JPH01117787A - 酵素もしくは菌体固定粒状体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野１ 本発明は酵素もしくは菌体を包括するキトサン粒状体に
関し、化学品、！！！薬、医薬２食品等を生産するファ
インケミカルの分野に供するのに好適なバイオリアクタ
ーに関するものである。 （従来の技術１ 従来、酵素もしくは菌体を固定化するのにキトサンを用
いたものとして、特開昭５３−１３（３５８４号に開示
された技術がある。該公報で開示されている技術は、キ
トサンを酸性溶液として酵素もしくは微生物菌体を添加
し混合した後、界面活性剤、キトサン以外の高分子物質
と水不溶の有機溶剤を用いてマイクロカプセル化する。 しかる後、温水中で該有機溶剤を蒸発させた微粒子状の
キトサン組成物である。 【発明が解決しようとする問題点］ 上述の固定化酵素もしくは固定化微生物菌体を得る方法
は、複雑な工程を必要とする上に酸性水溶液中で包括操
作を行い、更に有機溶剤を使用して微粒子とするために
酵素もしくは微生物菌体の包括を生じ易く、又、キトサ
ンの懸濁液を調製して微粒子状に成形するために任意の
粒子径にＦｌｊＩｉ５することも粒径分布を均一化する
ことも困難である。そして得られた微粒子状の組成物を
バイオリアクターとして応用し、カラム等に詰めたとき
に圧損を生じ易く、強度も弱いので実際に使用する際に
問題を生じ易い欠点がある。 本発明は、上述の従来技術の欠点を解決し、置換基導入
により水溶性にしたキトサンを用いて中性ｐＨ域で温和
な条件で酵素もしくは菌体を包括固定化することにより
、酵素もしくは菌体の活性の失活を少なくすると共に酵
素もしくは国体固定化物の粒子径を０．１〜３．０ｍ、
の範囲で自由に制御可能とし、更に粒状体の強度を高め
た、工業用途に好適なバイオリアクター用担体に提供す
るものである。− 【問題点を解決するための手段】 本発明は、カルボキシアルキル化水溶性キトサンに酵素
もしくは菌体を接触させ、次いでカルシウムイオンとコ
バルトイオンが共存する水溶液中で該複合体を凝固析出
成形することを特徴とする酵素もしくは菌体固定粒状体
を製造するものである。本発明で用いられるキトサンは
、脱アセチル化度５０〜９５％で平均分子量が１０，０
００〜２３０．０００の低分子量のものが用いられる。 又、該キトサンを酢酸、ジクロロ酢酸、！ｉｉＲ等の単
独もしくはそれらの混合物の水溶液に溶解し、２〜２０
％濃度のキトサン酸性溶液とする。これを水酸化ナトリ
ウム。 水酸化カリウム、アンモニア等の塩基性溶液中に適量づ
つ落下させて粒状に凝固再生した後、中性になる迄充分
水洗して得られた再生キトサンを用いてもよい。この時
、塩基性溶液中にメタノール。 エタノール等の極性を有するアルコール類を加えること
も出来る。水溶性のカルボキシアルキル化キトサンを得
るには、上述のキトサンを４８°Ｂｅの水酸化ナトリウ
ム等の濃アルカリ溶液中に一２０〜４０℃の条件で１〜
２晩浸漬した後、水酸化ナトリウム等のアルカリ成分を
除去し、イソプロピルアルコール、メチルアルコール、
エチルアルコール等の極性溶媒中で、カルボキシアルキ
ル化剤としてモノクロロ酢酸、モノブロム酢酸、２−ク
ロルプロピオン酸、モノクロル酪酸等より選ばれたカル
ボキシアルキル化剤をキトサンに対し２〜１０倍モル吊
を加え、０〜５０℃で１〜２４時間反応させる。 反応終了後、上述の極性ＷｉｔＩＸで洗浄した後、水に
溶解させてカルボキシアルキル化キトサン水溶液を得る
。 該水溶液は透析膜を用いて脱塩、精製した後、エバポレ
ーターを用いてＩＩＨし、１〜２０％の固形分濃度カル
ボキシアルキル化キトサン水溶液とする。次いで、酵素
もしくは菌体をカルボキシアルキル化キトサン水溶液と
混合接触させた後、孔径０．１０〜０．２５　ｔｔｍの
ノズルから凝固欣中に適位づつ滴下し、凝固析出させて
均一な粒径の酵素もしくは菌体固定化粒状体を得る。 本発明に用いられる酵素としては、α−アミラーゼ、β
−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、酸性プロテアーゼ、
ペプシン、ペクチナーゼ、アミノアシラーゼ、インベル
ターゼ等の加水分解酵素、ウリカーゼ、グルコースオキ
