JPH01108995A - 培養動物細胞による蛋白質の産生を向上させるための遺伝子増幅方法 - Google Patents
培養動物細胞による蛋白質の産生を向上させるための遺伝子増幅方法Info
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- JPH01108995A JPH01108995A JP62266529A JP26652987A JPH01108995A JP H01108995 A JPH01108995 A JP H01108995A JP 62266529 A JP62266529 A JP 62266529A JP 26652987 A JP26652987 A JP 26652987A JP H01108995 A JPH01108995 A JP H01108995A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、蛋白質の製造法およびそれに使用する動物細
胞に関する。
胞に関する。
本発明によれば動物細胞の培養によって、種々の蛋白質
、殊に医薬品として有用な生物活性のある哺乳動物の蛋
白質を製造することができる。
、殊に医薬品として有用な生物活性のある哺乳動物の蛋
白質を製造することができる。
従来の技術
遺伝子工学の技術により、哺乳動物が産生ずる有用な蛋
白質を生産する場合、大きく分けて、宿主に、大腸菌等
の原核生物を用いる場合と、チャイニーズハムスター卵
巣細胞株（ＣＨＯ細胞と略す）等の哺乳動物の細胞を用
いる場合との二通りがある。前者の場合は、目的とする
蛋白質と同じ一次構造を持つ蛋白質を大量に得られると
いう利点がある反面、動物細胞に特有の蛋白質の修飾が
無いために、生物学的活性や安定性が低いという欠点が
ある。後者の場合は、目的とする蛋白質は適当に修飾さ
れることが期待されるが、単位細胞光たりの産生能が、
著しく低いという欠点を有する。この後者の欠点を克服
するために、目的とする蛋白質をコードする遺伝子を動
物細胞へ導入し、細胞内にてこの遺伝子を増幅させて単
位細胞力たりの生産能を高める系が開発されている。こ
の例として良く知られているものに、細胞が核酸を生合
成する経路で必須である酵素の一つ、デヒドロフオレー
トレダクターゼ遺伝子（ｄｌ＋ｌ’ｒと略す）を、目的
とする遺伝子と共に、ｄｂｆ’ｒ欠損細胞に導入して、
凸「「の阻害剤であるメントレキセート（ＭＴＸと略す
）を含む培地中にて、ｄＭ’ｒとこの目的とする遺伝子
を一緒に増幅させる方法がある。通常最初に得られたｄ
ｈｌ’ｒ（→形質転換細胞のうち約２０％位が目的とす
る遺伝子産物を産生じている。次に、ＭＴＸの培地中の
濃度を順次増やしていくことにより、ｄｈｆ’ｒとこの
目的とする遺伝子のコピー数を順次、増加させていくこ
とができる。
白質を生産する場合、大きく分けて、宿主に、大腸菌等
の原核生物を用いる場合と、チャイニーズハムスター卵
巣細胞株（ＣＨＯ細胞と略す）等の哺乳動物の細胞を用
いる場合との二通りがある。前者の場合は、目的とする
蛋白質と同じ一次構造を持つ蛋白質を大量に得られると
いう利点がある反面、動物細胞に特有の蛋白質の修飾が
無いために、生物学的活性や安定性が低いという欠点が
ある。後者の場合は、目的とする蛋白質は適当に修飾さ
れることが期待されるが、単位細胞光たりの産生能が、
著しく低いという欠点を有する。この後者の欠点を克服
するために、目的とする蛋白質をコードする遺伝子を動
物細胞へ導入し、細胞内にてこの遺伝子を増幅させて単
位細胞力たりの生産能を高める系が開発されている。こ
の例として良く知られているものに、細胞が核酸を生合
成する経路で必須である酵素の一つ、デヒドロフオレー
トレダクターゼ遺伝子（ｄｌ＋ｌ’ｒと略す）を、目的
とする遺伝子と共に、ｄｂｆ’ｒ欠損細胞に導入して、
凸「「の阻害剤であるメントレキセート（ＭＴＸと略す
）を含む培地中にて、ｄＭ’ｒとこの目的とする遺伝子
を一緒に増幅させる方法がある。通常最初に得られたｄ
ｈｌ’ｒ（→形質転換細胞のうち約２０％位が目的とす
る遺伝子産物を産生じている。次に、ＭＴＸの培地中の
濃度を順次増やしていくことにより、ｄｈｆ’ｒとこの
目的とする遺伝子のコピー数を順次、増加させていくこ
とができる。
しかしながら、この方法では、■目的物質の発現を十分
うながすような細胞株を得るためには、その遺伝子の増
幅に約１年の期間が必要であり、■ｄｈｆｒ欠損で実用
化しうる動物細胞は現在のところ事実上、ＣＨＯ細胞の
みであるという難点がある。Ｉｌ的とする蛋白質の種類
によっては、他の細胞株をつかう必要も生じている。
うながすような細胞株を得るためには、その遺伝子の増
幅に約１年の期間が必要であり、■ｄｈｆｒ欠損で実用
化しうる動物細胞は現在のところ事実上、ＣＨＯ細胞の
みであるという難点がある。Ｉｌ的とする蛋白質の種類
によっては、他の細胞株をつかう必要も生じている。
本発明が解決しようとする問題点
本発明によれば、遺伝子をインビボで増幅させるので、
■汎用されているｄｈｌ’ｒベクターのように宿主細胞
としてｄｈｌ’ｒ（−） ＣＨＯ細胞のような限られた
