JPH01104100A - 単球から得られる血管活性を有する蛋白質及びその類似体、この蛋白質を抽出する方法並びにそれらを治療用及び抗体製造に利用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一連の蛋白質、特に内皮細胞増殖を阻止する
血管活性を有する糖蛋白質、特に単球から得た因子、こ
の因子を抽出する方法及びこれらの蛋白質の用途に関す
る。

血管細胞の成長を制御することはアテローム動脈硬化及
び新生血管形成の発生及び進展に重要なファクターであ
る。特に最近内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞の増
殖を刺激する成長因子に注意が向けられてきた。血管細
胞の増殖を阻止することができるほんのわずかな因子が
確認されている。

赦近、多くの研究者達が血管壁細胞の成長を調節するた
めの血行中の単球の役割に注意を集中させている。ヴア
スキュラタイディス（ＶａＳＣｔｌ　Ｉａｔ　１ｄｉｓ
）　、アテローム動脈硬化、炎症及び癌性転移のような
血管壁に影響を及ぼす多くの病理学的プロセスに単球が
関与することが最近報告された（参うな場合に重要な役
割を演じている。ＭＤＧＦ（Ｈｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒ
ｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔ’ｈ　Ｐｒｏｎｏｔｉｎａ　Ｆａ
ｃｔｏｒ）とも称する単球由来の成長促進因子が単離、
確認された（参照文献３〜１１）。

カーレー（にａｈａｌｅｈ）と彼の共同研究者達によっ
て得られた結果（参照文献１３）と一致する本出願人に
よって実施された予備研究の結果（参照文献１２）は、
成長促進因子に加えて、単球が阻害因子を生産すること
もできることを示している。

特に、本出願人は、ヒト正常単球がヒト内皮細胞の増殖
を阻止する因子を生産することを立証し、この因子をＭ
ＥＣＩ　Ｆ　［単球由来の内皮細胞阻害因子（Ｈｏｎｏ
ｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
　Ｃｅ１ｌ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ）　
］と命名した。

本出願人は、ＭＥＣＩ　Ｆを分析することができる純度
でこの物質を抽出する方法を今まさに開発したのである
。

その−態様に従えば、本発明は、 １）ヒト正常単球を培養し、 せな架橋多糖カラムに通し、 ３）この上澄層を、硫安を用いる下降勾配溶離法を使用
して、約８のｐＨで平衡させたフェニル化架橋アガロー
スゲルカラムに通し、 ４）工程３）で得た活性画分を約８のｐＨで平衡させた
工程２）で使用したタイプのカラムに通し、５）工程４
）で得た溶出液を、塩化ナトリウムでの上昇勾配溶離法
を用いる、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥｌタイプの
イオン交換カラムに通し、 ６）工程５）で得た画分を細胞培地によって平衡させた
低圧排除クロマトグラフィーカラムに通し、次いで ７）必要に応じて工程６）で得た活性画分を高圧液体ク
ロマトグラフィーに掛けた後、精製物を回収する工程か
ら本質的に成ることを特徴とする単球由来の内皮細胞阻
害因子、即ち、ＭＥＣＩ　Ｆを抽出する方法を目的とす
る。

ヒト正常単球は分画遠心分離によってか又はフィブロネ
クチン（ｆ　１ｂｒｏｎｅｃｔ　ｉｎｅ　）でカバーし
てもレシス（ｃｙｔａｐｈｅｒｅｓ　ｉｓ　）及び選択
付着によってのいずれかで血液から単離される。この方
法の詳細は以下に示す実験例の項において説明する。

単球は約２４時間培養するのが有利である。

架橋多糖カラムは、例えば、スウェーデン、ウプサラの
製薬会社、ファーマシア・ファイン・ケミカルス（Ｐｈ
ａｒｌａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｎｉｃａｌｓ）によ
って「セフ７デツクス（５ｅｐｈａｄｅｘ、登録商標）
　Ｇ−２５゜という名で販売されているタイプのもので
ありうる。

フェニル化架橋アガロースゲルカラムは、例えば、「フ
ェニルセフｙＯ−ズ（Ｐｈｅｎｙｌ　５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　。

登録商標）ＣＩ４ＢＪという名で同ファーマシア社によ
って販売されているタイプのものでありうる。

ＤＥＡＥタイプのイオン交換カラムは、例えば、フラン
ス、ジェネヴイリアース（Ｇｅｎｎｅｖｉｌｌｉｅｒｓ
）のアイ・ビー・二フ（ＩＢＦ）社によってｒ　ＤＥＡ
Ｅ−トリスアクリル（ＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、
登録商標）ＬＳＪという名で販売されているものであり
うる。

低圧排除クロマトグラクイ−カラムは、例えば、「トリ
スアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、登録商標）　　０Ｆ
−０５Ｊという名でアイ・ビー・エフ社によって販売さ
れているものでありうる。

高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は西ドイツ、
ミュンヘンのパイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社によ
ってｒＴＳＫ−２５０Ｊという名で販売されているカラ
ムを使用して行うことができる。

本発明の方法をさらに詳細に説明するために、この方法
を実施するための詳細な具体例を本明細書の実験例の項
に記載するが、これらの具体例は本発明を限定するもの
ではない。

一変更例によれば、ＭＥＣＩ　Ｆはレチノイン酸又はさ
らに良好にはＤＭＳＯで刺激した後、ＨＬ６０系（参照
文献１４）のような白血病単球細胞系の上澄液から単離
することができる。

ＭＥＣＩ　Ｆ及び後述するその誘導体は遺伝子工学技術
によって、公知のベプ、チド配列から対応するｍＲＮＡ
を単離して得ることもできる。

得られた精製ＭＥＣＩ　Ｆを分析した結果、これが６４
〜７０ｋＤの見掛は分子ｉを有する糖蛋白質であること
を確立することができた。

この糖蛋白質はおおよそ次の割合： Ａｓｐ：８０、Ｔｈｒ　：　２３．０６、Ｓｅｒ：２９
．４０、Ｇｌｕ：５６．５、Ｐｒｏ　：　２７゜７０、
Ｇｌｙ：　３８．９８、Ａｌａ：４２．８８、Ｖａｌ：
３６．１６、Ｍｅｔ：４．８３、Ｉｌｅ：１８．７９、
Ｌｅｕ　：　５０．９２、Ｔｙｒ　：　２０゜１５、Ｐ
ｈｅ：２７．１６、Ｇ　１　ｃ　Ｎ　Ｈ２：　３　。

１０、Ｌｙｓ　：　６０．８７、Ｈｉｓ：１３．８１及
びＡｒｇ：２７．６０ で分布した５６８個のアミノ酸基又は残基を含んでいる
。

そのＮ末端ペプチド配列は次の通りである。

−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
＾ｒ！Ｊ−Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−１１ａ−Ｓｅｒ− （但し、Ｘ及びＹは同一でも異なっていてもよく、それ
ぞれＴｒｐ又はＡｓｐを表す）。

この糖蛋白質はアミノ糖及び非アミノ糖を含んでいる。

結乾燥してより長い期間安定に保管できる。

このように定義された糖蛋白質は本発明のさらに別の目
的を成す。

本発明は、グリコシル化蛋白質であるのが好ましい約０
．６〜２００ｋＤの分子量を有する、配列−Ｓｅｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−を含む蛋白質
も目的とする。

この配列はＮ末端であるのが好ましい。

さらに、問題の配列は次の通りであるのが好ましい。

一Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ−Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−１ｌｅ−Ｓｅｒ− （但し、Ｘ及びＹは同一でも異なっていてもよく、それ
ぞれＴｒｐ又はＡｓｐを表す）。

