JPH06343476A - 改良された生産性を有するベクターおよび哺乳動物細胞系 - Google Patents
改良された生産性を有するベクターおよび哺乳動物細胞系Info
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- JPH06343476A JPH06343476A JP6147027A JP14702794A JPH06343476A JP H06343476 A JPH06343476 A JP H06343476A JP 6147027 A JP6147027 A JP 6147027A JP 14702794 A JP14702794 A JP 14702794A JP H06343476 A JPH06343476 A JP H06343476A
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- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 タンパク質発現を増大させるために、異種タ
ンパク質のＤＮＡをコードする配列を哺乳動物細胞系に
導入するための改良ベクターを提供する。 【構成】 そのベクターは、ｃＤＮＡタンパク質をコー
ドする配列、第一プロモーターおよび下流のドナー・イ
ントロンであって、第二プロモーターおよびドナー・イ
ントロン・アクセプターの間に配置された第一プロモー
ターおよび下流のドナー・イントロンを含んでなる。例
示された実施例において、その塩基配列は、因子ＶＩＩ
Ｉをコードしており、トランスフェクションされた細胞
系の高生産性は、最小増幅可能指数を樹立することによ
って保証されるものであって、その方法は、常法とは反
対に、増幅前に比較的低い生産性を有する細胞系を使用
することに、焦点を合わせることである。
ンパク質のＤＮＡをコードする配列を哺乳動物細胞系に
導入するための改良ベクターを提供する。 【構成】 そのベクターは、ｃＤＮＡタンパク質をコー
ドする配列、第一プロモーターおよび下流のドナー・イ
ントロンであって、第二プロモーターおよびドナー・イ
ントロン・アクセプターの間に配置された第一プロモー
ターおよび下流のドナー・イントロンを含んでなる。例
示された実施例において、その塩基配列は、因子ＶＩＩ
Ｉをコードしており、トランスフェクションされた細胞
系の高生産性は、最小増幅可能指数を樹立することによ
って保証されるものであって、その方法は、常法とは反
対に、増幅前に比較的低い生産性を有する細胞系を使用
することに、焦点を合わせることである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般に、遺伝子工学的
に作出された哺乳動物細胞系から、生物学的に活性なタ
ンパク質を生産することに関する。特に、本発明は、細
胞系の生産性を増強する新規なベクターおよび細胞選択
方法に関する。本発明は、特に、組み換え因子ＶＩＩＩ
の生産を増大するために有用である。
に作出された哺乳動物細胞系から、生物学的に活性なタ
ンパク質を生産することに関する。特に、本発明は、細
胞系の生産性を増強する新規なベクターおよび細胞選択
方法に関する。本発明は、特に、組み換え因子ＶＩＩＩ
の生産を増大するために有用である。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子増幅は、哺乳動物細胞におけるタ
ンパク質生産を増大するために広く応用されてきた手法
である。問題のタンパク質をコードしている転写ユニッ
ト（ｃＤＮＡ）は、通常、増幅可能なマーカーに共有結
合される。次いで、転写ユニットとマーカーは、適当な
細胞に同時に導入され、続いて選択され、同時に増幅さ
れる。
ンパク質生産を増大するために広く応用されてきた手法
である。問題のタンパク質をコードしている転写ユニッ
ト（ｃＤＮＡ）は、通常、増幅可能なマーカーに共有結
合される。次いで、転写ユニットとマーカーは、適当な
細胞に同時に導入され、続いて選択され、同時に増幅さ
れる。
【０００３】もっとも広く使用される遺伝子のトランス
フェクションおよび増幅手法は、ＤＨＦＲ欠失のチャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に関連するジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）発現ベクターの使用を
伴う（Kellems, Curr. Op. Biotech. 2:723-729, 199
1）。組織プラスミノーゲンアクチベーター、エリスロ
ポイエチンおよび因子ＶＩＩＩを含む商業的に価値のあ
るタンパク質の多くは、この手法に基づいて生産されて
来た（Kaufman，米国特許第4,740,461号および Kaufman
et al., Mol. Cell. Biol. 5(7):1750-1759, 1985 参
照）。内因性ＤＨＦＲ遺伝子の存在のために、この手法
は、一般にＤＨＦＲ欠失のない細胞宿主にまでは拡大さ
れてない。しかしながら、ＤＨＦＲ+細胞宿主を使用し
て治療用のタンパク質を発現する場合には、極めてわず
かな成功例が報告されているにすぎない。
フェクションおよび増幅手法は、ＤＨＦＲ欠失のチャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に関連するジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）発現ベクターの使用を
伴う（Kellems, Curr. Op. Biotech. 2:723-729, 199
1）。組織プラスミノーゲンアクチベーター、エリスロ
ポイエチンおよび因子ＶＩＩＩを含む商業的に価値のあ
るタンパク質の多くは、この手法に基づいて生産されて
来た（Kaufman，米国特許第4,740,461号および Kaufman
et al., Mol. Cell. Biol. 5(7):1750-1759, 1985 参
照）。内因性ＤＨＦＲ遺伝子の存在のために、この手法
は、一般にＤＨＦＲ欠失のない細胞宿主にまでは拡大さ
れてない。しかしながら、ＤＨＦＲ+細胞宿主を使用し
て治療用のタンパク質を発現する場合には、極めてわず
かな成功例が報告されているにすぎない。
【０００４】米国特許第4,965,199号（Wood, et al., 1
990）には、ＤＨＦＲ+新生児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ
