JPH01102094A - 高温下でのリバビリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリバビリン及び関連化合物の製造方法に関する
。

〔従来の技術〕

リバビリンの分類名はＩ−β−Ｄ−リボフラノシルー１
．２．４−）リアゾール−３−カルボキサミドである。

この種の化合物は公知の抗ウィルス剤である。この点に
ついてはジョセフ・Ｔ・ライトコウスキイ（Ｊｏｓｅｐ
ｈ　Ｔ、Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ）らの米国特許第３．７９
８．２０９号（１９７４年３月１９日に登録）を参照さ
れたい０本明細書中では、リバビリンと称することにす
るが、トリアゾールに結合したリボース基を有する関連
化合物も含まれているものと理解されたい。

リバビリンの製造方法には幾つかの方法がある。

化学的な方法（酵素を用いない化学的な方法）は費用が
かかる。高価な出発原料及び低収率により特徴づけられ
るプロセス工程が普通である。

その結果、生物変換法が広範囲にわたって研究されてき
た。これらの方法に於いて、リボースをトリアゾールに
結合するのに一種以上の酵素が使用される。幾つかの場
合に於いて、酵素がまず単離されついで触媒として使用
される。この点についてはライトコウスキイらの米国特
許第３，９７６．５４５号（１９７６年８月２４日に登
録）を参照されたい。この特許には、リボースドナーが
リボース−１−ホスフエートである方法が開示されてい
る。トリアゾールアクセプターである１、２．４−）リ
アゾール−３−カルボキサミドとドナーとを０℃〜５０
℃の温度でヌクレオシドホスホリラーゼの存在下で反応
させる。酵素源は広範に開示されている。

また、発酵を伴う方法も公知である。これらの方法に於
いては、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ−
ｒｉｕｍ）属からの微生物の如き増殖微生物を含む培地
に１．２．４−）リアゾール−３−カルボキサミドを添
加する。この場合に於いて、必要なリボースドナーは、
微生物が成長するのに伴って、発酵培地から生じる。微
生物が成長するので、温度は比較的に低い。典型的な温
度は２０℃〜４０℃である。反応時間は極めて長く、典
型的には何日もかかる。

ヤマナカ（Ｙａｍａｎａｋａ）らの米国特許筒４，４５
８．０１６号（１９８４年７月３日に登録）には、温度
が５５℃〜６５℃であること以外は上記の米国特許筒３
．９７６．５４５号の方法に極めて類似する方法が記載
されている。

単離された酵素ではなくむしろ必要な活性を含む全細胞
を使用し得る。特別な物質が使用されるこの特許明細書
の比較結果によれば、生成されるリバビリンの量が７０
℃では極めて少なく７５℃〜８０℃ではごくわずかであ
る（第７欄の第３表を参照のこと）、この試験に使用さ
れた微生物は肺炎杆菌（月遣崩１１１虹且狭貝畦１１リ
−であり、リボースドナーはリボース−１−ホスフェー
トまたはウリジンであった。

フジシマ（Ｐｕｊ　ｉｓｈｉｍａ）らの米国特許筒４．
６１４，７１９号（１９８６年９月３０日に登録）には
、上記の米国特許筒４，４５８．０１６号に類似する方
法が開示されている。米国特許筒４，６１４．７１９号
に於いて、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ匹旦９憇）微生物が非増殖性条
件下に使用される。この開示によれば多種のリボースド
ナーが使用でき、温度は４０℃〜８０℃であってもよい
。しかしながら、実施例に於いてイノシンがドナーとし
て主として使用され温度は通常６０℃である。実施例２
に於いて、種々のドナーが６０℃でブレビバクテリウム
・アセチリカムを用いて試験され、実施例４に於いて７
０℃までの種々の温度がその微生物及びドナーとしての
イノシンを用いて試験されている。リバビリンの収率は
は６５℃〜７０℃の間で劇的に減少する。

〔発明が解決しようとする課題〕

米国特許筒４．４５８．０１６号及び同第４．６１４．
７１９号の生物変換法は、従来の化学的な方法、及び酵
素を使用前に単離しなければならなかった方法よりも多
くの利点をもたらす。しかしながら、更に改良すること
が要望されていた。例えば、これらの方法によるリバビ
リンの生成速度は所望の速度よりも遅い。米国特許筒４
，６１４．７１９号の実施例に於いて、典型的な反応時
間は２０時間または２４時間であり、リバビリンの生成
量は比較的少ない（記載されたデータに基づけば、せい
ぜい約１０ｇ１ｌｌであると計算される）。かくして、
収率（％）〔実際には下記の転化率（％）〕はこれらの
方法に於いて許容し得るかもしれないが、これらの方法
の生産性は所望される生産性よりも劣る。更に、リバビ
リンは希ＴＩ溶液中にのみ生成されるので、その回収は
所望される費用よりも費用がかかる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明に従って、ブレビバクテリウム・アセチリカム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ
）から誘導された酵素調製物の存在下に、リボースドナ
ーとトリアゾール化合物とを反応させる工程を含む１゜
２．４−トリアゾールヌクレオシドの改良された製造方
法が提供される。本発明はリボースドナーがグアノシン
またはグアノシン誘導体であり、そして前記の反応の少
なくとも一部分の間の温度が６５℃以上であることを特
徴とする。本発明方法は反応混合物中に高濃度の所望の
生成物を達成することができる。