Ｘ及びＹは異なっているのが好ましく、さらに好ましく
はＸはＴｒｐを表しかつＹはＡｓｐを表す。

そのような蛋白質は遺伝子工学の通常の方法によって生
産するのが有利である。

ＭＢＣ’ＩＦはブタ内皮−胞Ｇ；ｉる活性は代かだがヒ
ト内皮細胞に′は１ミリリットル当り約１ピコグラム単
位の濃度で作用する。これは平滑筋細胞もしくはヒト動
脈細胞又は大人の皮膚の線維芽細胞もしくは胎児肺の線
維芽細胞の成長を実質的に変更しない。

ヒト内皮細胞に及ぼすその作用は接触の６時間後に探知
することができる。それは１２時間後にプラトーに達し
、４８時間安定である。

その作用は成長因子［Ｅ　ＣＧ　Ｆ　（’Ｅｎｄｏｔｈ
ｅｌｉａｌＣｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）　
：内皮細胞成長因子゛］を添加することによって部分的
に可逆的（５０％）になる。

ＭＥＣＩ　Ｆは５１１Ｑ／ＩＩＩの濃度では細胞に害を
与えない。

Ｍ　Ｅ　Ｃ１，、Ｆ及びそれから得られる上記に定義し
たような、同一の特性を有する（＠）蛋白質は局所的な
皮膚塗布、関節的注射、皮下注射もしくは静脈内潅流の
ために、また特に点眼液もしくは軟膏として通常の添加
剤及び／又は賦形剤の存在下にガレヌス製剤状に変え名
ことができる。

ＭＥＣＩ　Ｆ及び同一の特性を有するその誘導体は、特
に、 −糖尿病性網膜症、新生血管侵入及び老年性黄斑変性の
処置のために眼科において、 −末梢血管症又は動脈炎の治療及び内皮増殖による人口
器官閉塞の防止のために −新生毛細血管の増殖を防止するための静脈疾患の処置
及び下肢の静脈異常及び酒さ性ざ癒の処置のために −血管腫瘍疾患、即ち、血管増殖、カポジー症候郡及び
Ｍ癌性新生血管発生（充実性腫瘍、腎臓、肝臓等）を伴
う血管腫症の処置のために、及び −　炎症性疾患、即ち、慢性関節リウマチの処置のため
に、 治療目的で使用することができる。

その投与形態及び量は処置すべき疾患及び患者の個々の
形質によって主に決まり、かつ通常の知識に基づいてそ
の専門家によって決定されうる。

痙性疾患におけるＭＢＣＩ　Ｆの量を測定するために使
用することができる特異のポリクローナルｆ又はモノク
ローナルｌｖＬ体を通常の技術によって生産することに
も使用しうる。

特に、参照文献１５に記載されているような、ＥＬＩＳ
Ａ技術をこの目的のために有利に使用することもできる
。

上記したＭＥＣＩ　Ｆの誘導体も抗体を生産するために
使用しうる。

［実施例］ 本発明をさらに詳細に説明するために、以下にＭＥＣＩ
　Ｆの抽出例並びにその物理化学的及び薬理学的研究の
詳細な説明を挙げるが、これらの説明は本発明の範囲を
限定するものではない。

健康な正常供血者から得たクエン酸塩添加ヒト完全血液
を試料として使用した。まず、単核細胞を密度勾配遠心
分離によって分離した０次いで、単球を選択付着法、即
ち：単核細胞をプラスチック製の培養皿に接種すること
（参考文献１６）によって単離した。この工程の後に回
収された付着単核細胞はエステラーゼでの特異染色試験
並びに半球及びリンパ球に対する特異単クローン抗体で
の細胞の標識（参照文献１６）によって９５±３％の単
球を含んでいることが判った。血小板の混入は１単球当
り５〜１０個であった。

次に、単球を、５％のＣＯ２を含む雰囲気において３７
℃で２４時間、ジブコ（ＧＩＢＣＯ）から提供された２
、５％のウシ胎児血清（Ｆｅ２）を添加したＭ−１９９
培地中で培養した。この期間の終了後、培地の上澄液を
集め、０．２μｍの孔径のフィルターで一過した。上記
工程を全て滅菌状態で行った。

注）　種々の化学製品のＭＥＣＩ　Ｆの生産に及ぼす影
響をこれらの製品を培養期間の開始にあたり単球に添加
することによって検討しておいた。

スＧ−２５及びフェニルセファローズＣＬ　４Ｂはスウ
ェーデン、ウプサラのファーマシア・ファイン・ゲミカ
ルス社によって、ＤＥＡＥ−トリスアクリルＬＳ及びト
リスアクリルＧＦ−０５はフランス、ジエネヴイリ７−
スのアイ・ビー・エフ社によって提供され並びにＨＰＬ
Ｃ用カラム、ＴＳＫ−２５０は西ドイツ、ミュンヘンの
バイオ−ラッド社によって提供された。使用したこれら
の化学製品は全てｒ試薬用Ｊ品質のものであった。

精製過程の各段階において、各画分について内皮細胞増
殖に関する試験を３回行い、阻害活性を有する画分を検
知した。

単球培地の上澄液１リツトルを幾つかに分けてそれぞれ
の試験において１０１１４のトリスば街液で８．０／）
Ｅ）Ｉ＋に平衡さぜなセファデックスＧ−２５のカラム
（４，４ｘ７０ｃｎ）に通した０次に、集められた活性
画分を固体硫安の３０％飽和溶液で処理し、遠心分離し
た後、上澄層を３０％飽和硫安溶液を含むＩＱＩＩＭの
トリス緩衝液で８．０のｐＨに平衡させパフェニルセフ
讐ローズのカラム（３゜２Ｘ３３ＣＩｌ）に通した。試
料を固定し、平衡用緩衝液で十分洗浄した後、カラムを
ｐＨ８，０の１０ｒａＨ）リス緩衝液中３０から０％の
直線勾配の硫安溶液で展開した。活性画分を集め、上記
したセファデックスＧ−２５のカラムに通した後、さら
に追加の分離をＤＨ８，０の１Ｏｎ＋ＨトリスＩＩ衝液
中０からＩＭの直線勾配のＮａＣｌを用いてＤＥＡＥ−
トリスアクリル［Ｓのカラム（１，５ｘ８ｃｎ）によっ
て実施した。クロマトグラフィー画分を血管培養細胞に
対するそれらの生物学的活性に関して試験する前に、そ
れらを全て培地、即ち、（フランス、パリのパスツール
・インスチチュートによって提供された）ハンクス（ｆ
ｌａｎｋｓ）［ｌ’ｉ液で平衡させたトリスアクリルＧ
Ｆ−０５のカラム（２，４ｘ１０ｃｎ）に通さなければ
ならない°、このＧＦ−〇５カラムでのクロマトグラフ
ィーまでの最終精製回数は５７０回であった１次に、Ｄ
ＢＡＥ及びＧＦ−０５カラムによるクロマトグラフィー
後に単離された蛋白質がＭＥＣｒＦ蛋白質であることを
確かめ、かつこの蛋白−゛の分子量を決定するために、
活性画分をＨＰＬＣＴＳＫ−２５０カラムによる別のク
ロマトグラフィー工程に掛け、かつＳＤＳ　　ＰＡＧＥ
ｔ気泳動（ｓｏｄｉｕｎ　ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａ
ｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｉｉ、＜Ｉｅ　ｑｅｌ　ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって分析した。

