JPH06125784A - モノクローナル抗体，ハイブリドーマ，その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】各種非受容体型チロシンキナーゼを検出、定量
することができるモノクローナル抗体を提供する。 【構成】非受容体型チロシンキナーゼの特異領域に結合
性を示すモノクローナル抗体を作製した。 【効果】本発明のモノクローナル抗体は、非受容体型チ
ロシンキナーゼと特異的に結合し、また結合能も高いの
で、各種非受容体型チロシンキナーゼの検出、測定用試
薬などとして、有利に使用することができる。さらに、
生体臓器、組織、細胞中の非受容体型チロシンキナーゼ
を測定することにより、該蛋白質による細胞内の情報伝
達機構の失調が原因となる疾病、例えば癌の診断に役立
つことが期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非レセプター型チロシ
ンキナーゼの特異領域に結合性を示すモノクローナル抗
体、その製造法および用途に関する。さらに、該モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】生理活性物質が生体を構成している個々
の細胞の増殖や分化そして恒常性の維持などの機能を発
揮するための情報は、細胞膜上に存在する特異的なレセ
プターへそれぞれのレセプターに対応するリガンドが結
合することが最初のシグナルとなって、細胞内へ伝達さ
れる。この伝達系の一つとしてチロシン残基特異的タン
パク質キナーゼ（以下チロシンキナーゼと呼称すること
がある）の関与する反応系が知られている。チロシンキ
ナーゼをコードする遺伝子は、上皮細胞成長因子（Epid
ermal growth factor：ＥＧＦ）レセプター遺伝子に代
表される受容体型とガン遺伝子 src に代表される非受
容体型の２種の遺伝子群に大別される。非レセプター型
チロシンキナーゼ遺伝子群は、 src, yes, lyn, fgr, f
yn, lck, hck, blk などの src 遺伝子群とその他の ab
l遺伝子群, fps/fes遺伝子群に分けられ、 それらの遺伝
子産物はすべてチロシンキナーゼ活性を有している。受
容体型チロシンキナーゼは細胞膜を貫通して存在し、リ
ガンドが細胞膜外部のドメインに結合すると、細胞膜内
部のドメインのチロシンキナーゼ活性が亢進され、細胞
増殖の情報が細胞内に伝達されると解されている。しか
しながら、非受容体型チロシンキナーゼは、細胞膜外部
および膜貫通ドメインは存在せず、細胞内ドメインのみ
で、この部分がミリスチン酸により細胞膜に結合して存
在している。そのために、具体的にどのような情報を伝
達しているのかは不明であった。最近、非受容体型チロ
シンキナーゼであるｐ５６^lckがＴリンパ球上に存在す
るＣＤ４あるいはＣＤ８と［Cell，５５，３０１（198
8）］、またｐ５３^lynおよびｐ５６^lynがＢリンパ球上
に存在するＩgＭと［Science，２５１，１９２（199
1）］複合体を形成することが示され、ＣＤ４／ＣＤ
８，細胞表面ＩgＭを通した情報伝達に非受容体型チロ
シンキナーゼが重要な役割を担っていることが想定され
るに至っている。非受容体型チロシンキナーゼは、その
アミノ末端から特異領域、調節領域、キナーゼ領域およ
び制御領域に分けられる。このうち特異領域は、個々の
産物に固有な配列であることから、それぞれに特有な分
子との相互作用に必要なのであろうと推測されている。
実際ｐ５６^lckはこの領域を介してＣＤ４分子と結合す
るといわれている。

【０００３】

【発明が解決すべき課題】したがって、非受容体型チロ
シンキナーゼの特異領域に結合性を示すモノクローナル
抗体を作製することができれば、各種チロシンキナーゼ
の細胞・組織での発現の分布およびその発現量を知るこ
とができると同時に、各種チロシンキナーゼの役割をさ
らに明確化することが期待される。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、鋭意研究した結果、非受容体型チロシンキナー
ゼまたはその特異領域の部分ペプチドを免疫原として、
該チロシンキナーゼに対して高い結合能を有するモノク
ローナル抗体を作製することに成功した。該モノクロー
ナル抗体は、免疫組織化学的、免疫化学測定法に付す
と、該チロシンキナーゼを感度よく検出・定量でき、ま
た該モノクローナル抗体を用いることにより該チロシン
キナーゼを効率よく精製することができる。これらの知
見に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、 (１)免疫グロブリンクラスがＩgＧに属し、非受容体型
チロシンキナーゼの特異領域に結合性を示すモノクロー
ナル抗体； (２)非受容体型チロシンキナーゼまたはその特異領域の
部分ペプチドで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、同種ま
たは異種のリンパ球様細胞とからなるクローン化された
ハイブリドーマ； (３)非受容体型チロシンキナーゼまたはその特異領域の
部分ペプチドで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、同種ま
たは異種のリンパ球様細胞とを細胞融合し、クローニン
グすることを特徴とする上記（２）記載のハイブリドー
マの製造法； (４)上記（２）記載のハイブリドーマを液体培地中また
は哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクローナル抗体を生
成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記
（１）記載のモノクローナル抗体の製造法； (５)上記（１）記載のモノクローナル抗体を用いること
を特徴とする非受容体型チロシンキナーゼの検出・定量
法 および (６)上記（１）記載のモノクローナル抗体を用いること
を特徴とする非受容体型チロシンキナーゼの精製法であ
る。

【０００５】非受容体型チロシンキナーゼとしては、温
血動物（例、哺乳動物、鳥類）のものであればいずれで
もよく、またそれらの部分ペプチドおよびムテイン(mut
ein）であってもよい。非受容体型チロシンキナーゼ遺
伝子群としては、 src, yes, lyn, fgr, fyn,lck, hck,
blk などの src遺伝子群とその他の abl遺伝子群, fps
/fes遺伝子群に分けられ、 それらの遺伝子産物はすべて
チロシンキナーゼ活性を有している。 その具体例とし
ては、src遺伝子産物（Ｓrcと呼称する場合がある）と
しては トリＳrc［T. Takeyaら、 Cell ３２：８８１（1
983)の図３にアミノ酸配列が示 されている］が，yes遺
伝子産物（Ｙesと呼称する場合がある）としてはヒトＹ
es［J. Sukegawaら、 Mol. Cell. Biol. ７：４１（198
7)の図２にアミノ酸配列が示されている］が、 lyn遺伝
子産物（Ｌynと呼称する場合がある）としてはヒト Ｌy
n［Y. Yamanashiら，Mol. Cell. Biol. ７：２３７(198
7)］が，fgr遺伝子産物（Ｆgrと呼称する場合がある）
としてはヒトＦgr［K. Inoueら，Oncogene １ ：３０１
(1987)］が，fyn遺伝子産物（Ｆynと呼称する場合があ
る）としてはヒ トＦyn［K. Sembaら，Proc. Natl. Aca
d. Sci. ８３：５４５９(1986)］が、lck遺伝子産物
（Ｌckと呼称する場合がある）としてはマウスＬck［J.
D. Marthら、 Cell ４３：３９３（1985)の図６にlsk^T
遺伝子産物としてアミノ酸配列が示さ れている］が，h
ck遺伝子産物（Ｈckと呼称する場合がある）としてはヒ
トＨck ［S. F. Zieglerら、 Mol. Cell. Biol. ７：２
２７６（1987)の図１にアミノ酸 配列が示されている］
が，blk遺伝子産物（Ｂlkと呼称する場合がある）とし
て はマウスＢlk［S. M. Dymeckiら、 Ｓcience ２４
７：３３２（1990)の図１にア ミノ酸配列が示されてい
る］が，それぞれ代表例としてあげられる。非受容体型
チロシンキナーゼを得るには、該チロシンキナーゼのポ
リペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有
する発現型ベクターを作製し、適当な宿主細胞に導入し
て該チロシンキナーゼを産生させればよい。例えば、 ヒ
トＬyn，Ｆgr，Ｆynを得るための発現型ベクターとして
は、(イ)Ｌyn，ＦgrまたはＦynをコードするＲＮＡを分
離し、(ロ)該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、(ハ)該相補ＤＮＡを
プラスミドに組み込み、(ニ)得られた組み換えプラスミ
ドで宿主を形質転換し、(ホ)得られた形質転換体を培養
後、形質転換体から適当な方法、例えばＤＮＡプローブ
を用いたコロニーハイブリダイゼーション法により目的
とするＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、(ヘ)該プ
ラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、
(ト)該クローン化ＤＮＡをビークル中のプロモーターの
下流に連結する、ことにより、それぞれ製造することが
できる。