シダーゼ等の酸化還元酵素、グルコースイソメラーゼ等
の異性化酵素、トランスアミナーゼ等の転移酵素、ヒア
ウロニダーピ、アスパルターゼ等の脱離酵素等が、又、
菌体としては、ニッシュリア・コリ等のエツジエリチア
属、アスベルギウスオクラセウス等のアスペルギウス属
、ストレプトコッカス・フェーカリス等のストレプトコ
ツカス属、シュードモナス・ドキュネ等のシュードモナ
ス属、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバ
クテリウム属、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
等のブレビバクテリウム属、トリゴノプシス・パリアビ
リス等のトリゴノプシス属、ラクトバチラス・デルブレ
ツキ−等のラクトバチラス属、キャンディダ・トロピカ
リス等のキャンディダ属、ハンヌセラ・ヤディニー等の
ハンヌセラ属、サツカロマイセス・セリビシェ等のサツ
カロマイセス属の属に属する国体が挙げられる。 凝固浴としてはカルシウムイオンとコバルトイオンが共
存した水溶液が用いられ、例えばカルシウムイオンを生
じる化合物としては塩化カルシウム、炭酸カルシウム等
が挙げられ、コバルトイオンを生じる化合物としては塩
化コバルトが挙げられるが、特に塩化カルシウムと塩化
コバルトの組合せが好適である。塩化コバルトの代りに
塩化バリウム、塩化ストロンチウム等の酵素もしくは国
体の活性を失わない化合物を用いることも可能であり、
又、操作的に困難であるが該複合体溶液を塩化カルシウ
ム水溶液中に落下させ、更に塩化コバルト水溶液で処理
することも可能である。凝固浴水溶液中の塩化カルシウ
ムと塩化コバルトの濃度は、夫々が０．００１〜１０重
量％の水溶液濃度であり、好ましくは塩化カルシウムが
０．１〜１０重量％。 塩化コバルトが０．００１〜１重量％の水溶液濃度であ
る。塩化カルシウムのみを用いたカルシウムイオン水溶
液のみを含む凝固浴から再生した粒状体はその強度が低
く、コバルトイオン水溶液を併用することによりバイオ
リアクター用担体として好ましい強度を得ることが出来
るのである。得られた酵素もしくは菌体を固定化した粒
状体を、純水又はクエン酸・リン酸緩衝液、コットホッ
フの緩衝液等で充分洗浄する。 本発明によれば、上記カルボキシアルキル化キトサン水
溶液濃度、凝固浴中のカルシウムイオンとコバルトイオ
ン濃度を適宜選択することによって、粒径０．１〜２．
５順２強度は通水時のｓｖ、’ｈｒが１〜１０の範囲で
圧力損失が１　Ｋｇ　／　ｃｄ以下のような使用に適し
た酵素もしくは菌体固定粒状体を得ることができる。 以下実施例で本発明を詳述するが、本発明はこの範囲に
限定されないことは勿論である。

【実　施　例】

実施例１゜ 脱アセチル化度９５％、平均分子量６５　、０００のキ
トサン１００ｇを４８°Ｂ６の苛性ソーダ１文中で室温
で２時間反応させた。−２０℃で一晩凍結後解凍し、再
び一２０℃で一晩凍結し解凍処理した。 イソプロピルアルコール１１中に処理物を分散させ、モ
ノクロロ酢ｔｊ２８１ｇを添加攪拌し室温で４時間反応
させた。次に１λのイソプロピルアルコールを添加して
撹拌し、デカンテーションを行い洗浄した。この洗浄を
更に二回繰返した。次いでイソプロピルアルコールを蒸
発除去し、純水５０℃に溶解し透析Ｗｊ！（Ｕｎｉｏｎ
　Ｃａｒｂｉｄｅ　Ｃｏｒｐ、製のＳｅａｍｌｅｓｓ　
Ｃｅ１ｌｕｌｏｓｅ　ｔｕｂｉｎｇ　）を用い、外液と
して水ｉｏｏ、ｇを用いて２時間の脱塩を行う。この１
Ｉ５２塩操作を五目繰返し行った。その後エバポレータ
ーを用いて固定弁７％のカルボキシル化キトサン水溶液
１．２１を得た。 次いでアミラーゼ（大野製薬■製、アマノ１５，０００
）（活性単位１５，０ＯＯＵ　／　ｇ＞粉末２０ｇをカ
ルボキシル化キトサン水溶液中に練り込み接触させて原
液とし、孔径０．２５闇のノズルから３％塩化カルシウ
ムと０．４％塩化コバルトの混合水溶液中に落下速度を
夫々１．５．　３．　４ｄ　／　ｎｉｎと変化させて滴
下し、室温で３０分攪拌し、ゲル強度の高い粒子径が夫
々０．５．　０．７．　１．２ａのアミラーゼ固定化粒
状体を夫々４００−ずつ得た。得られた粒状体の発現力
