JPH01104198A - 分析の精度を向上させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明は分析の精度を向上させる方法に関する。

更に詳細には、生理活性因子例えば酵素２抗原。

抗体、血球凝集素などを用いて物質を分析する方法、又
はこれらの生理活性因子そのものを分析する方法におい
て、反応液中に炭素、水素及び酸素よりなる水溶性の不
活性な有機高分子化合物を共存させることによって分析
の精度を向上させる方法に関する。本発明の対象とする
分析には、例えば酵素を用いてトリグリセライドなどの
脂質、脂肪、グルコースなどのａ類あるいはアミン類、
アミノ酸類を分析する生化学的測定法や抗原及び／又は
抗体を用いてホルモン類、腫瘍関連抗原、゛抗体あるい
゛は生理活性物質などを分析する免疫測定法などが含ま
れる。そして、このような分析が利用される分野として
は、臨床医学、基礎医学、生化学、遺伝子工学などの広
義のバイオテクノロジー、バイオケミストリーがある。

特に臨床医学の分野では血液、尿などの生体体液中の成
分を分析し、それによって診断、治療を行うことが１つ
の大きな手法であり、上記のような分析が汎用されてい
る。

〔従来技術〕

このような生理活性因子を用いる分析又は生理活性因子
の分析においては、生理活性因子が一般に比較的不安定
であるため、分析に用いる反応液中にアルブミンなどの
蛋白質を安定化剤として加えることが行われる。又、生
理活性因子の試験管その他反応容器への非特異的吸着を
防止する目的で、種々の蛋白質あるいは界面活性剤が加
えられることもある。例えばＭ、Ｋｕｒｏｂｅらは免疫
測定用の緩衝液に牛血清アルブミンを添加している（Ｃ
１ｉｎｉｃａ　Ｃｈｔｍｉｃａ　Ａｃｔａ　１５６巻、
５１〜６０ページ。

１９８６年）。又、Ｒ，Ｙａｍａｍｏｔｏらは免疫測定
用の緩衝液にゼラチンと牛血清アルブミンを添加してい
る（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　８７巻。

１９７〜２０１ページ、　１９８６年）。更に、血清中
の成分を分析する場合には当然反応液中に血清蛋白質が
入ってくる。このような反応液を取り扱う場合、撹拌等
で泡が発生し、しかもこれがすぐには消えないので、極
微量を取り扱うこれらの分析方法においてはピペット等
の操作時に誤差を生じたりする。また生体体液成分の測
定の際には測定者の安全を確保するためや多量の検体を
処理するためにチップ式の簡易ピペットを用いる場合が
多く、この場合には、特に液の粘性と泡のために測定精
度が悪くなる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは上記のような問題点を解決し、生理活性因
子を用いる分析法又は生理活性因子の分析法の精度を向
上すべく鋭意検討した結果、本発明を完成したものであ
る。即ち、本発明は生理活性因子の特異的反応を利用し
て物質を分析する方法又は生理活性因子そのものを分析
する方法において、反応液中に炭素、水素及び酸素より
なる水溶性の不活性な有機高分子化合物を共存させ分析
の精度を向上させるものである。

〔問題点を解決するための手段及びその作用〕生理活性
因子の特異的反応を利用して物質を分析する方法又は生
理活性因子を分析する方法における炭素、水素及び酸素
よりなる水溶性の不活性な有機高分子化合物の添加効果
、即ち分析の精度を向上させる効果は著しいものである
。ちなみに、単に消泡効果のみ期待するのであれば、通
常用いられる合成消泡剤を用いることもできるが、水不
溶性であるものが多くまた反応を妨害するものも多く、
実際に反応に使用できず、また使用されてもいない。又
エタノール、メタノール等も消泡効果を有するが揮発性
を有するため液量の変化をきたし、ごく僅かな量を取り
扱うこのような分野の測定には不適当であり、さらには
反応液中に蛋白質等の沈澱を生じさせることもあり測定
が不可能となることもある。又、生理活性因子の安定化
の為にはアルブミンなどの蛋白質の添加が行われる事が
あり、この場合には発泡性が更に高まり分析精度を悪（
する結果となる。このような場合は前記のようにエタノ
ールやメタノールのような消泡剤を添加すると蛋白質の
変性等の問題も発生し易く測定に支障をきたすこととな
る。本発明による有機高分子化合物の添加効果はアルブ
ミン等の生理活性物質の安定他剤添加効果を確保しつつ
、測定精度を向上させるものである。

