JPH01101885A - 新規アルカリプロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリプロテアーゼ及びこれを産生ず
る微生物に関し、更に詳細には、日本の洗濯状況に適し
た洗浄用酵素として広く用いることのできるアルカリプ
ロテアーゼ及びバチルス属に属する当該アルカリプロテ
アーゼ生産菌に関する。

〔従来の技術〕

洗浄剤へのプロテアーゼの配合は、以前よシ行われてき
ているが、当初洗浄剤へ配合されてい九プロテアーゼは
、／Ｑノｑインや膵臓トリプシンといった中性付近に最
適反応ｐＨを有しているものが用いられてい友。

しかし、周知の如く、洗浄剤のｐＨは高アヤカリ側にあ
シ、洗剤用酵素もアルカリ側に最適反応ｐＨを有し、界
面活性剤中において安定なものが望まれ、開発されてき
た。その結果、欧米諸国では１９６７年以降アルカリプ
ロテアーゼ配合洗剤の市場が急激に延び始めてきた。日
本においても１９７９年以降に本格的なプロテアーゼ配
合洗剤が市場に出されるに至っている。

現在、洗剤酵素として用いられている代表的なアルカリ
プロテアーゼは、アルカラーゼ、サビナーゼ、エスペラ
ーゼ（ノボ　インダストリー製）、マキサターゼ（ギス
ト　ゾロカーディス製）等であり、これらの酵素の最適
反応温度は６０℃付近にあシ欧米諸国の洗濯様式にかな
ったものである。

しかしながら、日本の洗濯様式は、室温付近で洗浄を行
うことが一般的である為、より低い温度領域において従
来のプロテアーゼよシ活性の強いプロテアーゼの提供が
求められておシ、これに適合するものとしてＡＰＩ−２
１（昭和電工■製）が開発されるに至っている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来よシ、ケラチン等の不溶性蛋白を良く分解する能力
のあるプロテアーゼが洗浄に寄与することも知られてお
り（皆用基：繊消誌２６３２２（１９８５））、前記の
プロテアーゼに要求される諸性質、すなわち、アルカリ
側でも作用すること及び低温においても活性が高いこと
に加え、更にケラチン等の不溶性蛋白質に対する優れた
作用を有するという性質を兼ね備えたプロテアーゼを洗
剤中に配合すれば、優れた洗浄力と使い易すさを有する
洗剤組成物が得られることが期待される。

したがって、このような性質を有するアルカリプロテア
ーゼの開発が求められていた。

〔問題を解決する為の手段〕

そこで本発明者らは、ケラチンを分解する能力を有し、
かつ最適反応温度の低い（低温域においても活性の高い
）アルカリプロテアーゼを得べく、ゾロテアーゼ生産菌
について鋭意検索をおこなった。

そしてその結果、栃木県芳賀郡の土壌中から得られた一
群の微生物が上記条件を満足するアルカリプロテアーゼ
を産生ずることを見出し、本発明を完成した。

本発明のアルカリプロテアーゼを産生ずる微生物は、そ
れぞれバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、）
ＫＳＭ−２００１、バチルス・エスピーＫＳＭ−２００
２、バチルスＯエスピー　ＫＳＭ−２００３及びバチル
ス・エスピーＫＳＭ−２００５と名付けられたものであ
り、以下に示すような菌学的性質を有する。

（Ａ）　　形態的性質 （ａ）　　細胞の形及び大きさ バチルス−エスピーＫＳＭ−２００１：桿菌０．５〜１
．ＯＸ　１．０〜３５μｍ パ≠ルス・エスピーＫＳＭ−２００２：桿菌０．５〜０
．８　Ｘ　１．５〜３．０μｍバチルス・エスピーＫＳ
Ｍ−２００３：桿菌０．５〜０．８　Ｘ　Ｏ，８〜２３
μｍバチルス・エスピーＫＳＭ−２００５：桿菌０５＝
ＯＢＸ　１．５〜５．０ｐｍ （ｂ）　　多形性 いずれの菌株も認められない。

（Ｃ）　　運動性 いずれの菌株も周鞭毛を有し、運動性あり。

（ｄ）　　胞子（大きさ、形、位置） バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：０．４〜０．６
Ｘ０．４〜０．６μｍ、卵円形又は円形、中央準端バチ
ルス・エスピーＫＳＭ−２００２：０．４〜０．８Ｘ０
．４〜０．８μｍ９円形又はジβ円形、中央準端バチル
ス・エスピーＫＳＭ−２００３：Ｑ、５〜０．８Ｘ０．
８〜１．２μｍ、卵円形又は円柱形、中央準端バチルス
・エスピー、Ｋ　Ｓ　Ｍ　−２００５：０．５〜０．８
Ｘ０．８〜１．２μｍ、卵円形、中央準端（ｅ）　　ダ
ラム染色 いずれの菌株も陽性 （ｆ）　　抗酸性 いずれの菌株も陰性 （ｇ）　　肉汁寒天平板上での発育形態バチルス・エス
ピー　ＫＳＭ−２００１：ｐＨ７，０にて生育し、円形
、中凸状、円滑波状のコロニーを形成する。コロニーの
大きさは直径１．０〜４．０　ｍ表面は円滑で露滴状の
淡黄色を呈する。ま九半透明であ多脂状のコロニーであ
る。