【０００６】ＬynをコードするＲＮＡは、Ｂリンパ球，
マクロファージ，ＦgrをコードするＲＮＡは、マクロフ
ァージ，顆粒球系白血球，ＦynをコードするＲＮＡは、
Ｔリンパ球，血小板等からそれぞれ得ることができる。
このようにして得られた発現ベクターを、適当な宿主
（例、大腸菌，枯草菌，酵母，動物細胞）に組み込み、
得られた形質転換体を培地に培養することにより、ヒト
のＬyn，Ｆgr，Ｆynを製造することができる。上記ヒト
Ｌyn，Ｆgr，Ｆyn蛋白質としては、それらの一部が変異
されたあるいは欠失されたムテインをも含む。該ムテイ
ンとしては、 特異領域の一部が変異されたあるいは欠失
されたものでもよい。非受容体型チロシンキナーゼの特
異領域としては、ヒトＳrcの場合１番から８４番までの
アミノ酸配列が、ヒトＹesの場合１番から９２番のアミ
ノ酸配列が、ヒトＬynの場合１番から６７番までのアミ
ノ酸配列が、ヒトＦgrの場合１番から７７番までのアミ
ノ酸配列が、ヒトＦynの場合１番から８２番までのアミ
ノ酸配列が、マウスＬckの場合１番から６５番までのア
ミノ酸配列が、ヒトＨckの場合１番から６１番までのア
ミノ酸配列が、マウスＢlkの場合１番から５６番までの
アミノ酸配列の各領域が、それぞれ挙げられる。免疫原
としての非受容体型チロシンキナーゼの特異領域の部分
ペプチドとしては、該非受容体型チロシンキナーゼに特
異的に結合性を示すモノクローナル抗体が取得できるも
のなら、いくつのアミノ酸配列からなるペプチドであっ
てもよいが、１０〜１００個からなるペプチドが好まし
く、望ましくは１０〜２５個からなるペプチドがより好
ましい。本発明で用いられる部分ペプチドは、ペプチド
合成の公知の常套手段で製造し得る。そしてそれは、固
相法，液相法のいずれによってもよい。そのようなペプ
チド合成の方法としては、例えば、“ザ ペプチズ（Th
e Peptides）”，第１巻（1966），Schroder and Lubke
著，Academic Press，New York, U.S.A. や “ペプチド
合成”，泉屋ら著，丸善株式会社（1975）に記載の方法
が挙げられる。また、該部分ペプチドは、適当な酵素に
より非受容体型チロシンキナーゼを切断することによ
り、製造してもよい。該方法としては、例えば、“生化
学実験講座１ タンパク質の化学II”，日本生化学会
編，東京化学同人（1976）の２５５ページから３３２ペ
ージに記載の方法が挙げられる。

【０００７】本発明のモノクローナル抗体を製造するに
は、非受容体型チロシンキナーゼまたはその特異領域の
部分ペプチドを哺乳動物に免疫し、得られた脾臓細胞と
哺乳動物のリンパ球様細胞とを融合させ、次いでクロー
ン化することにより製造される。非受容体型チロシンキ
ナーゼまたはその特異領域のペプチドを免疫するに際し
ては、該ペプチドをキャリヤー蛋白との複合体としてか
ら、これを免疫に用いてもよい。とりわけ免疫原性が弱
いと考えられるペプチドはキャリアー蛋白との複合体で
免疫される方が好ましい。該キャリヤー蛋白としては、
たとえばウシ血清アルブミン，ウシサイログロブリン，
ヘモシアニンなどが挙げられる。キャリヤー蛋白複合体
を用いる場合に、キャリヤー蛋白と非受容体型チロシン
キナーゼまたはその特異領域のペプチドとのカップリン
グ比率は、約０.１〜３０倍（キャリヤー／該ペプチ
ド：重量比）で用いられる。望ましくは約０.５〜５倍
が用いられる。また、ハプテンとキャリヤーとのカップ
リングには、種々の縮合剤を用いることが出来るが、グ
ルタルアルデヒドやカルボジイミド等が好都合に用いら
れる。非受容体型チロシンキナーゼまたは蛋白複合体を
用いて免疫するに際し、免疫する哺乳動物は、羊、山
羊、兎、モルモット、ラット、マウス等の実験動物が使
われるが、モノクローナル抗体を得るためには、ラッ
ト、マウスが好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免
疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下等の
いずれのルートからでも可能であるが、主として皮下、
腹腔内、静脈内に（とりわけ皮下）注入するのが好まし
い。また、免疫間隔，免疫量等も可変度は高く、種々の
方法が可能であるが、たとえば２週間隔で約２〜６回免
疫し、最終免疫後、約１〜５日、好ましくは約２〜４日
後に摘出した脾臓細胞を用いる方法がよく用いられる。
免疫量は１回にペプチド量として、マウス当り約０.１
μｇ以上、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇ用いるこ
とが望ましい。又、脾臓を摘出する前に、部分採血を行
い、血中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓細胞を用
いる融合実験を行うことが望ましい。

【０００８】上記脾臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融
合は例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損
（ＨＧＰＲＴ^-）や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ^-）の
様なマーカーを持った適切な同種または異種（好ましく
は同種）のミエローマ［例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａg・８Ｕ
１（市森他 ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ッド(J. Immunol. Methods) ８０：５５（1985））］
等の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。例えばケ
ーラーおよびミルスタインらの方法［ネイチャー（Natu
re）２５６：４９５（1975）］に準じて融合させること
により製造される。たとえばミエローマ細胞と脾臓細胞
とを約１：５の割合で、たとえばイスコフ培地とハムＦ
−１２培地を１：１に混合した培地（以下ＩＨ培地と称
する）に懸濁させ、センダイウイルス，ポリエチレング
リコール(ＰＥＧ)等の融合剤が用いられる。もちろんジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を
加えることも可能である。融合剤として、 ＰＥＧを用い
る場合、ふつう約１０００〜６０００の重合度のＰＥＧ
を約１０％〜８０％の濃度で約０.５〜３０分処理する
方法が用いられる。好ましい条件の一例として、ＰＥＧ
６０００を約３５〜５５％で約４〜１０分処理するこ
とにより、効率よく融合させることが出来る。融合細胞
は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地
［ＨＡＴ培地；ネイチャー，２５６，４９５（1975）］
等を用いて、選択的に増殖させることが出来る。増殖し
て来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生があるか
否かについてスクリーニングを行うことができるが、抗
体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来る。即
ち、この場合には、まず第１段階として免疫したペプチ
ドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）法またはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）法等の方法で調べることが出来るが、これらの方法
についても種々の変法が可能である。好ましい測定法の
一例として、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べ
る。セルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体を常法に従ってカップリングさ
せておき、これに測定したい培養上清や、マウスの血清
を加え、一定時間、定温（約４〜４０℃を示す。以下に
おいても同様）で反応させる。この後、反応物をよく洗
った後、酵素で標識したペプチド（酵素とペプチドを常
法に従いカップリングさせた後精製）を加え、一定時
間，定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間，定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。

【０００９】選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いた
ペプチドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、
限界希釈法等によりクローニングを行うことが望まし
い。クローン化された細胞の上清について同様にスクリ
ーニングを行い抗体価の高いウエルの細胞を増やすこと
により、免疫したペプチドと反応性を示すモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。このよ
うにしてクローン化されたハイブリドーマを、液体培地
中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地たとえば
ＲＰＭＩ−１６４０［Moore, G. E., et. al. ジャーナ
ル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（J. Am.Med. Assoc.）１９９：５４９（1967）］に約
０.１〜４０％の牛血清を加えた培地等で約２〜１０日
間、好ましくは約３〜５日間培養することにより、培養
液から該モノクローナル抗体を得ることができる。ま
た、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水
を採取することにより抗体を取得することが出来る。こ
のためには、例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を
前もって接種したＢＡＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０
⁴〜１×１０⁷個、好ましくは約５×１０⁵〜２×１０⁶個
のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２０日後、
好ましくは約１０〜１４日後に腹水液を採取する。腹水
に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画，ＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易にモ
ノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離す
ることが出来る。このようにして、非受容体型チロシン
キナーゼに対するモノクローナル抗体が得られる。

【００１０】本発明のモノクローナル抗体は、非受容体
型チロシンキナーゼと特異的に結合し、当該チロシンキ
ナーゼ以外の非受容体型チロシンキナーゼと交差反応を
示さない。本発明のモノクローナル抗体は、非受容体型
チロシンキナーゼに特異的に結合することから、各種非
受容体型チロシンキナーゼ測定用試薬として極めて有用
である。さらに生体臓器、組織，細胞中の非受容体型チ
ロシンキナーゼの測定を容易にすることは、非受容体型
チロシンキナーゼに関する基礎知見（例えば生体内分
布）を得る上からも極めて有用である。生体臓器，組
織，細胞中の非受容体型チロシンキナーゼの検出には通
常酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）などによる定量、あるい
は蛍光抗体法やラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）が
用いられる。特に、ＥＩＡ法が好ましい。またこれらの
臓器，組織，細胞中に存在する非受容体型チロシンキナ
ーゼの大きさを知るにはタンパクのウエスタンブロッテ
ィング法が有効である。この方法は臓器，組織，細胞由
来の粗抽出液あるいはその部分精製試料をアクリルアミ
ド電気泳動した後、メンブランフィルターにトランスフ
ァーし、ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ（hors
eradish peroxidase：ＨＲＰ）結合抗非受容体型チロシ
ンキナーゼ抗体で検出する。

【００１１】さらに該抗体と非受容体型チロシンキナー
ゼとの結合能を利用し、抗体アフィニティーカラムを作
製して非受容体型チロシンキナーゼの精製の試薬として
利用することもできる。非受容体型チロシンキナーゼを
検出，定量するために用いられる抗体分子は、ＩgＧで
もよく、またはそのフラクション｛例、Ｆ(ab′)₂ ，Ｆ
ab′もしくはＦab｝であっても良い。なかでも、標識剤
を直接結合させる抗体分子はＦab′であることが好まし
い。本発明のモノクローナル抗体は、非受容体型チロシ
ンキナーゼの免疫化学的測定法における試薬として用い
ることができる。非受容体型チロシンキナーゼの免疫化
学的測定法によって、生体組織や体液中の非受容体型チ
ロシンキナーゼの量を測定することができる。したがっ
て、たとえば種々の組織や体液中の非受容体型チロシン
キナーゼを測定することにより、細胞の増殖、 分化情報
伝達機構の異常が原因になる疾病、たとえば癌の診断に
役立つことが期待される。上記免疫学的測定法におい
て、二種の抗体を用いる測定法を行うに際しては、一方
の抗体として本発明のモノクローナル抗体を用い、他方
の抗体として、本発明のモノクローナル抗体またはポリ
クローナル抗体を用いることができる。