−２１）において因子ＶＩＩＩを生産する方法が記載さ
れている。この方法は、（ｉ）ＤＨＦＲをコードしてい
る第２のＤＮＡ配列に結合された因子ＶＩＩＩをコード
するＤＮＡ配列、およびネオマイシン耐性に関与する選
択マーカーとを宿主細胞による同時トランスフェクショ
ン、（ｉｉ）Ｇ４１８を含有する選択培地による形質導
入株の選択、および（ｉｉｉ）増加量のメトトレキセー
ト（ＭＴＸ）を含有する培地でのＧ４１８耐性細胞の増
殖を必要とする。
990）には、ＤＨＦＲ+新生児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ
−２１）において因子ＶＩＩＩを生産する方法が記載さ
れている。この方法は、（ｉ）ＤＨＦＲをコードしてい
る第２のＤＮＡ配列に結合された因子ＶＩＩＩをコード
するＤＮＡ配列、およびネオマイシン耐性に関与する選
択マーカーとを宿主細胞による同時トランスフェクショ
ン、（ｉｉ）Ｇ４１８を含有する選択培地による形質導
入株の選択、および（ｉｉｉ）増加量のメトトレキセー
ト（ＭＴＸ）を含有する培地でのＧ４１８耐性細胞の増
殖を必要とする。
【０００５】Wallら（Gene, 81: 139-149, 1989)は、ヒ
ト２９３細胞で機能性タンパク質Ｃを発現させるため
に、ＤＨＦＲ／ＭＴＸ同時増幅手法の使用について報告
した。また、Okamotoら(Biotechnol., 8:550-553, 199
0)は，ヒト・リンパ系細胞において顆粒球コロニー刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の増幅および発現について記載し
ている。
ト２９３細胞で機能性タンパク質Ｃを発現させるため
に、ＤＨＦＲ／ＭＴＸ同時増幅手法の使用について報告
した。また、Okamotoら(Biotechnol., 8:550-553, 199
0)は，ヒト・リンパ系細胞において顆粒球コロニー刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の増幅および発現について記載し
ている。
【０００６】組み換えＤＮＡ技術の最近の進歩にも拘わ
らず、因子ＶＩＩＩに関して高い生産性をもった組み換
え細胞クローンの誘導は、難問のまま残されている。引
用することによった本明細書の内容となる欧州特許出願
公開第0260148号（Gorman, 1987年9月17日公開）は、プ
ロモーターの下流および因子ＶＩＩＩをコードしている
ＤＮＡの上流に安定化塩基配列を有する発現ベクター
（ｐＣＩＳ−Ｆ８）の構築を記載している。そのベクタ
ーは、サイトメガロウイルスもしくはＣＭＶのプロモー
ターおよびエンハンサー、因子ＶＩＩＩをコードしてい
るｃＤＮＡ、および３’終止塩基配列を用いて構築され
た。この安定化配列の存在しない場合には、因子ＶＩＩ
Ｉの発現は、試験されたいかなる細胞種においても観察
されなかった。
らず、因子ＶＩＩＩに関して高い生産性をもった組み換
え細胞クローンの誘導は、難問のまま残されている。引
用することによった本明細書の内容となる欧州特許出願
公開第0260148号（Gorman, 1987年9月17日公開）は、プ
ロモーターの下流および因子ＶＩＩＩをコードしている
ＤＮＡの上流に安定化塩基配列を有する発現ベクター
（ｐＣＩＳ−Ｆ８）の構築を記載している。そのベクタ
ーは、サイトメガロウイルスもしくはＣＭＶのプロモー
ターおよびエンハンサー、因子ＶＩＩＩをコードしてい
るｃＤＮＡ、および３’終止塩基配列を用いて構築され
た。この安定化配列の存在しない場合には、因子ＶＩＩ
Ｉの発現は、試験されたいかなる細胞種においても観察
されなかった。
【０００７】ｐＣＩＳ−Ｆ８、ネオマイシン耐性を付与
するプラスミド発現ベクターを用いて、ヒト２９３Ｓ細
胞を同時にトランスフェクションすることによって、本
発明者は、因子ＶＩＩＩの中等度の生産性（０．１−
０．２ｕＵ／ｃ／ｄ）を有する組み換え細胞系を得るこ
とができた。
するプラスミド発現ベクターを用いて、ヒト２９３Ｓ細
胞を同時にトランスフェクションすることによって、本
発明者は、因子ＶＩＩＩの中等度の生産性（０．１−
０．２ｕＵ／ｃ／ｄ）を有する組み換え細胞系を得るこ
とができた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、驚くべ
きことに、種々のトランスフェクション実験から多数の
集団およびコロニーを増幅させる数多くの試みは、メト
トレキセートでの増幅拡大後に高い生産性クローン（１
−２ｕＭまで）を作出することはできなかった。その増
幅は、米国特許第4,740,461号(Kaufman）および第4,96
5,199号(Wood, etal.)記載のように実施された。
きことに、種々のトランスフェクション実験から多数の
集団およびコロニーを増幅させる数多くの試みは、メト
トレキセートでの増幅拡大後に高い生産性クローン（１
−２ｕＭまで）を作出することはできなかった。その増
幅は、米国特許第4,740,461号(Kaufman）および第4,96
5,199号(Wood, etal.)記載のように実施された。
【０００９】
【課題を解決するための手段】今、本発明者は、因子Ｖ
ＩＩＩのようなタンパク質の発現レベルが、哺乳動物細
胞をトランスフェクションするために使用されるベクタ
ーを修飾することによって、顕著に増大させられること
を、初めて発見した。修飾の詳細およびその使用が、以
下に記載される。
ＩＩＩのようなタンパク質の発現レベルが、哺乳動物細
胞をトランスフェクションするために使用されるベクタ
ーを修飾することによって、顕著に増大させられること
を、初めて発見した。修飾の詳細およびその使用が、以
下に記載される。
【００１０】ここに開示するベクターは、タンパク質を
コードする塩基配列、第一プロモーターおよび下流のド
ナー・イントロンであって、第二プロモーターおよびド
ナー・イントロン・アクセプターの間に配置された第一
プロモーターおよび下流のドナー・イントロンを含んで
なる。一つの好適な実施態様においては、因子ＶＩＩＩ
の塩基配列コード（ＦＶＩＩＩＣもしくはＦＶＩＩＩ：
Ｃとしても知られている）およびそのベクターは、ｐＣ
ＡＩＳ−Ｆ８である。また、その因子ＶＩＩＩをコード
している塩基配列は、誘導体、変異体もしくは断片であ
ることができる（例えば、米国特許第5,045,455号 参
照）。そのベクターは、哺乳動物細胞によるタンパク質