バチルス・エスピー　ＫＳＭ−２００２：円形、凸円状
、円滑波状のコロニーを形成する。大きさは直径１．０
〜５．０ｉｎ　　表面は円滑で露滴状、淡黄色〜乳白色
を呈する。また半透明であ多脂状のコロニーである。

バチルス・エスピー　ＫＳＭ−２００３：りＨ７，Ｏに
て生育し、円形、台状、円滑波状のコロニーを形成する
。コロニーの表面は、円滑、露滴状で淡黄色を呈する。

また半透明であ多脂状のコロニーである。

ノ層チルス・エスピー　ＫＳＭ−２００５：ｐＨ７，０
にて生育し、円形、中凸状、円滑波状のコロニーを形成
する。コロニーの表面は、円滑、露滴状で淡黄色を呈す
る。また半透明であり、指状のコロニーである。

（ｈ）　　肉汁寒天斜面上での生育 バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：ｐＨ７，０にお
いて帯状の弱い生育を示し、乳白色、半透明のコロニー
を形成する。ｐＨ１０，０において波帯状に生育する。

バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２：ｐＨ７，０にお
いて帯状の弱い生育を示し、乳白色、半透明のコロニー
を形成する。ｐＨ１０，０において波帯状に生育する。

バチルス・エスピーＫＳＭ−２００３：ｐＨ７，０にお
いて帯状の弱い生育を示し、乳白色、半透明のコロニー
ヲ形成する。ｐＨ１０，０において波帯状に生育する。

バチルス・エスピー　ＫＳＭ−２００５：ｐＨ７０＊　
１０．０にて波帯状に生育し、乳白色、半透明のコロニ
ーヲ形成する。

（ｉ）　　肉汁液体培養 いずれの菌もｐＨ７，０にて僅かに生育するが菌膜は形
成しない。

０）　　肉汁ゼラチン穿刺培養 バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：ｐＨ７，０にお
いてゼラチン液化せず。

バチルスａｘスビーＫＳＭ−２００２，２００３，２０
０５：ｐＨ７，０においていずれもゼラチンを液化する
。

仮）　リドマスミルク いずれの菌株も僅かに生育するがミルクの凝固、リドマ
スの色調変化は認められない。

（Ｂ）　　生理的性質 （ａ）　　以下の生理試験の結果は、いずれの菌株も陰
性であった。

硝酸塩の還元、脱窒反応、ＭＲテスト、ｖＰテスト、イ
ンドールの生成、硫化水素の生成、無機窒素源の利用（
硝酸す）　ＩＪウム。

硫酸アンモニウムン、色素の生成、クエン酸の利用（Ｃ
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、　Ｓｉｍｏｎｓの培地）、　ウ
レアーゼ、ＯＦテスト。

（ｂ）　　以下の生理試験の結果はいずれの菌株も陽性
であった。

オキシダーゼ、カタラーゼ。

（ｃ）　　デンプンの加水分解 バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１，２００３：分解
する。

バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２，２００５：分解
せず。

（ｄ）　　生育ｐＨ範囲 バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：ｐＨ８〜１０．
０で生育良好。但し、ｐＨ７，０〜１１．０の範囲内で
生育可能。

パデルスΦエスピーＫＳＭ−２００２：　−ｐＨ６，０
〜１１，０で生育する。

バチルス−エスピーＫＳＭ−２００３：ｐＨ７，０〜１
１．０で生育する。

バチルス・エスピーＫＳＭ−２００５：ｐＨ７．０〜１
０，０で生育する。

（ｆ）　　生育温度範囲 バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１：２０℃〜３７℃
で生育良好。但し、１０℃〜４０℃の範囲内で生育可能
。

バチルス働エスーーｘｓＭ−ｚｏｏ２，２ｏｏ３，２ｏ
ｏｓ　：２０℃〜３０℃で生育良好。但し、１０℃〜３
７℃の範囲内で生育可能。

（ω　酸素に対する態度 いずれの菌株も、好気性及び嫌気性下で生育可能。

（ｈ）　　糖類からの酸及びガスの生成いずれの菌株も
、以下の糖類から酸及びガスを生成しなかった。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−７ラクトース、Ｄ−ガラクトース
、マルトース、シュークロース、ラクトース、トレノ１
０〜ス、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、イノシ
トール、グリセロール、スターチ。

（ｉ）　　糖類の資化性 以下余白 （ｊ）　　塩化ナトリウムに対する耐性バチルス・エス
ピーＫＳＭ−２００１，２００２，２００３：１０％塩
化す）ｌラム存在下で生育する。