蛋白質の濃度をアミノ酸組成から及び自動分析装置で測
定することによって純粋画分に関し決定した。

上記したアミノ酸組成はアミノ酸配列自動決定装置によ
って決定した。

生産試料の自動分析装置での分析によって、次の濃度の
アミノ酸を決定することができた（ピコモル値）。

Ａｓｐ：２０．０７９、Ｔｈｒ　　：　　５．　７９、
Ｓｅｒニア、　　３８、Ｇｌｕ：　　１４．　１８、Ｐ
ｒｏ　　：６、９５、Ｇｌｙ：９．　７８、Ａｌａ：　
　１０．　７６４、Ｖａｌ　　：　　９．　０７８、Ｍ
ｅｔ　　：　　１．　２１２．Ｉｌｅ：４．７１６、Ｌ
ｅｕ　　：　１２．７８１、Ｔｙｒ：　　５．０５８、
Ｐｈｅ　　：　　６．８１９、Ｇ　１　ｃ　Ｎ　Ｈ２：
　Ｏ、’　７７　’８、Ｌｙｓ：　１５．２７９、Ｈｉ
ｓ：３．４８及びＡｒｇ：６．９２゜上記した異なるア
ミノ酸基の概数を上記結果から推論した。

、トー ヒト血管内皮細胞を履帯から採集し、先に述べた方法（
参照文献１７）によって培養した。ヒト皮膚及び胎児肺
の線維芽細胞はフランス、ヴイレジュイフ（Ｖｉｌｌｅ
ｊｕｉｆ）のニー・マシェラ・コニロー（＾、　Ｈａｃ
ｉｅｉｒａ　Ｃｏｅｈｌｏ）によって贈呈されたもの（
ＩＮＳＥＲＭ　　Ｕ−５０）であり、かつヒト大腿平滑
筋細胞はフランス、ペサック（Ｐｅ５ｓａｃ　）のジエ
ー・ラルー（Ｊ、　Ｌａｒｒｕｅ）から贈呈されたもの
（ＩＮＳＥＲＭ　　Ｕ−８＞であった、ブタ大動脈の内
皮細胞はフランス、パリのエル・ドローエ（Ｌ、　Ｄｒ
ｏｕｅｔ）によって提供されたもの（Ｉ　ＮＳＥＲＭ　
　Ｕ−１５０）であった、フランスのコミサリア・ア・
レネルギー・アトミークから（メチル−３Ｈ）−チミジ
ン（５Ｃｉ／ｍＨ）を得た。チミジンで標識された培養
血管細胞を、！ｌ１ｆｌａ収穫１ｍ［ノルウェー、゛ラ
イアー（Ｌｉｅｒｊのスカトロン（５ｋａｔｒ。

ｎ）社製］によって採集した。

ＭＥＣＩ　Ｆの生物学的活性を培養血管細胞のＤＮＡに
（メチル−３Ｈ）−チミジンを組入れることによって３
回試験した。この目的のために、１０％のウシ胎児血清
を添加したＭ−１９９培地中の１２〜１５０００個の細
胞を多数の消（ｗｅｌｌ）を有する皿の各培養溝に導入
し、５％ＣＯ２の雰囲気中でＭＥＣＩ　Ｆの存在下に３
７℃で２４時間培養した０次に、これらの培養細胞を（
メチル−３Ｈ）−チミ、ジン（１μＣｉ／孔）で１６時
間培養した。この培養期間の終了後、培地を除去し、か
つコラゲナーゼで処理した後、細胞を細胞収穫機を用い
てガラス繊維フィルターによって採集した。増殖の試験
に使用されるヒト及びブタ内皮細胞を一次培養から獲得
し、一方平滑筋細胞及び線維芽細胞をそれぞれ８番目及
び１３番目の継代培養から獲得した。

ヒ　　　　　　゛　°のト　　に　　　ＭＥＣＩＰの　
。

ヒト血ｉの単離単球が二゛ヒ）′膀°静脈の内皮細胞に
（メチル−３Ｈ）−チミジンを組入れることによって実
証されるように、これらの細胞の増殖を阻害することが
できるＭＥＣＩ　Ｆと呼ばれる因子を遊離することが判
明した。培地中の単球によるＭＥＣＩ　Ｆの生産は培養
の２４時間後に最大に達し、それから減退する。それで
も、この最初の２４時間の後に培地中に存在するＭＢＣ
Ｉ　Ｆは少なくとも７２時間安定のままであるはずであ
る。ＭＥＣＩＦの生産は単球の数及び培地中の血清蛋白
質の濃度によって決まる。単球に対する培地中のウシ胎
児血清の濃度が２．５％であった時に、ＭＢＣＩＦの最
大の発現が見られた。

ＭＥＣＬＦの発現が汚染細胞に起因する可能性を排除す
るために、単球の調製において見出だしな正常の濃度で
血小板又はリンパ球に対する培地を単球に関して説明し
たのと同様の方法を用いて内皮培養細胞について試験し
た。対照的に、これらの結果は内皮細胞においてＤＮＡ
の合成が増大していることを示した。このことは、ＭＥ
ＣＩ　Ｆの生産が単球に直接起因することを示唆してい
る。

単球培地をシクロへキシミドで処理することによって、
この培地中のＭＥＣＩ　Ｆの遊離が完全に阻害された。

さらに、シクロ−オキシゲナーゼの阻害剤であるインド
メタシンでの処理によって、ＭＥＣＩ　Ｆの発現に鍔環
変化を生じなかった。このことは、ＭＥＣＩＦの発現が
アラキドン酸の代謝ではなく、蛋白質合成を必要として
いることを示唆している。

エンドトキシン［ＬＰＳ　（リボ多糖）、大腸菌、１０
ｊｇ／ａｌｌ又はｆＭＬＰ　（ホルミル−メチオニルロ
イシンフェニルアラニン、０．１＃ｌ）での単球の活性
化によって、ＭＥＣＩ　Ｆの生産は促進されなかった。

４℃でＭＥＣＩ　Ｆを含む培地を保存しても、生活性に
同等影響を与えず、かつその培地は５６℃において５分
間安定であった。

ＭＥｃ　Ｉ　Ｆの生活性はプロテアーゼの阻害剤である
アプロチニンによって中和されなかった。

ＭＥＣＩ　Ｆは、それが予め標識されな内皮細胞性によ
ってその生活性を内皮細胞に及ぼさないことが、他のａ
測によって示されな一 １亘１詮１１ フェニルセファローゼによる精製工程の後、内皮細胞に
対するＭＥＣＩ　Ｆの活性を約１４％の硫安溶液で溶離
したピークで観測した。他の画分は掻く温かの活性しか
示さなかった。ＤＥＡＥトリスアクリル−ＬＳでのさら
に別の精製工程によって、他の蛋白質からＭＥＣＩ　Ｆ
を分離した。ＭＥＣＩＦを含む画分が最初のピークで溶
離され、ゲル電気泳動分析によって、単一のバンドであ
ることが示された。

この蛋白質をＨＰＬＣＴＳＫ−２５０クロマトゲラフイ
ーに掛けた後、その活性が単一のピークの画分中に存在
することがさらに確認された。

さらに、単球含有層ＭＥＣＩ　Ｆの培地をＴＳＫ−２５
０カラムに通した時、活性画分がＤＥＡＥによるクロマ
トグラフィーから得た活性画分と同一の容量で見出ださ
れた。

精製工程にヘパリンセプア６−ズ（Ｈｅｐａｒｉｎｅ　
５ｅｐｈａｒｏｓｅ、登録商標）及びチバクａン（Ｃｉ
ｂａｃｒｏｎ）ブルー　Ｆ３ＧＡ　　セファローズ（登
録商標）によるクロマトグラフィーを導入する実験も行
ったが、ＭＥＣＩ　Ｆがこれらのクロマトグラフィー支
持体のいずれによっても保持されないことが判った。