【００１２】非受容体型チロシンキナーゼの測定方法に
おいて用いられる担体上に保持された抗体における担体
としては、例えば、ゲル粒子（例、アガロースゲル
［例、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ（ファルマ
シア・ファインケミカル社（スエーデン）製）］、デキ
ストランゲル［例、セファデックスＧ−７５、セファデ
ックスＧ−１００、セファデックスＧ−２００（ファル
マシア・ファインケミカル社（スエーデン）製）］、ポ
リアクリルアミドゲル［例、バイオゲルＰ−３０、バイ
オゲルＰ−６０、バイオゲルＰ−１００（バイオラッド
・ラボラトリーズ社（米国）製）］、セルロース粒子
［例、アビセル（旭化成製）、イオン交換セルロース
（例、ジエチルアミノエチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロース）］、物理的吸着剤［例、ガラス（例、
ガラス球、ガラスロッド、アミノアルキルガラス球、ア
ミノアルキルガラスロッド）、シリコン片、スチレン系
樹脂（例、ポリスチレン球、ポリスチレン粒子）、イム
ノアッセイ用プレート（例、ヌンク社（デンマーク）
製）、イオン交換樹脂｛例、弱酸性陽イオン交換樹脂
［例、アンバーライトＩＲＣ−５０（ローム・アンド・
ハース社（米国）製）、ゼオカーブ２２６（パームチッ
ト社（西ドイツ）製）］、弱塩基性陰イオン交換樹脂
［例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダウエックス３（ダ
ウケミカル社（米国）製）］｝などが挙げられる。

【００１３】担体に抗体を保持させるには、公知の常套
手段を応用し得るが、例えば、“代謝”、第８巻（1971
年）、第６９６頁に記載されているブロムシアン法、グ
ルタールアルデヒド法などが挙げられる。また、より簡
便な方法として物理的に担体表面に吸着させてもよい。
標識剤を結合させた抗体における標識剤としては、放射
性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられ
るが、酵素を用いるのが好ましい。酵素としては、安定
で非活性の大きなものが好ましく、ペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ等を用いることができるが、ペ
ルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダーゼとして
は、種々の起源のものを用いることができるが、その例
としてはたとえば西洋わさび、パイナップル、イチジ
ク、甘藷、ソラマメ、トウモロコシなどから得られるペ
ルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさびから抽出さ
れたホースラディッシュ ペルオキシダーゼ（horserad
ish peroxidase）（ＨＲＰ）が好ましい。ペルオキシダ
ーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子としてのＦa
b′のチオール基を利用するために、あらかじめペルオ
キシダーゼにマレイミド基を導入したものを用いると好
都合である。

【００１４】マレイミド基をペルオキシダーゼに導入す
る方法としては、ペルオキシダーゼのアミノ基を介して
マレイミド基を導入することができる。そのためには、
Ｎ−サクシニミジル−マレイミド−カルボキシレート誘
導体を用いることができ、好ましくは、Ｎ−（γ−マレ
イミドブチルオキシ）サクシイミド（ＧＭＢＳと略称す
ることもある）などが良い。従って、マレイミド基とペ
ルオキシダーゼとの間に一定の基が入っていることとな
ってもよい。ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させる
には、両者をｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ない
し５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させるこ
とによって行われる。該緩衝液としては、たとえば、ｐ
Ｈ７.０の０.１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。この
ようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に用い
られる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２５
［ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデン）
製］、バイオゲルＰ−２［バイオラッド・ラボラトリー
ズ社（米国）製］などが挙げられる。マレイミド化ペル
オキシダーゼと抗体分子との反応は、両者を緩衝液中で
約０℃ないし４０℃の温度で、約１ないし４８時間反応
させることにより行うことができる。該緩衝液として
は、たとえば、ｐＨ６.０の５mＭエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム塩を含む０.１Ｍリン酸緩衝液などが挙げ
られる。このようにして得られたペルオキシダーゼ標識
抗体は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精
製することができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う
際に用いられる担体としては、例えば、セファデックス
Ｇ−２５［ファルマシア・ファインケミカル社（スエー
デン）製］、バイオゲルＰ−２［バイオラッド・ラボラ
トリーズ社（米国）製］などが挙げられる。さらに、ペ
ルオキシダーゼにチオール基を導入し、マレイミド化さ
れた抗体分子と反応させても良い。ペルオキシダーゼ以
外の酵素を抗体に直接結合させるには、ペルオキシダー
ゼの場合に準じて行なうことができ、また、自体公知の
グルタルアルデヒド法，過ヨウ素酸法，水溶性カルボジ
イミド法などが用いられる。

【００１５】本発明の測定系における被検試料として
は、尿、血清、血漿、髄液等の体液、あるいは、動物細
胞や菌体の抽出液またはその培養上清が挙げられる。本
発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキシダーゼ
の場合について以下に具体的に説明するが、ペルオキシ
ダーゼに限定されるものではない。 まず、：担体に保持された抗体に、測定すべき非受容
体型チロシンキナーゼ含有の分析対象物を加えて抗原抗
体反応を行った後、これに前記で得られたペルオキシダ
ーゼと抗非受容体型チロシンキナーゼ抗体との結合物を
加えて反応させる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作を既知量の非受容体型チロシンキ
ナーゼの標準溶液に対してあらかじめ行い、非受容体型
チロシンキナーゼ量と吸光度もしくは蛍光強度との関係
を標準曲線として作成しておく。 ：未知量の非受容体型チロシンキナーゼを含む分析対
象物（被検試料）について得られた吸光度もしくは蛍光
強度を標準曲線にあてはめ、分析対象物中の非受容体型
チロシンキナーゼの量を測定する。

【００１６】非受容体型チロシンキナーゼまたはその特
異領域の部分ペプチドとキャリヤー用蛋白との複合体を
免疫原として得られた抗体を用いて非受容体型チロシン
キナーゼを精製することができる。これには、該抗体を
用いてアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行な
うことにより行なうことができる。該アフィニティーカ
ラムクロマトグラフィーは、たとえば、該抗体を適切な
担体にカップリングさせ、これをカラムに充填し、非受
容体型チロシンキナーゼを含む溶液をカラムに通し吸着
させ、次いで溶出させることにより行なうことができ
る。該担体としては、たとえば、先に記載された担体と
同様のものが挙げられる。とりわけゲル粒子や各種合成
樹脂が好都合に用いられる。たとえばＣＮＢr−activat
ed Sepharose ４Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル
社製），アフィゲル−１０，アフィゲル−１５（バイオ
ラッド・ラボラトリーズ社製）などが挙げられる。抗体
を担体にカップリングさせるには、公知の常套手段を応
用し得るが、たとえば“代謝”，第８巻（1971年），第
６９６頁に記載されているブロムシアン法，グルタール
アルデヒド法が挙げられる。また、水溶性カルボジイミ
ドを用いる方法、活性エステル法なども用いることがで
きるが、より簡便な方法として物理的に担体表面に吸着
させてもよい。

【００１７】このようにして得られた抗体カラムを用い
て精製を行なうには、抗体を結合させた担体を充填した
抗体カラムに中性付近の緩衝液中の非受容体型チロシン
キナーゼを吸着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄
したのち、特異的に吸着された非受容体型チロシンキナ
ーゼを溶出させる。特異的に吸着された非受容体型チロ
シンキナーゼを溶出するには、たとえば、低ｐＨもしく
は高ｐＨの緩衝液，高濃度の塩を含有する緩衝液を用い
て行なわれる。該低ｐＨの緩衝液としては、たとえばｐ
Ｈ２.３の０.１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液，ｐＨ１.８
の０.１Ｍ第二クエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液などが
挙げられる。該高ｐＨの緩衝液としては、たとえばｐＨ
１１のアンモニア水，ｐＨ１１.７の０.２Ｍホウ酸ナト
リウム緩衝液などが挙げられる。該高濃度の塩を含有す
る緩衝液としては、たとえば６Ｍグアニジン塩酸溶液，
７Ｍ尿素溶液などが挙げられる。上記の溶出は、バッチ
法でもよく、またカラムを用いる方法でもよい。

【００１８】抗原の溶出液はたとえば透析して精製す
る。たとえば低ｐＨの緩衝液で溶出した時は、たとえば
０.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０.５），高ｐＨ
の緩衝液で溶出した時は、たとえば０.１Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐＨ３.０）で中性化したのち、たとえば
０.１％ＮaＮ₃を含む０.０２Ｍリン酸食塩緩衝液（ｐＨ
８.０）に対して透析する。また高濃度の塩を含有する
緩衝液で溶出した抗原液は直接に上記のリン酸食塩緩衝
液に透析して保存することもできる。また、上記溶出液
または透析液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥標品とし
て保存することもできる。このようにして精製された非
受容体型チロシンキナーゼは、極めて高単位のものであ
り、たとえばＸ線解析により該蛋白質の構造の解明に利
用されるであろうし、またこれら蛋白とinteract する
物質が明らかにされることにより、シグナルの伝達シス
テムの解析にも役立つものと考えられる。