酵素遺伝子欠損株しか使えないという制限が無くなり、
目的とする蛋白質産生のために最適な細胞を選んで使用
出来るようになり、また、■宿主細胞に導入された遺伝
子の数が１細胞あたり約２０〜５０コピーに達するのに
わずかに２０〜４０日で足りるようになる。
■汎用されているｄｈｌ’ｒベクターのように宿主細胞
としてｄｈｌ’ｒ（−） ＣＨＯ細胞のような限られた
酵素遺伝子欠損株しか使えないという制限が無くなり、
目的とする蛋白質産生のために最適な細胞を選んで使用
出来るようになり、また、■宿主細胞に導入された遺伝
子の数が１細胞あたり約２０〜５０コピーに達するのに
わずかに２０〜４０日で足りるようになる。
発明の構成
本発明は、蛋白質をコードする遺伝子とハイグロマイシ
ンＢ耐性遺伝子を用いて動物細胞を形質転換し、その形
質転換株をハイグロマイシンＢを含有する培地で培養し
て蛋白質をコードする遺伝子のコピー数を増加させる方
法に関する。更に本発明は、そのようにしてコピー数を
増加させた動物細胞を用いて蛋白質を製造する方法に関
する。
ンＢ耐性遺伝子を用いて動物細胞を形質転換し、その形
質転換株をハイグロマイシンＢを含有する培地で培養し
て蛋白質をコードする遺伝子のコピー数を増加させる方
法に関する。更に本発明は、そのようにしてコピー数を
増加させた動物細胞を用いて蛋白質を製造する方法に関
する。
ハイグロマイシンＢはＰｅＬＬＩｎｇｅｒ等によって１
９５３年に発見されたＳＬｒｅｐｔｏｍｙｅｅｓ ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓによって生産される抗生物質で
あり、豚の腸内寄生虫の駆除剤として実用化されている
。これは、真核細胞および原核細胞における蛋白合成を
阻害、するものである。このハイグロマイシンＢ耐性を
与える遺伝子ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ（ｈｙｇｒｏＩｌｙｃｉｎ Ｂ Ｐｈｏｓｐｈｏｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ：以下ｈｐｈと略す）がり、
ＧｒｉｔＺらにより解明されその塩基配列等が明らかに
されている（Ｌ、 Ｇｒｉｔｚａｔ ａｊ、、 Ｇｃｎ
ｃ ｎ （１９８３） １７９−１８８）。本発明者等
は、このｈｐｈ遺伝子を蛋白質をコードする遺伝子とと
もに動物細胞に形質転換させ、その形質転換株をハイグ
ロマイシンＢ含有培地で培養することにより蛋白質をコ
ードする蛋白質のコピー数が増加し、その結果蛋白質の
生産能が高まるという驚くべき事実を発見した。
９５３年に発見されたＳＬｒｅｐｔｏｍｙｅｅｓ ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓによって生産される抗生物質で
あり、豚の腸内寄生虫の駆除剤として実用化されている
。これは、真核細胞および原核細胞における蛋白合成を
阻害、するものである。このハイグロマイシンＢ耐性を
与える遺伝子ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ（ｈｙｇｒｏＩｌｙｃｉｎ Ｂ Ｐｈｏｓｐｈｏｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ：以下ｈｐｈと略す）がり、
ＧｒｉｔＺらにより解明されその塩基配列等が明らかに
されている（Ｌ、 Ｇｒｉｔｚａｔ ａｊ、、 Ｇｃｎ
ｃ ｎ （１９８３） １７９−１８８）。本発明者等
は、このｈｐｈ遺伝子を蛋白質をコードする遺伝子とと
もに動物細胞に形質転換させ、その形質転換株をハイグ
ロマイシンＢ含有培地で培養することにより蛋白質をコ
ードする蛋白質のコピー数が増加し、その結果蛋白質の
生産能が高まるという驚くべき事実を発見した。
このことは、ｄｌｌ「ｒ（−）ＣＨＯ細胞のような限ら
れた宿主細胞だけでなくあらゆる動物細胞宿主を用いた
場合に応用できるという点で極めて利用価値の高いもの
である。
れた宿主細胞だけでなくあらゆる動物細胞宿主を用いた
場合に応用できるという点で極めて利用価値の高いもの
である。
宿主として用いられる動物細胞に制限はないが、好適な
例として次のようなものが挙げられる。
例として次のようなものが挙げられる。
Ｌｔｋ−（ＡＴＣＣＣＣＬ １．３）
Ｃ３Ｈマウス繊維芽り細胞
ＢＶ５１４７．Ｇ、１．４．０ＶＡＲ，１（ＡＴＣＣＣ
ＲＬ １５８８）ＡＫＲ／ＪマウスＴリンパ腫由来 Ｐ３８８Ｄｌ （ＡＴＣＣＴＩＢ １３３）マウス単球
−マクロファージ由来 ＮＩＨ／３７３ （ＡＴＣＣＣＲＬ １８５８）ＮＩＨ
５ｗ１ｓｓマウス胎児細胞由来 ＴＩＰ−１（ＡＴＣＣＴＩＢ ２０２）ヒト！、１％球
由来 Ｕ−９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ １５９３）ヒト組織法リ
ンパ腫由来 Ｈｅｐ Ｇ２ （ＡＴＣＣＨＢ ８０６５）ヒト肝癌
由来 ＦＭ３Ａ Ｃ３Ｈ／Ｈｅｎマウス乳癌由来Ｖｃｒｏ
（ＡＴＣＣＣＣＬ ８１）アフリカミドリザル腎由
来 ＣＨＯ−Ｋｌ （ＡＴＣＣＣＣＬ ８１）チャイニーズ