バチルス・ニスぎ−ＫＳＭ−２００５ニア％塩化ナトリ
ウム存在下で生育する。

以上のアルカリプロテアーゼ生産菌の菌学的性質を、「
バーゾエーズマニュアルオプ　デイターミネイティブバ
クテリオロゾー第８版（１９７４）Ｊ及び「ザゾーナス
バチルス、アグリカルチャーハンドブックＮ１４２７（
１９７３）Ｊの記載に準じ、他の菌株と比較すると次の
通りである。

いずれの菌株も、ダラム陽性の有胞子細菌でバチルス属
に属する細菌であることは明白であるが、更に若干の相
違点はあるものの、グルコース、マンニトール等を貴化
することはできるが酸産生が認められないこと、硝酸還
元能を持たないこと、クエン酸を利用しないこと並びに
嫌気条件下では生育不可能であることから、バチルス・
プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　）に近縁
であると考えられる。

しかし、バチルス・プレビスは、５％の食塩を含む培地
では生育できない点が本発明の菌と異なっティる。また
、パｆ　Ａ／　スｅ　ｚＱ　、Ｘラージ（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｐＨｓｔｅｕｒｉｉ　）にも近縁であるが、嫌気条
件下での生育、アルカリ培地においてＮＨ２Ｃｌを要求
しないこと、尿素を炭酸アンモニウムに変換しない等の
点において本発明の菌とは異なっている。またバチルス
・プレビスとバチルス・、９スツーリの中間に位置する
バチルス・７０イデンライヒ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｒｅ
ｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　）にも同様に類似はしている
が、尿素の変換及びフェニルアラニンの脱アミン反応を
行う点で本発明の菌とは異なっている。

更に本発明菌株中、バチルス・エスピーＫＳＭ−２００
１及び−２００３はいずれもでんぷん加水分解能を有し
ておシ、バチルス・アルカロフイラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ　）の近縁とも判断され
るが、バチルス・アルカロフイラスはｐＨ７で生育でき
ないのく対し、これら菌株はｐＨ７以上で生育できる点
において相違する。

以上の点から、本発明者は本発明のアルカリプロテアー
ゼ生産菌、すなわち、バチルス・ニス♂−ＫＳＭ−２０
０１、ＫＳＭ−２００２、ＫＳＭ−２００３及びＫＳＭ
−２００５はいずれも従来知られている。２チルス属の
菌種とは異なるバチルス属の新菌種と判断した。それら
菌株を以下のように工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託した。

バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１（＠工研菌寄第９
４４９号）バチルス・エスピーＫＳＭ−２００２（微工
研薗寄第９４５０号）バチルス・エスピーＫＳＭ−２０
０３（微工研薗寄第９４５１号）バチルス・エスピーＫ
ＳＭ−２００５（微工研菌寄第９４５３号）上記の各菌
株を用いて本発明の新規なアルカリプロテアーゼを得る
には、適当な培地に該菌株を接種し、常法に従って培養
すれば良い。培地中には貴化し得る炭素源及び窒素源を
適当量含有せしめておくことが好ましい。

この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、そ
の例としては、窒素源としては、コーングルテンミール
、大豆粉、コーンスチーデリカー、カザミノ酸、酵母エ
キス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペ
プトン、ハイゾロ、アゾノ９ワー、コーンミール、ンイ
ピーンミール、コーヒー粕、綿笑油粕、カルチベータ、
アミフレックス及びアゾゾロン、ゼスト、アゾツクスな
どが挙げられる。又、炭素源としては、資化し得る炭素
源、例えば、アラビノース、キシロース、グルコース、
マンノース、フジクトース、カラクトース、蔗糖、麦芽
糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノシトール
、グリセリン、可溶性デンプンや廉価な廃糖蜜、転化糖
等、また資化し得る１機酸、例えば酢酸等が挙げられる
。また、その他、リン酸、Ｍｇ２＋　、　Ｃａ２＋　、
　Ｈｎ２＋　、　ｚｎ２＋。

Ｃｏ”　、　Ｎａ＋、　Ｋ＋などの無機塩や、必要であ
れば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加するこ
ともできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるプロテ
アーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製の
手段に準じて行なうことが出来る。

すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等することによ
って菌体を分離し、その菌体及び培養Ｆ液から通常の分
離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（
メタノール、エタノール、インデロノｑノールアセトン
等）によって蛋白を沈澱させたシ、又、限外濾過（例え
ばダイアフローメンブレンＹＣ１アミコン社製）により
濃縮させて本発明のプロテアーゼを得る。塩析法では例
えば、硫安（３０〜７０チ飽和画分）、溶媒沈澱では例
えば、７５ｔＩｉエタノール中で酵素を沈澱させた後、
濾過或いは遠心分離、脱塩することによってこれを凍結
乾燥粉末とすることも可能である。

脱塩の方法としては透析又はセファデックス　Ｇ−２５
等を用いるゲルろ過法等の一般的方法が用いられる。

このようにして得られる酵素液は、そのまま使用するこ
ともできるが、更に公知の方法により精製結晶化して用
いることもできる。さらに酵素を精製するには、例えば
ヒドロキシアノｑタイトクロマトグラフィー等の吸着ク
ロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス又はＤＥ
ＡＥ−セルロース等のイオン交換クロマトグラフィー及
びセファデックスやバイオダルのような分子篩ダルクロ
マトグラフィーを適宜組み合わせて分別精製すれば良い
。