発現を増大するために、その細胞中に、異種のタンパク
質塩基配列をコードしている適切なＤＮＡを導入するた
めに使用される。
コードする塩基配列、第一プロモーターおよび下流のド
ナー・イントロンであって、第二プロモーターおよびド
ナー・イントロン・アクセプターの間に配置された第一
プロモーターおよび下流のドナー・イントロンを含んで
なる。一つの好適な実施態様においては、因子ＶＩＩＩ
の塩基配列コード（ＦＶＩＩＩＣもしくはＦＶＩＩＩ：
Ｃとしても知られている）およびそのベクターは、ｐＣ
ＡＩＳ−Ｆ８である。また、その因子ＶＩＩＩをコード
している塩基配列は、誘導体、変異体もしくは断片であ
ることができる（例えば、米国特許第5,045,455号 参
照）。そのベクターは、哺乳動物細胞によるタンパク質
発現を増大するために、その細胞中に、異種のタンパク
質塩基配列をコードしている適切なＤＮＡを導入するた
めに使用される。
【００１１】本明細書は、また、そのタンパク質の連続
生産ができ、しかもより高い生産性を有するような、目
的のタンパク質のための増幅可能な細胞集団を選択する
ための改良された方法についても開示する。
生産ができ、しかもより高い生産性を有するような、目
的のタンパク質のための増幅可能な細胞集団を選択する
ための改良された方法についても開示する。
【００１２】好適な増幅可能なマーカーは、ＤＨＦＲで
あるが、グルタミン・シンテターゼ（ＧＳ）および多剤
耐性（ＭＤＲ）のようなその他のマーカーで置換されて
もよい。トランスフェクションすべき細胞宿主は、全て
の哺乳動物細胞であり、ＤＨＦＲ−欠失である必要はな
い。それらの染色体ＤＮＡ中に選択遺伝子を組み込むこ
とで知られている細胞系が、最良である。例えば、ヒト
胎児性腎（２９３Ｓ）、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）、新生児ハムスター腎（ＢＨＫ−２１）、骨
髄腫、およびＨｅｐＧ２細胞のような肝がん系、および
それに類するものが挙げられる。
あるが、グルタミン・シンテターゼ（ＧＳ）および多剤
耐性（ＭＤＲ）のようなその他のマーカーで置換されて
もよい。トランスフェクションすべき細胞宿主は、全て
の哺乳動物細胞であり、ＤＨＦＲ−欠失である必要はな
い。それらの染色体ＤＮＡ中に選択遺伝子を組み込むこ
とで知られている細胞系が、最良である。例えば、ヒト
胎児性腎（２９３Ｓ）、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）、新生児ハムスター腎（ＢＨＫ−２１）、骨
髄腫、およびＨｅｐＧ２細胞のような肝がん系、および
それに類するものが挙げられる。
【００１３】トランスフェクションされた哺乳動物細胞
系の生産性は、最小増幅可能指数を樹立することによっ
て増強することができ、その方法は、常法とは逆に、最
初の選択とミニクローニングの後ではあるが増幅させる
前に、比較的低い生産性を有する細胞系を使用すること
に焦点を合わすものである。本願によれば、選択された
細胞は、増幅可能指数（△Ｅ＝Ｙ／Ｘ）＞３をもつ必要
があり、その場合Ｘ＝最初の増幅前の細胞の生産性、お
よびＹ＝最初の増幅後の細胞の生産性である。
系の生産性は、最小増幅可能指数を樹立することによっ
て増強することができ、その方法は、常法とは逆に、最
初の選択とミニクローニングの後ではあるが増幅させる
前に、比較的低い生産性を有する細胞系を使用すること
に焦点を合わすものである。本願によれば、選択された
細胞は、増幅可能指数（△Ｅ＝Ｙ／Ｘ）＞３をもつ必要
があり、その場合Ｘ＝最初の増幅前の細胞の生産性、お
よびＹ＝最初の増幅後の細胞の生産性である。
【００１４】
（実施例１）発現ベクターの構築。
【００１５】発現ベクターｐＣＩＳ−Ｆ８およびｐＳＶ
2−ｎｅｏＢａ１６を、欧州特許出願公開第0260148号記
載のように構築した。改良された発現ベクター（ｐＣＡ
ＩＳ−Ｆ８と記す）は、隣接型３’イントロン配列（Ｃ
ＡＰ部位に関して＋１〜＋１３２，図２）を含むアデノ
・主要後期プロモーターを、標準の組み換え技術（Mani
atis, 1990）を用いて、既知のベクターｐＣＩＳ−Ｆ８
のＳａｃＩＩ部位に挿入することによって構築した。こ
の３８２ｂｐＳａｃＩＩ断片は、米国特許第4,965,199
号（Woodら）に記載されたｐＡＭＬ３ｐ．８ｃｌから分
離された。
2−ｎｅｏＢａ１６を、欧州特許出願公開第0260148号記
載のように構築した。改良された発現ベクター（ｐＣＡ
ＩＳ−Ｆ８と記す）は、隣接型３’イントロン配列（Ｃ
ＡＰ部位に関して＋１〜＋１３２，図２）を含むアデノ
・主要後期プロモーターを、標準の組み換え技術（Mani
atis, 1990）を用いて、既知のベクターｐＣＩＳ−Ｆ８
のＳａｃＩＩ部位に挿入することによって構築した。こ
の３８２ｂｐＳａｃＩＩ断片は、米国特許第4,965,199
号（Woodら）に記載されたｐＡＭＬ３ｐ．８ｃｌから分
離された。
【００１６】簡単に言えば、３８２ｂｐ断片は、Ｓａｃ
ＩＩを用いてｐＡＭＬ３ｐ．８ｃｌ５０μｇを消化後ゲ
ル精製された。この断片は、次いで、ＳａｃＩＩを用い
て直鎖状化したｐＣＩＳ−Ｆ８に連結した。２０℃で４
時間連結後、連結混合物５０ｎｇが、イー・コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換するために使用された。
ＡＭＬプロモーターおよびイントロン配列のクローニン
グの成功は、塩基配列決定によって確認された（図
２）。そのベクターの構築図式は、図５に示される。
ＩＩを用いてｐＡＭＬ３ｐ．８ｃｌ５０μｇを消化後ゲ
ル精製された。この断片は、次いで、ＳａｃＩＩを用い
て直鎖状化したｐＣＩＳ−Ｆ８に連結した。２０℃で４
時間連結後、連結混合物５０ｎｇが、イー・コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換するために使用された。
ＡＭＬプロモーターおよびイントロン配列のクローニン
グの成功は、塩基配列決定によって確認された（図
２）。そのベクターの構築図式は、図５に示される。
【００１７】（実施例２）高生産性を有する安定な細胞
クローンの誘導。
クローンの誘導。
【００１８】産生細胞系は、ｐＣＩＳ−Ｆ８もしくはｐ
ＣＡＩＳ−Ｆ８の１０μｇおよびｐＳＶ2−ｎｅｏＢａ
１６の１０μｇにより、製造者の指示に従ってリポフェ
クション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）法を用いて，５ｘ
