JP2985018B2 - 新規微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規微生物に関し、更に
詳細には界面活性剤に対して極めて優れた安定性を有
し、洗浄剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼ
Ｋ−１６を産生し、バチルス属に属する新規微生物に関
する。

【０００２】

【従来の技術】洗浄剤へのプロテアーゼの配合は以前よ
り行われており、現在多くのアルカリプロテアーゼが洗
剤用酵素として用いられている。その代表的なものとし
ては、アルカラーゼ、サビナーゼ、エスペラーゼ（ノヴ
ォ・インダストリー社製）等が挙げられるが、これらア
ルカリプロテアーゼの多くのものは、界面活性剤液中で
の安定性が悪いという問題があった。

【０００３】一方、界面活性剤に安定なものとしてYa酵
素（特開昭61-280278 号公報）等が報告されているが、
これは活性領域が高温度側にあるため、一般的に室温付
近で洗浄を行う日本の洗濯様式には適合しないという問
題があった。

【０００４】また、より低い温度領域において、従来の
プロテアーゼよりも活性発現力の強いプロテアーゼとし
てＡＰＩ−２１（特公昭60-55118号公報）が開発されて
いるが、これも界面活性剤液中での安定性は未だ充分満
足のいくものではなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、界面活性剤中
で高い安定性を有し、洗浄剤配合酵素として優れた機能
を有するアルカリプロテアーゼを生産する微生物を自然
界から探索し、これを分離・精製することは極めて意義
のあることである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、上
記課題を解決するため、広く日本の土壌よりアルカリプ
ロテアーゼ生産菌を得るべく、鋭意検索した。その結
果、栃木県芳賀郡の土壌より採取したバチルス属に属す
る微生物が洗浄剤配合系において優れた安定性を有する
新規なアルカリプロテアーゼを生産することを見出し、
本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明はバチルス（Bacillus）
属に属する新規なアルカリプロテアーゼＫ−１６生産菌
を提供するものである。

【０００８】本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６を
産生する微生物はバチルス属に属し、以下に示すような
菌学的性質を有する。

【０００９】（Ａ）形態的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌 0.8〜1.0 μm × 2.2
〜２５μm （ｂ）多形性：無し。 （ｃ）運動性：周鞭毛を有し、運動性あり。 （ｄ）胞子〔大きさ、形、位置〕： 1.0〜1.2 μm ×1.
4〜2.2 μm 、楕円形 、中央準端、胞子嚢の膨潤ややあり。（ｅ）グラム染
色：陽性 （ｆ）抗酸性：陰性 （ｇ）肉汁寒天平板上での発育形態：円形、葉状、表面
円滑、淡黄色、半透明 のコロニー。 （ｈ）肉汁寒天斜面上での生育：不規則な葉状、表面少
しだけ粗な円滑、淡黄 色、半透明のコロニー。 （ｉ）肉汁液体培養：生育良好で混濁あり菌膜無し。 （ｊ）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育良好で液化する。 （ｋ）リトマスミルク：ペプトン化するが、ミルクの凝
固なし、リトマスの変化なし。

【００１０】（Ｂ）生理的性質 （ａ）硝酸塩の還元：陽性 （ｂ）脱窒反応：陰性 （ｃ）ＭＲテスト：陰性 （ｄ）ＶＰテスト：陽性 （ｅ）インドール生成：陰性 （ｆ）硫化水素生成：陰性 （ｇ）澱粉加水分解：陽性 （ｈ）クエン酸の利用：陽性 （ｉ）無機窒素源の利用：硝酸塩を利用するが、アンモ
ニウム塩は利用しない。 （ｊ）色素の生成：陰性 （ｋ）ウレアーゼ：陰性 （ｌ）オキシダーゼ：陽性 （ｍ）カタラーゼ：陽性 （ｎ）生育の温度範囲：５５℃以下 （ｏ）生育のｐＨ範囲：ｐＨ６．６〜１０．３で生育可
能。 （ｐ）酸素に対する態度：好気的 （ｑ）ＯＦテスト：酸化型（Ｏ型） （ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性：１０％塩化ナトリ
ウム存在下で生育する。 （ｓ）糖からの酸生成及びガス生成。

【００１１】

【表１】

【００１２】以上の菌学的性質について「バージェーズ
マニュアル オブ システマティック バクテリオロ
ジー（Williams & Wilkins社，１９８４年）」(Bergey'
s Manual of Systematic Bacteriology) の記載に準じ
検討したところ、本発明菌株は、バチルス ズブチルス
（Bacillus subtilis）に属させることが妥当である。
しかし、バチルス ズブチルスがpH１０の培地には全く
生育しないのに対し、本発明菌株はpH１０でも良好に生
育する。また、バチルス ズブチルスが５５℃では生育
できないのに対し、本発明菌株は５５℃においても生育
が可能であること等の相違点が認められる。