斯くして得られた本発明のアルカリプロテアーゼは以下
に示すような理化学的性質を有する。なお、以下におい
て、バチルス・エスピーＫＳＭ−２００１株の産生ずる
アルカリプロテアーゼをアルカリプロテアーゼに−２０
０１と、ＫＳＭ−２００２株の産生ずるものをアルカリ
プロテアーゼに−２００２と、ＫＳＭ−２００３株の産
生ずるものをアルカリプロテアーゼに−２００３と、Ｋ
ＳＭ−２００５株の産生ずるものをアルカリプロテアー
ゼに−２００５とそれぞれ称する。

（ａ）　　基質特異性 尿素変性ヘモグロビンに対する各酵素の活性を同一とし
、ケラチン、カゼイン、ミオグロビン及び牛血清アルブ
ミンに対する活性を測定した。１００　ｍＭホウ酸緩衝
液（ｐＨ１０，５）に各基質を１％（尿素変性ヘモグロ
ビンは１２％）加え、各酵素液Ｉ　Ｘ　１０〜’　Ａ、
Ｕ、を添加し、２５℃にて１０分間反応を行った（ケラ
チンを基質とし九場合は６０分間）。それぞれの基質に
対するＡＰＩ−２１の活性を１とした時の各酵素の相対
活性を第１表に示す。

以下余白 この結果から明らかなように、本発明のアルカリプロテ
アーゼは現在洗剤用酵素として良く用いられている酵素
ＡＰＩ−２１，アルカラーゼ、サビナーゼ等と比べ、ケ
ラチン分解性が優れている。

（ｂ）　　反応最適ｐＨ 各緩衝液（１００ｍＭ）中に最終濃度ｚ２％の尿素変性
ヘモグロビンを添加し、１．０Ｘ１０〜’Ａ、　Ｕ、の
各酵素液を加え、２５℃１０分間反応を行った。最適ｐ
Ｈの値を１００％とし、各ｐＨでの反応初速度を相対的
に表わした。この結果を第１−Ａ図〜第１−Ｄ図に示す
。なお、使用した緩衝液及びそのｐＨ範囲は以下の通シ
である。

酢酸緩衝液　　　　　ｐＨ４．０〜６，０リン酸緩衝液
　　　　ｐＨ６．０〜＆０ホウ酸緩衝液　　　　ｐＨ＆
ｏ−１０，０炭酸緩衝液　　　　　ｐＨ９−１１，０リ
ン酸ナトリウム緩衝液　　ｐＨ１０．５〜Ｉ　ＺＯこれ
らの図から明らかな如く、アルカリプロテアーゼに−２
００１及びに−２００２の最適ｐＨは９，５〜１０．５
、アルカリプロテアーゼに−２００３の最適ｐＨは＆５
〜１１．５、アルカリプロテアーゼに−２００５の最適
ｐＨは８．５〜１０．０であった。

（ｃ）　　ｐＨ安定性 上記（ｂ）で用いたのと同じ各緩衝液（１００ｍＭ　）
中に２　Ｘ　１０〜’　Ａ、Ｕ、の酵素液を加え、５℃
で２４時間放置した。この処理液を０．５　Ｍホウ酸緩
衝液で５倍に希釈後、尿素変性ヘモグロビンを基質とし
、ｐＨ１０，５で反応を行い、残存活性を測定した。処
理前の酵素活性を１００％とし、各ｐＨ領域にて処理し
たサンプルの活性を相対的に我わした。この結果を第２
−Ａ図〜第２−Ｄ図に示′す。

これらの図から明らかな如く、アルカリプロテアーゼに
−２００１及びに−２００２はｐＨ４〜１２の範囲で安
定であり、また、アルカリプロテアーゼに−２００３及
びに−２００５はｐＨ５〜１２の範囲で安定であった。

（ｄ）　　反応最適温度 各温度下、Ｉ　Ｘ　１０〜’　Ａ、Ｕ、の各酵素液を用
い、尿素変性ヘモグロビンを基質としてｐＨ１０，５で
反応をおこなった結果を第３−Ａ図〜第３−Ｄ図に示す
。

これらの図から明らかな如く、アルカリプロテアーゼに
−２００１及びに−２００５は４０℃に最適温度を、ア
ルカリプロテアーゼに−２００２及びに−２００３は３
５〜４０℃に最適温度をそれぞれ有し、しかもいずれの
酵素の場合にも２０〜３０℃の低温域において最高活性
時の５０％以上の活性を示した。

（ｅ）　　界面活性剤及びビルダーの影響的２　Ｘ　１
０”−’Ａ、Ｕ、の各アルカリプロテアーゼを所定濃度
の各種界面活性剤又はビルダーを溶解した５０ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐＨ＆０）に加え、２５℃で１時間放置した
。その後、同緩衝液にて５倍に希釈後、アンソン−ヘモ
グロビン法によυ残存活性を測定した。界面活性剤及び
ビルダー無添加で同様に処理した酵素活性を１００チと
し、残存活性を相対値で表わした。この結果を第２表に
示す。