１０5細胞を同時にトランスフェクションすることによ
って樹立された。典型的なトランスフェクション実験
は、２．５ｘ１０6細胞を必要とする（ＧＩＢＣＯ）。
多重トランスフェクションは、通常、同時に実施され
る。トランスフェクションを２日継続した後、細胞はト
リプシン消化され、４８穴平板（CoStar,増殖面積＝１
００ｍｍ2）中に接種され、そしてＧ４１８（４００μ
ｇ／ｍｌ）を含有する選択培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、重
量比＝１：１）で増殖された。Ｇ４１８耐性細胞の因子
ＶＩＩＩ生産性は、製造者（Coatest,Kabi）の指示によ
る発色性基質法によって、〜５０％集密度において（選
択開始後約３週）測定された。次いで、その細胞は、５
０ｎＭメトトレキセート含有の培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１
２、１：１、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジ
ン欠）で、集密になるまで成長させられた。この最初の
増幅段階は、通常は、約３週間要する。次いで、メトト
レキセート耐性細胞は、因子ＶＩＩＩ生産性に関して定
量された。
ＣＡＩＳ−Ｆ８の１０μｇおよびｐＳＶ2−ｎｅｏＢａ
１６の１０μｇにより、製造者の指示に従ってリポフェ
クション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）法を用いて，５ｘ
１０5細胞を同時にトランスフェクションすることによ
って樹立された。典型的なトランスフェクション実験
は、２．５ｘ１０6細胞を必要とする（ＧＩＢＣＯ）。
多重トランスフェクションは、通常、同時に実施され
る。トランスフェクションを２日継続した後、細胞はト
リプシン消化され、４８穴平板（CoStar,増殖面積＝１
００ｍｍ2）中に接種され、そしてＧ４１８（４００μ
ｇ／ｍｌ）を含有する選択培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、重
量比＝１：１）で増殖された。Ｇ４１８耐性細胞の因子
ＶＩＩＩ生産性は、製造者（Coatest,Kabi）の指示によ
る発色性基質法によって、〜５０％集密度において（選
択開始後約３週）測定された。次いで、その細胞は、５
０ｎＭメトトレキセート含有の培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１
２、１：１、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジ
ン欠）で、集密になるまで成長させられた。この最初の
増幅段階は、通常は、約３週間要する。次いで、メトト
レキセート耐性細胞は、因子ＶＩＩＩ生産性に関して定
量された。
【００１９】細胞系選択方法 各集団の“デルタＥ指数”が、次に測定された。デルタ
Ｅ指数は、Ｘ＝５０ｎＭメトトレキセート選択前の生産
性、およびＹ＝５０ｎＭメトトレキセート選択後の生産
性である場合のデルタＥ＝Ｙ／Ｘとして定義される。典
型的なトランスフェクションは、トランスフェクション
された細胞の２２０−４４０集団のスクリーニングを伴
うであろう。デルタＥ＞３の細胞集団は、さらにサブク
ローニングされ、次のより高いレベル（１００ｎＭ）の
メトトレキセートで増幅された。高い生産性をもった集
団（先行技術によれば、さらなる増幅のために選択され
た）は、より高い生産性まで増幅させることができない
ことに注目すべきである。全てのこれらの集団は、３よ
り低い低デルタＥ指数値を有する。中等度の生産性であ
るが高いデルタＥ指数（＞３）をもつ細胞集団が、より
高い生産性まで増幅された。
Ｅ指数は、Ｘ＝５０ｎＭメトトレキセート選択前の生産
性、およびＹ＝５０ｎＭメトトレキセート選択後の生産
性である場合のデルタＥ＝Ｙ／Ｘとして定義される。典
型的なトランスフェクションは、トランスフェクション
された細胞の２２０−４４０集団のスクリーニングを伴
うであろう。デルタＥ＞３の細胞集団は、さらにサブク
ローニングされ、次のより高いレベル（１００ｎＭ）の
メトトレキセートで増幅された。高い生産性をもった集
団（先行技術によれば、さらなる増幅のために選択され
た）は、より高い生産性まで増幅させることができない
ことに注目すべきである。全てのこれらの集団は、３よ
り低い低デルタＥ指数値を有する。中等度の生産性であ
るが高いデルタＥ指数（＞３）をもつ細胞集団が、より
高い生産性まで増幅された。
【００２０】典型的選択は、９６のサブ集団（９６穴平
板、増殖面積＝３２ｍｍ2）中への、１集団（〜１ｘ１
０5）の細胞の継代培養工程を包含する。その細胞は、
１００ｎＭメトトレキセート中で集密に増殖され、因子
ＶＩＩＩの生産性に関して測定された。次に、最高の生
産性をもった集団が、次のより高いレベルのメトトレキ
セート（２００ｎＭ）中での増幅において、クローン濃
度を高める同様な培養にかけられた。選択の同様な方法
が、確実な高レベルの因子ＶＩＩＩの生産性に達するま
で繰り返された。２９３Ｓ細胞に関して、最高生産性
は、１μＭメトトレキセートにおいて一般には達せられ
る。メトトレキセートのより高いレベルでの増幅は、因
子ＶＩＩＩの生産性をさらに増大することはなかった。
単細胞クローンは、次いで、５０ｎＭメトトレキセート
の存在下での限界希釈クローニングによって得られた。
板、増殖面積＝３２ｍｍ2）中への、１集団（〜１ｘ１
０5）の細胞の継代培養工程を包含する。その細胞は、
１００ｎＭメトトレキセート中で集密に増殖され、因子
ＶＩＩＩの生産性に関して測定された。次に、最高の生
産性をもった集団が、次のより高いレベルのメトトレキ
セート（２００ｎＭ）中での増幅において、クローン濃
度を高める同様な培養にかけられた。選択の同様な方法
が、確実な高レベルの因子ＶＩＩＩの生産性に達するま
で繰り返された。２９３Ｓ細胞に関して、最高生産性
は、１μＭメトトレキセートにおいて一般には達せられ
る。メトトレキセートのより高いレベルでの増幅は、因
子ＶＩＩＩの生産性をさらに増大することはなかった。
単細胞クローンは、次いで、５０ｎＭメトトレキセート
の存在下での限界希釈クローニングによって得られた。
【００２１】表１に示すように、高生産性を有するクロ
ーンは、ｐＣＩＳ−Ｆ８（０．７−１．０ｕＵ／ｃ／
ｄ）およびｐＣＡＩＳ−Ｆ８（１．３−１．５ｕＵ／ｃ