本発明によれば、本発明方法の少なくとも一部中で温度
は６５℃以上であるべきである。この限度よりも高い温
度を使用し得るが、実際問題として温度が高くなるにつ
れて生成速度は高いままであるとしても転化率は減少す
る。それ故、約７０℃の温度が好ましい。

リボースドナーはグアノシンである。これは市販されて
おり、ＲＮＡ例えば酵母ＲＮＡの加水分解産物中に見ら
れる。また、グアニル酸の如きグアノシンの誘導体も使
用し得る。

触媒活性源として使用される微生物はブレビバクテリウ
ム・アセチリカムである。この種のいずれの菌株も使用
し得る。ザ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手できるＡＴＣ
Ｃ３９３１１として同定されており、上記の米国特許第
４．６１４，７１９号に記載されている菌株が好ましい
。

微生物は、本明細書の実施例の直前の調製例１に記載さ
れた方法の如き通常の発酵方法により調製し得る。微生
物の試料を好適な栄養物質と共に発酵槽中に接種し定常
期まで成長させる。得られる培養液を触媒物質として直
接使用し得る。また、細胞をろ過または遠心分離により
培養液から除去して細胞ペーストとして使用し得る。細
胞を、それらの透過性を増すように処理してもよい。こ
の目的には、凍結融解の如き処理や米国特許第４．６１
４．７１９号に記載されているその他の処理が有効であ
る。

本発明に従えば、ブレビバクテリウム・アセチリカムか
ら誘導されるいずれの酵素調製物も有用である。これは
上記の調製物を含み、またこの微生物のヌクレオシドホ
スホリラーゼ活性に応答性であるブレビバクテリウム・
アセチリカムから単離された一種以上の遺伝子を形質発
現する微生物からのいずれの調製物も含む。

反応混合物中の反応体の濃度は広範に変化させることが
できる。グアノシンドナーの濃度は約１０ミリモル〜５
００ミリモル、トリアゾールは約１０ミリモル〜５００
ミリモルであることができ、そして細胞は約２　ｇ／　
１〜１００ｇ／　ｌ　（細胞乾燥重量基準）の量で存在
することができる。反応ではトリアゾール１モル当りド
ナー１モルを用いるので、これらの反応体はこの反応比
で反応混合物中に存在するのが好ましい。

また開始ｐＨは広く変化してもよく、約６．０〜約９．
２の範囲であってもよい。反応中にｐＨを制御すること
は重要ではないが、ｐＨ制御は望ましい、リバビリン製
造の最適ｐＨは約７．２である。

リボースドナー及びトリアゾールの他に、反応混合物は
ホスフェートイオンを含有することが好ましい（これは
酵素により必要とされることがあるからである）。ホス
フェートイオンの有用な源はモノリン酸カリウムであり
、その濃度は典型的には約２５ミリモル〜約１００ミリ
モルである。ｐＨを反応中に制御する場合には、−層低
濃度のホスフェートが有効である。

下記の実施例に於いて、転化率（％）が示されている。

転化率（％）は、制限反応体のモル量を基準として出発
原料の最初の量で割った（除算した）モル基準のリバビ
リンの量である。これは先行技術文献に於いて収率と称
されるものと考えられる。更に正確には、収率は、反応
する出発原料の量で割った生成物の量を云う。収率を計
算するためには、出発原料の最終量を知る必要がある。

本明細書の実施例に於いて、反応終了時の出発原料の残
存量を計る努力はしなかった。出発原料が所望の生成物
だけになる場合には、転化率（％）と収率（％）とは同
じである。