以下余白 この結果から明らかなように、アルカリプロテアーゼに
−２００１及びに−２００２は試験したすべての界面活
性剤及びビルダーに対し安定であった。また、アルカリ
プロテアーゼＫ　−２００３はＬＡＳ、ＳＡＳ及びＥＤ
ＴＡに対してはやや不安定であるが、その他の界面活性
剤及びビルダーに対して非常に安定であった。更に、ア
ルカリプロテアーゼに−２００５は前者のアルカリプロ
テアーゼよシはやや劣るものの比較的安定であると言え
る。

（ｆ）　　酵素阻害剤の影響 一般的な酵素阻害剤、すなわち、ノ９ラクロロマーキュ
リーペンゾエイト（ＰＣＭＢ）、ジイソプロピルフルオ
リデート（ＤＦＰ）、アンナノ９イン、ロイペプチン、
ペプスタチン、キモスタチンについて、これらが本発明
のアルカリプロテアーゼに対し与える影響を調べ友、各
阻害剤は、所定濃度となるように１００ｍＭホウ酸緩衝
液（ｐＨ８，０）（ＤＦＰの場合のみ１００ｍＭ）リス
塩酸緩衝液ｐＨ７，０）へ加え、４　Ｘ　１０〜’　Ａ
、Ｕ。

のアルカリプロテアーゼを添加後２５℃１時間処理を行
った。その後同緩衝液にて１０倍に希釈後、アンンンー
ヘモグロピン法によυ残存活性を測定した。残存活性は
、阻害剤無添加で同様に処理した酵素活性に対する相対
値で表わした。この結果を第３表に示す。

第３表 いずれの酵素もＤＦＰ及びキモスタチンで阻害されるこ
とからセリ／プロテアーゼであることが示唆されるが、
その阻害率は従来のセリンプロテアーゼに比較し、非常
に小さく、本発明のアルカリプロテアーゼの特徴の１つ
としてこれらの阻害剤に対し強い抵抗性を有しているこ
とがあげられる。

（２）金属イオンの影響 金属イオンの酵素活性に及ぼす影響について調べた結果
を第４表に示した。各金属塩を５ｍＭとなるように０．
１　Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）に加え、各アルカリ
プロテアーゼ４　Ｘ　１０＝Ａ、Ｕ。

添加後２５℃１０分間処理を行った。その後同緩衝液に
て１０倍に希釈してアンノン−ヘモグロビン法にて酵素
活性を測定した。金属塩未添加の系を対照として用い、
その活性を１００とした時の相対値で各金属イオンの影
響を表わした。

以下余白 第４表 この結果、いずれのプロテアーゼもＣｕ”＋　によって
は強く阻害されたが、他の金属イオンに対しては非常に
安定でアシ、何ら影響を受けなかった。

（ｈ）　　分子量 トヨ、ｅ−ルＨＷ−５５を用いるダルー過クロマトグラ
フィーにより、各アルカリプロテアーゼの分子量を測定
した。このゲルろ過において、溶出液としては、０．１
Ｍ塩化カリウム、５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０　ｍ
Ｍ　）　’Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用い、ま
た標準蛋白として牛血清アルブミン（ＭＷ：　６ａ００
０　）、卵白アルブミン（ＭＷ：４へ０００）、キモト
リデシノーグンＡ　（ＭＷ：　２５０００　）、及びリ
ボヌクレアーゼＡ　（ＭＷ：　１ａ７００　）を用いた
。この結果を第５表に示す。

第５表 〔発明の効果〕 本発明のアルカリプロテアーゼ生産菌の産生ずるアルカ
リプロテアーゼは、軟土の如く、アルカリ側において高
い活性を示し、しかもこの活性は低温域においても最高
活性の５０％以上の活性を有するものである。更に、こ
のアルカリプロテアーゼは、ケラチン等において優れた
分解力を有し、かつ、洗剤組成物中に配合されたシ、洗
濯中に混入する各種成分、例えば界面活性剤、ビルダー
成分、金属イオン等の存在下においてもほとんどその作
用の低下は認められない。したがって、本発明のプロテ
アーゼは、各々の洗剤に配合するプロテアーゼとして極
めて優れたものである。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ プロテアーゼ産生菌株の分離、採取： （１）栃木県芳賀郡で採取した土壌サンプルの約１２′
Ｊｋ滅菌生理食塩水１ｏ−に懸濁し、８０℃にて２０分
間放置し熱処理した。熱処理上清液０、１　ｍｌをケラ
チンハロー寒天培地へ接種し、３０℃で４８時間靜装培
養した。用いたケラチンハロー寒天培地の組成は以下に
示す通りである。