ハムスター卵巣由来 ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣＣＣＬ １０）シリアンハムス
ター腎由来 本発明によって生産される蛋白質は、踊乳動物が生産す
るあらゆる蛋白質であるが、例えば医学的有用性の高い
次のようなものが挙げられる。
ＲＬ １５８８）ＡＫＲ／ＪマウスＴリンパ腫由来 Ｐ３８８Ｄｌ （ＡＴＣＣＴＩＢ １３３）マウス単球
−マクロファージ由来 ＮＩＨ／３７３ （ＡＴＣＣＣＲＬ １８５８）ＮＩＨ
５ｗ１ｓｓマウス胎児細胞由来 ＴＩＰ−１（ＡＴＣＣＴＩＢ ２０２）ヒト！、１％球
由来 Ｕ−９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ １５９３）ヒト組織法リ
ンパ腫由来 Ｈｅｐ Ｇ２ （ＡＴＣＣＨＢ ８０６５）ヒト肝癌
由来 ＦＭ３Ａ Ｃ３Ｈ／Ｈｅｎマウス乳癌由来Ｖｃｒｏ
（ＡＴＣＣＣＣＬ ８１）アフリカミドリザル腎由
来 ＣＨＯ−Ｋｌ （ＡＴＣＣＣＣＬ ８１）チャイニーズ
ハムスター卵巣由来 ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣＣＣＬ １０）シリアンハムス
ター腎由来 本発明によって生産される蛋白質は、踊乳動物が生産す
るあらゆる蛋白質であるが、例えば医学的有用性の高い
次のようなものが挙げられる。
インシュリン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、エリ
スロボイエチン、神経成長因子、ＬＨＲＨ（黄体形成ホ
ルモン放出ホルモン）のようなホルモン。組織プラスミ
ノーゲン活性化因子、プロティンＣやα２プラスミンイ
ンヒビタ−のようなプロテアーゼインヒビター、第■因
子や第Ｘ因子のような血液凝固因子群、免疫グロブリン
等の血液中の微量成分。
スロボイエチン、神経成長因子、ＬＨＲＨ（黄体形成ホ
ルモン放出ホルモン）のようなホルモン。組織プラスミ
ノーゲン活性化因子、プロティンＣやα２プラスミンイ
ンヒビタ−のようなプロテアーゼインヒビター、第■因
子や第Ｘ因子のような血液凝固因子群、免疫グロブリン
等の血液中の微量成分。
本発明において用いてｈｐｈ遺伝子及び蛋白質をコード
する遺伝子は、それぞれが動物細胞中で働く翻訳開始の
ためのプロモーター及び終結のための領域（ポリＡ領域
、ターミネータ−等）を含んでいる必要がある。蛋白質
をコードする遺伝子は、ｃＤＮＡに由来するものであっ
てもゲノムＤＮＡであっても良い。これらの遺伝子を別
々のプラスミドに組み込んで動物細胞に共形質転換（コ
トランスフェクション）することができる。
する遺伝子は、それぞれが動物細胞中で働く翻訳開始の
ためのプロモーター及び終結のための領域（ポリＡ領域
、ターミネータ−等）を含んでいる必要がある。蛋白質
をコードする遺伝子は、ｃＤＮＡに由来するものであっ
てもゲノムＤＮＡであっても良い。これらの遺伝子を別
々のプラスミドに組み込んで動物細胞に共形質転換（コ
トランスフェクション）することができる。
また両方の遺伝子を一つのプラスミドに組み込んで形質
転換することも可能である。
転換することも可能である。
形質転換の方法としては、燐酸カルシウム共沈澱法、ポ
リエチレングリコール法、マイクロインジェクション法
、ブリッキフグ法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリブレ
ン法、エレクトロポレーション法、等のあらゆる方法が
原理的に応用可能である。このようにしてハイグロマイ
シンＢ耐性となった形質転換株をハイグロマイシンＢ濃
度を上昇させて培養することにより蛋白質をコードする
遺伝子のコピー数を増加させる。ノ１イグロマイシンＢ
の濃度は形質転換株が生育することができる範囲内で高
めることができ、特にその制限はない。５．０００〜１
０，０００μｇ ／ ｍｌ程度までは生育に支障がない
と考えられる。
リエチレングリコール法、マイクロインジェクション法
、ブリッキフグ法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリブレ
ン法、エレクトロポレーション法、等のあらゆる方法が
原理的に応用可能である。このようにしてハイグロマイ
シンＢ耐性となった形質転換株をハイグロマイシンＢ濃
度を上昇させて培養することにより蛋白質をコードする
遺伝子のコピー数を増加させる。ノ１イグロマイシンＢ
の濃度は形質転換株が生育することができる範囲内で高
めることができ、特にその制限はない。５．０００〜１
０，０００μｇ ／ ｍｌ程度までは生育に支障がない
と考えられる。
以下に、免疫システムにおいて重要な働きをする細胞で
あるマウスのサプレッサーＴ細胞やキラーＴ細胞の抗原
蛋白ｔ、ｙｔ−２を、マウス繊維芽細胞を宿主として用
いて産生ずる例について説明する。抗原蛋白Ｌｙｔ−２
は、Ｉｆ、 Ｃａｎｔｏｒ等によって見出され（Ｊ、
Ｅｘｐ、 Ｍａｄ、 １４１．１３７［１−１３８９（
１９７５）、 ｌｍ５ｕｎｏ１． Ｒｅｖ、 ３３．１
０５−１２４ （１９７７）等〕、２つのアロタイプが