炭素、水素及び酸素よりなる水溶性の不活性な有機高分
子化合物には、例えば水溶性多１１！類やポリアルキレ
ングリコール等が挙げられる。

水溶性多糖としては通常市販されているものであればい
ずれでも使用でき特に限定されない。分子量としては反
応液に溶解した時の粘性を考慮すると、分子ｌ！に１０
０から１．ＯＯＯ，ＯＯＯの範囲のものが好ましく、こ
の際一定範囲の分子量のものを分画して用いても各種分
子量のものを混合して用いてもその効果は変わらない。

又、反応液中の濃度は、分子量にもよるが０．０１％以
上であれば効果が認められる。添加濃度の上限は特に無
いが、粘性の問題から１０％以下の濃度で用いるのが好
ましい。水溶性多糖の具体例としては例えばアミロース
（α−１，４−グルカン）、デキストラン（α−１，６
−グルカン）、ラミナリン（α−１，３−グルカン）な
どが挙げられる。これらの水溶性多糖は単独で用いても
良いし、２種以上を混合して用いることもできる。ポリ
アルキレングリコールとしては一般式（ｎは２以上、Ｒ
＋　、Ｒｚ　、Ｘ、ＹはＨ又はアルキル基である。）で
示されるものであればいずれでも使用できる。又、反応
液中の濃度は０．０５％以上であれば効果が認められる
。添加濃度の上限としては、反応液中の粘度の上昇、あ
るいは反応液中の成分の不溶化などを考慮すれば、１０
％以下が好ましい。ポリアルキレングリコールの具体例
としては例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレ
ングリコール等が挙げられる。これらのポリアルキレン
グリコールは単独で用いても良いし、２種以上を混合し
て用いることもできる。

本発明が適用される分析法としては、例えば代表的なも
のとして以下のようなものがある。

（１）酵素反応を利用する物質の分析法（酵素的測定法
） （２）免疫反応を利用する物質の分析法（免疫測定法）
（３）生理活性物質の受容体を利用する物質の分析法（
レセプターアッセイ） （４）ホルモンの結合蛋白質などの結合蛋白質を利用す
る物質の分析法（プロティン・パインディング・アッセ
イ） 分析される物質としては種々の蛋白質、アミノ酸、ホル
モン類、ｔｉ、脂質、ビタミン′類、抗原。

抗体、酵素、その他生理活性物質、あるいは天然又は合
成の薬物などがある。これらの物質は通常溶液として分
析に供されるが、この溶液としては生体由来の体液、例
えば血液、尿、唾液、汗なども含まれる。

以上のような分析において本発明は分析の精度の向上に
おおいに寄与する。以下試験例及び実施例にて本発明を
具体的に説明する。

試験例１．測測定度に及ぼす各種成分の影響Ｒ０Ｙａｍ
ａｍｏｔｏらの方法（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅａ＋１
ｓｔｒｙ＋　３１巻、６２８ページ、　１９８５年）に
従い血清中インスリンの測定を行った。試薬の調製法及
び測定法は全て上記の方法に従った。但し、免疫反応用
緩衝液中の牛血清アルブミンは除いた。

検体血清１００μｌに酵素標識インスリン抗体溶液５０
０μ２を添加混合し、３０°Ｃで１時間反応させた。こ
の反応液をインスリン不溶化セファロースのカラムに流
し、カラムを洗浄後、カラムに結合した酵素活性を測定
した。標準インスリン血清と検体血清について上記測定
を行い検体血清のインスリン濃度を求めた。

