）！およびＨに変換された。

平衡をＬ−マレートからシフトさせるためにはオキサロ
アセテートをＧＯＴおよびグルタレ−トの添加によりＬ
−アスパルテートおよびα−ケトグルタレートに変換さ
せた。

代表的な実験においては、５”ｌ／ｌｄＭＤＨ溶液０．
０１ｍ、２岬／＋ｄ　ＧＯ’ｒ懸濁液０．０１ｍ（いず
れも水中）、および実施例２記載のＨＡＤ−ポリマー２
５．５Ｆ（’；’１　ｏｑ　ＮＡＤ）に水を加えて１．
４２−とじた。この溶液０．３−を２％アルギネー）２
Ｑ／＜ＳＯ水溶液１ｇと混合しそして注射器部よび針（
内径０．２１１１１　）を用い、平均分子ｆｆ１５８０
０を有するポリリジンの０．４％水溶液中に噴霧した。

噴霧された溶液９３１岬から５５８ｑのマイクロカプセ
ルが得られ、これらは１５分後にポリリジン溶液からと
り出され（デカンテーション）そして次に１％ＮａＣ１
水溶液で洗った。次にカプセルを１２．５％グルタルジ
アルデヒド溶液中に１分間入れて架橋させた。カプセル
を４００−ビーカー中で水中に置きそして窒素を吹き込
むことにより攪拌した。１７時間、２日、３日、６日お
よび７日後に上澄み溶液の一部分をとり、２５７ｎｍで
の溶液の昔吸収を測定してＮＡＤ　標準曲線と比較し、
それにより上澄み溶液中のＮＡＤ含量（すなわちカプセ
ルからの失われたＮＡＤ　　）を測定した。下記の結果
が得られた。

９日後に約０．７Ｘ１０″′３ミリモルのＮＡＤに相当
する４４カプセルをとり、そしてベーリンガー・マンハ
イム社の！レートアラ七イに記載された条件下にマレー
ト、の変換に使用した。マイクロカプセルは等両全のＮ
ＡＤ　を用いて過剰のマレートから３０分以内で０．０
０４ｖを変換させた（理論的変換はＬ−マレート０．０
０３岬）。

実施例　５ ポリマーに固定されたＮＡＤを用いる半連続的な酵素リ
アクター、コファクターは再循ＩＮＫより再生 ここでは酵素系としてぎ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）
および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が用いられ、ホ
ルメートはＮＡＤ　　を用いてＦＤＨによりＣＯ２およ
びＮＡＤＨに変換されそしてピルベートはＮＡＤＨを用
いてＬＤＨによりラクテートに変換される。ピルベート
およびホルメートは基質として過剰に用いられ、ＣＯ２
は逃散されそしてラクテートは反応の唯一の生成物とし
て溶液中で測定された。酵素およびＮＡＤ−ポリマーを
保持するにはセルロースアセテ−）Ｍの限外ｐ過膜を用
いた（排除限界分子量：　５０００）。反応は限外濾過
セル中で行われ、反応混合物は２パールの圧力の下に置
かれそして７ラクシミンとして採取された透過物中の２
クテートを測定できた。

実施例２によるＮＡＤ−ポリマー（ＮＡＤ　Ｏ，０２１
ミリモルに相当）　、ＬＤＨ０，１’ｖＳＦＤ）！　４
単位、ピルベート０．２６ミリモルおよびホルメー）０
．２５ミリモルをｐＨ７：２の燐酸塩緩衝液３，７−中
で用いた。攪拌下およびＮ２加圧２バールの下に透過フ
ラクションを３０分毎に集めた。各７ラクシヨンを集め
たのちｐＨ７２の燐酸塩緩衝液を用いて濃縮物をもとの
３．７−となした。さらに各第４フジクシヨン後に０．
２６ミリモルのピルベートおよび０．２６ミリモルのホ
ルメートを加えた。

透過物をベーリンガー・マンハイム社から販売されてい
るラクテート測定アッセイを用いてラクテート含量につ
いて検べた。２２個のフラクションについて、１透過フ
ラクシヨン（１ｄｆつ）尚り３〜６Ｘ１０　ミリモルの
ラクテートが得られた。アッセイを中断しそして２日後
（週末）に続行したのちも各透過フラクション中の２ク
テート含量は同じ一定したレベルのままであった。

実施例　６ Ａ、　Ｎ−ビニルアミン含量４．８　ｍｉ量％を有する
Ｎ−ビニルアミン／Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアセトアミ
ド共重合体の製造 Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアセトアミド３６ｇおよびＮ−
ビニルホルムアミド３りをインプロパツール４０ｄ中で
開始剤としてのα、αＩ−アゾイソブチロニトリル４０
０ｗｇを用い８０℃で共重合させた（２４時間）。