ある。すなわち、Ｃ３Ｈマウス等に見られるＬｙＬ−２
，１とＢａ１ｂ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス等に
見られるＬｙｔ−２，２である。以下の実験においては
、Ｌｙｔ−２，２のゲノム遺伝子全体を含む５．３ｋｂ
のＨＩｎｄｍ断片を用いた。
あるマウスのサプレッサーＴ細胞やキラーＴ細胞の抗原
蛋白ｔ、ｙｔ−２を、マウス繊維芽細胞を宿主として用
いて産生ずる例について説明する。抗原蛋白Ｌｙｔ−２
は、Ｉｆ、 Ｃａｎｔｏｒ等によって見出され（Ｊ、
Ｅｘｐ、 Ｍａｄ、 １４１．１３７［１−１３８９（
１９７５）、 ｌｍ５ｕｎｏ１． Ｒｅｖ、 ３３．１
０５−１２４ （１９７７）等〕、２つのアロタイプが
ある。すなわち、Ｃ３Ｈマウス等に見られるＬｙＬ−２
，１とＢａ１ｂ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス等に
見られるＬｙｔ−２，２である。以下の実験においては
、Ｌｙｔ−２，２のゲノム遺伝子全体を含む５．３ｋｂ
のＨＩｎｄｍ断片を用いた。
宿主細胞としてはＣ３Ｈマウス繊維芽り細胞（ｍｏｕｓ
ｅ ｒｌｂｒｏｂｌａｓｔ Ｌ ｃｅｌｌ）のうちチミ
ジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子のないＬｔｋ−細胞（ＡＴ
ＣＣＣＣＬｌ、３）を使用した。
ｅ ｒｌｂｒｏｂｌａｓｔ Ｌ ｃｅｌｌ）のうちチミ
ジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子のないＬｔｋ−細胞（ＡＴ
ＣＣＣＣＬｌ、３）を使用した。
ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を有するプラスミドベク
ターとしては、Ｂ、 Ｓｕｇｄｃｎ等（Ｎｏｔ。
ターとしては、Ｂ、 Ｓｕｇｄｃｎ等（Ｎｏｔ。
Ｃｃｌｌ、 Ｂｌｏｌ、、 ５．４１０−４１３ （
１９８５） ）により作成されたｐＨＥＢｏを用いた。
１９８５） ）により作成されたｐＨＥＢｏを用いた。
このｐ ＨＥ Ｂｏは、ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐
性遺伝子とｏｒｉを含むＤＮＡ断片と、ハイグロマイシ
ンＢ耐性の大腸菌由来のｈｐｈをヘルペスシンプレック
スウィルス（ｈｃｒｐｃｓ ｓｉｍｐｌｃｘ ｖｉｒｕ
ｓ）タイプ！型のチミジンキナーゼ（【ｋ）遺伝子のプ
ロモーターとポリＡシグナルではさんで動物細胞中で発
現するようにした断片から構築したｐ）ｌｙｇなるプラ
スミドベクターのＢｓＬＥ１１部位に、１９８４年ｒｌ
ａｅｒによってその塩基配列が明らかになった（Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１０゜２０７−２１１ （１９８４）
） Ｂ９５−８型エプスタイン−バーウィルス（Ｅｐｓ
ｔｅｌｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ、 ＥＢＶと略す）の
ｏｒＩＰを含むＤＮＡ断片を組み込んだものである。
性遺伝子とｏｒｉを含むＤＮＡ断片と、ハイグロマイシ
ンＢ耐性の大腸菌由来のｈｐｈをヘルペスシンプレック
スウィルス（ｈｃｒｐｃｓ ｓｉｍｐｌｃｘ ｖｉｒｕ
ｓ）タイプ！型のチミジンキナーゼ（【ｋ）遺伝子のプ
ロモーターとポリＡシグナルではさんで動物細胞中で発
現するようにした断片から構築したｐ）ｌｙｇなるプラ
スミドベクターのＢｓＬＥ１１部位に、１９８４年ｒｌ
ａｅｒによってその塩基配列が明らかになった（Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１０゜２０７−２１１ （１９８４）
） Ｂ９５−８型エプスタイン−バーウィルス（Ｅｐｓ
ｔｅｌｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ、 ＥＢＶと略す）の
ｏｒＩＰを含むＤＮＡ断片を組み込んだものである。
実 施 例 Ｌｙｔ−２遺伝子の増幅導入遺伝子の作
成 ｔ、ｙｔ−２，２のゲノム遺伝子全体を含む５．３ｋｂ
のＨｌｎｄＩＩ［断片（Ｈ，Ｎａｋａｕｃｈｉ ら、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
成 ｔ、ｙｔ−２，２のゲノム遺伝子全体を含む５．３ｋｂ
のＨｌｎｄＩＩ［断片（Ｈ，Ｎａｋａｕｃｈｉ ら、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 ！１ｉｃ１．ＵＳＡ、 ８２５１２Ｂ−５
１３０（１９８５）をｐＨＥＢｏのＨｉｎｄｍ部位にサ
ブクローニングし、ｐＨＥ −ＬＹ２Ｇを作製した。ｐ
ＨＥ−ＬＹ２Ｇを単一制限酵素部位であるＣ１ａｌで消
化し直鎖化した。
１３０（１９８５）をｐＨＥＢｏのＨｉｎｄｍ部位にサ
ブクローニングし、ｐＨＥ −ＬＹ２Ｇを作製した。ｐ
ＨＥ−ＬＹ２Ｇを単一制限酵素部位であるＣ１ａｌで消
化し直鎖化した。
遺伝子の細胞への導入
最終のＤＮＡ濃度がｐＨＥ −ＬＹ２Ｇ。