【００１９】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclatureによる略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性
体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示す
ものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 cＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 dＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 Ｔdr ：チミジン ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇ，Ｇly ：グリシン Ａ，Ａla ：アラニン Ｖ，Ｖal ：バリン Ｌ，Ｌeu ：ロイシン Ｉ，Ｉle ：イソロイシン Ｓ，Ｓer ：セリン Ｔ，Ｔhr ：スレオニン Ｃ，Ｃys ：システイン Ｍ，Ｍet ：メチオニン Ｅ，Ｇlu ：グルタミン酸 Ｄ，Ａsp ：アスパラギン酸 Ｋ，Ｌys ：リジン Ｒ，Ａrg ：アルギニン Ｈ，Ｈis ：ヒスチジン Ｆ，Ｐhe ：フェニールアラニン Ｙ，Ｔyr ：チロシン Ｗ，Ｔrp ：トリプトファン Ｐ，Ｐro ：プロリン Ｎ，Ａsn ：アスパラギン Ｑ，Ｇln ：グルタミン Ｃlz ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂrz ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂzl ：ベンジル Ｂoc ：ｔ−ブトキシカルボニル 後述の実施例１で得られたハイブリドーマＬＹ８、ＬＹ
９および実施例２で得られたハイブリドーマＦＧＡ−１
２は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）および通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にそれぞれ
寄託されている。受託日および受託番号を次の〔表１〕
に示す。

【表１】 ハイブリドーマ ＩＦＯ ＦＲＩ ＬＹ８ IFO 50346 FERM BP-3711 (1991年8月7日) (1992年1月17日) ＬＹ９ IFO 50347 FERM BP-3712 (1991年8月7日) (1992年1月17日) ＦＧＡ−１２ IFO 50348 FERM BP-3713 (1991年8月12日) (1992年1月17日)

【００２０】

【実施例】以下に実施例をもって、本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらによってなんら限定され
るものではない。 実施例１ （１）Ｌyn−β−gal 融合タンパクの発現：Ｌynタンパ
ク質(アミノ酸配列は Mol. Cell. Biol, ７，２３７−
２４３（1987) の図２に示されている)のＡrg２５から
Ａla１１９までの９５アミノ酸残基をコードするcＤＮ
Ａ断片（２８５bp）をpＩＣ−IIIベクターのＳmaＩ部位
に組み込み、pＩＣ−ＬＹＮを構築した［Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. ８６，６５３８−６５４２（198
9）］。pＩＣ−ＬＹＮを大腸菌ＵＴ４８１株に導入し、
対数増殖期に培地（Ｌ−ブロース）中に１００mＭ Ｉ
ＰＴＧ（isopropyl−β−Ｄ−galactopyranoside）を１
／５０容加え、１２時間培養しＬynタンパク質とβ−ガ
ラクトシダーゼ（Ｌyn−β−gal）の融合タンパク質を
生産させた。 （２）Ｌyn−β−gal 融合タンパクの精製：Ｌyn−β−
gal 融合タンパクの精製はアルマンの方法［ジーン（Ge
ne）２９，２７−３１（1984）］に準じて行った。２リ
ットル培養から集めた大腸菌ＵＴ４８１／pＩＣ−ＬＹ
Ｎの菌体１１.４５ｇを４６mlの氷冷１０mＭ ＭgＣl₂を
含む２０mＭ Ｔris-ＨＣl（ｐＨ７.４）に懸濁し、氷冷
下に超音波処理を行い遠心した。その上清にＮaＣlおよ
びジチオスレイトール（ＤＴＴ）をそれぞれ１.６Ｍ，
１０mＭとなるように添加し、１０mＭ ＭgＣl₂，１.６
Ｍ ＮaＣl，１０mＭ ＤＴＴを含む２０mＭ Ｔris-ＨＣl
（ｐＨ７.４）で平衡化したｐ−aminophenyl β−Ｄ−t
hiogalactopyranoside-agarose（ＴＰＥＧ−agarose）
カラム（シグマ社製）（径１.０cm×１５.３cm）にかけ
た。平衡化に用いたバッファーでカラムを洗浄した後、
１０mＭ ２−メルカプトエタノールを含む１００mＭホ
ウ酸ナトリウ ム（ｐＨ１０.０）を流速３０ml／hr で
流し、５ml毎に分画した。溶出された画分３７mlを２リ
ットルの１mＭ ＭgＣl₂，０.１mＭ エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ），１mＭ ＤＴＴを含む４０mＭ Ｔris-
ＨＣl（ｐＨ７.５）に対して一晩透析した。ＰＭ１０メ
ンブラン（ダイヤフロー・アミコン社製）で７.４mlに
ま で濃縮した後、透析バッファーと同じ溶液で平衡化
したセファクリル−Ｓ−２００ＨＲカラム（ファルマシ
ア社製）（径２.６cm×６８cm）にてゲルろ過を行い、
Ｌyn−β−gal 融合タンパク６.５mgを得た。

【００２１】（３）免疫：ＢＡＬＢ／cマウス（♀８週
令）に対し生理食塩水０.２mlに溶解させた１４０μgの
抗原Ｌyn−β−gal 融合タンパク（（２）で得られたも
の）と同量のフロインド完全アジュバント（Difco社
製）を混合して皮下に注射した。２週間後に同量の抗原
と０.２mlのフロインド不完全アジュバントの混合物を
皮下に再投与した。さらに２週間後に同様の追加免疫を
行い、その１０日後に生理食塩水に溶かした２００μg
のＬyn−β−gal 融合タンパクを静脈内に接種した。 （４）細胞融合：上記（３）で得られた免疫マウスよ
り、抗原最終投与の３日後脾臓を摘出し、細胞融合に用
いる細胞を得た。この細胞は、イスコフ培地とハムＦ−
１２培地を１：１の比率に混合した培地（以下ＩＨ培地
と略す）に懸濁した。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６
３−Ａg・８Ｕ１は１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ
１６４０培地で５％炭酸ガス，９５％空気の条件で継
代培養した。細胞融合は、ケーラーおよびミルスタイン
らが確立した方法［ケーラー，Ｇ.およびミルスタイ
ン，Ｃ.；ネイチャー（Nature）２５６：４９５（197
5）］に準じて行った。上記ミエローマ細胞４.０×１０
⁷個と上述した方法で得られた免疫されたリンパ球２.０
×１０⁸個を混合、遠沈し、０.５mlのＩＨ培地に溶解し
た４５％ポリエチレングリコール６０００（以下ＰＥ
Ｇ６０００と称することがある）を滴下した。ＰＥＧ６
０００溶液は、予め３７℃に温め、ゆっくりと滴下し
た。７分後３７℃に予温したＩＨ培地を１分間に０.５m
lずつ加え１０mlとし た後、室温で７００ｒｐｍ１５分
間遠心し上清を除去した。この細胞沈殿物を２０％ウシ
胎児血清を含むＩＨ培地１３０mlに懸濁し、９６ウエル
マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μlずつ植え
つけた。１日後、ヒポキサンチン１×１ ０^-4Ｍ，アミ
ノプテリン４×１０^-7Ｍ，チミジン１.６×１０^-5Ｍを
含んだ２０ ％ウシ胎児血清含有ＩＨ培地（以下ＨＡＴ
培地と称することがある）を各ウエルに１００μlずつ
添加し、さらに３日おきに、培地の１／２量をＨＡＴ培
地と交 換した。このようにして生育した細胞は雑種細
胞である。

【００２２】（５）抗体産生細胞の検索：上記（２）で
精製されたＬyn−β−gal 融合タンパクあるいはβ−ガ
ラクトシダーゼを２.５μg／mlになるよう０.０１Ｍ炭
酸緩衝液（ｐＨ８.５）で希釈し、その１００μlを９６
ウエルイムノプレート（ヌンク社製）の各ウエルに入れ
４℃で一夜放置し、固相にＬyn−β−gal 融合タンパク
あるいはβ−ガラクトシダーゼを結合させた。０.１５
Ｍ ＮaＣlを含有する０.０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.
０）で洗浄した後、余剰の結合部位をふさぐため、１％
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０.０１Ｍリ
ン酸緩衝液を２００μlずつウエルに注入して、使用時
まで冷所に保存した。以上のようにして得られたＬyn−
β−gal 融合タンパクあるいはβ−ガラクトシダーゼを
結合した９６ウエルイムノプレートのそれぞれに雑種細
胞培養上清を１００μlずつ加え室温で２時間インキュ
ベートした。培養上清を除去、洗浄後２次抗体として西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス
ＩgＧ抗体（カッペル社製）を加え室温で２時間インキ
ュベートした。２次抗体を除去し、よくウエルを洗浄し
た後、ペルオキシダーゼ基質溶液（０.０２％Ｈ₂Ｏ₂と
０.１５％ｏ−フェニレンジアミンを含むｐＨ５.５のク
エン酸ナトリウム緩衝液）を１００μl加え、２５℃で
１０分間反応させ、２Ｎ−硫酸１００μlを加えること
により酵素反応を停止した後、マイクロプレート用自動
比色計（ＭＴＰ−３２，コロナ社製）を用い、４９２nm
における吸光度を測定した（ＥＬＩＳＡ法）。この方法
により、β−ガラクトシダーゼに結合性を示さずＬyn−
β−gal 融合タンパクと特異的に反応する抗体の存在が
７ウエルに認められた。 （６）雑種細胞のクローニング：これらのウエル中の細
胞を、１ウエルあたり０.５個となるように、予め６×
１０⁵個／ウエルのマウス胸腺細胞をフィーダー細胞と
してまいておいた９６ウエルマイクロプレートにまき、
クローニングを行った。その結果、それぞれのウエルか
ら代表的なクローン細胞各１種を得、合計７種のクロー
ン細胞、すなわち、ＬＹ１，ＬＹ３，ＬＹ４，ＬＹ６，
ＬＹ７，ＬＹ８（ＩＦＯ ５０３４６、 ＦＥＲＭ ＢＰ
−３７１１），ＬＹ９（ＩＦＯ ５０３４７、ＦＥＲＭ
ＢＰ−３７１２）を得た。