【００１３】以上の結果から明らかなように、本発明菌
株はバチルス ズブチルスに属させることが妥当である
が、いくつかの点においてこれと相違し、また他の公知
の菌株とも異なるので、本発明菌株をバチルス・エスピ
ー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ１６と命名し、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第３３７６号とし
て寄託した。

【００１４】かかる本発明の微生物を適当な培地に接種
し、常法に従って培養すれば、界面活性剤に対して極め
て安定なアルカリプロテアーゼＫ−１６を生産すること
ができる。

【００１５】使用される培地としては、通常の微生物の
培養に用いられ本菌株に利用可能なものであれば何れを
も使用することができるが、該培地中には資化しうる炭
素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好まし
い。

【００１６】この炭素源及び窒素源については特に制限
はないが、その例としては、窒素源としてはコーングル
テンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉
エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミー
ル、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチ
ベーター、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、ア
ジックス等が挙げられる。また、炭素源としては、資化
しうる炭素源、例えばアラビノース、キシロース、グル
コース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、蔗
糖、麦芽糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノ
シトール、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転
化糖等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げら
れる。また、その他、リン酸、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Z
n²⁺、Co²⁺、Na⁺ 、K⁺ 等の無機塩や、必要であれば、無
機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもでき
る。

【００１７】斯くして得られた培養物中からのアルカリ
プロテアーゼＫ−１６の採取及び精製は、一般の酵素の
採取及び精製の手段に準じて行うことが出来る。

【００１８】すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等
することによって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液
から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、
溶媒沈澱法（メタノール、エタノール、イソプロピルア
ルコール、アセトン等）によって蛋白質を沈澱させた
り、また、限外濾過（例えばダイアフローメンブレンＹ
Ｃ、アミコン社製）により濃縮させてアルカリプロテア
ーゼＫ−１６を得る。塩析法では、例えば硫安（３０〜
７０％飽和画分）、溶媒沈澱では、例えば７５％エタノ
ール中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、脱
塩することによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可
能である。ここで脱塩の方法としては、透析又は、セフ
ァデックスＧ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方
法が用いられる。

【００１９】このようにして得られる酵素液は、そのま
ま使用することもできるが、更に公知の方法により精製
結晶化して用いることも出来る。更に酵素を精製するに
は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等
の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデック
ス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロースやＣＭ−
バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びセフ
ァデックスやバイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグ
ラフィーを適宜組み合わせて分別精製すればよい。

【００２０】斯くして得られたアルカリプロテアーゼＫ
−１６は、以下に示すような酵素学的性質を有する。
尚、以下において、酵素活性の測定は次の如くして行っ
た。

【００２１】カゼイン１％を含む５０mMホウ酸−NaOH緩
衝液（pH１０）１mlを 0.1mlの酵素溶液と混合し、４０
℃、１０分間反応させた後、反応停止液（0.123Mトリク
ロロ酢酸−0.246M酢酸ナトリウム− 0.369M 酢酸）２ml
を加え、３０℃、２０分間放置した。次に濾紙（ワット
マン社製、No.2）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォ
ーリン・ローリー法の改良法によって測定した。

【００２２】また１Ｐ．Ｕ．は、上記反応条件下におい
て１分間に１mmole のチロシンを遊離する酵素量とし
た。

【００２３】（１）作用 高アルカリ性条件下で各種蛋白質に対して作用する。

【００２４】（２）基質特異性 アルカリプロテアーゼＫ−１６の各種基質に対する特異
性を、他の市販プロテアーゼと比較した。用いた基質
は、カゼイン、尿素変性ヘモグロビン、獣毛ケラチン、
エラスチンでこれらに対する分解活性を測定した。５０
mMホウ酸−NaOH緩衝液（pH10.0）に各基質を１％（尿素
変性ヘモグロビンは 2.2％）加え、各酵素液 0.5×１０
^-4Ｐ．Ｕ．（エラスチンは 3.5×１０^-4Ｐ．Ｕ．）を添
加し、４０℃、１０分間反応を行った。各々の基質にお
けるアルカリプロテアーゼＫ−１６の活性を１００とし
た時の各酵素の活性を表２に示す。

【００２５】

【表２】

【００２６】この結果からも明らかなように、アルカリ
プロテアーゼＫ−１６は水可溶性及び水不溶性の蛋白質
を良好に分解し、現在洗剤用酵素として良く用いられて
いる市販酵素Ａ、市販酵素Ｂと比較して、特にエラスチ
ンに対して優れた作用を示す。