／ｄ）の両方から得られた。ｐＣＡＩＳ−Ｆ８によって
作出されたクローンは、ｐＣＩＳ−Ｆ８によって作出さ
れたクローンよりも生産性において、有意に４０−５０
％増を示した。これらのクローンは、血清を含まない条
件下でも因子ＶＩＩＩの連続生産のために安定であり、
好適である。
ーンは、ｐＣＩＳ−Ｆ８（０．７−１．０ｕＵ／ｃ／
ｄ）およびｐＣＡＩＳ−Ｆ８（１．３−１．５ｕＵ／ｃ
／ｄ）の両方から得られた。ｐＣＡＩＳ−Ｆ８によって
作出されたクローンは、ｐＣＩＳ−Ｆ８によって作出さ
れたクローンよりも生産性において、有意に４０−５０
％増を示した。これらのクローンは、血清を含まない条
件下でも因子ＶＩＩＩの連続生産のために安定であり、
好適である。
【００２２】表１ 種々の発現ベクターによりトランスフェクションされた
２９３Ｓ細胞の増幅クローンの因子ＶＩＩＩ生産性。
２９３Ｓ細胞の増幅クローンの因子ＶＩＩＩ生産性。
【００２３】 ベクター スクリーニング法 クローン＊＊の生産性 （１μＭ） （ｕＵ／ｃ／ｄ） ｐＣＩＳ−Ｆ８ 常法＊ ０.１〜０.２５ ｐＣＩＳ−Ｆ８ デルタＥ ０.７〜１.０ ｐＣＡＩＳ−Ｆ８ 常法＊ ０.１５〜０.３ ｐＣＡＩＳ−Ｆ８ デルタＥ １.３〜１.５ ＊ Ｇ４１８選択が、メトトレキセート中のさらなる増
幅のために選ばれた後の、最高生産性を示す細胞。
幅のために選ばれた後の、最高生産性を示す細胞。
【００２４】＊＊全１０−１２クローンが、１ｕＭメト
トレキセートに対する耐性獲得後の生産性によって評価
された。
トレキセートに対する耐性獲得後の生産性によって評価
された。
【００２５】本明細書において示されるように、デルタ
Ｅ指数は、さらに増幅され得る潜在的な高生産性の細胞
集団を同定するために有用な指標である。
Ｅ指数は、さらに増幅され得る潜在的な高生産性の細胞
集団を同定するために有用な指標である。
【００２６】（実施例３）因子ＶＩＩＩの連続生産。
【００２７】高生産性のクローンの一つが、１０％透析
ウシ胎児血清を補足されたＪｏｋｌｉｋの最小必須培地
（GIBCO）の２５０ｍｌ撹拌培養で、５−７ｘ１０5細胞
／ｍｌの細胞濃度まで増殖された。その培養は、１００
ｒ．ｐ．ｍ．のスピードで撹拌され、３７℃の培養器中
に保たれた。次いで、その細胞は、ハンクス液（GIBC
O）で洗浄され、血清不含の生産培地（インシュリン５
μｇ／ｍｌ、トランスフェリン２５μｇ／ｍｌ、ヒト血
清アルブミン１ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍＭＭｇＣｌ2を
追加されたＪｏｋｌｉｋのＭＥＭ）中５ｘ１０5細胞／
ｍｌの濃度で、２５０ｍｌ撹拌フラスコに再接種され、
３７℃に保たれた。２４時間後、培養液が採取され、発
色性Ｃｏａｔｅｓｔ（Kabi）法によって因子ＶＩＩＩ生
産に関して定量された。その細胞は、遠心分離され、新
鮮な血清不含生産培地に再懸濁され、そしてさらに２４
時間３７℃で培養され、その後同様な操作が、２４時間
間隔で２１日間繰り返された。この生産期間を通して、
細胞の生産性は、１．２−１．５ｕＵ／ｃ／ｄの範囲に
維持された。
ウシ胎児血清を補足されたＪｏｋｌｉｋの最小必須培地
（GIBCO）の２５０ｍｌ撹拌培養で、５−７ｘ１０5細胞
／ｍｌの細胞濃度まで増殖された。その培養は、１００
ｒ．ｐ．ｍ．のスピードで撹拌され、３７℃の培養器中
に保たれた。次いで、その細胞は、ハンクス液（GIBC
O）で洗浄され、血清不含の生産培地（インシュリン５
μｇ／ｍｌ、トランスフェリン２５μｇ／ｍｌ、ヒト血
清アルブミン１ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍＭＭｇＣｌ2を
追加されたＪｏｋｌｉｋのＭＥＭ）中５ｘ１０5細胞／
ｍｌの濃度で、２５０ｍｌ撹拌フラスコに再接種され、
３７℃に保たれた。２４時間後、培養液が採取され、発
色性Ｃｏａｔｅｓｔ（Kabi）法によって因子ＶＩＩＩ生
産に関して定量された。その細胞は、遠心分離され、新
鮮な血清不含生産培地に再懸濁され、そしてさらに２４
時間３７℃で培養され、その後同様な操作が、２４時間
間隔で２１日間繰り返された。この生産期間を通して、
細胞の生産性は、１．２−１．５ｕＵ／ｃ／ｄの範囲に
維持された。
【００２８】上記開示に加えて、種々の変法が、この分
野の技術者には考えられる。例えば、アーグメンティン
グ（ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ）配列とこの開示ベクターの
組み合わせが、ヒトの遺伝子治療を意図したベクターと
して使用することができるであろう。因子ＶＩＩＩの場
合には、そのベクターは、ヒト肝細胞中に組み込まれて
もよい。したがって、上記実施例は、例示として解釈さ
れるべきであり、開示された本発明の範囲は、次の請求
の範囲によってのみ限定されるべきであると考える。
野の技術者には考えられる。例えば、アーグメンティン
グ（ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ）配列とこの開示ベクターの
組み合わせが、ヒトの遺伝子治療を意図したベクターと
して使用することができるであろう。因子ＶＩＩＩの場
合には、そのベクターは、ヒト肝細胞中に組み込まれて
もよい。したがって、上記実施例は、例示として解釈さ
れるべきであり、開示された本発明の範囲は、次の請求
の範囲によってのみ限定されるべきであると考える。
【００２９】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。
ある。
【００３０】１．タンパク質をコードしている塩基配列
と、第一プロモーターおよび下流のドナー・イントロン
であって、第二プロモーターおよびドナー・イントロン
・アクセプターの間に配置されている第一プロモーター
および下流のドナー・イントロンを含んでなるベクタ
ー。
と、第一プロモーターおよび下流のドナー・イントロン
であって、第二プロモーターおよびドナー・イントロン
・アクセプターの間に配置されている第一プロモーター
および下流のドナー・イントロンを含んでなるベクタ
ー。
【００３１】２．前記ドナー・イントロン・アクセプタ
ーの下流に位置する因子ＶＩＩＩもしくは因子ＶＩＩＩ
誘導体をコードしている塩基配列を含んでなる第１項の
ベクター。
ーの下流に位置する因子ＶＩＩＩもしくは因子ＶＩＩＩ
誘導体をコードしている塩基配列を含んでなる第１項の
ベクター。