グルコース　　　　　　　　　１％ 酵母エキス　　　　　　　　　０．２％羊毛ケラチン　
　　　　　　１　チ カルゼキシメチルセルロース　　　　１　チリン酸第−
カリウム　　　　０．１％ 硫酸マグネシウム・７水塩　　　　　０．０２％寒天　
　　　　　　　　　　１．５％ （Ｉｔ）　　上記培地組成物に、別滅菌を施した１０％
炭酸ナトリウムを０．０１優、０．１チ、ｌチ添加し、
最終ｐＨｔ　７．０．９．０，１０．５に調整後、平版
培地を作製した。

培養後、生育したコロニーの周囲にハローを生じたもの
を選抜し、同培地で２〜３回純化し、均一のプロテアー
ゼ生産菌を得た。土壌サンプル３００点よシ各ｐＨの平
板培養より得られた菌株は、１２０１１株でめった。

（Ｉｌｌ）　　上記（ｉ）で得たこれらの菌株を以下に
示すケラチン液体培地へ接種し、３０℃で好気的に４８
時間振盪培養を行った。

グルコース　　　　　　　　　０．２％ケラチン（羊毛
）ｏ、５チ 酵母エキス　　　　　　　　０．０５チリン酸第−カリ
ウム　　　　０．１チ 硫酸マグネシウム（７水塩）　　　　　０．０２％炭酸
ナトリウム（別滅菌）ｏ、４％ ｐＨ９，０ 培養中ま九は終了後、ケラチンの分解力が顕著な菌株を
選択し、アルカリプロテアーゼ生産菌を得た。

斯くして得られた４自株金それぞれバチルス−エスピー
ＫＳＭ−２００１，２００２、２００３及び２００５と
命名した。

実施例２ 実施例１によυ得られたバチルス・エスピーＫＳＭ−２
００１（ＦＥＲＭ、Ｐ−９４４９）、ＫＳＭ−２００２
（ＦＥＲＭ、Ｐ−９４５０）、ＫＳＭ−２００３（ＦＥ
ＲＭ、Ｐ−９４５１）及びに８Ｍ−２００５（ＦＥＲＭ
、Ｐ−９４５３）のそれぞれを以下の液体培地に接種し
、３０℃で好気的に４８時間振盪培養を行い、アルカリ
プロテアーゼを生産させた。

グルコース　　　　　　　　２　％ 魚肉エキス　　　　　　　　１　％ 大豆粉　　　　　　　　　　１　％ 硫酸マグネシウム　　　　０．０２％ リン酸第−カリウム　　　　０．１％ ｐＨ１０，０ 培養終了後、得られた培養物を遠心分離（３０００ｒ　
ｐｍ　：　１０分間）して菌を除去し、得られ九培養上
清を酵素液としてそのプロテアーゼ活性を測定した。ア
ルカリプロテアーゼの活性は次の２通りの方法によって
測定した。

（ａ）　　尿素変性ヘモグロビンを基質としたアンソン
−ヘモグロビン法： アンソ／の方法に従い（Ａｎｓｏｎ、　Ｍ、　Ｌ　：　
Ｊ、　Ｇｅｒ。

血清ヘモグロビンを変性させ、苛性ソーダにてｐＨ１０
，５とした。この基質溶液（ヘモグロビンとして２２％
〕を０．５ｄに酵素液０．１ａ／（１，０ｘｌＯ−１，
０Ｘ１０　　μＡ、Ｕ、　）を添加し２５℃にて１０分
間反応を行い４．９　％　トリクロル酢酸１、０〜を加
え反応を停止した。反応終了後、遠心分離（３０００ｒ
ｐｍ　１０分間）を行いその上清液中に含まれる蛋白分
解物をフォーリン・ローリ−法（０，Ｈ，Ｌｏｗｒｙら
、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　１９３２６５（１９５
１））によって定量した。

ＩＡ、Ｕ、は、上記反応条件下において１分間に１　ｍ
ｍｏｌｅのチロシンを遊離する酵素量とした。

ら）　ケラチンを基質とした方法： ０．５％羊毛ケラチンを２０　ｍＭ炭酸緩衝液中に懸濁
させた溶液０．５ｍＫ、酵素液０．１−を添加し、２５
０２時間反応を行い、４９％トリクロル酢酸水溶液１．
０〜を加え反応を停止した。以下の操作は（ａ）と同一
とし、蛋白分解物量を測定した。なお、ＩＫＵは、上記
反応条件下において１分間にｉｍｍｏｌｅのチロシンを
遊離する酵素量とした。

本実施例で得られた酵素液のゾロテアーゼ活性は、第６
表の通シである。

第６表 実施例３ 実施例２において得られた各酵素液に７５チ飽和になる
ように硫安を添加した。生じた沈殿を遠心分離（８００
０ｒｐｍ　１５分）シ、イオン交換水に対し透析後その
酵素学的性質（理化学的性質）を詞べたところ、前記の
通シであった。

実施例４ 洗浄式＃： ＪＩＳ　Ｋ３３７１に準じ、洗浄試験をおこなった。

洗浄系は、市販の無リン重質洗剤（酵素未添加のもの）
を０．１３３％になるように４’ｐＨの水にて調製後、
アルカリプロテアーゼに−２００１，に−２００２及び
に−２００３の各ゾロテアーゼ溶液を０、　ＯＩ　ＡＵ
／ｌとなるようにそれぞれ添加した。