【００２７】（３）至適pH 各種pH緩衝液（５０mM）中に最終濃度0.91％となるよう
にカゼインを加え、アルカリプロテアーゼＫ−１６を
5.2×１０^-5Ｐ．Ｕ．加えて４０℃、１０分間反応して
活性を測定した。最適pHでの活性を１００とし、各pHで
の活性を相対的に表した。結果を図１に示す。図１から
も明らかなようにアルカリプロテアーゼＫ−１６の至適
pHは11.0〜12.3である。尚、使用した各種緩衝液、及び
そのpH範囲は次のとおりである。 酢酸緩衝液 pH3.9〜5.7 リン酸緩衝液 pH6.6〜8.3 炭酸緩衝液 pH9.2〜10.9 リン酸−NaOH緩衝液 pH10.9〜12.7 KCl−NaOH緩衝液 pH10.9 〜12.6

【００２８】（４）pH安定性 （３）で用いたのと同じ緩衝液（２０mM）中に 7.9×１
０^-3Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−１６を加え、
２５℃で４８時間放置した。この処理液を５０mMホウ酸
−NaOH緩衝液（pH10.0）で４０倍に希釈後、活性を測定
した。処理前の酵素活性を１００％として各pHでの相対
活性を求めた。結果を図２に示す。図２から明らかなよ
うにアルカリプロテアーゼＫ−１６は、Ca²⁺非存在下で
はその安定領域がpH 6.0〜12.0であり、２mM Ca²⁺存在
下ではその安定域はpH 5.0〜12.0であった。

【００２９】（５）至適温度 基質として0.91％のカゼインを含む５０mMホウ酸−NaOH
緩衝液（pH10.0）に3.1 ×１０^-5Ｐ．Ｕ．のアルカリプ
ロテアーゼＫ−１６を加え、１０分間各温度で反応を行
った。４０℃での活性を１００％として各温度での相対
活性を求めた。結果は図３に示す。図３からも明らかな
ように、アルカリプロテアーゼＫ−１６の至適温度は、
Ca²⁺非存在下では５５℃であり、５mM Ca²⁺存在下では
７０℃であった。

【００３０】（６）耐熱性 ２０mMホウ酸−NaOH緩衝液（pH9.5 ）に 1.6×１０
^-3Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−１６を加え、各
温度で１０分間熱処理し、氷冷後、５０mMホウ酸−NaOH
緩衝液（pH10.0）で５倍希釈した。そして0.91％カゼイ
ンを基質として活性を測定した。未処理時の活性を１０
０％として各処理温度での相対活性を求めた。結果を図
４に示す。図４からも明らかなように、Ca²⁺非存在下で
５０℃、５mMCa²⁺存在下では６０℃まで上記熱処理条件
下で、９０％以上の活性が維持された。

【００３１】（７）分子量 アルカリプロテアーゼＫ−１６の分子量をドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により調べた。分子量マーカーには低分子量用マー
カーキット（バイオラッド）すなわち、ホスホリラーゼ
ｂ（分子量：97,400）、牛血清アルブミン（分子量：6
6,200）、卵白アルブミン（分子量：42,700）、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（分子量：31,000）、大豆トリプ
シンインヒビター（分子量：21,500）、リゾチーム（分
子量：14,400）を用いた。この方法によりアルカリプロ
テアーゼＫ−１６の分子量は28,000±1,000 と決定し
た。

【００３２】（８）等電点 アルカリプロテアーゼＫ−１６の等電点を等電点電気泳
動法により調べた。カラム用の両性担体にはサーバライ
ト９−１１を用いた。この方法によりアルカリプロテア
ーゼＫ−１６の等電点は10.5以上であることがわかっ
た。

【００３３】（９）金属イオンの影響 各種金属イオンについて、アルカリプロテアーゼＫ−１
６に対して与える影響を調べた。まず、２０mMホウ酸−
NaOH緩衝液（pH9.5 ）に各種金属塩を１mMの濃度で添加
し、そこに 3.9×１０^-3Ｐ．Ｕ．の酵素を加えて３０
℃、２０分間放置した。その後、５０mMホウ酸−NaOH緩
衝液（pH10.0）で５倍に希釈して残存活性を測定した。
残存活性は、金属塩無添加で同様に処理した酵素活性に
対する相対値で表した。結果を表３に示した。この結果
から明らかなように、アルカリプロテアーゼＫ−１６
は、Hg²⁺及びCu²⁺により活性が阻害されることがわか
る。また、前記（５）及び（６）の結果よりCa²⁺により
熱安定性が向上することがわかる。