【００３２】３．組み込まれた染色体要素として第１項
のベクターを包含する哺乳動物細胞系。
のベクターを包含する哺乳動物細胞系。
【００３３】４．組み込まれた染色体要素として第２項
のベクターを包含する哺乳動物細胞系。
のベクターを包含する哺乳動物細胞系。
【００３４】５．哺乳動物細胞中へ染色体組込み的に組
み込まれたベクターｐＣＡＩＳ−Ｆ８。
み込まれたベクターｐＣＡＩＳ−Ｆ８。
【００３５】６．異種タンパク質を生産するための細胞
系を選択する方法であって、 Ａ．異種タンパク質をコードしているＤＮＡ配列、増幅
可能なマーカーをコードしている第２のＤＮＡ配列、お
よび選択可能なマーカーをコードしている第３のＤＮＡ
配列により、哺乳動物細胞を同時にトランスフェクショ
ンする工程； Ｂ．該トランスフェクションされた細胞を、選択培地に
おいてさらにサブ集団にクローニングし、そのような選
択可能なマーカー耐性細胞を選択する工程； Ｃ．異種タンパク質の生産性をアッセイする工程； Ｄ．宿主細胞が増幅可能なマーカーを欠失していない該
選択マーカー耐性細胞を低レベルの選択薬剤を含有する
培地中で培養する工程； Ｅ．各細胞集団について、増幅可能指数△Ｅであって、
次の等式 △Ｅ＝Ｙ／Ｘ 本式中、Ｘは、最初の増幅前の細胞の生産性であり、そ
してＹは、最初の増幅後の細胞の生産性であるで定義さ
れる該指数を樹立させる工程、ならびに Ｆ．△Ｅ指数３以上の値をもつ細胞をさらに増幅させる
ことであって、選択薬剤の量を増大させることにより実
施される該増幅工程を含んでなる方法。
系を選択する方法であって、 Ａ．異種タンパク質をコードしているＤＮＡ配列、増幅
可能なマーカーをコードしている第２のＤＮＡ配列、お
よび選択可能なマーカーをコードしている第３のＤＮＡ
配列により、哺乳動物細胞を同時にトランスフェクショ
ンする工程； Ｂ．該トランスフェクションされた細胞を、選択培地に
おいてさらにサブ集団にクローニングし、そのような選
択可能なマーカー耐性細胞を選択する工程； Ｃ．異種タンパク質の生産性をアッセイする工程； Ｄ．宿主細胞が増幅可能なマーカーを欠失していない該
選択マーカー耐性細胞を低レベルの選択薬剤を含有する
培地中で培養する工程； Ｅ．各細胞集団について、増幅可能指数△Ｅであって、
次の等式 △Ｅ＝Ｙ／Ｘ 本式中、Ｘは、最初の増幅前の細胞の生産性であり、そ
してＹは、最初の増幅後の細胞の生産性であるで定義さ
れる該指数を樹立させる工程、ならびに Ｆ．△Ｅ指数３以上の値をもつ細胞をさらに増幅させる
ことであって、選択薬剤の量を増大させることにより実
施される該増幅工程を含んでなる方法。
【００３６】７．該宿主細胞が、 Ａ．プロモーターの下流および目的の異種タンパク質の
アミノ酸配列をコードしているＤＮＡの上流のオーグメ
ンティング配列； Ｂ．該オーグメンティング配列の下流の、目的のタンパ
ク質のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ；および Ｃ．転写終結部位の下流の、ポリアデニル化配列をコー
ドしているＤＮＡ、を含有する二重鎖ＤＮＡ配列を担持
する発現ベクターを含んでなる第６項の方法。
アミノ酸配列をコードしているＤＮＡの上流のオーグメ
ンティング配列； Ｂ．該オーグメンティング配列の下流の、目的のタンパ
ク質のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ；および Ｃ．転写終結部位の下流の、ポリアデニル化配列をコー
ドしているＤＮＡ、を含有する二重鎖ＤＮＡ配列を担持
する発現ベクターを含んでなる第６項の方法。
【００３７】８．該宿主細胞が、さらにアーグメンティ
ング配列を包含する、第７項の方法。
ング配列を包含する、第７項の方法。
【００３８】９．該アーグメンティング配列が、スプラ
イスドナー1−イントロン1−スプライスドナー2−イン
トロン2−アクセプター配列を包含する、第７項の方
法。
イスドナー1−イントロン1−スプライスドナー2−イン
トロン2−アクセプター配列を包含する、第７項の方
法。
【００３９】１０．該プロモーターが、ヒト・サイトメ
ガロウイルスの即時型初期遺伝子に由来する、第７項の
方法。
ガロウイルスの即時型初期遺伝子に由来する、第７項の
方法。
【００４０】１１．該スプライス1−イントロン1配列
が、アデノウイルスの主要後期プロモーター領域に由来
する、第７項の方法。
が、アデノウイルスの主要後期プロモーター領域に由来
する、第７項の方法。
【００４１】１２．該スプライスドナー2配列が、ヒト
・サイトメガロウイルスに由来する、第７項の方法。
・サイトメガロウイルスに由来する、第７項の方法。
【００４２】１３．該イントロン2−アクセプター配列
が、ヒト免疫グロブリン可変領域に対応する、第７項の
方法。
が、ヒト免疫グロブリン可変領域に対応する、第７項の
方法。
【００４３】１４．異種タンパク質のアミノ酸配列をコ
ードしているＤＮＡが、因子ＶＩＩＩをコードしてい
る、第７項の方法。
ードしているＤＮＡが、因子ＶＩＩＩをコードしてい
る、第７項の方法。
【００４４】１５．異種タンパク質のアミノ酸配列をコ
ードしているＤＮＡが、因子ＶＩＩＩの誘導体、変異
体、もしくは断片をコードしている、第７項の方法。
ードしているＤＮＡが、因子ＶＩＩＩの誘導体、変異
体、もしくは断片をコードしている、第７項の方法。
【００４５】１６．宿主細胞が、ヒト胎児性腎細胞（２
９３）である、第７項の方法。
９３）である、第７項の方法。
【図１】Ａは、先行技術のベクターｐＣＩＳ−Ｆ８を示
し、Ｂは、本願のベクターｐＣＡＩＳ−Ｆ８を示す。
し、Ｂは、本願のベクターｐＣＡＩＳ−Ｆ８を示す。
【図２】Ａは、図１ＡのＣＭＶプロモーターおよびドナ
ー2−イントロン2−アクセプター（Ｄ２Ｉ２Ａ）の線状
地図を示し、Ｂは、図１ＢのＣＭＶプロモーターおよび
ドナー2−イントロン2−アクセプターとの関係において
ＡＭＬプロモーターおよびドナー1−イントロン1の位置
の線状地図を示す。
ー2−イントロン2−アクセプター（Ｄ２Ｉ２Ａ）の線状
地図を示し、Ｂは、図１ＢのＣＭＶプロモーターおよび
ドナー2−イントロン2−アクセプターとの関係において
ＡＭＬプロモーターおよびドナー1−イントロン1の位置
の線状地図を示す。
【図３】アデノ・主要後期プロモーターおよびそのイン
トロンのヌクレオチド配列を示す。
トロンのヌクレオチド配列を示す。
【図４】本願の選択方法全般および△Ｅの算出を例示す
る流れ図である。
る流れ図である。
【図５】ベクターｐＣＡＩＳ−Ｆ８の構築図式を例示す