酵素標識インスリン抗体溶液に、１％エタノール、１％
アデカノール（旭電化社製）、０．１％牛血清アルブミ
ン（和光紬薬工業製）、１％デキストランＴ−５００（
ファルマシア社製）、１％ポリエチレングリコール６０
００　（和光紬薬工業社製）、０．１％牛血清アルブミ
ンと１％デキストランＴ−５００，０，１％牛血清アル
ブミンと１％ポリエチレングリコール６０００を各々添
加した場合の１０回の測定値の平均及び測定精度を表−
１に示す。尚、測定精度は同じ検体を１０回測定した場
合の変動係数（ＣＶ）で表す。

表−１ アデカノールについては酵素標識インスリン抗体溶液に
溶けなかったので測定ができなかった。

エタノールおよび牛血清アルブミンおよび無添加の場合
は測定精度がかなり悪かった。これらに比ベデキストラ
ンＴ−５００とポリエチレングリコール６０００を添加
すると明らかに変動係数（ＣＶ）が低下し牛血清アルブ
ミンのみでは測定精度が悪かったものがデキストランＴ
−５００やポリエチレングリコール６０００を添加する
測定精度の向上が認められた。

実施例１　、サイロキシンの測定における検量線の安定
性 （１）酵素標識サイロキシン溶液 Ｒ，Ｙａｍａｍｏｔｏらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　　４巻
、　　１６８〜１７４ページ、　１９８２年）に従いβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼとサイロキシンを結合させ、５
００ｍＵ／！ｎ１の溶液を作製した。

（２）抗体溶液 上記の文献の方法に従ってサイロキシン抗体（ウサギ）
を調製した。この抗体を後に述べる反応用緩衝液に２０
Ｍｇ７ｍｌの濃度になるよう溶解した。更に、この溶液
に８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸１．８■／
戚を添加した。

（３）第二抗体感作ビーズ （抗ウサギＩｇＧ）ＩｇＧをＫ　、　Ｋａ　ｔｏらの方
法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　３６巻、１５５７〜１５６６ページ、　１９７７年
）に従いポリスチレンビーズに結合させた。

（４）反応用緩衝液 １０酵リン酸緩衝液（ｐＨ７）にＯ’、３Ｍ　ＮａＣ１
，１ｍＭＭｇＣ１ｚ、０．１％牛血清アルブミン及び０
．５％加水分解ゼラチンを加えたものを用いた。

（５）サイロキシンの測定 サイロキシンの濃度が各々０．１．２５．２．５゜５．
０．１２．５．２５．０Ｍｇ／ｄｉのヒト血清について
２重測定を行った。血清２５μ２に抗体溶液又はデキス
トランＴ−５００１ｍｇ／　ｍｌを含む抗体溶液３００
μ２と酵素標識サイロキシン溶液１００μｌを添加混合
し、これに第二抗体感作ビーズ１個を加えて、３７°Ｃ
で３０分間反応させた。次に該ビーズを反応用緩衝液に
て洗浄後、洗浄したビーズをｐ−クロロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトジッド溶液（１■／ｄ）　　５００μ！中
に入れ、３７°Ｃで６０分間酵素反応を行った。酵素反
応液に反応停止液（ガラクトース１０ｍｇ／ｍｌを含む
１０ｍＭ　ＥＤＴ＾溶液）２ｄを加え５７５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。得られた検量線を図−１に示す。

各段階毎のサイロキシン濃度における二回の測定値の吸
光度差を表−２に示す。

表−２ 抗体溶液にデキストラン無添加の場合の２点間の吸光度
のばらつきは最大０．０４１．平均０．０２２であるの
に対し、デキストラン添加では最大０．００８．平均０
．００５であり明らかにばらつきが小さく、測定精度が
良いことが分かる。

実施例２．サイロキシンの定量 実施例１と同じ方法でヒト血清を十重測定した。

抗体溶液に２■／ｄのデキストランＴ−５００を添加し
た場合と添加しない場合の測定のばらつきを調べた。デ
キストラン無添加の場合、測定値の平均は９．１Ｍｇ／
ａ、標準偏差は０．６９　ｕ　ｇ／ａ、　ＣＶは７．１
％であった。デキストランを添加すると測定値の平均は
９．８μｇ／ａ、標準偏差は０．２１Ｍｇ／ａ。