【００３４】

【表３】

【００３５】（１０）阻害剤の影響 一般的な酵素阻害剤について、アルカリプロテアーゼＫ
−１６に対して与える影響を調べた。１０mMリン酸緩衝
液（pH7.0 ）に各種阻害剤を所定濃度になるように加
え、そこにアルカリプロテアーゼＫ−１６ 7.9×10
^-3Ｐ．Ｕ．を添加し、３０℃で２０分間放置した。その
後、該処理液をイオン交換水にて２０倍希釈し、残存活
性を測定した。残存活性は、阻害剤無添加で同様に処理
した酵素活性に対する相対値で表した。結果を表４に示
した。この結果から明らかなように、アルカリプロテア
ーゼＫ−１６は、セリンプロテアーゼの阻害剤であるジ
イソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、フェニルメタ
ンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、キモスタチンで
活性が阻害されることから、活性中心にセリン残基を有
するプロテアーゼであることがわかる。

【００３６】

【表４】

【００３７】（１１）界面活性剤の影響 6.6 ×１０^-2Ｐ．Ｕ．の酵素液を、所定濃度の各種界面
活性剤を溶かした５mlの0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH9.
0 、エタノールを１０％含む）に加え４０℃で４時間放
置し、その後５０mMホウ酸−NaOH緩衝液（pH10.0）で２
０倍希釈後、残存活性を測定した。処理時間０分での活
性を１００％とし残存活性を相対値で表した。結果を表
５に示した。この結果から明らかなようにアルカリプロ
テアーゼＫ−１６は、各種界面活性剤が高濃度（１〜１
０％）存在しても高い安定性を示すものであった。

【００３８】

【表５】

【００３９】

【発明の効果】上述の如く、本発明微生物の産生するア
ルカリプロテアーゼＫ−１６は、不溶性蛋白質に対し優
れた作用を示し、広範な温度域で充分活性を発揮するの
に加え、界面活性剤中で極めて高い安定性を有するた
め、洗浄剤の添加酵素として有用なものである。

【００４０】

【実施例】次に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説
明する。

【００４１】実施例１ プロテアーゼ産生菌株の分離、採取： （１）土壌のサンプルの約１ｇを滅菌生理食塩水１０ml
に懸濁し、８０℃にて２０分間放置し熱処理した。熱処
理上清液 0.1mlをケラチンハロー寒天培地へ接種し、３
０℃で４８時間静置培養した。用いたケラチンハロー寒
天培地の組成は以下に示す通りである。 グルコース 1％ 酵母エキス 0.2％ 獣毛ケラチン 1％ カルボキシメチルセルロース 1％ リン酸第一カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム・７水塩 0.02％ 寒天 1.5％

【００４２】（２）上記培地組成物に、別滅菌を施した
１０％炭酸ナトリウムを１％添加し、最終pHを10.5に調
整後、平板培地を作製した。培養後、生育したコロニー
の周囲にハローを生じたものを選抜し、同培地で２〜３
回純化し、均一のプロテアーゼ生産菌を得た。

【００４３】（３）上記（２）で得たこれらの菌株を以
下に示す液体培地へ接種し、３０℃で好気的に４８時間
振盪培養を行った。 グルコース 2.0％ ポリペプトンＳ 1.0％ 酵母エキス 0.05％ リン酸第一カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム・７水塩 0.02％ 炭酸ナトリウム（別滅菌） 1.0％ pH 10.5 培養終了後、得られた培養物を遠心分離（3000rpm;１０
分間）して菌を除去し、得られた培養上清を酵素液とし
た。

【００４４】（４）上記（３）で得られた酵素液から凍
結乾燥により粗酵素サンプルを調製し、市販液体洗剤中
における４０℃での保存安定性評価を行った。そのなか
から、最も安定性に優れる酵素を生産するものの一菌株
としてバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｋ１６株を得た。

【００４５】実施例２ 菌体の培養、アルカリプロテアーゼＫ−１６の精製： （１）実施例１で得られた好アルカリ性細菌、バチルス
・エスピー ＫＳＭ−Ｋ１６を以下の液体培地（3.0l)
に接種し、３０℃で好気的に４８時間振盪培養を行い、
アルカリプロテアーゼＫ−１６を生産させた。 グルコース 2.0％ 魚肉エキス 1.0％ 大豆粉 1.0％ 硫酸マグネシウム 0.02％ リン酸第一カリウム 0.1％ pH 10.0