【００２３】（７）抗体の製造：上記（６）においてク
ローニングによって得られたハイブリドーマクローンＬ
Ｙ３，ＬＹ６，ＬＹ８，ＬＹ９のそれぞれをあらかじめ
０.５mlのミネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢ
ＡＬＢ／cマウスの腹腔内に１匹あたり１×１０⁶個接種
することにより腹水化を行った。ハイブリドーマを腹腔
に投与して１０日後、腹水を採取した。得られたそれぞ
れの腹水約１０mlから、ステーリンら［ジャーナル オ
ブ バイオロジカルケミストリー，２５６：９７５０−
９７５４（1981）］の方法に準じてモノクローナル抗体
を精製した。まず腹水からフイブリン様物質を除去する
ため１０,０００ｒｐｍ１５分間遠心した後、リン酸緩
衝液−食塩水（ＰＢＳ：８.１mＭ−Ｎa₂ＨＰＯ₄，１.５
mＭ ＫＨ₂ＰＯ₄，２７mＭ ＫＣl，１３７mＭ ＮaＣl，
ｐＨ７.２）で２８０nmの紫外部吸収（Ａ₂₈₀）が１２〜
１４の値を示す濃度に希釈した。希釈後サンプルに飽和
硫酸アンモニウム溶液を４７％の濃度になるように加
え、４℃で撹拌しながら６０分間塩析を行ない、その後
遠心（１０,０００ｒｐｍ，１５分間）を行なって沈殿
物を得た。沈殿物を５０mＭ ＮaＣl含有２０mＭトリス
緩衝溶液（ｐＨ７.９）に溶融し、同溶液２リットルに
対して透析を行なった。２時間後、２リットルの新しい
同じ透析液に換え、さらに１５時間透析を行なった。透
析後、沈殿を除去するため１０,０００ｒｐｍ１５分間
遠心を行ない、上清をＡ₂₈₀の値が２０〜３０の濃度に
なるように調整した。このサンプルを充分量の５０mＭ-
ＮaＣl含有トリス緩衝溶液で平衡化した２０mlのＤＥＡ
Ｅセルロースカラム（ワットマンＤＥ₅₂）にかけ、５０
mＭ ＮaＣl含有トリス緩衝溶液でよく洗った後、５０m
Ｍ−５００mＭ ＮaＣlを含む同緩衝液の濃度勾配塩溶液
を用いて１.５ml／分の流出速度で分画を行なって素通
り分画を濃縮し、それぞれの精製モノクローナル抗体Ｍ
ＡｂＬＹ３，ＭＡｂＬＹ６，ＭＡｂＬＹ８およびＭＡｂ
ＬＹ９を得た。抗体の純度の確認にはラエムリらの方法
［ネイチャー，２２７，６８０−６８５（1970）］に準
じてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い
た。すなわち、硫安塩析し、ＤＥＡＥセルロースカラム
で素通りした分画を、２−メルカプトエタノールで還元
し、アクリルアミド濃度１０％のゲルを用いて１８０ボ
ルトで２.５時間泳動を行なった。その結果、いずれの
モノクローナル抗体も５２ｋＤａ前後にＨ鎖，２８ｋＤ
ａ前後にＬ鎖の２つのバンドが認められた。 （８）抗体のサブクラスの測定：抗体のサブクラスは次
の方法で測定した。即ち上記（２）で得られたＬyn−β
−gal 融合タンパクをコートした９６ウエルイムノプレ
ートにクローン化されたそれぞれのハイブリドーマ培養
上清を１００μl入れ室温で２時間インキュベートし
た。培養上清を除去，洗浄後ウサギ抗マウスＩgＧ１，
ＩgＧ２ａ，ＩgＧ２ｂ，ＩgＧ３，κ鎖，λ鎖に対する
抗体（カッペル社製）をそれぞれ１００μl入れ室温で
２時間インキュベートした。それぞれの抗体を除去，洗
浄後ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩgＧ抗体（カッペル社
製）を加え室温で２時間インキュベートした。標識抗体
を除去し、よく洗浄した後、上記（５）記載の方法で酵
素反応を行ない吸光度を測定した。その結果、ＭＡｂＬ
Ｙ３およびＭＡｂＬＹ６はＩgＧ１κ型，ＭＡｂＬＹ７
およびＭＡｂＬＹ９はＩgＧ２ａκ型，ＭＡｂＬＹ１お
よびＭＡｂＬＹ８はＩgＧ２ｂκ型のサブクラスである
ことが判明した。

【００２４】（９）抗体の抗原結合性の検討 抗体がＬyn蛋白質を認識するかどうかは、免疫沈降／キ
ナーゼアッセイ法またはウェスタンブロット法を用い
た。ヒトＢ細胞株Daudi細胞またはマウスＢ細胞株ＷＥ
ＨＩ−２３１細胞１×１０⁷個に１mlの細胞融解バッフ
アー（１％ディジトニン，１０mＭトリエタノールアミ
ン，１５０mＭ ＮaＣl，１０mＭヨードアセトアミド，
１mＭ ＥＤＴＡ，アプロチニン１０μg／ml，ｐＨ７.
８）を加え、 ３０分間０℃で処理した。１５,０００rpm
２０分間４℃で遠心し上清を採取した。得られた上清
にそれぞれの抗体を加え４℃１時間反応させた。反応終
了後プロテインＧセファロースを加え、４℃で１時間振
とうした。反応物を細胞融解バッフアーでよく洗い、サ
ンプルバッフアー（２０％グリセロール，１０％２ＭＥ
(メ ルカプトエタノール），６％ＳＤＳ，１３０mＭ Ｔ
ris ｐＨ６.８ ＢＰＢ(ブロモフェノールブルー）〜２
mg）に懸濁し、免疫沈降／キナーゼアッセイ法に供し
た。またウェスタンブロット法のために上記２種の細胞
のそれぞれ１×１０⁷個 を１mlの細胞融解バッフアーで
処理し、５分間煮沸後１０％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行なった。泳動後、メンブランにトランスファ
ーし，各種の抗Ｌyn抗体で処理を行ない、アルカリフォ
スファターゼ標識抗体で、抗Ｌyn抗体のＬyn蛋白への結
合性を検討した。結果は〔表２〕に示したように、ＭＡ
ｂＬＹ３，ＭＡｂＬＹ６，ＭＡｂＬＹ８，ＭＡｂＬＹ９
がＬyn蛋白質に結合性を示すことが判明した。

【表２】抗Ｌynモノクロナール抗体のＬyn蛋白への結合
性 ─────────────────────────────────── モノクローナル抗体 ───────────────── 細胞株 測定法 ＬＹ３ ＬＹ６ ＬＹ８ ＬＹ９ ─────────────────────────────────── ヒトB細胞株 免疫沈降/キナーゼ法 ＋ ＋ ＋ ＋ Daudi ウェスタンブロット法 ＋ マウスB細胞株 免疫沈降/キナーゼ法 ＋ WEHI-231 ウェスタンブロット法 ± ─────────────────────────────────── ＋は反応性を示す。

【００２５】実施例２ （１）Ｈ−Ｃys−Ａla−Ｈis−Ｉle−Ｐro−Ａsn−Ｔyr
−Ｓer−Ａsn−Ｐhe−Ｓer−Ｓer−Ｇln−Ａla−Ｉle−
Ａsn−Ｐro−Ｇly−Ｐhe−Ｌeu−Ａsp−ＯＨ（Ｃys−Ｆ
gr［４８−６７］ペプチド）の製造 Ｆgr蛋白質(アミノ酸配列の１番から１４３番までが、O
ncogene １，３０１−３０４（1987) の図２に示されて
いる)のＡla４８からＡsp６７に対応するペプチド（以
下Ｆgr［４８−６７］と呼称することがある）に、リン
カーとしてＮ末端部にＣysを付加したペプチドの合成
は、自動ペプチド合成機４３０Ａ（アプライドバイオシ
ステム社製）を用いた固相合成法にて行なった。プログ
ラムは「スタンダード１」を用いた。基本的な合成過程
等は、メリーフィールド アールビー（Merrifield，
Ｒ．Ｂ．； アドバンス オブ エンザイモロジー（Ad
v.Enzymol.）３２：２２１−２９６（1969）の方法に準
じている。レジン（固相）にはＢoc−Ａsp（ＯＢzl）−
ＰＡＭ−Ｐ（フェニルアセトアミドメチル ポリマー）
（０.５mmol，レジン７００mgに相当）を用い、カルボ
キシル末端から以下のアミノ酸を順次合成した。Ｂoc−
アミノ酸として、Ｂoc−Ｌeu−ＯＨ，Ｂoc−Ｐhe−Ｏ
Ｈ，Ｂoc−Ｇly−ＯＨ，Ｂoc−Ｐro−ＯＨ，Ｂoc−Ａsn
−ＯＨ，Ｂoc−Ｉle−ＯＨ，Ｂoc−Ａla−ＯＨ，Ｂoc−
Ｇln（ＯＢzl）−ＯＨ，Ｂoc−Ｓer（Ｂzl）−ＯＨ，Ｂ
oc−Ｓer（Ｂzl）−ＯＨ，Ｂoc−Ｐhe−ＯＨ，Ｂoc−Ａ
sn−ＯＨ，Ｂoc−Ｓer（Ｂzl）−ＯＨ，Ｂoc−Ｔyr（Ｂ
rz）−ＯＨ，Ｂoc−Ａsn−ＯＨ，Ｂoc−Ｐro−ＯＨ，Ｂ
oc−Ｉle−ＯＨ，Ｂoc−Ｈis（Ｔos）−ＯＨ，Ｂoc−Ａ
la-OH,Boc−Ｃys（ＭeＢzl）−ＯＨを用いた。アミノ末
端Ｃysまで合成したのちペプチドレジンを合成機から取
り出し、乾燥した。 ペプチドレジン１ｇに１.５mlの
ｐ−クレゾールおよび０.５mlの１,２−エタンジチオー
ルを加え、さらに約８mlの液体フッ化水素を加えて０℃
で２時間反応させた。反応終了後、デシケーター中でフ
ッ化水素を減圧除去し、０.１％の２−メルカプトエタ
ノールを含むジエチルエーテルで、続いてジエチルエー
テルで洗い、大部分の混在試薬を除去した。ペプチドを
１０mlの３％酢酸で抽出し、ろ過により抽出液中に混入
しているレジンを除いた。ろ液をセファデックス（Seph
adex）Ｇ−２５を用いるゲルろ過により精製した。ゲル
ろ過条件は、カラムサイズφ３×７０cm；検出波長２３
０nm；溶媒３％酢酸；流速３０ml／hrであった。ペプチ
ドを含むフラクションを集めて凍結乾燥し、得られた粉
末標品について逆相高速液体クロマトグラフィーにより
さらに精製した［カラム：ＹＭＣ−パック，Ｄ−ＯＤＳ
−７ φ２０×２５０mm（ＹＭＣ社製）、カラム温度：
２５℃、溶出条件：溶出溶媒Ａ ０.１％トリフルオロ酢
酸−９９.９％蒸留水；溶出溶媒Ｂ ０.１％トリフルオ
ロ酢酸−９９.９％アセトニトリル；溶出プログラム０
分（７５％Ａ＋２５％Ｂ），２分（７５％Ａ＋２５％
Ｂ），３２分（４５％Ａ＋５５％Ｂ）；流出速度５ml／
min，検出波長２３０nm］。本条件下で保持時間約２３
分に溶出された主ピーク画分を集めてバイオラッドＡＧ
１×８（ＡcＯＨ型１.８×５cm）のカラムに通し、洗液
も集め、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥し、白
色粉末４６mgを得た。得られたペプチドは、上記と同様
の条件における高速液体クロマトグラフィーによる分析
で、保持時間２３分に鋭い単一ピークを与えた。エルマ
ン ジー エル（Elman, G. L.）法［アーキテクチュア
ル バイオケミストリー アンド バイオフィジクス
（Arch. Biochem. Biophys.）８ ２，７０−７７（195
9）］によって遊離のＳＨ基を定量を行ったところ、８
０％であった。 また、アミノ酸分析の結果は次のよう
であった。 Ａsp 3.95(4); Ｓer 2.72(3); Ｇln 1.04(1); Ｐro 1.7
9(2);Ｇly 1.00(1); Ａla 1.92(2); Ｃys 0.93(1); Ｉl
e 1.86(2);Leu 1.00(1); Ｔyr 0.94(1); Ｐhe 2.01(2);
Ｈis 0.83(1).