試験布は、ヒト皮膚上の汚れが付着しやすいワイシャツ
の衿部分（３日間着用）とし、一対比較ができるように
１１　Ｘ　１３ｃＩＩＩ程に裁断後、酵素添加、あるい
は酵素未添加の洗浄系にて３０℃１時間浸漬を行った。

浸漬終了後ターゴツトメーター（上品製作所製）ｔ−使
用し、２０℃、１２０ｒｐｍで１０分間洗浄を行った。

濯ぎ、乾燥後、一対の衿布（１５組）を見比べ汚れ落ち
の程度を３名の熟練した判定者によりそれぞれ肉眼で判
定を行った。判定方法は、汚れがほぼ完全におちている
場合を５点、汚れがほとんどおちていない場合を１点と
し、１５枚の衿布の合計評価点を求め、酵素未添加の洗
浄系による評価点を１００とした場合の比率を洗浄力指
数として表わした。この結果を第７表に示す。

第７表 実施例５ アルカリプロテアーゼに−２００２及びに−２００５の
ゾロテアーゼ液について、酵素濃度ｔ”０．０１６ｋＵ
／ｌとし、１０℃で２時間浸漬を行なう以外は実施例４
と同様にして址温での洗浄試験をおこなった。この結果
を第８表に示す。

第８表 以上の結果により、本発明のアルカリプロテアーゼは、
通常の洗濯温度における洗浄力はもとより、よシ低温に
おいてもその作用を充分に発揮しうる優れ丸洗浄剤用の
酵素であることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１−Ａ図ないし第１−Ｄ図は、それぞれ本発明のアル
カリプロテアーゼに−２００１ないしに−２００５の活
性に及ぼすｐＨの影響を示す図面である。 第２−Ａ図ないし第２−Ｄ図は、それぞれ本発明のアル
カリプロテアーゼに−２００１ないしに−２００５の安
定性に及ぼすｐＨの影響を示す図面である。 第３−Ａ図ないし第３−Ｄ図は、本発明のアルカリプロ
テアーゼに−２００１ないしに−２００５の活性に及ぼ
す温度の影響を示す図面である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有するアルカリプロテアーゼ。 （１）作用 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイン、ミオグロ
   ビン、牛血清アルブミンに対して作用する。 （２）基質特異性 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイン、ミオグロ
   ビン、牛血清アルブミンに対する高い活性を有する。特
   にケラチンに対して高い活性を有する。 （３）金属イオンの影響 Ｃｕ＾２＾＋により強く阻害される。 ２、更に次の性質を有する特許請求の範囲第１項記載の
   アルカリプロテアーゼ（Ｋ−２００１）。 （４）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は５．５〜１２．０である。最適ｐＨは９
   ．５〜１０．５であり、７．５〜１１．５の範囲に於い
   ても最適ｐＨにおける活性の５０％以上の相対活性を有
   する。 （５）ｐＨ安定性 ｐＨ４〜１１で極めて安定で失活せず、ｐＨ４〜１２．
   ５に於いても、５０％以上の活性を維持している。 （６）最適温度 作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわたり、その最適温
   度は４０℃である。また、１８〜４８℃の範囲において
   も、最適温度での活性の５０％以上を有している。 （７）分子量 約１７，０００（ゲルろ過法による） ３、更に次の性質を有する特許請求の範囲第１項記載の
   アルカリプロテアーゼ（Ｋ−２００２）。 （４）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は５．５〜１２．０である。最適ｐＨは９
   ．５〜１０．５であり、７．０〜１１．５の範囲に於い
   ても最適ｐＨにおける活性の５０％以上の相対活性を有
   する。 （５）ｐＨ安定性 ｐＨ７．０〜１０．５で極めて安定で失活せず、ｐＨ４
   〜１２に於いても、８０％以上の活性を維持している。 （６）最適温度 作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわたり、その最適温
   度は３５〜４０℃である。また、１８〜４５℃の範囲に
   おいても、最適温度での活性の５０％以上を有している
   。 （７）分子量 約６７，０００（ゲルろ過法による） ４、更に次の性質を有する特許請求の範囲第１項記載の
   アルカリプロテアーゼ（Ｋ−２００３）。 （４）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は５〜１２以上である。最適 ｐＨは８．５〜１１．５であり、７〜１２の範囲に於い
   ても最適ｐＨにおける活性の５０％以上の相対活性を有
   する。 （５）ｐＨ安定性 ＰＨ５〜１０．５で極めて安定で失活せず、ｐＨ４〜１
   ２．５に於いても、５０％以上の活性を維持している。 （６）最適温度 作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわたり、その最適温
   度は３５℃である。また、１８〜４８℃の範囲において
   も、最適温度での活性の５０％以上を有している。 （７）分子量 約５３，０００（ゲルろ過法による） ５、更に次の性質を有する特許請求の範囲第１項記載の
   アルカリプロテアーゼ（Ｋ−２００５）。 （４）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は５〜１２以上である。最適ｐＨは８．５
   〜１０．０であり、７．５〜１２以上の範囲に於いても
   最適ｐＨにおける活性の５０％以上の相対活性を有する
   。 （５）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１２で極めて安定で失活せず、ｐＨ４．５〜１
   ２．５に於いても、５０％以上の活性を維持している。 （６）最適温度 作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわたり、その最適温