ＭＥＣＩ　Ｆ　　、 非還元条件下のＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動及びクマシー
ブルーでの染色によって判るように、ＤＥＡＥ−トリス
アクリル　ＬＳでのクロマトグラフィーによって精製さ
れたＭＥＣＩＦは６４ｋＤの見掛は分子量に相当する単
一の広いバンドの形状に泳動しな、還元条件下において
、それは約７０ｋＤの大バンド及び約６８ｋＤの小バン
ドの２つのバンドの形状を示した。ＴＳＫ−２５０（６
０ｘ０゜７５ｃｌでの高圧液体クロマトグラフィーは約
６６ｋＤの分子量に相当する単一のピークを示した。

硝酸銀でのＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動ゲルの染色によっ
て、クマシープル染色によって得られたもののようない
かなる特ｉのバンドも示さなかった。過ヨウ素酸−シッ
フ反応（ＰＡＳ）は陽性であった。これは、ＭＥＣＩ　
Ｆが糖蛋白質であることを示している。単球培養の上澄
液をＴＳＫ−２５０による高圧液体クロマトグラフィー
に掛けたところ、阻害活性が純ＭＥＣＩ　Ｆと同一の容
量で溶離された画分（分子量：６６ｋＤ）中に見出ださ
れた。このことは、ＭＥＣＩ　Ｆが単球培養の上澄液中
に存在する阻害活性に相当することを示している。

に　　　　　−、　　′ （メチル−３Ｈ）−チミジンの組入れ阻止がＭＥＣＩＦ
を含有する培地の濃度に依存することがわかった。この
培地をその最初の濃度から６４＠に希釈すると、対照（
ｎ＝１５）と比較して８０〜３０％まで阻害効果が減少
された。１４ピコグラムの濃度のＭＥＣＩ　Ｆはウシ胎
児血清（２，５〜１０％、ｎ＝１６）の存在下にチミジ
ンの組入れに関して８１±２．５％（Ｘ：Ｉ：ＳＥＭ％
ＳＥＭ＝標準平均誤差）の阻害効果を生じた。血管内皮
細胞に関する成長調節効菓はＰ：／ＩＥ’　ｃ　Ｉ　Ｆ
の濃度に依存した。同じ濃度において、ＭＥＣＩ　Ｆは
ヒト正常皮膚の線維芽細胞（１１３±５％、ｎ＝６）並
びに胎児肺の線維芽細胞（１２８±６％、ｎ＝８）への
チミジンの組入れに顕著な影響を及ぼさなかった。同条
件において、平滑筋細胞及びヒト動脈細胞も影響されな
かった（１０８±６％、ｎ＝１２）、２８±７％（ｎ＝
１２）までの阻止率がブタ内皮細胞でも観測されたが、
上記のものより非常に低いものであった。

ある期間に渡って実施した研究によって、ＤＮＡの合成
が培養の６時間後にＭＥＣＩ　Ｆによって抑圧され、か
つこの効果が培養の１２時間後にプラトーに達すること
が示された。さらに、光学類Ｒ鏡で細胞を計数すること
によって判ったことだが、ＤＮＡの合成に対するＭＥＣ
Ｉ　Ｆの阻害効果が細胞増殖の低下と平行して生じる。

工り立１ユ まず、内皮細胞をＭＢＣＩ　Ｆの存在下に２４時間培養
し、次に細胞培地の一部に（メチル−３Ｈ）チミジンを
組入れ、１６．７２及び１２０時間後に測定しな、一方
、他の２つの細胞培地において、この２４時間の培養後
に、細胞を２０％ウシ胎児血清又は２５ｊｇのＥＣＧＦ
　（内皮細胞成長因子）のいずれかの存在下に別に１６
．７２及び１２０時間さらに培養した。結果を、ＭＥＣ
Ｉ　Ｆを存在させないで培養したものと比較して、各培
養時間の終了後にこれらの細胞に組入れられた（メチル
−３Ｈ）チミジンのパーセントで表しな、βＴＧＦを用
いて同様の測定を行った結果、内皮細胞成長の可逆性は
内皮細胞をβＴＧＦよりはむしろＭＥＣＩＦにさらした
後のほうが容易に達成されることが判明した。

ＴＧＦ　　ＶＩＥＣＩＦ　　’　　　　　　”製造業者
（米国、ミネソタ州、ミネアポリスのアール・アンド・
ジー社）によって説明されているように、ヒトβＴＧＦ
［アール・アンド・ジー（Ｒ＆Ｇ）社製］に対しで作用
する４０１１１（１００１１ｇのＩｇＭに相当）の特異
のポリクローナル抗体が２ｎｇ／ｎ＋ｌのβＴＧＦ［：
カリフォルニア州、ラジョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）のカ
ルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｎ）社製］の生物学的
活性を中和することがわかった。

種々の濃度（２〜１２μｇ／ｌ）の中位純度ＭＥＣＩ　
Ｆ　（ＤＥＡＥクロマトグラフィー後）を使用して、内
皮細胞増殖の阻止率が５０％になる量を同様に５０％の
成長阻止率を得るβＴＧＦの量（２ｎｇ／ｍｌ）と比較
した。ＭＥＣＩ　Ｆ又はβＴＧＦを抗βＴＧＦと共に室
温で１時間培養した後、その阻害効果を試験した。これ
らの抗βＴＧＦは内皮細胞の成長に対するＭＥＣＩ　Ｆ
の阻害効果を中和しなかった。

内皮細胞を光学顕微鏡で観察した場合、それらの培地中
にＭＥＣＩ　Ｆが存在すると、これらの細胞に、伸長し
た形をとる形態学的変化が生じていることが判る。しか
しながら、免疫螢光法及び透過電子嬰微鏡での観察によ
る調査によって、これらの細胞はそれらに特異の標識、
即ち、ウィルブランド（Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子及
びウェイベル・バラデイ体（１４ｅｉｂｅｌ　Ｐａ１ａ
ｄｅ　ｂｏｄｙ）を保存していることが示された。

一方、βＴＧＦが内皮細胞６−殖を阻止する場合は、細
胞の形態学的変化を生じなかった。

本実験例において示した結果は、ヒト正常単球を培養す
ることによって、ヒト内皮細胞の成長を阻止する因子を
遊離することができることを実証している。この阻害効
果は細胞毒活性よるものではなく、ＤＮＡ合成の阻止に
よるものである。当該因子、ＭＥＣＩ　Ｆは、高度に精
製した場合６６ｋＤの見掛は分子量を有する糖蛋白質で
ある。粗単球抽出物からのこの因子の発現は培養ウェル
に導入した半球の数によって決まり、かつその生産は蛋
白質合成を意味する。

単球由来のＭＥＣＩ　Ｆは、汚染細胞（血小板、リンパ
球）が実験条件下に阻害作用を生じる可能性はないが、
わずかな割合で存在するリンパ球（〈１０％）が単球に
よる阻害剤の生産にある程度影響するということによっ
て確かめられる。

その生物学的特性において、粗単球抽出物から単離した
ＭＥＣＩ　Ｆは内皮細胞の成長に作用する阻害因子であ
ることが示された。さらに、ＭＥＣＩＦは使用量に依存
する程度で内皮細胞におけるＤＮＡ合成を阻止させる。

ＭＥＣＩ　Ｆの強力な作用は１０１）Ｏ／ｍｌという低
い濃度で１５．０００個の細胞の成長にその効果を及ぼ
すことができることによって実証される。さらに、ＭＥ
ＣＩ　Ｆは、それがヒト平滑筋細胞、ヒト皮膚の線維芽
細胞及びブタ内皮細胞の成長に余り影響しないので、そ
の作用が細胞に特異的であることが判った。しかしなが
ら、これらの細胞は再生の異なる段階にあったので、細
胞の加齢によってＭＥＣＩ　Ｆに対して異なって応答す
る危険性を排除することができない。