【００２６】（２）免疫原の作製 Ｃys−Ｆgr［48-67］ペプチド２.０mgおよび牛サイログ
ロブリン（bovine thyroglobulin：ＢＴＧと略称する）
４.０mgを０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）２mlに溶
解し、１％グルタールアルデヒド水溶液を０.５ml加え
て氷冷下で３０分間撹拌後、室温で３時間撹拌を行なっ
た。撹拌終了後、２リットルのリン酸生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）に対し２度透析し、Ｃys−Ｆgr［48-67］−ＢＴＧ
conjugate を得た。 （３）免疫 ＢＡＬＢ／cマウス（♀８週令）に対しＰＢＳ ０.２ml
に溶解させたＣys−Ｆgr［48-67］−ＢＴＧ conjugate
１５０μgと同量のフロインド完全アジュバント（Difco
社製）を混合して皮下に注射した。２週間後に同量の抗
原と０.２mlのフロインド不完全アジュバントの混合物
を皮下に再投与した。さらに２週間毎に同様の追加免疫
を４度行い、その２週間後にＰＢＳに溶かした２８２μ
gのＣys−Ｆgr［48-67］−ＢＴＧ conjugate を静脈内
に接種した。 （４）細胞融合 上記（３）で得られた免疫マウスより、抗原最終投与の
３日後脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。こ
の細胞は、イスコフ培地とハムＦ−１２培地を１：１の
比率で混合した培地（以下ＩＨ培地と略す）に懸濁し
た。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａg・８Ｕ１
は１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地で
５％炭酸ガス，９５％空気の条件で継代培養した。細胞
融合は、ケーラーおよびミルスタインらが確立した方法
［ケーラー，Ｇ.およびミルスタイン，Ｃ.；ネイチャー
（Nature）２５６，４９５（1975）］に準じて行った。
上記ミエローマ細胞４.３×１０⁷個と上述した方法で得
られた免疫されたリンパ球２.０×１０⁸個を混合、遠沈
し、０.４mlのＩＨ培地に溶解し た４５％ポリエチレン
グリコール６０００（以下ＰＥＧ６０００と称する場合
ある）を滴下した。ＰＥＧ６０００溶液は、予め３７℃
に温め、ゆっくりと滴下した。７分後３７℃に予温した
ＩＨ培地を１分間に０.５mlずつ加え１０mlとした
後、室温で７００ｒｐｍ１５分間遠心し上清を除去し
た。この細胞沈殿物を２０％ウシ胎児血清を含むＩＨ培
地１００mlに懸濁し、９６ウエルマイクロプレート（ヌ
ンク社製）に１００μlずつ植えつけた。１日後、ヒポ
キサンチン１×１０^-4Ｍ，アミノプテリン４×１０
^-7Ｍ，チミジン１.６×１０^-5Ｍを含んだ２０％ウシ胎
児血清含有ＩＨ培地（以下ＨＡＴ培地と称する）を各ウ
エルに１００μlず つ添加し、さらに３日おきに培地の
１／２量をＨＡＴ培地と交換した。このようにして生育
した細胞は雑種細胞である。

【００２７】（５）抗体産生細胞の検索 Ｃys−Ｆgr［48-67］ペプチドを２.５μg／mlになるよ
うに０.０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８.５）で希釈し、その
１００μlを９６ウエルイムノプレート（ヌンク社製）
の各ウエルに入れ４℃で一夜放置し、固相にＣys−Ｆgr
［48-67］ペプチドを結合させた。０.１５Ｍ ＮaＣlを
含有する０.０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で洗浄し
た後、余剰の結合部位をふさぐため、１％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含有する０.０１Ｍリン酸緩衝液を
２００μlずつウエルに注入して、使用時まで冷所に保
存した。以上のようにして得られたＣys−Ｆgr［48-6
7］ペプチドを結合した９６ウエルイムノプレートに、
雑種細胞培養上清を１００μlずつ加え室温で２時間イ
ンキュベートした。培養上清を除去、洗浄後２次抗体と
して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗
マウスＩgＧ抗体（カッペル社製）を加え室温で２時間
インキュベートした。２次抗体を除去し、よくウエルを
洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液（０.０２％Ｈ₂
Ｏ₂と０.１５％ｏ−フェニレンジアミンを含むｐＨ５.
５のクエン酸ナトリウム緩衝液）を１００μl加え、２
５℃で１０分間反応させ、２Ｎ−硫酸１００μlを加え
ることにより酵素反応を停止した後、マイクロプレート
用自動比色計（ＭＴＰ−３２，コロナ社製）を用い、４
９２nmにおける吸光度を測定した（ＥＬＩＳＡ法）。こ
の方法により４ウエルに結合抗体の存在が観察された。 （６）雑種細胞のクローニング：これらのウエル中の細
胞を、１ウエルあたり０.５個となるように、予め５×
１０⁵個／ウエルのマウス胸腺細胞をフィーダー細胞と
してまいておいた９６ウエルマイクロプレートにまき、
クローニングを行った。その結果、それぞれのウエルか
ら代表的なクローン細胞各１種を得、合計４種のクロー
ン細胞、ＦＧＡ−１２（ＩＦＯ ５０３４８、ＦＥＲＭ
ＢＰ−３７１３），ＦＧＡ−１９，ＦＧＡ−２２，Ｆ
ＧＡ−５３を得た。