５０ｎｇ／ｍｌ、担体として用いた子牛胸腺ＤＮＡ。
２０μｇ ／ ｍｌとなるように、常法に従いカルシウ
ム・リン酸共沈殿を作成した。２０時間前に１０ｃｍ径
のプレートあたりｌＸｌ０６個の細胞をｌθ％牛脂児血
清を含むＤＭＥｔ９地、８ｍｌで播布しておいたＬｉｋ
（−）細胞にこの共沈殿を１ｍｌ加える事により遺伝子
の導入をおこなった。１目後にＤＭＥ培地を交換し、そ
の翌１」以降は５００μｇ ／ ｍｌのハイグロマイシ
ンＢを含むＤＭＥ培地で３〜４日毎に培地交換をおこな
った。約２週間後、ハイグロマイシンＢ耐性を獲得した
細胞がコロニーを形成した。
ム・リン酸共沈殿を作成した。２０時間前に１０ｃｍ径
のプレートあたりｌＸｌ０６個の細胞をｌθ％牛脂児血
清を含むＤＭＥｔ９地、８ｍｌで播布しておいたＬｉｋ
（−）細胞にこの共沈殿を１ｍｌ加える事により遺伝子
の導入をおこなった。１目後にＤＭＥ培地を交換し、そ
の翌１」以降は５００μｇ ／ ｍｌのハイグロマイシ
ンＢを含むＤＭＥ培地で３〜４日毎に培地交換をおこな
った。約２週間後、ハイグロマイシンＢ耐性を獲得した
細胞がコロニーを形成した。
コロニー出現率は１プレートあたり２００〜２，０００
であった。
であった。
ＬＬｙ−２遺伝子の発現の確認とトランスフエクタント
の株化 これらの細胞の表面に生産されるＬｙｔ−２発現につい
て蛍光活性化細胞選択装置（１’１ｕｏｒ。
の株化 これらの細胞の表面に生産されるＬｙｔ−２発現につい
て蛍光活性化細胞選択装置（１’１ｕｏｒ。
ｒｅｓｃｅｎｅｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ５
ｏｒＬｅｒ、以下ＦＡＣＳと略す）による解析をおこな
った。フルオレセン・イソチオシアネート（以下ＦＩＴ
Ｃと略す）で標識したラット抗り、ｙｔ−ｚ、を抗体、
同じくマウス抗Ｌｙｔ−２，１抗体、同じくマウス抗Ｌ
Ｙｔ−２，２抗体で細胞を染色しそれぞれの抗原蛋白の
生成の有無を確認した。未処理のし細胞はＣ３Ｈマウス
由来なので、Ｌｙｔ−２のアロタイプはＬｙｔ−２，１
であるが、Ｌｙｔ −２，１、Ｌｙｔ −２，２共に発
現されていなかった。一方、ｐＨＥ−ＬＹ２Ｇ遺伝子導
入により得られたハイグロマイシンＢ耐性細胞の場合は
、約５０％が、Ｌｙ１２．２のみを発現していたことを
確認した。常法に従い限界希釈法により細胞株化をおこ
なった。
ｏｒＬｅｒ、以下ＦＡＣＳと略す）による解析をおこな
った。フルオレセン・イソチオシアネート（以下ＦＩＴ
Ｃと略す）で標識したラット抗り、ｙｔ−ｚ、を抗体、
同じくマウス抗Ｌｙｔ−２，１抗体、同じくマウス抗Ｌ
Ｙｔ−２，２抗体で細胞を染色しそれぞれの抗原蛋白の
生成の有無を確認した。未処理のし細胞はＣ３Ｈマウス
由来なので、Ｌｙｔ−２のアロタイプはＬｙｔ−２，１
であるが、Ｌｙｔ −２，１、Ｌｙｔ −２，２共に発
現されていなかった。一方、ｐＨＥ−ＬＹ２Ｇ遺伝子導
入により得られたハイグロマイシンＢ耐性細胞の場合は
、約５０％が、Ｌｙ１２．２のみを発現していたことを
確認した。常法に従い限界希釈法により細胞株化をおこ
なった。
薬剤濃度増加による遺伝子の増幅
細胞株化によって得られたクローン１，２，３゜５．６
．７及びＩＯの７株のｐＨＥ−ＬＹ２Ｇトランスフェク
タントを、０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１，５０
０ ｕ ｔ；ｒ ／ ｍｌ及び３，０００μｇ ／ ｍ
ｌの濃度のハイグロマイシンＢを含む１０９６牛脂児血
清含有ＤＭＥ培地で増殖させた。細胞が増殖し始めて極
く小さなコロニーを形成するまでに要した期間は、ハイ
グロマイシンＢン農度が０〜１，５００μｇ ／ ｍｌ
の場合は約３０間、ａ、ｏｏｏμｇ ／ ｍｌの場合は
約２週間であった。ハイグロマイシンＢ濃度が０〜１．
５００μｇ ／ ｍｌの場合は薬剤濃度を変えてから約
２０日後にその細胞数が２ Ｘ １０７個となったので
培養を中止した。 ３，０００ ｕ ｇ ／ ｍｌの場
合は、約４０［１後に培養を中止した。
．７及びＩＯの７株のｐＨＥ−ＬＹ２Ｇトランスフェク
タントを、０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１，５０
０ ｕ ｔ；ｒ ／ ｍｌ及び３，０００μｇ ／ ｍ
ｌの濃度のハイグロマイシンＢを含む１０９６牛脂児血
清含有ＤＭＥ培地で増殖させた。細胞が増殖し始めて極
く小さなコロニーを形成するまでに要した期間は、ハイ
グロマイシンＢン農度が０〜１，５００μｇ ／ ｍｌ
の場合は約３０間、ａ、ｏｏｏμｇ ／ ｍｌの場合は
約２週間であった。ハイグロマイシンＢ濃度が０〜１．
５００μｇ ／ ｍｌの場合は薬剤濃度を変えてから約
２０日後にその細胞数が２ Ｘ １０７個となったので
培養を中止した。 ３，０００ ｕ ｇ ／ ｍｌの場
合は、約４０［１後に培養を中止した。
Ｌｙｔ−２，２抗原の発現量の増幅の確認それぞれ１×
１００個の培養細胞について、その表面に生産されてい
るＬｙｔ−２，２抗原の量をＦＡＣＳによって解析した
。ＦＡＣＳにはＦＩＴＣ標識抗体を用いた。