ヒト内皮細胞の成長に対するＭＥＣＩ　Ｆの生物学的影
響は試験培地中に増加量のＥＣＧＦ　（内皮細胞成長因
子）のような成長刺激剤を存在させることによって部分
的に克服することができる。

製品としてのＭＥＣＩ　Ｆの純度がゲル電気泳動におけ
る単一の主蛋白質バンドの形状及び高性能液体クロマト
グラフィーのようなゲルクロマトグラフィー濾過カラム
にＭ゛セＣ１゛°ｉ通した後の単一ピークによって実証
された。

非還元条件下でのゲル電気泳動分析によって、主バンド
の蛋白質は６４ｋＤの見掛は分子量を有することが示さ
れた。ＭＥＣＩ　Ｆは、インターフェロン（参照文献１
８．１９及び２０）、インターロイキン−１（参照文献
１１）、ＴＮＦ（参照文献２１）又はβＴＧＦ　（参照
文献２２）のような単球又はマクロファージ由来の公知
の成長調節物質のものとは異なる生物学的及び化学的特
性を有している。

ＭＥＣＩ　Ｆはインターフェロン類、ＩＬ−１、αＴＮ
Ｆ及びβＴＧＦのような他の公知の阻害因子と見掛は分
子量が異なっている。その作用は内皮細胞の成長に関し
βＴＧＦと同様であったが、それらが異なる因子である
ことを、多くの異なる特徴が示している６ＭＥＣＩ　Ｆ
は内毒素の刺激なしに合成されるが、βＴＧＦはそのよ
うな刺激を必要とする。内皮細胞成長の可逆性は内皮細
胞をβＴＧＦよりはむしろＭＥＣＩＦにさらした後のほ
うが容易に達成された、βＴｄＦ、αＴＮＦ［力へチン
（Ｃａｃｈｅｔｉｎ）　］並びにα及びγＩＮＦに特異
な抗体は内皮細胞の成長に関してＭＥＣＩＦの阻害効果
を中和しなかった。高濃度のＭＥＣＩＦ製剤が、βＴＧ
Ｆの生物学的試験における典型的な対照である正常なネ
ズミ腎臓線雑芥細胞の増殖に影響を与えないので、少量
のβＴＧＦによるＭＥＣＩ　Ｆの予想される汚染は発現
しそうもないように思われる。

細胞由来の他の異なる種類の内皮細胞成長阻害因子、例
えば、軟骨（参照文献２３）、ガラス体液（参照文献２
４）、血小板（参照文献２５）又は内皮細胞（参照文献
２６及び２７）から得られたものもＭＥＣＩ　Ｆの特性
とは異なる特性を有している。要約すれば、ＭＥＣＩ　
Ｆは先に確認された他の阻害因子（参照文献２８〜３０
）とは異なる内皮細胞阻害因子であるとこれらの研究会
てが示唆している。

単球が内皮細胞成長促進因子を生産することができると
いうことが知られていたので、酸臭促進因子と成°長阻
害因子との藺の平衡を保持することは炎症及びアテロー
ム動脈硬化を含むたくさんの病理生理学的状態に非常に
重要であると考えられる。この平衡は組織修復、糖尿病
性網膜症及び腫瘍関連新生血管形成の過程に件いうる血
管形成を変調するのに重要な役割を演じると思われる。

艶工しく猷 １）エッチ・セテイアデイ（Ｈ，５ｅｔｉａｄｉ）　、
エフ・リオテ（Ｆ、　Ｌｉｏｔｅ）　、及びジエー・エ
ル・ウォーテイア（Ｊ、　Ｌ、賛ａｕｔ　ｉｅｒ　）、
「単球及び血管障害（ＨｏｎｏｃｙｔｅＳａｎｄ　ｖａ
ｓｃｕｌａｒ　、Ｉｅｓｉｏｎｓ）　　Ｊ　、Ｎｏｕｖ
、　　Ｒｅｖ、　　Ｆｒ、　　Ｈｅｎａｔｏｌ、　　、
２８巻、１３９〜３４３頁’（１°’９’８６　）２）
ピーーｘムーヘンソ７　（Ｐ、Ｈ，Ｈｅｎ５ｏｎ）及び
アール・ビー・ジョンストン・ジュニア（Ｒ。

Ｂ、　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　Ｊｒ、）、「炎症における組
織損傷。

酸化性物質、プロテイナーゼ及びカチオン性蛋白質（Ｔ
ｉｓｓｕｅ　１ｎｊｕｒｙ　ｉｎ　１ｎｆｌａｌｌｌｌ
ａｔｉｏｎ。

０ｘｉｄａｎｔｓ、　Ｉ）ｒｏｔ１３ｉｎａｓｅｓ、　
ａｎｄ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　Ｊ　
、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、７９巻、６６９
〜６７４頁（１９８７） ３）エル・リファス（Ｌ、　Ｒｉｆａｓ）　、ケイ・ジ
エン（Ｖ、　５ｈｅｎ）、ケイ・ミツシェル（に、　Ｈ
ｉｔＣｈ１３１１）及びダブリュ・ニー・ペック（Ｗ、
Ａ、　Ｐｅｃｋ）−「マクロファージ由来の骨芽細胞様
細胞及び軟骨細胞成長因子（Ｈａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄ
ｅｒｉｖｅｄ　ｇｒＯｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ　　ｆｏ
ｒ　　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ　　ｃｅｌｌｓ
　　ａｎｄｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）Ｊ　　、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ。、８１巻、４５５８〜４５６２頁（１
４）ニス・ジエー・ライボケイッチ（Ｓ、Ｊ、　Ｌｅｉ
ｂ。

ｖｉｃｈ）及びアール・ロス（Ｒ，Ｒｏｓｓ）、「試験
管内線雑芥細胞の増殖を刺激するマクロファージ依存因
子（Ａ　ｎ＋ａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
　ｆａｃｔａｒ　　ｔｈａｔ　　５ｔｉｎｕｌａｔｅｓ
　　ｔｈｅ　　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆｒｉ
ｂｒｏｂｌａｓｔｓ　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）Ｊ　　、Ａ
ｎ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、、８４巻、５０１〜５１４頁（
１９７６）５）ゲイ・シー・ブレ：ｙ　（Ｋ、Ｃ，Ｇｌ
ｅｎｎ）及びアール・ロス「ヒト単球由来の間葉細胞成
長因子：内毒素及びコンカナバリンＡによる分泌作用の
活性化（Ｈｕｌａｎ　ｎｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｅｄ
　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｓ）　ｆｏｒ　ｍｅｓ
ｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌｓ：　ａｃｔｉｖａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｂｙ　ｅｎｄｏｔｏｘ
ｉｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ＾）」、セル
（Ｃｅｌｌ）　、２５巻、６０３〜６１５頁（１９８１
） ６）ワイ・マルチネット（Ｙ、Ｈａｒｔｉｎｅｔ）、ピ
ー・ビー・ビッタ−マン（Ｐ、Ｂ、　Ｂｉｔｔｅｒｎａ
ｎ）　、ジェー・エフ・モーネックス（Ｊ、Ｆ、　Ｈｏ
ｒｎｅｘ）、ジー・アール・グロテンドルスト（Ｇ、Ｒ
，Ｇｒ。