【００２８】（７）抗体の製造 上記（６）のクローニングによって得られたハイブリド
ーマクローンＦＧＡ−１２を、あらかじめ０．５mlのミ
ネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／cマ
ウスの腹腔内に一匹あたり１×１０⁶個接種することに
より腹水化を行なった。ハイブリドーマを腹腔に投与し
て１０日後、腹水を採取した。得られた腹水約１０mlか
ら、ステーリンら［ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー，２５６，９７５０−９７５４（1981）］
の方法に準じてモノクローナル抗体を精製した。まず腹
水からフイブリン様物質を除去するため１０,０００ｒ
ｐｍ１５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（ＰＢ
Ｓ：８.１mＭ−Ｎa₂ＨＰＯ₄，１.５mＭ ＫＨ₂ＰＯ₄，２
７mＭ ＫＣl，１３７mＭ ＮaＣl，ｐＨ７.２）で２８
０nmの紫外部吸収（Ａ₂₈₀）が１２〜１４の値を示す濃
度に希釈した。希釈後サ ンプルに飽和硫酸アンモニウ
ム溶液を４７％の濃度になるように加え、４℃で撹拌し
ながら６０分間塩析を行ない、その後遠心（１０,００
０ｒｐｍ，１５分間）を行なって沈殿物を得た。沈殿物
を５０mＭ ＮaＣl含有２０mＭトリス緩衝溶液 （ｐＨ
７.９）に溶融し、同溶液２リットルに対して透析を行
なった。２時間後、２リットルの新しい同じ透析液に換
え、さらに１５時間透析を行なった。透析後、沈殿を除
去するため１０,０００ｒｐｍ１５分間遠心を行ない、
上清をＡ₂₈₀の値が２０〜３０の濃度になるように調整
した。このサンプルを充分量の５０mＭ −ＮaＣl含有ト
リス緩衝溶液で平衡化した２０mlのＤＥＡＥセルロース
カラム（ワットマンＤＥ₅₂）にかけ、５０mＭ ＮaＣl含
有トリス緩衝溶液でよく洗った後、５０mＭ−５００mＭ
ＮaＣlを含む同緩衝液の濃度勾配塩溶液を用いて１.５
ml／分の流出速度で分画を行なって素通り分画を濃縮
し、精製モノクローナル抗体ＭＡｂＦＧＡ−１２を得
た。抗体の純度の確認にはラエムリらの方法［ネイチャ
ー，２２７，６８０−６８５（1970）］に準じてＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた。すなわ
ち、硫安塩析し、ＤＥＡＥセルロースカラムで素通りし
た分画を、２−メルカプトエタノールで還元し、アクリ
ルアミド濃度１０％のゲルを用いて１８０ボルトで２.
５時間泳動を行なった。その結果、５２ｋＤａ前後にＨ
鎖，２８ｋＤａ前後にＬ鎖の２つのバンドが認められ
た。 （８）抗体のサブクラスの測定：抗体のサブクラスは次
の方法で測定した。即ち上記（１）で得られたＣys−Ｆ
gr［48-67］ペプチドをコートした９６ウエルイムノプ
レートにクローン化されたそれぞれのハイブリドーマ培
養上清を１００μl入れ室温で２時間インキュベートし
た。培養上清を除去，洗浄後ウサギ抗マウスＩgＧ１，
ＩgＧ２ａ，ＩgＧ２ｂ，ＩgＧ３，κ鎖，λ鎖に対する
抗体（カッペル社製）をそれぞれ１００μl入れ室温で
２時間インキュベートした。それぞれの抗体を除去，洗
浄後ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩgＧ抗体（カッペル社
製）を加え室温で２時間インキュベートした。標識抗体
を除去し、よく洗浄した後、上記（５）記載の方法で酵
素反応を行ない吸光度を測定した。その結果、ＭＡｂＦ
ＧＡ−１２はＩgＧ２ｂκ型，他の３種のモノクローナ
ル抗体ＭＡｂＦＧＡ−１９，ＭＡｂＦＧＡ−２２，ＭＡ
ｂＦＧＡ−５３は全てＩgＧ１κ型サブクラスであるこ
とが判明した。

【００２９】（９）抗体の抗原結合性の検討 抗体がＦgr蛋白質を認識するかどうかは、免疫沈降法ま
たはウェスタンブロット法を用いた。 免疫沈降法：ヒト急性前白血病細胞株ＨＬ−６０細胞４
×１０⁶個をＰ^-メディウム１.５mlに浮遊し、２００μC
i／mlの［32_Ｐ］−orchophosphate を加え６cmシャーレ
中で３７℃，４時間培養した。培養終了後、上清を捨て
細胞沈渣に１mlのＲＩＰＡ(radio immunoprecipitation
assay)バッファー（５０mＭ ＨＥＰＥＳ(N-[2-Hydroxy
ethyl]piperazine-N´-[2-ethanesulfonic acid])ｐＨ
７.５，１５０mＭ ＮaＣl，１％Triton Ｘ−１００，１
mＭ ＥＤＴＡ，１００kIU(kirointernational unit)／m
lアプロチニン，５μg／ml ＰＭＳＦ(phenylmethylsulf
onyl fluoride)，１０μg／mlロイペプチン，０.１％Ｓ
ＤＳ，０.５％ＤＯＣ(sodium deoxycholate)，１０mＭ
ＮaＦ，２mＭ Ｎa₃ＶＯ₄，１０mＭ Ｎa pyrophosphat
e）を加え、よく撹拌し細胞を溶解させた。１５,０００
rpm，２０分間，４℃ で遠心し上清を採取した。得られ
た上清に、ＦＧＡ−１２抗体を加え４℃，１時間反応さ
せた。反応後プロテインＧセファロースを加え４℃，１
時間振とうした。ＲＩＰＡバッファーでよく洗ったの
ち、サンプルバッファー中で１００℃，５分間処理して
結合物を溶出した。上清を１０％ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルで電気泳動を行なったのち、ラジオオートグ
ラムをとった。その結果ＭＡｂＦＧＡ−１２は１μＭの
retinoic acidで５日間培養し顆粒球に分化させたＨＬ
−６ ０に発現しているＦgr蛋白質に結合性を示すこと
が判明した。 ウェスタンブロット法：ＨＬ−６０細胞２×１０⁶個を
サンプルバッファーに溶解し、振とうした後５分間煮沸
し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行なった。メンブランにトランスファー後、１時間室温
でＭＡｂＦＧＡ−１２抗体を反応させ、¹²⁵Ｉで標識し
たウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体で処理を行なっ
た後オートラジオグラムをとった。その結果１μＭのre
tinoic acidで分化させたＨＬ−６０細胞のlysate を用
いた場合５８ｋＤａ付近にシングルバンドが認められ、
ＭＡｂＦＧＡ−１２はＦgr蛋白質に結合性を示すことが
分った。

【００３０】実施例３ （１）Ｆyn−ＰＥＡ（Pseudomonas aeruginosa exotoxi
n A）融合蛋白（ＰＥＦＮ）の発現 Ｆyn蛋白質(アミノ酸配列は、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA ８３，５４５９−５４６３（1986) の図２に示され
ている）のＡsp１９からＴhr７３までの５５アミノ酸残
基をコードするcＤＮＡ断片（１６５bp）をpＶＣ４Ｄベ
クター［Biotechniques １０（２）：２０２−４，２０
６，２０８−９ (1991) ］のＰpuＭI／ＥcoＲI部位に組
み込んでpＶＣ−ＦＮを構築し、大腸菌ＢＬ２１（λＤ
Ｅ３）株に導入した。大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）／p
ＶＣ−ＦＮのＯＤ₆₀₀が０.４５の時に最終濃度が １mＭ
になるようにＩＰＴＧを加え、その３時間後集菌した。
得られた菌体を２０mlの氷冷ＴＥＮバッファー（５０m
Ｍ Ｔris−ＨＣl ｐＨ８.０，１mＭ ＥＤＴＡ，１００m
Ｍ ＮaＣl）に懸濁した後、２０mgリゾチーム（和光純
薬社製）を加え、室温で３０分間ゆるやかに混合した。
４℃，３０分間，８００×ｇで遠心後、その沈殿を０.
１％デオキシコール酸を含む氷冷ＴＥＮバッファー２０
mlに懸濁した。１６０μl １Ｍ ＭgＣl₂と２００μl １
mg／ml DNase（シグマ社製）を加え、室温で３０分間
ゆるやかに混合した。４℃，１０分間,１２０００×ｇ
で遠心後、その沈殿を０.５％Triton Ｘ−１００を含む
氷冷ＴＥＮバッファー２０mlに懸濁し、氷冷下に超音波
処理を行い、再び同条件で遠心した。沈殿に氷冷ＰＢＳ
バッファー２０mlを加え、懸濁後超音波処理を行ない遠
心した。沈殿に氷冷ＰＢＳ２mlを加え、懸濁後、超音波
処理を行なった。その結果ＰＥＦＮ３７.５mgを得た。 （２）抗原の可溶化 上記（１）で得られたＰＥＦＮ抗原懸濁液に終濃度２％
となるように１０％（ｗ／ｗ）ドデシル硫酸ナトリウム
溶液を加え、室温に５分間放置した後、沸騰水中で５〜
１０分間放置することにより、可溶化ＰＥＦＮ抗原を得
た。 （３）免疫 ＢＡＬＢ／cマウス（♀８週令）に対し生理食塩水０.１
mlに懸濁させた１５０μgのＰＥＦＮ抗原(（２）で得ら
れたもの）)と同量のフロインド完全アジュバント（Dif
co社製）を混合して皮下に注射した。２週間後に同量の
抗原と０.１mlのフロインド不完全アジュバントの混合
物を皮下に再投与した。さらにその２週後、４週後に同
様の追加免疫を行ない、４次免疫の２週後にＰＥＦＮ抗
原懸濁液の上清２００μlを静脈内に接種した。

【００３１】（４）細胞融合：上記（３）で得られた免
疫マウスより、抗原最終投与の３日後脾臓を摘出し、細
胞融合に用いる細胞を得た。この細胞は、イスコフ培地
とハムＦ−１２培地を１：１の比率で混合した培地（以
下ＩＨ培地と略す）に懸濁した。マウスミエローマ細胞
Ｐ３−Ｘ６３−Ａg・８Ｕ１は１０％ウシ胎児血清を含
むＲＰＭＩ １６４０培地で５％炭酸ガス，９５％空気
の条件で継代培養した。細胞融合は、ケーラーおよびミ
ルスタインらが確立した方法［ケーラー，Ｇ.およびミ
ルスタイン，Ｃ.；ネイチャー（Nature）２５６：４９
５（1975）］に準じて行った。上記ミエローマ細胞６.
８×１０⁷個と上述した方法で得られた免疫されたリン
パ球３.５×１０⁸個を混合、遠沈し、０.３mlのＩＨ培
地に溶解し た４５％ポリエチレングリコール６０００
（以下ＰＥＧ６０００と称する）を滴下した。ＰＥＧ６
０００溶液は、予め３７℃に温め、ゆっくりと滴下し
た。７分後３７℃に予温したＩＨ培地を１分間に０.５m
lずつ加え１０mlとした後、室温 で７００ｒｐｍ１５分
遠心し上清を除去した。この細胞沈殿物を２０％ウシ胎
児血清を含むＩＨ培地２００mlに懸濁し、９６ウエルマ
イクロプレート（ヌンク社製）に１００μlずつ植えつ
けた。１日後、ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍ，アミ ノ
プテリン４×１０^-7Ｍ，チミジン１.６×１０^-5Ｍを含
んだ２０％ウシ胎児血 清含有ＩＨ培地（以下ＨＡＴ培
地と称する）を各ウエルに１００μlずつ添加し、さら
に３日おきに培地の１／２量をＨＡＴ培地と交換した。
このようにして生育した細胞は雑種細胞である。