る流れ図である。
る流れ図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】タンパク質をコードしている塩基配列と、
第一プロモーターおよび下流のドナー・イントロンであ
って、第二プロモーターおよびドナー・イントロン・ア
クセプターの間に配置されている第一プロモーターおよ
び下流のドナー・イントロンを含んでなるベクター。 - 【請求項２】組み込まれた染色体要素として請求項１の
ベクターを含んでなる哺乳動物細胞系。 - 【請求項３】異種タンパク質を生産するための細胞系を
選択する方法であって、 Ａ．異種タンパク質をコードしているＤＮＡ配列、増幅
可能なマーカーをコードしている第２のＤＮＡ配列、お
よび選択可能なマーカーをコードしている第３のＤＮＡ
配列により、哺乳動物細胞を同時にトランスフェクショ
ンする工程； Ｂ．該トランスフェクションされた細胞を、選択培地に
おいてさらにサブ集団にクローニングし、そのような選
択可能なマーカー耐性細胞を選択する工程； Ｃ．異種タンパク質の生産性をアッセイする工程； Ｄ．宿主細胞が増幅可能なマーカーを欠失していない該
選択マーカー耐性細胞を低レベルの選択薬剤を含有する
培地中で培養する工程； Ｅ．各細胞集団について、増幅可能指数△Ｅであって、
次の等式 △Ｅ＝Ｙ／Ｘ 本式中、Ｘは、最初の増幅前の細胞の生産性であり、そ
してＹは、最初の増幅後の細胞の生産性であるで定義さ
れる該指数を樹立させる工程、ならびに Ｆ．△Ｅ指数３以上の値をもつ細胞をさらに増幅させる
ことであって、選択薬剤の量を増大させることにより実
施される該増幅工程を含んでなる方法。 - 【請求項４】該宿主細胞が、 Ａ．プロモーターの下流および目的の異種タンパク質の
アミノ酸配列をコードしているＤＮＡの上流のオーグメ
ンティング配列； Ｂ．該オーグメンティング配列の下流の、目的のタンパ
ク質のアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ；および Ｃ．転写終結部位の下流の、ポリアデニル化配列をコー
ドしているＤＮＡ、を含有する二重鎖ＤＮＡ配列を担持
する発現ベクターを含んでなる請求項３の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7520993A | 1993-06-10 | 1993-06-10 | |
| US075209 | 1993-06-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06343476A true JPH06343476A (ja) | 1994-12-20 |
Family
ID=22124251
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6147027A Pending JPH06343476A (ja) | 1993-06-10 | 1994-06-07 | 改良された生産性を有するベクターおよび哺乳動物細胞系 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5612213A (ja) |
| EP (2) | EP0629700A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06343476A (ja) |
| AT (1) | ATE272122T1 (ja) |
| CA (1) | CA2125449C (ja) |
| DE (1) | DE69433925T2 (ja) |
| DK (1) | DK0874057T3 (ja) |
| ES (1) | ES2226029T3 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997047755A1 (en) * | 1996-06-12 | 1997-12-18 | Japan Tobacco Inc. | Method for the expression of foreign genes and vectors therefor |
| WO2002000915A2 (en) | 2000-06-27 | 2002-01-03 | Basf Aktiengesellschaft | Cyanobacterial nucleic acid fragments encoding proteins useful for controlling plant traits via nuclear or plastome transformation |
| JP2007537713A (ja) * | 2003-10-16 | 2007-12-27 | クラウド ネグリエー | 第ＶＩＩＩ因子及びその誘導体の高発現レベルのための改変されたｃＤＮＡ |
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| US6475725B1 (en) | 1997-06-20 | 2002-11-05 | Baxter Aktiengesellschaft | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
| US6051401A (en) * | 1998-07-28 | 2000-04-18 | Bayer Corporation | Methods and constructs for protein expression |
| US6221349B1 (en) | 1998-10-20 | 2001-04-24 | Avigen, Inc. | Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells |
| US6358703B1 (en) | 1998-12-10 | 2002-03-19 | Bayer Corporation | Expression system for factor VIII |
| US20040235715A1 (en) * | 1999-11-12 | 2004-11-25 | Bayer Corporation | Method of producing glycosylated bikunin |
| US7723102B2 (en) | 2000-09-28 | 2010-05-25 | Bayer Corporation | Enhanced transfection system |