ｔｅｎｄｏｒｓｔ）　、ジー・アール・’？−チ：ｙ　
（Ｇ、Ｒ。

Ｈａｒｔｉｎ）及びアール・ジー・クリスタル（Ｒ。

Ｇ、　ｃｒｙｓｔａｌ）、「活性化ヒト単球はｃ−ｓｉ
ｓ−Ｈ腫瘍遺伝子を発１現ビかつＰＤＧＦ様活性を示す
メゾイエイタ−を遊離する（　Ａｃｔ　１ｖａｔｅｄ　
ｈｕｍａｎ　＋ｔＯｎＯｃｙｔｅＳ　ｅｘｐｒｅｓｓ　
ｔｈｅ　ｃ−ｓｉｓ　ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏａｅｎｅ　
ａｎｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａ　１ｅｄｉａｔｏｒ　ｓｈ
ｏｗｉｎｇ　ＰＯＧＦ−１ｉｋｅ　ａｃｔ、１ｖｉｔｙ
）　Ｊ　、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１９巻、
１５８〜１６０頁７）ビー・ジエー・ボルヴエリニ（Ｐ
、Ｊ、　Ｐｏ１ｖｅｒｉｎｉ）、アール・ニス・コトラ
７　（ＲｌＳ、　Ｃｏｔｒａｎ）、エム・ニー・ギンブ
ｏン（Ｈ，Ａ、　Ｇ１１ｌｂｒｏｎｅ）及びイー・アー
ル・ユナニュー（Ｅ、Ｒ，Ｕｎａｎｕｅ）、「活性マク
ロファージは血管増殖を誘発する（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ
　ｎａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　１ｎｄｕｃｅ　ｖａｓｃｕ
ｌａｒ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」、ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）２６９巻、８０４〜８０６頁（１９７
７）８）　ジー・ビー・グリーンバーブ（Ｇ、Ｂ、Ｇｒ
ｅｅｌｌｂｕ「り）及びティー・ゲイ・ハント（Ｔ、に
、　Ｈｕｌｌｔ）、「創（Ｓ液及びマクロファージにさ
らされた血管内皮及び平滑筋細胞の試験管内増殖性応答
（Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎ
ｓｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎ
ｄｏｔｈｅｌｉａ’ｉ　ａｎ’ｄ’５ｌｏｏｔｈ　ｍｕ
ｓｃｌｅｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｔｏ　ｗｏｕｎ
ｄ　ｆｌｕｉｄｓ　ａｎｄ　ｎａｃｒｏｐｈａｃ＋ｅｓ
）」、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、９６巻
、２０３〜２１４頁（１９７８） ９）アール・ティー・ウオール（Ｒ，Ｔ、　Ｗａｌｌ）
、エル・ニー・バーカー（Ｌ、Ａ、　Ｈａｒｋｅｒ）、
エル・ジエー・クアードラッチ（Ｌ、Ｊ、　Ｑｕａｄｒ
ａｃｃｉ　）及びジー・イー・ストライカ−（Ｇ、Ｅ、
　５ｔｒｉｋｅｒ）、「試験管内の内皮細胞増殖に影響
を及ぼす因子（ＦａＣｔＯｒＳ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎ
ｇ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａＩ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆ
ｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）」、Ｊ、　Ｃｅ１
１、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　、　９６巻、２０３〜２１４
頁１０）ビー−２ム−７−チン（Ｂ、Ｈ，Ｈａｒｔｉｎ
）　、エム・ニー・ギンブロン（１４，＾、　Ｇ１１ｂ
ｒｏｎｅ）、イー−７−ルー１ナニユ−（Ｅ、　Ｒ，Ｕ
ｎａｎｕｅ）及びアール・ニス・コトラン（Ｒ，Ｓ、　
Ｃｏｔｒａｎ）、「マクロファージ由来の成長因子によ
る非リンパ性間葉細胞増殖の刺激（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｏｎ　ｏｆｎｏｎｌｙｕｈｏｉｄ　ｎｅｓｅｎｃｈｙｎ
ａｌ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｂ’ｙ
　ａ　ｎａｃｒｏｐｈａｇｅ”ａｅｒｉ’ｖ’ｅｄ’　
ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）１　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　、１２６巻、１５１０〜１５１５頁（１９８
１） １１）ビー・ニス・オーイ（Ｂ、Ｓ、　０ｏｉ）　、イ
ー・ビー・マツカーシー（Ｅ、Ｐ、　Ｈｃ　Ｃａｒｔｈ
ｙ）　、ｘ　−・ハス（Ａ、　Ｈｓｕ）及びワイ・エム
・オーイ（Ｙ、Ｈ，０ｏｉ）　、ｒ内皮細胞増殖のヒト
単核細胞による変調（Ｈｕｉａｎ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅ
ａｒ　ｃｅｌｌ　ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄ
ｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉ
。

ｎ）」、Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｒｅｄ、、１０
２巻、４２８〜４３３頁（１９８３） １２）エイ・グーリロン・マレット（＾、Ｃｏｕｒｉｌ
ｌｏｎＭａｌｌｅｔ）　、ジエー・エル・ウォーティア
（Ｊ。

Ｌ、　Ｗａｕｔｉｅｒ）及びエム・ビー・ウォーティア
（Ｈ，Ｐ、　　Ｗａｕｔｉｅｒ）、「単球由来の内皮細
胞阻害因子（Ｍ　Ｅ　ＣＩ　Ｆ　）　　（Ｈｏｎｏｃｙ
ｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌ
ｌ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）　Ｊ、第６
回インター−ワシントン春期シンポジウム（Ｓｉｘｔｈ
　Ｉｎｔｅｒ−Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｓｐｒｉｎｇ　
５ｙｎｐｏｓｉｕｎ＋）、編者：エルーｃル・ガｏ　（
Ｌ、Ｌ、　０ＡＬＬＯ）、１６０ａ（７ブスＶう乏ト）
（１９８６）１３）エム・ビー・カーシー（Ｈ，Ｂ、　
Ｋａｈａｌｅｈ）　、ｘ。

フ・デルストｏ　（Ｆ、　Ｄｅ　Ｌｕ５ｔｒｏ）　、ダ
ブリュ・バック（Ｗ、　Ｂｏｃｋ）及びイー・デイ−・
レロイ（Ｅ、Ｄ、　ＬｅＲｏｙ）、「内皮細胞及び線雑
芥細胞の成長のヒト単球による変調：線維症の予想機構
（Ｈｕｎａｎ　１ｏｎｏｃｙｔｅ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ａｎ
ｄ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ：　ｐ。

５ｓｉｂｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓＩｌ’ｆｏｒ　ｆｉｂ
ｒｏｓｉｓ）」、Ｃｌ１ｎ。

１１１１１ｕｎＯ１，１１１１ｕｎ０１）ａｔｈｏｌ、
、３９巻、２４２〜２５５頁（１９８６） １４）ジｓ　−−エル・ウォーティア（Ｊ、Ｌ、　Ｗａ
ｕｔｉｅｒ）エム・ビー・ウォーティア（Ｈ，Ｐ、　Ｗ
ａｕｔｉｅｒ）、デイ−・ビンティニュー　（Ｄ、　Ｐ
ｉｎｔｉｇｎｙ）等、「血管内皮への細胞付着にｒＪＪ
″４する因子（Ｆａｃｔｏｒｓ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉ
ｎ　ｃａｌｌ　ａｄｌ＋ｅｓｉｏｎ　ｔｏ　ｖａｓｃｕ
ｔａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｎ＋）」、ブラッド・セ
ル（Ｂｌｏ。