【００４６】（２）培養終了後、得られた培養物３l を
遠心分離（10,000rpm;５分間）して菌を除去し、その上
清液を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末２ｇをイオン交換水
１０mlに溶解（粗酵素液）した後、同溶液を透析膜を用
いて１０mMトリス−塩酸緩衝液（２mM Ca²⁺添加、pH7.5
）に対して一晩透析し、２６mlの透析処理液（活性3.1
5Ｐ．Ｕ．／ml、比活性1.97Ｐ．Ｕ．／mg蛋白）を得
た。次に、１０mMトリス−塩酸緩衝液（２mM Ca²⁺添
加、pH7.5 ）で平衡化したＣＭ−５２セルロース担体を
充填したカラムにかけ、同緩衝液でカラム内を洗浄した
後、０〜0.15M 塩化ナトリウムを含む同緩衝液でアルカ
リプロテアーゼＫ−１６を溶出させた。この活性画分を
集めたところ全量は１５ml、活性は1.12Ｐ．Ｕ．／ml、
比活性は5.75Ｐ．Ｕ．／mg蛋白であった。そして、当溶
液を５０mMトリス−塩酸緩衝液（１０mMCa²⁺、0.2M塩化
ナトリウム添加、pH8.0 ）に対して一晩透析した後、限
外濾過（アミコン社製、分画分子量 5,000）により濃縮
し、５０mMトリス−塩酸緩衝液（１０mM Ca²⁺、0.2M塩
化ナトリウム添加、pH8.0 ）で平衡化したセファデック
スＧ−５０（ファルマシア社製）のゲル濾過クロマトグ
ラフィーにかけ同緩衝液にて展開させた。ここで得られ
た活性画分は全量11.5ml、活性は 0.9Ｐ．Ｕ．／ml、比
活性は6.03Ｐ．Ｕ．／mg蛋白であった。当溶液を、イオ
ン交換水に対して一晩透析後、活性0.56Ｐ．Ｕ．／ml、
比活性5.60Ｐ．Ｕ．／mg蛋白の溶液を得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｋ１６
が産生するアルカリプロテアーゼＫ−１６の活性に及ぼ
すpHの影響を示す図面である。

【図２】本発明のバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｋ１６
が産生するアルカリプロテアーゼＫ−１６の安定性に及
ぼすpHの影響を示す図面である。

【図３】本発明のバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｋ１６
が産生するアルカリプロテアーゼＫ−１６の活性に及ぼ
す温度の影響を示す図面である。

【図４】本発明のバチルス・エスピー ＫＳＭ−Ｋ１６
が産生するアルカリプロテアーゼＫ−１６の安定性に及
ぼす温度の影響を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 渡辺 洋子 栃木県宇都宮市下平出町1018−36 田崎 マンション203号 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606−６ (72)発明者 川合 修次 栃木県宇都宮市竹林町308 (72)発明者 伊藤 進 栃木県宇都宮市東峰町3441−64 (56)参考文献 特開 平１−165378（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 1/20 C12N 9/54 - 9/56

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の酵素学的性質を有するアルカリプ
   ロテアーゼＫ−１６を生産するバチルス・エスピー Ｋ
   ＳＭ−Ｋ１６。 （１）作用 高アルカリ性条件下で各種蛋白質に対して作用する。 （２）基質特異性 水可溶性蛋白質ならびに水不溶性蛋白質に対して良好な
   活性を有する。 （３）至適pH カゼインを基質とし、４０℃にて１０分間反応を行った
   場合、至適pHは11.0〜12.3である。 （４）pH安定性 カゼインを基質とし、２５℃で処理した場合、Ca²⁺存在
   下、pH 5.0〜12.0の範囲で極めて安定である。 （５）至適温度 カゼインを基質とし、pH10.0で反応を行った場合、至適
   温度は５５℃である。 （６）耐熱性 pH 9.5、５０℃にて１０分間熱処理した場合、９０％以
   上の残存活性を有する。 （７）分子量 28,000±1,000 （ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−
   ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による） （８）等電点 10.5以上（等電点電気泳動法による） （９）金属イオンの影響 カゼインを基質とした場合、Hg²⁺及びCu²⁺で活性が阻害
   される。また、Ca²⁺で熱安定性が増大する。 （１０）阻害剤の影響 エチレンジアミン四酢酸、ｐ−クロロマーキュリー安息
   香酸、アンチパインで活性が阻害されない。ジイソプロ
   ピルフルオロリン酸、フェニルメタンスルホニルフルオ
   リド、キモスタチンによって活性が阻害される。 （１１）界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキ
   シエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナト
   リウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルカ
   ンスルホン酸ナトリウム、α−スルホ脂肪酸エステル等
   の界面活性剤が高濃度に存在しても、酵素は極めて安定
   である。