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| ES2525067T3 (es) | 2005-04-07 | 2014-12-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Método de incremento de la función de un vector de AAV |
| US20070214041A1 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-13 | Cisco Technologies, Inc. | System and method for location-based mapping of soft-keys on a mobile communication device |
| US9315825B2 (en) | 2010-03-29 | 2016-04-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
| WO2011126808A2 (en) | 2010-03-29 | 2011-10-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
| TR201908020T4 (tr) | 2011-02-17 | 2019-06-21 | Univ Pennsylvania | Doku özgüllüğünü değiştirmek ve aav9-aracılı gen transferini geliştirmek için bileşimler ve yöntemler. |
| WO2015012924A2 (en) | 2013-04-29 | 2015-01-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and use thereof |
| EP3283126B1 (en) | 2015-04-16 | 2019-11-06 | Emory University | Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof |
| WO2022032140A2 (en) | 2020-08-07 | 2022-02-10 | Amicus Therapeutics, Inc. | Vesicle targeting proteins and uses of same |
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| US5079159A (en) * | 1983-12-27 | 1992-01-07 | Genetics Institute, Inc. | Method for making tissue plasminogen activator |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| AU613316B2 (en) * | 1986-09-12 | 1991-08-01 | Genentech Inc. | Improved recombinant expression |
-
1994
- 1994-05-30 ES ES98108577T patent/ES2226029T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-30 AT AT98108577T patent/ATE272122T1/de active
- 1994-05-30 EP EP94108283A patent/EP0629700A3/en not_active Withdrawn
- 1994-05-30 DK DK98108577T patent/DK0874057T3/da active
- 1994-05-30 DE DE69433925T patent/DE69433925T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-30 EP EP98108577A patent/EP0874057B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-07 JP JP6147027A patent/JPH06343476A/ja active Pending
- 1994-06-08 CA CA2125449A patent/CA2125449C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-03 US US08/333,706 patent/US5612213A/en not_active Expired - Lifetime
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Also Published As
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|---|---|
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| DK0874057T3 (da) | 2004-11-22 |
| EP0874057A2 (en) | 1998-10-28 |
| ES2226029T3 (es) | 2005-03-16 |
| CA2125449A1 (en) | 1994-12-11 |
| DE69433925D1 (de) | 2004-09-02 |
| ATE272122T1 (de) | 2004-08-15 |
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| US5612213A (en) | 1997-03-18 |
| EP0874057A3 (en) | 1999-01-07 |
| DE69433925T2 (de) | 2005-07-28 |
| EP0629700A2 (en) | 1994-12-21 |
| EP0629700A3 (en) | 1995-02-15 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050517 |