ｄ　ｃｅｌｌｓ）、９巻、２２１〜２３４頁（１９８１
５）イー・エングヴアル（Ｅ、　Ｅｎａｖａｌｌ）及び
ビー・パニルマン（Ｐ、　Ｐｅ’？Ｉｎａｉｆｎ）、「
酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、ＩＩＩ：抗原被
覆管中における酵素標識抗免疫グロブリンによる特異抗
体の量化（ＥｎｚｙＩｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｎｕｎｏ
ｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ；　ＩＩＩ　：　ｑｕａｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ　ｂｙ　ｅｎｚｙＩｌｅ　１ａｂｅｌｌ
ｅｄ　ａｎｔｉ−ｉｎｌｌｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｉ
ｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｔｕｂｅｓ）」、
Ｊ、　ｌ１ｌｕｎｏ１．．１０９巻、１２９〜ｆ３５頁
１６）エッチ・セチアデイ（Ｈ，５ｅｔｉａｄｉ）　、
ジエー・エル・ウォーテイア（Ｊ、Ｌ、　　Ｗａｕｔｉ
ｅｒ）、エイ・クーリロン・マレット（Ａ、　Ｃｏｕｒ
ｉｌｌｏｎ　Ｈａｌｌｅｔ）、ビー・バッサ（Ｐ、　Ｐ
ａ５ｓａ）及びジ工−・ビー・シーン（Ｊ、Ｐ、　Ｃａ
ｅｎ）、「フィブロネクチンへのイ・１着増加及び糖尿
病単球によるＨＯ−１発現（Ｉｎｃｒｅａｓｅ　ａｄｔ
＋ｅｓｉｏｎ　ｔｏ　ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ａｎｄ
　Ｈａ−１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｄｉａｂｅｔ
ｉｃ　１ｏｎｏｃｙｔｅｓ）　Ｊ　、Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕ
ｎｏ１．　、１３８巻、３２３０〜３２３４頁（１９８
７） １７）ジエー・エル・ウォーティア（Ｊ、Ｌ、　Ｗａｕ
ｔｉｅｒ）デイ―・ビンティ＝゛、％　−（Ｄ’、Ｐｉ
ｎｔｉｇｎｙ）、ジ工−・マツクルーフ（Ｊ、　Ｈａｃ
ｌｏｕｆ）　、エム・ビー・ウォーティア（ＨｌＰ、　
Ｗａｕｔｉｅｒ）　、イー・コルヴアズイア−（Ｅ、　
Ｃｏｒｖａｚｉｅｒ）及びジェー・ビー・シーン（Ｊ、
Ｐ、　Ｃａｅｎ）、「培養血管内皮への赤血球付着後の
１０スタサイクリンの遊＠　（Ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　
ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ　ａｆｔｅｒｅｒｙｔｈｒｏ
ｃｙｔｅ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｔｏ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ
　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｌｌｅｌｊｕｌ）Ｊ　
、Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｈｅｄ、、１０７巻、
２１０〜２１５頁（１９８６）１８）アール・フリーセ
ル（Ｒ，Ｆｒ１ｅｓｅｌ）　、ニー　−コモリヤ（Ａ、
にｏｍｏｒｉｙａ）及びティー・メイシア（Ｔ、　Ｈａ
ｃｉａｇ）、「γ−インターフェロンによる内皮細胞増
殖の阻止（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈ
ｅｌｉａｌ　　ｃｅｌｌ　　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏ
ｎ　　ｂｙ　ｇａｎｌｌａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）　
Ｊ　、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。Ｂｉｏｌ、、１０４巻、６８９
〜６９６頁（１９８７） １９）ダブリュ・イー・スチュアート２世（Ｗ、　Ｅ。

Ｓｔｅｗａｒｔｔ、　２ｎｄ）、「インター７ｚｏンの
別個の分子種（Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　１ｏｌｅｃｕｌａｒ
　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）」、
ヴーイジロ゛ジー（Ｖｉｒｏｌｏａｙ）６１巻、８０〜
８６頁（１９７４） ２０）ワイ・ケイ・ジップ（Ｙ、に、　Ｙｉｐ）　、ビ
ー・バロウクラ７　（Ｂ、　Ｂａｒｒｏｗｃｌｏｕｇｈ
）、シー・アーバン（Ｃ，Ｕｒｂａｎ）及びジエー・ケ
イルセク（Ｊ、　Ｖｉｌｃｅｋ）、「ヒトガンマーイン
クフエロンの分子量は他のヒトインターフェロンの分子
量と類似している（Ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅ
ｉｇｈｔｏｆ　ｈｕｎａｎ　ｇａ＋＋ｎａ　１ｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ　ｉｓ　５ｉ１ｉ１ａｒ　ｔ。

ｔｈａｔ　ｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ｈｕ＋ｇａｎ　１ｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎｓ）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、
２１５巻、４１１〜４１゛　　３頁（１９８２） ２１）エル・ジエ゛−・オールド（Ｌ、Ｊ、　０１ｄ）
　、ｒ腫瘍壊死因子；ポリペプチドメゾイエイタ−網状
層ｔａ　（Ｔｕｎｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｒａｃｔｏ
ｒ、　ＰＯＩｙＤｅＤｔｉｄｅ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｎ
ｅｔｗｏｒｋ）、１　、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
３２６巻、３３０〜３３１頁（１９８２２）　７−ル・
ｚルー　ハイマーク（ＲｏＬ、　Ｈｅ１ｎａｒｋ）、デ
イ−・アール・トウアージック（０，Ｒ，Ｔｗａｒｄｚ
ｉ’ｋ）及びニス・工゛ム・レユワルツ（Ｓ、Ｈ，Ｓｃ
　ｈｖａ　ｒ　ｔ　ｚ　）、「血小板から得たβ型形質
転換成長因子による内皮再生の阻止（Ｉｎｈｉｂｉｔｉ
ｏｎｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｒｅｇｅｎｅｒａ
ｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｙｐｅ−ｂｅｔａｔｒａｎｓｆｏｒ
Ｉｌｉｎｇａｒｏｖｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｒｏｎ　ｐ
ｌａｔｅｌｅｔＳ）」、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ
）、２３３巻、１０７８〜１０８０） ２３）ｉツチ・プレニ（Ｈ，Ｂｒｅｎ）及びジェー・フ
ォクマン（Ｊ、　Ｆｏｌｋｎａｎ）、「軟骨によッテ仲
介された腫瘍性血管形成の阻止（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
　。

ｔ　ｔｕｍｏｒ　ａｎＱｉＯｇｅｒｔｅｓｉｓ　ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｃａｒｔｉｌａａｅ）　Ｊ　、Ｊ、
　Ｅｘｐ、　Ｈｅｄ、、１４１巻、４２７〜４３９頁（
１９７５） ２４）エル・レイモンド（Ｌ、　Ｒａｙｎｏｎｄ）及び
ビー・ジャコプソン（Ｂ、　Ｊａｃｏｂｓｏｎ）、「ウ
シ硝子体中の刺激性及び阻害性細胞成長因子の単離及び
同定（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｌｅｎｔｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ　ｏｆｓｔｉｒ＃ｕｌａｔｏｒｙ　ａｎｄ
　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆ
ａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｔｒｅｏｕ）
　Ｊ　、　Ｅｘｐ、　Ｅｙｅ。

Ｒｅｓ、、３４巻、２６７〜２８６頁（１９８２）２５
）エム・ティー・ブラウン（’Ｈ’、Ｔ、　Ｂｒｏｗｎ
）及びデイ−・アール・クレモンズ（Ｄ、Ｒ，Ｃｌｅｍ
ｌＩｏｎＳ）、「血小板は内皮細胞の複製及び成長のペ
プチド阻害剤を含む（Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ　ｃｏｎｔａ
ｉｎ　ａｐｅｐｔｉｄｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　
ｅｎｄｏｔｈｅ！ｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｒｅｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ）　Ｊ　、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　ＡＣａ　ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、
、８３巻、３３２１〜３３２５頁（１９８６） ２６）シー・エッチ・ウィレムス（Ｃ，Ｈ，Ｗｉｌｌｅ
ｉｓ）。