１００個の培養細胞について、その表面に生産されてい
るＬｙｔ−２，２抗原の量をＦＡＣＳによって解析した
。ＦＡＣＳにはＦＩＴＣ標識抗体を用いた。
ＦＡＣＳの結果によれば、得られた７つの株化細胞全て
において細胞あたりのＬｙｔ−２，２蛋白抗原発現量は
ハイグロマイシンＢの濃度に依（メして増加している。
において細胞あたりのＬｙｔ−２，２蛋白抗原発現量は
ハイグロマイシンＢの濃度に依（メして増加している。
増加の度合いを平均値あるいは最頻値で表すと表１のよ
うになる。
うになる。
表１中で、相対的蛍光強度とは、励起波長が４８８ ｎ
ｍで発光スペクトラムの極大波長が５３５ｒ＋ｍである
ＦＩＴＣの蛍光強度を表わす単位であり、この蛍光強度
の分布における最頻度とはピークの値を示し、平均値と
は分布全体の算術平均値を表わす。また標準化最頻度お
よび標苧化平均値とは、各クローンのハイグロマイシン
Ｂ５００μｇ ／ ｍｌにおける各々の蛍光強度の最頻
値および平均値を１とした時の他の濃度における各々の
蛍光強度の値を示している。
ｍで発光スペクトラムの極大波長が５３５ｒ＋ｍである
ＦＩＴＣの蛍光強度を表わす単位であり、この蛍光強度
の分布における最頻度とはピークの値を示し、平均値と
は分布全体の算術平均値を表わす。また標準化最頻度お
よび標苧化平均値とは、各クローンのハイグロマイシン
Ｂ５００μｇ ／ ｍｌにおける各々の蛍光強度の最頻
値および平均値を１とした時の他の濃度における各々の
蛍光強度の値を示している。
（以下余白）
Ｌｙｔ−２遺伝子の増幅の確認
それぞれ約２Ｘ１０７個の培養細胞から次のようにＤＮ
Ａを調整しコピー数の増加を確認した。
Ａを調整しコピー数の増加を確認した。
培養細胞の染色体外遺伝子をハート エキストラクショ
ン（ｆｌｉｒｔ １Ｅｘｔｒａｅｔｌｏｎ）法（Ｂ、
Ｈｌｒｔ。
ン（ｆｌｉｒｔ １Ｅｘｔｒａｅｔｌｏｎ）法（Ｂ、
Ｈｌｒｔ。
Ｊ、 Ｈｏｔ、 Ｂｌｏｌ、 ２６．３０５−３０９
（１９０７））にて調製し、ひきつづき、沈殿として得
られる染色体画分のＤＮＡから常法により染色体ＤＮＡ
を調製した。
（１９０７））にて調製し、ひきつづき、沈殿として得
られる染色体画分のＤＮＡから常法により染色体ＤＮＡ
を調製した。
得られたＤＮＡをサザンハイプリダイゼーションにより
解析するために、まずＬｙｔ−２遺伝子を５．３ｋｂの
大きさに切出すＨｌｎｄｎＩで消化した。
解析するために、まずＬｙｔ−２遺伝子を５．３ｋｂの
大きさに切出すＨｌｎｄｎＩで消化した。
ル−ンあたり約ｌＯμｇのＤＮＡを０．７５％のアガロ
ースを担体として電気泳動し、大きさに応じて分画した
。
ースを担体として電気泳動し、大きさに応じて分画した
。
このＤＮＡをナイロンメンブレンにトランスファーする
ことにより固定した後、ニックトランスレーション法で
ラベルした３２Ｐ −Ｌｙｔ−２，２ｃＤＮＡをプロー
ブにしてＬｙｔ−２遺伝子を検出した。また、各レーン
上のＤＮＡｆｆ１のバラツキからくる不正確さを無くす
るために、内部標識としてＬｙｔ−３遺伝子を用いた。
ことにより固定した後、ニックトランスレーション法で
ラベルした３２Ｐ −Ｌｙｔ−２，２ｃＤＮＡをプロー
ブにしてＬｙｔ−２遺伝子を検出した。また、各レーン
上のＤＮＡｆｆ１のバラツキからくる不正確さを無くす
るために、内部標識としてＬｙｔ−３遺伝子を用いた。
即ち、どの細胞にも１コピーづつ存在するＬｙｔ−３の
オートラジオグラフィー上のバンドの強さを各々のレー
ンにおいて１として、ＬｙＬ−２のバンドの強さの標学
化を行なった。
オートラジオグラフィー上のバンドの強さを各々のレー
ンにおいて１として、ＬｙＬ−２のバンドの強さの標学
化を行なった。
サザンハイプリダイゼーション法によって得られたオー
トラジオグラフィのバンドの強さをデンシトメーターで
１ｌｌ１１定し定量化した。結果を表２に示す。各クロ
ーンにおける５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ存
在下でのＬｙｔ−２遺伝子数を１とし、それに対する相
対値として表示されている。
トラジオグラフィのバンドの強さをデンシトメーターで
１ｌｌ１１定し定量化した。結果を表２に示す。各クロ
ーンにおける５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ存
在下でのＬｙｔ−２遺伝子数を１とし、それに対する相
対値として表示されている。
遺伝子を導入しないし細胞のＬＹｔ−２のコピー数を１
とすると、通常の５００μｍｇ ／ ｍｌハイグロマイ
シンＢ存在下ではトランスフエクタントにおけるＬｙｔ
−２遺伝子は約４〜１０コピーとなり、ａ、ｏｏ。
とすると、通常の５００μｍｇ ／ ｍｌハイグロマイ
シンＢ存在下ではトランスフエクタントにおけるＬｙｔ
−２遺伝子は約４〜１０コピーとなり、ａ、ｏｏ。
μｇ ／ ｍｌ存在下では２０〜５０コピーとなった。
同じＤＮＡ標品について、プローブとしてｐＨＥＢｏを
用いてサザンハイプリダイゼーシコンを行なったところ
、ｐＨＥＢｏのコピー数もＬｙＬ−２のコピー数と平行
して増加していた。
用いてサザンハイプリダイゼーシコンを行なったところ