次にイソプロパツールを、水を同時に添加（４０ｄｆ）
Ｌながら留置した。生成したポリマー水溶液に濃塩酸４
０−を添加しそして８時間１１０℃で加熱した。この強
酸性反応混合物を水で希釈しそして次に強塩基性イオン
交換体を用いて塩酸およびぎ酸を除去した。真空下（−
１００ミリパー／Ｌ／）にａ縮後に、〜４．８　Ｊ＆量
％のＮ−ビニルアミン含量を有するＮ−ビニルアミン／
Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアセトアミド共重合体の水溶液
が得られた。ポリマー溶液の固形物含量３３．３％、ｐ
Ｈ値１１．５、そしてポリマーの低下した粘度０．２５
ｄｌ／９が測定された（　Ｈ２０２０％溶液、２５℃で
測定）。

Ｂ、Ｎ−ビニルアミン含！１．５．７重量％を有するＮ
−ビニルアミン／Ｎ−ビニルピロリドン共重合体の製造 Ｎ−ビニルピロリドン２０りおよびＮ−ビニルホルムア
ミド２りを、ＮＨａＯＨ溶液１−を加えた水１２０ｍｊ
中で８０℃およびアルゴン被覆の下に重合させた。開始
剤α、α′−アゾイソブチロニトリル１１０■、重合時
間２４時間、生成した共重合体水溶液に濃塩酸１４５−
を添加しそしてこの混合物を７時間還流下に加熱した（
１１０℃）。

次に反応混合物をＡで記載されるようにして強塩基性イ
オン交換体で処理した。ここでＮ−ビニルアミン含量５
．７重量％を有するＮ−ビニルアミン／Ｎ−ビニルピロ
リドン共重合体の水溶液１６０りが得られた。ポリマー
溶液の固形物含量９５３％、ｐＨ値１０．１そしてポリ
マーの低下した粘度１．６１ｄ／ｇが測定された（Ｈ２
０２０％溶液、２５℃で測定）。

ｃ、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアミン／Ｎ　−ビニル−Ｎ
−メチルホルムアミド共重合体の製造（方法Ｂによる） 開始剤としてα、α′−アゾイソブチロニトリルｔ−用
い、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルホルムアミドを重合させそ
して水溶液中塩酸を用い１００℃でこのホモポリマーを
部分的に加水分解した。時間および塩酸濃度の函数とし
ての部分氷解の結果を以下の表に示す。

棒時間　　　　９５％塩基性Ｎ　　　１３．５％塩基性
Ｎ２時間　　　１５．７％塩基性Ｎ　　　２０．１％塩
基性Ｎ方法（ａ）では１モルのＮ−ビニル−Ｎ−メチル
ホルムアミドに対し１モルのＨＣｔを、方法（′ｂ）で
は１モルに対し２．５モルのＨＣｔを用いた。

塩基性窒素の値はぎ酸および塩酸をイオン交換体により
除去したあとに測定された。１００％加水分解は塩基性
窒素価２４．９％に相当する。例えば塩基性窒素が９０
％である場合、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアミン／Ｈ−ビ
ニルーＮ−メチルホルムアミド共重合体はＮ−ビニル−
Ｎ−メチルアミン含量３６．０重量％を有する。

特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）芳香族アミノ基またはベンジルアミノ基を有するコ
   フアクターをはじめに相当するイソチオシアネートに変
   換し、そしてこれを次に適当な官能基を有するポリマー
   に付着させることからなるコフアクターをポリマーに結
   合させる方法。 ２）ポリマーが水溶性である請求項１記載の方法。 ５）水溶性ポリマーが第１または第２アミノ基を有する
   請求項２記載の方法。 ４）水溶性ポリマーがビニルアミンとビニルメチルアセ
   タミドとの共重合体であるかまたはビニルメチルアミン
   とビニルメチルアセタミドとの共重合体であつて、モノ
   マーの比が１：９９から４０：６０重量％であることが
   できる共重合体である請求項３記載の方法。 ５）水溶性ポリマーが部分的にアルキルアミンで置換さ
   れたα，β−ポリ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ，Ｌ
   −アスパルタミドである請求項３記載の方法。 ６）水溶性ポリマーがポリエチレンイミンまたは水溶性
   炭水化物である請求項２記載の方法。 ７）チオ尿素またはチオカルバメート橋により芳香族ア
   ミノ基またはベンジルアミノ基を介して水溶性ポリマー
   に結合されたコフアクター。 ８）請求項７記載のポリマーに結合されたコフアクター
   および１種またはそれ以上の酵素を含有する酵素リアク
   ター。 ９）ポリマーに結合されたコフアクターおよび酵素がマ
   イクロカプセル中に含有された請求項８記載の酵素リア
   クター。 １０）ポリマーに結合されたコフアクターおよび酵素が
   限外ろ過膜を備えた膜リアクター中に含有された請求項
   ８記載の酵素リアクター。