ジー・シー・ビー・アステルデイ（Ｇ、Ｃ，Ｂ。

＾５ｔｅｌｄｉ）、ビー・ジー・デグルー）（Ｐ、Ｇ。

ＤｅＧｒｏｏｔ）　、　エム・デイ−・ジャンセン（Ｈ
，口。

Ｊａｎｓｓｅｎ）、エム・デイ−・ゴンザルヴエズ（Ｈ
，Ｄ、　Ｇｏｎｓａｌｖｅｚ）　、ダブ’）　ユ・１：
”　−・’７　マイジルメーカー（Ｗ、Ｐ、　２ｅｉｊ
ｌｅｍａｋｅｒ）　、シュー・ニー・ヴアンモーリック
（Ｊ、八、　Ｖａｎ　Ｈｏｕｒｉｋ）及びダブリュ・ジ
ー・ヴアンアゲン（Ｗ。

Ｇ、　Ｖａｎ　Ａｋｅｎ）、「培養ヒト血管内皮細胞に
よって調整された媒体は血管平滑筋細胞の成長を阻止す
る（Ｍｅｄｉａ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｂｙ　ｃｕ
ｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｉａｎ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎ’
ｄｏｔｈｊｌｒａｌ　ｃｅｌｌ　１ｎｈｉｂｉｔ　ｔｈ
ｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　５ｎｏｏ
ｔｈ　ｎｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ）」、Ｅｘｐ、　Ｃｅ１
１．　Ｒｅｓ、１３９巻、１９１〜１９７頁（１９８２
） ２７）シュー・シュー・カステロット・ジュニア（Ｊ、
Ｊ、　Ｃａ５ｔｅｌｌｏｔ　Ｊｒ）、エル・デイ・フエ
ーヴｙ　−（Ｌ、Ｖ、　Ｆａｖｅａｕ）、エム・シュー
・カルノヴスキー（Ｍ、Ｊ、にａｒｎｏｖｓｋｙ　）及
びアール・デイ−・ローゼンバーグ（Ｒ，Ｄ、　Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ　）、「内皮細胞由来のヘパリンによる血
管平滑筋細胞成長の阻止：血小板内グリコシダーゼの予
想しうる役割（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｓｃ
ｕｌａｒ　５１１１ｏｏｔｈ　ｎ＋ｕｓｃｌｅ　ｃｅｌ
ｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂｙ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅ
ｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｈｅｐａｒｉｎ；　Ｐｏ５ｓｉ
ｂｌｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆｐｌａｔｅｌｅｔ　　ｅｎｄＯ
ｃｌＩｙｃＯ３ｉｄａｓｅ）Ｊ　　、Ｊ、８ｉｏｌ。

ＣｈｅＩｌ、２５７巻、１１２５６〜１１２６０頁２８
）アール・クラム（Ｒ，Ｃｒ１ＪＩＩ）、Ｘス−サボ−
（Ｓ、　５ｚａｂｏ）及びシュー・フォークマン（Ｊ。

Ｆｏｌｋｎａｎ）、「新種のステロイド類がヘパリン又
はベパリンフラグメ１ンドの°存在下に血管形成を阻止
する（Ａ　ｎｅｗ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　５ｔｅｒｏｉｄ
ｓ　１ｎｈｉｂｉｔｓ　ａｎａｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉ
ｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆｈｅｐａｒｉｎ　
ｏｒ　ａ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）」、サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３０巻、１３７５〜１
３７８頁（１９８５） ２９）　７−ル・工Ａｙ　−マイマーク（Ｒ，Ｌ、　Ｈ
ｅ１ｉａｒｋ）及びニス・エム・シュワルツ（Ｓ、Ｈ，
ＳｃｈｗａｒｔＺ）、「内皮細胞成長の調節における膜
−膜相互作用の役割（Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｊｍｅｉｂ
ｒａｎｅ−ｒ＃ｅｎｂｒａｎｅ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏ
ｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｏｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅ
ｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ）」、
Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、１００巻、１９３４〜
１９４０頁（１９８５）３０）ビー−エル・シューマツ
チャー　（Ｂ、Ｌ、　５ｃｈｕｎａｃｈｅｒ）、デイ−
・グランド（Ｄ、　Ｇｒａｎｔ）及びアール・アイゼン
スタイン（Ｒ，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ）、「平滑筋細胞
は内皮細胞成長阻害剤を生産する（ＳＩｌｏｏｔｈ　ｎ
ｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ａｎ　１
ｎｈｉｂｉｔｏｒ　　ｏｆ　　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
　　ｃｅｌｌ　　ｇｒｏｓｖｔｈ）　　Ｊ　　、　動脈
硬化（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ＞　、５巻、
１１０〜１１５頁（１９８５＞

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、約０．６〜２００ｋＤの分子量を有するグリコシル
   化蛋白質であるのが好ましい、配列 −Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
   を含む蛋白質。 ２、前記配列がＮ末端である請求項１記載の蛋白質。 ３、前記配列が −Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
   Ａｒｇ−Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ− （但し、Ｘ及びＹは同一でも異なっていてもよく、それ
   ぞれＴｒｐ又はＡｓｐを表す）である請求項１又は２記
   載の蛋白質。 ４、Ｘ及びＹは異なっており、Ｘが好ましくはＴｒｐを
   表しかつＹが好ましくはＡｓｐを表す請求項３記載の蛋
   白質。 ５、次の割合： Ａｓｐ：約８０、Ｔｈｒ：約２３．０６、Ｓｅｒ：約２
   ９．４０、Ｇｌｕ：約５６．５、Ｐｒｏ：約２７．７０
   、Ｇｌｙ：約３８．９８、Ａｌａ：約４２．８８、Ｖａ
   ｌ：約３６．１６、Ｍｅｔ：約４．８３、Ｉｌｅ：約１
   ８．７９、Ｌｅｕ：約５０．９２、Ｔｙｒ：約２０．１
   ５、Ｐｈｅ：約２７．１６、ＧｌｃＮＨ＿２：約３．１
   ０、Ｌｙｓ：約６０．８７、Ｈｉｓ：約１３．８１及び
   Ａｒｇ：約２７．６０ で分布した５６８個のアミノ酸残基を含み、かつ次のＮ
   末端ペプチド配列 −Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
   Ａｒｇ−Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ− （但し、Ｘ及びＹは同一でも異なっていてもよく、それ
   ぞれＴｒｐ又はＡｓｐを表す）を有する６４〜７０ｋＤ
   の見掛け分子量を有する糖蛋白質。 ６、前記見掛け分子量が６６ｋＤである請求項５記載の
   糖蛋白質。 ７、１）ヒト正常単球を培養し、 ２）培養後ろ過した上澄層を約８のｐＨで平衡させた架
   橋多糖カラムに通し、 ３）この上澄層を、硫安を用いる下降勾配溶離法を使用
   して、約８のｐＨで平衡させたフェニル化架橋アガロー
   スゲルカラムに通し、 ４）工程３）で得た活性画分を約８のｐＨで平衡させた
   工程２）で使用したタイプのカラムに通し、 ５）工程４）で得た溶出液を、塩化ナトリウムでの上昇
   勾配溶離法を用いる、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ
   ）タイプのイオン交換カラムに通し、 ６）工程５）で得た画分を細胞培地によって平衡させた
   低圧排除クロマトグラフィーカラムに通し、次いで ７）必要に応じて工程６）で得た活性画分を高圧液体ク
   ロマトグラフィーに掛けた後、精製物を回収する工程か
   ら本質的に成ることを特徴とする請求項５又は６記載の
   糖蛋白質を抽出する方法。 ８、請求項１〜６のいずれか１項記載の少なくとも１種
   の（糖）蛋白質を有効成分として含むことを特徴とする
   薬剤。 ９、抗体を製造するために請求項５又は６記載の糖蛋白
   質を使用する方法。 １０、抗体を製造するために請求項１〜４のいずれか１
   項記載の蛋白質を使用する方法。