   度は４０℃である。また、２２〜５５℃の範囲において
   も、最適温度での活性の５０％以上を有している。 （７）分子量 約４０，０００（ゲルろ過法による） ６、バチルス属に属し、次の性質を有するアルカリプロ
   テアーゼＫ−２００１を産生する微生物。 （１）作用 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイ ン、ミオグロビン、牛血清アルブミン等に対して作用す
   る。 （２）基質特異性 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイ ン、ミオグロビン、牛血清アルブミンに対する高い活性
   を有する。特にケラチンに対して高い活性を有する。 （３）金属イオンの影響 Ｃｕ＾２＾＋により強く阻害される。 （４）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は５．５〜１２．０である。最適ｐＨは９
   ．５〜１０．５であり、７．５〜１１．５の範囲に於い
   ても最適ｐＨにおける活性の５０％以上の相対活性を有
   する。 （５）ｐＨ安定性 ｐＨ４〜１１で極めて安定で失活せず、ｐＨ４〜１２．
   ５に於いても、５０％以上の活性を維持している。 （６）最適温度 作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわたり、その最適温
   度は４０℃である。また、１８〜４８℃の範囲において
   も、最適温度での活性の５０％以上を有している。 （７）分子量 約１７，０００（ゲルろ過法による） ７、バチルス属に属し、次の性質を有するアルカリプロ
   テアーゼＫ−２００２を産生する微生物。 （１）作用 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイ ン、ミオグロビン、牛血清アルブミンに対して作用する
   。 （２）基質特異性 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイ ン、ミオグロビン、牛血清アルブミンに対する高い活性
   を有する。特にケラチンに対して高い活性を有する。 （３）金属イオンの影響 Ｃｕ＾２＾＋により強く阻害される。 （４）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は５．５〜１２．０である。最適ｐＨは９
   ．５〜１０．５であり、７．０〜１１．５の範囲に於い
   ても最適ｐＨにおける活性の５０％以上の相対活性を有
   する。 （５）ｐＨ安定性 ｐＨ７．０〜１０．５で極めて安定で失活せず、ｐＨ４
   〜１２に於いても、８０％以上の活性を維持している。 （６）最適温度 作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわたり、その最適温
   度は３５〜４０℃である。また、１８〜４５℃の範囲に
   おいても、最適温度での活性の５０％以上を有している
   。 （７）分子量 約６７，０００（ゲルろ過法による） ８、バチルス属に属し、次の性質を有するアルカリプロ
   テアーゼＫ−２００３を産生する微生物。 （１）作用 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイ ン、ミオグロビン、牛血清アルブミンに対して作用する
   。 （２）基質特異性 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイ ン、ミオグロビン、牛血清アルブミンに対する高い活性
   を有する。特にケラチンに対して高い活性を有する。 （３）金属イオンの影響 Ｃｕ＾２＾＋により強く阻害される。 （４）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は５〜１２以上である。最適 ｐＨは８．５〜１１．５であり、７〜１２の範囲に於い
   ても最適ｐＨにおける活性の５０％以上の相対活性を有
   する。 （５）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１０．５で極めて安定で失活せず、ｐＨ４〜１
   ２．５に於いても、５０％以上の活性を維持している。 （６）最適温度 作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわたり、その最適温
   度は３５℃である。また、１８〜４８℃の範囲において
   も、最適温度での活性の５０％以上を有している。 （７）分子量 約５３，０００（ゲルろ過法による） ９、バチルス属に属し、次の性質を有するアルカリプロ
   テアーゼＫ−２００５を産生する微生物。 （１）作用 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイ ン、ミオグロビン、牛血清アルブミンに対して作用する
   。 （２）基質特異性 尿素変性ヘモグロビン、ケラチン、カゼイ ン、ミオグロビン、牛血清アルブミンに対する高い活性
   を有する。特にケラチンに対して高い活性を有する。 （３）金属イオンの影響 Ｃｕ＾２＾＋により強く阻害される。 （４）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は５〜１２以上である。最適 ｐＨは８．５〜１０．０であり、７．５〜１２以上の範
   囲に於いても最適ｐＨにおける活性の５０％以上の相対
   活性を有する。 （５）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１２で極めて安定で失活せず、ｐＨ４．５〜１
   ２．５に於いても、５０％以上の活性を維持している。 （６）最適温度 作用温度は１０〜７０℃の広範囲にわたり、その最適温
   度は４０℃である。また、２２〜５５℃の範囲において
   も、最適温度での活性の５０％以上を有している。 （７）分子量 約４０，０００（ゲルろ過法による）