ＣＶは２．１％となりデキストラン無添加の場合に比べ
て測定精度が極めて向上した。

同時に抗体溶液にポリエチレングリコール（平均分子量
６０００）　　１．０％を添加して同じ測定を行ったと
ころ、測定値の平均は９．８μｇ／ａ、標準偏差は０．
２８Ｍｇ／ｄ１．　　ＣＶは２．９％となり、デキスト
ランと同じく測定精度が良好であった。

実施例３．エノラーゼの測定 に、Ｋｉｍｕｒａらの方法に従いヒト血清中のエノラー
ゼ（Ｎｅｕｒｏｎ−５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｅｎｏｌａｓｅ
）を酵素免疫測定によって測定した。測定に用いるすべ
ての試薬に５　ｍｇ／　ｔｒｄｌ　（０，５％）のデキ
ストリン（商品名パインデックス、松谷化学工業社製）
を添加した場合と添加しない場合について十重測定を行
い測定精度を比較した。デキストリン無添加では、測定
値の平均は５．９μｇ／Ｌ０Ｕ、標準偏差は０．４２ｕ
ｇ／ａ、　　ＣＶは７．１％であったのに対し、デキス
トリン添加では平均値６．０μｇ７社、標準偏差は０．
２１μｇ／ａ。

Ｃ■は３．５％であった。

実施例４．ガラクトシダーゼの活性測定大腸菌由来のガ
ラクトシダーゼの活性を測定した。ガラクトシダーゼ溶
解液として０．１％牛血清アルブミンと１ｍＬＭｇＣｈ
を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いた。この
溶解液及び溶解液にデキストランＴ−７０又はエチレン
グリコールを１％添加した液にガラクトシダーゼを溶解
した。この酵素液１ｄに４−メチルウンベリフェリル−
β−Ｄ−ガラクトシッド溶液（０，１ｍｇ／ｍ１）　　
０．５ｍｆｌを加え３０°Ｃで１０分間反応させた後、
０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，３）　
２５ｍ１を加え混合した。この液について励起波長３６
０ｎｍ、測定波長４５０ｎｍで蛍光を測定し酵素活性を
計算した。各々の条件で十重測定したところ表−３に示
す結果が得られた。

表−３ 表−３より明らかなようにデキストラン又はエチレング
リコールの添加で測定精度の向上が見られる。

［発明の効果］ 以上の如く、本発明法は分析の精度の向上に寄与すると
ころ大である。特に近年の分析技術は微量成分の分析、
あるいは微量の試料を用いる分析という方向で発展して
おり、このことより分析精度の確保ということが重要に
なってきている。この意味において、本発明は極めて有
用なものである。

【図面の簡単な説明】

図−１は実施例１において得られたサイロキシンの検量
線を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）生理活性因子の特異的反応を利用して物質を分析す
   る方法又は生理活性因子そのものを分析する方法におい
   て、反応液中に炭素、水素及び酸素よりなる水溶性の不
   活性な有機高分子化合物の１種以上を共存させることを
   特徴とする分析の精度を向上させる方法。 ２）有機高分子化合物が水溶性多糖である特許請求の範
   囲第１項記載の分析の精度を向上させる方法。 ３）水溶性多糖がα−１，３−グルカン又はα−１，４
   −グルカン又はα−１，６−グルカンである特許請求の
   範囲第２項記載の分析の精度を向上させる方法。 ４）有機高分子化合物がポリアルキレングリコールであ
   る特許請求の範囲第１項記載の分析の精度を向上させる
   方法。 ５）生理活性因子が抗原及び／又は抗体である特許請求
   の範囲第１項乃至第４項記載の分析の精度を向上させる
   方法。 ６）生理活性因子が酵素である特許請求の範囲第１項乃
   至第４項記載の分析の精度を向上させる方法。 ７）分析される物質が生体体液中に存在する物質である
   特許請求の範囲第１項乃至第４項記載の分析の精度を向
   上させる方法。