、ｐＨＥＢｏのコピー数もＬｙＬ−２のコピー数と平行
して増加していた。
表 ２ ｐＨＥ−ＬＹ２Ｇによる形質転換細胞におけ
る相対的ｔ、ｙｔ−２，２遺伝子息細胞名０ ５００１
５００３０００（μｇ／ｍｌ）クローン２ ０．２９
１ １．９ ３．５クローン５ − １ ２．０
５．４クローン７ ０．１７ １ １．２ ４．５
る相対的ｔ、ｙｔ−２，２遺伝子息細胞名０ ５００１
５００３０００（μｇ／ｍｌ）クローン２ ０．２９
１ １．９ ３．５クローン５ − １ ２．０
５．４クローン７ ０．１７ １ １．２ ４．５
第１図はｐＨＥ −ＬＹ２Ｇの遺伝子地図である。
図中Ｈ，Ｅ、 Ｂ、 Ｃ，ＳはそれぞれＨｉｎｄｍ。
ＥｃｏＲＩ、 Ｂａ５ＨＩ、 Ｃ１ａｌ、 ５ａｃｌ
の制限酵素認識部位を表わす。 Ｌ ｙｔ −２，２遺伝子中の白の太い線はエクソンの
うち非翻訳領域、黒の太い線はエクソンの翻訳領域を示
す。またその他の領域はイントロンおよび本遺伝子の５
′側と３′側のフランキング領域を示す。最も３′側に
あるエクソンにつづ＜ ＡＡＡＴＴＡはポリＡ付加シグ
ナルを示す。Ａｍｐ’はアンピシリン耐性遺伝子であり
、ＥＢＶ ｏｒｌＰはエプスタイン−バーウィルスのｏ
ｒＩＰ領域である。ｈｐｈはハイグロマイシンＢ耐性遺
伝子、ｔｋｐとｔｋＡはそれぞれチミジンキナーゼのプ
ロモーターとポリＡシグナルを示す。
の制限酵素認識部位を表わす。 Ｌ ｙｔ −２，２遺伝子中の白の太い線はエクソンの
うち非翻訳領域、黒の太い線はエクソンの翻訳領域を示
す。またその他の領域はイントロンおよび本遺伝子の５
′側と３′側のフランキング領域を示す。最も３′側に
あるエクソンにつづ＜ ＡＡＡＴＴＡはポリＡ付加シグ
ナルを示す。Ａｍｐ’はアンピシリン耐性遺伝子であり
、ＥＢＶ ｏｒｌＰはエプスタイン−バーウィルスのｏ
ｒＩＰ領域である。ｈｐｈはハイグロマイシンＢ耐性遺
伝子、ｔｋｐとｔｋＡはそれぞれチミジンキナーゼのプ
ロモーターとポリＡシグナルを示す。
Claims (2)
- （１）蛋白質をコードする遺伝子とハイグロマイシンＢ
耐性遺伝子で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転
換株をハイグロマイシンＢを含有する培地で培養して、
蛋白質をコードする遺伝子のコピー数を増加させ、得ら
れた動物細胞を培養し、培養動物細胞中に生成する蛋白
質を採取することを特徴とする蛋白質の製造方法。 - （２）蛋白質をコードする遺伝子とハイグロマイシンＢ
耐性遺伝子で動物細胞を形質転換させ、得られた形質転
換株をハイグロマイシンＢを含有する培地で培養して得
られた蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増加した
動物細胞。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62266529A JPH01108995A (ja) | 1987-10-23 | 1987-10-23 | 培養動物細胞による蛋白質の産生を向上させるための遺伝子増幅方法 |
| EP88117380A EP0313009A3 (en) | 1987-10-23 | 1988-10-19 | Method of gene amplification for enhancing protein production in cultured animal cells |
| FI884845A FI884845A7 (fi) | 1987-10-23 | 1988-10-20 | Menetelmä geenin monistamiseksi tarkoituksena lisätä proteiinin tuotantoa viljellyissa eläinsoluissa |
| PT88807A PT88807A (pt) | 1987-10-23 | 1988-10-20 | Processo para a amplificacao de genes e para a preparacao melhorada de proteinas em culturas de celulas animais |
| KR1019880013734A KR890006816A (ko) | 1987-10-23 | 1988-10-21 | 배양 동물 세포 내에서 단백질 생산을 증가시키기 위한 유전자 증폭 방법 |
| AU24089/88A AU2408988A (en) | 1987-10-23 | 1988-10-21 | Method of gene amplification for enhancing protein production in cultured animal cells |