価、圧力損失を次の方法で測定し第１表に示す結果を得
た。 発現力価は０．１モルのＮ−アセチル−０［−メチオニ
ン水溶液（１）８８．０）　１０−に粒状体５ｒＩｄｌ
を加え攪拌し、３７℃で１５分間反応させ、反応停止後
ニンヒドリンの発色により５７０　ｎ１１における吸光
度からアシラーゼ固定化粒状体１ｒＩｉの活性を求めた
。尚、活性単位は３７℃、３０分間でＬ−メチオニン１
μモル生成したものを１０とした。圧力損失は内径が２
．５α、高さ３０αのカラムに粒状体を充填しＳＶ／ｈ
ｒを５で純水を通液した時の圧力損失を測定した。 比較例 特開昭５３−１３６５８４号に記載の方法に準じて行っ
た。 実施例１で用いたキトサン３ｇをＯ，ＩＮ−ｊ：　＠　
５０絨に溶解し、０．５Ｎ−苛性ソーダにてｐＨ６，０
に調節し、全量が２００ｄの１．５％キトサン水溶液を
得た。 この水溶液にアミラーゼ（アマノ１５．０００＞を６．
８９練り込み、２０℃でホモジナイズした。一方、ベン
ゼン１，７００９　、界面活性剤（商品名、スパン２０
゜花王アトラスａＭ）　　ｓｏｏｇ、エチルセルロース
６０９、ポリスチレン４０９を混合した液中にホモジナ
イズした液を注油し３０℃で１０分間攪拌、更に分子ｆ
ｆ１６０．ＯＯＱのポリエチレングリコール７％水溶液
を４　、８００　ｇ添加し、６０℃で４時間攪拌しベン
ゼンを蒸発させ約４００ｄのアミラーゼ固定化微粒子体
を得た。この粒子体の粒径は０．０１〜０．０７．、の
範囲に分布していた。又、発現力価、損力損失を実施例
１と同様の方法で測定し第１表に示す結果を得た。 第　　１　　表 第１表の結果から明らかな如く、本発明の粒状体は粒子
径が大きいので取扱いにも優れ、発現力価は粒子径に関
係なく高く圧力損失も強度が高いことを示し比較例より
好適なことを示した。 実施例２゜ サッカロース１５０９／１．　Ｈｆｆｌエキス４ｇ／ρ
。 ポリペプトン４ｇ／父、ｉ酸マグネシウム７水和物０．
１ｇ／、１２．塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／文、
硫酸アンモニウム１．：Ｉｇ／文、リン酸２水素カリウ
ム１．０ｇ／　１の培養液１λ中にエタノール生産菌で
あるＩＦＯ１９５３のサツカロマイセス・セルビシアー
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）を５×１０８ｃｅｌｌｓ加え、三日間培養し、その
培養液をデカンテーションし、更に０．９％塩化ナトリ
ウム水溶液２００ｄで５分間攪拌デカンテーションをミ
ロ繰返し洗浄、濾別した国体を湿重岱で５ｇ採取し、実
施例１と同様にして得たカルボキシメチル化キトサン水
溶液１０ｄに繰り込み接触させ、４％塩化カルシウムと
０．０５％塩化コバルトの混合水溶液中に孔径０．２５
１＋１＃ｌのノズルより滴下し凝固析出させ、次いで０
．９％の食塩水溶液１００ｄ中でミロ洗浄し、粒子径０
．７順の菌体固定化粒状体１５ｍを得た。 この粒状体を上述の培養液１５０ｄ中に入れて３０℃、
７２時間培養した結果、菌体は顕著な増値を示し、国体
のリークは認められなかった。そして活発にエタノール
を生産し２４時間後の培養液中のエタノール濃度を測定
した結果３％であった。

【発明の効果】

本発明による酵素もしくは菌体固定粒状体は、カルボキ
シアルキル化水溶性キトサンに酵素もしくは国体を接触
させて、カルシウムイオンとコバルトイオンが共存する
水溶液中で凝固析出させることで得られるものである。 従って、酵素もしくは菌体の活性を消失させる様な薬品
を用いてないので活性も高く、又１粒状体の強度も充分
に高く、工業的にバイオリアクター用担体として用いた
時にも圧力損失が少なく、実用上好適なものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カルボキシアルキル化水溶性キトサンに酵素もしく
   は菌体を接触させ、カルシウムイオンとコバルトイオン
   が共存する水溶液中で凝固析出成形することを特徴とす
   る酵素もしくは菌体固定粒状体の製造法。 ２、カルシウムイオンとコバルトイオンが共存する水溶
   液が塩化カルシウムと塩化コバルトの水溶液である特許
   請求の範囲第１項記載の酵素もしくは菌体固定粒状体の
   製造法。