以下の調製例及び実施例によって本発明を更に詳細に説
明する。

ｐＨ７，２の水性培地１０Ｉｌを調製し、滅菌し、発酵
槽中で組み合わせた。培地の組成を第１表に示す。培地
５００−を含むフエルンバソハ（Ｐｅｒｎｂａｃｈ）フ
ラスコ中でブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙｌｉｃｕ＋ｗ）Ａ
ＴＣＣ３９３１１を３０℃で２０時間培養することによ
り植菌物（または接種物）を調製した。フエルンバンハ
培地は、硫酸マグネシウムを欠いていること以外は、発
酵槽中で使用したものと同じであった。植菌物を移した
後に、発酵槽を３０℃で２０時間培養したｓｐＨを水酸
化カリウムで７．２にＭ御した。培養液２０ｇｅｌ量の
追加のグルコースを発酵中に１２時間経過後に添加した
。

発酵の終了時に、培養液を遠心分離して培養液１４当り
湿潤細胞５０ｇを生成した。細胞をｌθミリモルのホス
フェート緩衝液中に再懸濁することにより細胞を洗浄し
た。ついで遠心分離により細胞を集め凍結ペーストとし
て貯蔵した。

第１表 本米国ミシガン州ミツドランドのダウ・ケミカル（Ｄｏ
ｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から入手し得る。

〔実施例〕

５００−フラスコ内でグアノシン２０ミリモルと１．２
．４−トリアゾール−３−カルボキサミド２０ミリモル
とＫｌｂＰＯｉ　２０ミリモルと水２００＠ｌとを組み
合わせて生物変換培地を調製した。水酸化カリウムと硫
酸とによって、フラスコｐＨ値を所望の値に調整した。

フラスコを温度制御浴中に置き、フラスコ内容物を所望
の値に平衡させた。次に、ブレビバクテリウム・アセチ
リカム細胞ペースト（室温で融解したもの）４０ｇを各
フラスコ中に入れて生物変換を開始させた。フラスコ内
容物を磁石攪拌器で攪拌した。

リバビリン濃度の分析用試料を、生物変換混合物から定
期的に取り出した。細胞を含まない溶液中の濃度を決定
した。生物変換の最初の１時間に亘って計算した初期反
応速度、反応から数時間後の細胞不合リバビリン濃度及
び変換、並びに最終的な細胞不含リバビリン濃度及び変
換（２０〜２７時間後に測定）を、反応温度及び初期反
応ｐＨの関数として第■表に示す、変換率については、
細胞不含溶液中のグアノシン初期濃度に対するモル基準
で表した。

第■表 ネ −・　１２ニア０℃　びＨ７，２で　　ヌクレオシドリ
ボースドナーを変えること以外は、実施例１と同様にし
て生物変換混合物を調製した。生物変換テストは、５種
類のヌクレオシドを用いて行った。すべての生物変換操
作は７０℃及び初期ｐｎ７．２で行った。結果を第１表
に示す。変換率は細胞不合溶液中のヌクレオシド初期濃
度に関するモル基準で表した。最終変換率は２８．２５
時間後に決定した。

第１表 ＊比較用 〔作　用〕 特定のリボースドナーを用いることにより、通常の温度
よりも高温を用いることができることを本発明者は見出
した。変換率の減少をほとんどまはまったく伴わずに、
反応の生産性の増加が結果として得られる。この結果は
、従来技術によれば高温では変換率が大幅に低下するも
のと示唆していたので、驚くべきものである。この点を
以下の比較実験によって確認した。すなわち、別のドナ
ー（例えばイノシン）を使用したところ、７０℃におい
ては反応速度が所望のもの程には高くないだけでなく、
出発材料から所望の生成物への変換率も所望のものより
高くなかった。

本発明者が見出したところによれば、初期速度が一層速
くなるだけでなく、リバビリンの生成が長期間に亘って
高速に維持され、従って、最終反応混合物中に高濃度の
所望の生成物が生成される。

特定の理論に拘束されることを望むものではないが、グ
アノシンの副生成物は他のドナーの副生成物よりも溶解
度が低いために前記の現象が起きるものと思われる。従
って、副生成物が酵素作用を■害する機会が少なくなる
ものと考えられる。こうして、リバビリンの高い生成速
度が高水準で維持され、高濃度が得られる。

反応混合物中のリバビリンの最終濃度は、この方法を実
施する全体のコストにとって重要な要素である。濃厚溶
液からの回収は希釈溶液からの回収よりも費用が低いの
で、高濃度は経済的である。

本発明方法を用いることにより、極めて高濃度のリバビ
リン（好ましい態様では１００ｇ／　ｌのオーダー）を
容易に達成することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、リボースドナーがグアノシンまたはグアノシン誘導
   体であり、そして反応の少なくとも一部分の間の温度が
   ６５℃以上であることを特徴とする、ブレビバクテリウ
   ム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
   ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）から誘導された酵素調製物の存
   在下にリボースドバーとトリアゾール化合物とを反応さ
   せる工程を含む１，２，４−トリアゾールヌクレオシド
   の製造方法。