【００３２】（５）抗体産生細胞の検索 可溶化ＰＥＦＮ抗原あるいは同様に可溶化したＰＥＡを
１０μg／mlになるように０.０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
８.５）で希釈し、その１００μlを９６ウエルイムノプ
レート（ヌンク社製）の各ウエルに入れ４℃で一夜放置
し、固相にＰＥＦＮあるいはＰＥを結合させた。０.１
５Ｍ ＮaＣlを含有する０.０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７.０）で洗浄した後、余剰の結合部位をふさぐため、
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０.０１
Ｍリン酸緩衝液を２００μlずつウエルに注入して、使
用時まで冷所に保存した。以上のようにして得られたＰ
ＥＦＮあるいはＰＥを結合した９６ウエルイムノプレー
トに、雑種細胞培養上清を１００μlずつ加え室温で２
時間インキュベートした。培養上清を除去、洗浄後２次
抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識
ヤギ抗マウスＩgＧ抗体（カッペル社製）を加え室温で
２時間インキュベートした。２次抗体を除去し、よくウ
エルを洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液（０.０
２％Ｈ₂Ｏ₂と０.１５％ ｏ−フェニレンジアミンを含む
ｐＨ５.５のクエン酸ナトリウム緩衝液）を１００μl加
え、２５℃で１０分間反応させ、２Ｎ−硫酸１００μl
を加えることにより酵素反応を停止した後、マイクロプ
レート用自動比色計（ＭＴＰ−３２，コロナ社製）を用
い、４９２nmにおける吸光度を測定した（ＥＬＩＳＡ
法）。この方法により、ＰＥに結合性を示さず、ＰＥＦ
Ｎと特異的に反応する抗体産生ハイブリドーマを得た。

【００３３】実施例４ （１）Ｆｙｎ−ＧＳＴ（Glutathione S−Toausferase）
融合蛋白（ＧＳＦＮ）の発現 Ｆｙｎ蛋白質のＭｅｔ１からＴｈｒ７３までのアミノ酸
をコードするｃＤＮＡ断片(２１９ｂｐ)をＰＣＲ法で増
幅し、ＮｃｏＩ，ＥｃｏＲＩ部位を導入した。Ｎｃｏ
Ｉ，ＥｃｏＲＩで酵素処理し、digest された断片をア
ガロースゲルより切り出し回収した。この断片をプラス
ミドｐＧＥＸ・２ＴＮのＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位に組
み込み、大腸菌ＤＨ５αに導入した。大腸菌ＤＨ５α／
ｐＧＥＸ・２ＴＮ−ＦｙｎのＯＤ₅₉₅が１の時に、０．
１ｍＭになるようＩＰＴＧを加え、その２０時間後に集
菌した。得られた菌体を５０ｍｌのＬバッファー（５０
ｍＭTris−ＨＣｌｐＨ７．５，２５％ sucrose, ０．５
％ＮＰ４０，５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）に懸濁し、超音波破砕
後遠心を行い、上清に３ｍｌのグルタチオンアガロース
ビーズを加え、一晩撹拌した。ビーズをカラムにつめ、
ＷＥバッファー（２０ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐＨ７．５，
２ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄後、５ｍＭ
グルタチオン，５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ９．６）
にて結合蛋白を溶出、これをＷＥバッファーに対し一晩
透析した。５００ｍｌの培養より約１５ｍｇの融合蛋白
ＧＳＦＮを得た。 （２）免疫 ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀８週令）に対し生理食塩水０．
１ｍｌに懸濁させた５０μｇのＧＳＦＮと同量のフロイ
ンド完全アジュバントを混合して腹腔内に注射した。２
週間後に同量の抗原と０．１ｍｌのフロインド不完全ア
ジュバントの混合物を腹腔内に再投与した。さらにその
２週間後、生理食塩水に溶かした２０μｇのＧＳＦＮを
静脈内に接種した。

【００３４】（３）細胞融合 上記（２）で得られた免疫マウスより、抗原最終投与の
３日後脾臓を摘出し、採取された脾臓細胞（１．５×１
０⁸個）とマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・
８ＵＩ（３．０×１０⁷個）を混合、遠心分離した。得
られた沈渣に、１ｍｌのＴ培地（日本製薬製）に溶解し
た５０％ポリエチレングリコール１５００を、予め３７
℃に温め、１分間徐々に加えて細胞融合させ、３７℃の
Ｔ培地７ｍｌを５分間かけて加えた後、１,５００ｒｐ
ｍで５分間遠心した。この細胞沈殿物にＨＡＴ培地を３
０ｍｌ加え、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ
ずつ播種し、２〜３日間隔でＨＡＴ培地を半量ずつ交換
しながら培養を続けた。このようにして２８０ウェルに
ハイブリドーマの増殖を認めた。 （４）抗体産生細胞の検索 ＧＳＦＮ抗原あるいはＧＳＴを１０μｇ／ｍｌになるよ
うに０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈し、そ
の１００μｌを９６ウェルイムノプレートの各ウェルに
入れ４℃で一夜放置し、固相にＧＳＦＮあるいはＧＳＴ
を結合させた。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、余剰の
結合部位をふさぐため、１％ウシ血清アルブミンを含有
する０．０１Ｍリン酸緩衝液を２００μｌずつウェルに
注入して、使用時まで冷所に保存した。以上のようにし
て得られたＧＳＦＮあるいはＧＳＴを結合した９６ウェ
ルイムノプレートに、ハイブリドーマ培養上清を１００
μｌ添加し、室温で１時間反応した。培養上清を除去、
洗浄後西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ抗体（カッペル社製）を加え、室温で１時間反応さ
せた。２次抗体を除去し、ウェルを洗浄した後、ペルオ
キシダーゼ基質溶液（０．０２％Ｈ₂Ｏ₂と０．１５％ο
−フェニレンジアミンを含むｐＨ５．５のクエン酸ナト
リウム緩衝液）を１００μｌ加え、室温で反応させた。
３０分後、１Ｎ−硫酸１００μｌで反応を停止させ、マ
イクロプレート用自動比色計を用い、４９２ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。この方法によりＦｙｎ蛋白質に特
異的に結合性を示すモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマを取得した。

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、非受容
体型チロシンキナーゼに特異的に結合し、また結合能も
高いので、各種非受容体型チロシンキナーゼの検出・測
定用試薬などとして、有利に用いることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｐ 9284−4Ｃ Ｂ 9284−4Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】免疫グロブリンクラスがＩgＧに属し、非
   受容体型チロシンキナーゼの特異領域に結合性を示すモ
   ノクローナル抗体。
2. 【請求項２】非受容体型チロシンキナーゼが lyn遺伝子
   産物であり、 lyn遺伝子産物以外の非受容体型チロシン
   キナーゼと交差反応を示さない請求項１記載のモノクロ
   ーナル抗体。
3. 【請求項３】非受容体型チロシンキナーゼが fgr遺伝子
   産物であり、 fgr遺伝子産物以外の非受容体型チロシン
   キナーゼと交差反応を示さない請求項１記載のモノクロ
   ーナル抗体。
4. 【請求項４】非受容体型チロシンキナーゼが fyn遺伝子
   産物であり、 fyn遺伝子産物以外の非受容体型チロシン
   キナーゼと交差反応を示さない請求項１記載のモノクロ
   ーナル抗体。
5. 【請求項５】非受容体型チロシンキナーゼまたはその特
   異領域の部分ペプチドで免疫した哺乳動物の脾臓細胞
   と、同種または異種のリンパ球様細胞とからなるクロー
   ン化されたハイブリドーマ。
6. 【請求項６】哺乳動物がマウスである請求項５記載のハ
   イブリドーマ。
7. 【請求項７】リンパ球様細胞がミエローマである請求項
   ５記載のハイブリドーマ。
8. 【請求項８】非受容体型チロシンキナーゼまたはその特
   異領域の部分ペプチドで免疫した哺乳動物の脾臓細胞
   と、同種または異種のリンパ球様細胞とを細胞融合し、
   クローニングすることを特徴とする請求項５記載のハイ
   ブリドーマの製造法。
9. 【請求項９】哺乳動物がマウスである請求項８記載の製
   造法。
10. 【請求項１０】リンパ球様細胞がミエローマである請求
    項８記載の製造法。
11. 【請求項１１】請求項５記載のハイブリドーマを液体培
    地中または哺乳動物の腹腔内で増殖し、モノクローナル
    抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
    する請求項１記載のモノクローナル抗体の製造法。
12. 【請求項１２】哺乳動物がマウスである請求項１１記載
    の製造法。
13. 【請求項１３】リンパ球様細胞がミエローマである請求
    項１１記載の製造法。
14. 【請求項１４】請求項１記載のモノクローナル抗体を用
    いることを特徴とする非受容体型チロシンキナーゼの検
    出・定量法
15. 【請求項１５】酵素免疫測定法を行う請求項１４記載の
    検出・定量法。
16. 【請求項１６】請求項１記載のモノクローナル抗体を用
    いることを特徴とする非受容体型チロシンキナーゼの精
    製法。