| DK588188A DK588188A (da) | 1987-10-23 | 1988-10-21 | Fremgangsmaade til forstaerkning af et gen i dyreceller, saaledes behandlet celle og dennes anvendelse |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62266529A JPH01108995A (ja) | 1987-10-23 | 1987-10-23 | 培養動物細胞による蛋白質の産生を向上させるための遺伝子増幅方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01108995A true JPH01108995A (ja) | 1989-04-26 |
Family
ID=17432148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62266529A Pending JPH01108995A (ja) | 1987-10-23 | 1987-10-23 | 培養動物細胞による蛋白質の産生を向上させるための遺伝子増幅方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0313009A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01108995A (ja) |
| KR (1) | KR890006816A (ja) |
| AU (1) | AU2408988A (ja) |
| DK (1) | DK588188A (ja) |
| FI (1) | FI884845A7 (ja) |
| PT (1) | PT88807A (ja) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL66065A (en) * | 1981-06-22 | 1989-06-30 | Lilly Co Eli | Recombinant dna cloning vectors and the e.coli transformants thereof |
| CA1341345C (en) * | 1987-05-08 | 2002-03-05 | Hanne Ranch Johansen | Expression of foreign genes in drosophila cells |
| IL86354A0 (en) * | 1987-05-22 | 1988-11-15 | Orion Yhtymae Oy | Episomal vector for the expression of selected dna fragments coding for optional polypeptides in mammalian cells and methods for the production thereof |
| EP0319206A3 (en) * | 1987-11-30 | 1990-04-18 | Berlex Laboratories, Inc. | Gene amplification |
-
1987
- 1987-10-23 JP JP62266529A patent/JPH01108995A/ja active Pending
-
1988
- 1988-10-19 EP EP88117380A patent/EP0313009A3/en not_active Withdrawn
- 1988-10-20 FI FI884845A patent/FI884845A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-10-20 PT PT88807A patent/PT88807A/pt not_active Application Discontinuation
- 1988-10-21 KR KR1019880013734A patent/KR890006816A/ko not_active Withdrawn
- 1988-10-21 AU AU24089/88A patent/AU2408988A/en not_active Abandoned
- 1988-10-21 DK DK588188A patent/DK588188A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0313009A3 (en) | 1989-11-23 |
| EP0313009A2 (en) | 1989-04-26 |
| DK588188D0 (da) | 1988-10-21 |
| FI884845A0 (fi) | 1988-10-20 |
| FI884845L (fi) | 1989-04-24 |
| PT88807A (pt) | 1989-07-31 |
| AU2408988A (en) | 1989-04-27 |
| DK588188A (da) | 1989-04-24 |
| FI884845A7 (fi) | 1989-04-24 |
| KR890006816A (ko) | 1989-06-16 |
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