JPH01124382A - 導入抗原タンパク質を有する動物由来細胞 - Google Patents
導入抗原タンパク質を有する動物由来細胞Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、細胞の他の細胞に対する結合およびそれとの
融合を誘発する抗原タンパク質を膜中へ導入された動物
由来細胞に関する。より詳しくは本発明は、外膜がその
中に、修飾された細胞またはリポソームを種々の標的細
胞、殊にウィルス例えばヒト免疫不全ウィルス（以下Ｈ
ＩＶとして示す）に感染した細胞に生体内および試験管
内で選択的に結合させる特異性タンパク質物質を取込ん
だ修飾された細胞およびリポソームに関する。
融合を誘発する抗原タンパク質を膜中へ導入された動物
由来細胞に関する。より詳しくは本発明は、外膜がその
中に、修飾された細胞またはリポソームを種々の標的細
胞、殊にウィルス例えばヒト免疫不全ウィルス（以下Ｈ
ＩＶとして示す）に感染した細胞に生体内および試験管
内で選択的に結合させる特異性タンパク質物質を取込ん
だ修飾された細胞およびリポソームに関する。
背景の情報
後天性免疫不全症候群（エイズ）は明示された年代学的
配列の症状および高い死亡率を特徴とするビルレント疾
患である（カラン（ｃｕｒｒａｎ、Ｊ、Ｗ、）ほか、「
エイズの疫学」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ＋２
２９．１３５２〜１３５７ （１９８５））。エイズ
は１９８１年に初めて記載され、そのときから米国のみ
で約４００．０００例を有する流行割合および９０％以
上の３年死亡率に達した。今日米国中に約１００万のヒ
トがヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に感染されたと推
定される。ＨＩ Ｖはコアタンパク質、ゲノムＲＮＡお
よび酵素逆転写酵素を含むレトロウィルスとして分類さ
れている。
配列の症状および高い死亡率を特徴とするビルレント疾
患である（カラン（ｃｕｒｒａｎ、Ｊ、Ｗ、）ほか、「
エイズの疫学」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ＋２
２９．１３５２〜１３５７ （１９８５））。エイズ
は１９８１年に初めて記載され、そのときから米国のみ
で約４００．０００例を有する流行割合および９０％以
上の３年死亡率に達した。今日米国中に約１００万のヒ
トがヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に感染されたと推
定される。ＨＩ Ｖはコアタンパク質、ゲノムＲＮＡお
よび酵素逆転写酵素を含むレトロウィルスとして分類さ
れている。
ＨＩＶの若干の抗原に対する抗体が感染したヒトの血清
中に存在する。
中に存在する。
エイズにおける免疫不全の特徴はＴ４ヘルパー／インデ
ューサーリンパ球の消耗である〔ゴツトリーブ（Ｇｏｔ
ｔｌｉｅｂ）ほか、ニュー・イングランド・ジャーナル
・オプ・メデイシン（Ｎ、 ＥｎｇＪ、 Ｍｅｄ、）、
３０５．１４２５〜１４３１ （１９８１） ）。
ューサーリンパ球の消耗である〔ゴツトリーブ（Ｇｏｔ
ｔｌｉｅｂ）ほか、ニュー・イングランド・ジャーナル
・オプ・メデイシン（Ｎ、 ＥｎｇＪ、 Ｍｅｄ、）、
３０５．１４２５〜１４３１ （１９８１） ）。
この欠損は主にリンパ球のこの集団のＨＩＶによる選択
的感染の結果である。ヘルパーリンパ−球の表面上に存
在するＴ４分子（ｃＤ４抗原を示す）はＴ４リンパ球の
表面に対する特異的結合後に細胞内に入るＨＩＶウィル
スに対する受容体として関連づけられた〔ダルグレイシ
ュ（Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ）ほか、ネーチ＋−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、 ３１２． ７６３〜７６７（１９８４））
。ウィルスが入る機構は完全には示されなかったが、し
かし受容体仲介エンドサイトークスまたはＨＩＶエンベ
ロープと細胞膜との直接融合に類似するであろう〔ステ
ィン（Ｓｔｅｉｎ）ほか、セル（ｃｅｌｌ）、４９．
６５９〜６６８（１９８７））。
的感染の結果である。ヘルパーリンパ−球の表面上に存
在するＴ４分子（ｃＤ４抗原を示す）はＴ４リンパ球の
表面に対する特異的結合後に細胞内に入るＨＩＶウィル
スに対する受容体として関連づけられた〔ダルグレイシ
ュ（Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ）ほか、ネーチ＋−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、 ３１２． ７６３〜７６７（１９８４））
。ウィルスが入る機構は完全には示されなかったが、し
かし受容体仲介エンドサイトークスまたはＨＩＶエンベ
ロープと細胞膜との直接融合に類似するであろう〔ステ
ィン（Ｓｔｅｉｎ）ほか、セル（ｃｅｌｌ）、４９．
６５９〜６６８（１９８７））。
フソーゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）タンパク質、ｇｐ１２０
（分子量１２０，０００ ドルトンの糖タンパク質）
と称される〔マクドウガル（Ｍｃ Ｄｏｕｇａｌｌ）ほ
か、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３１．３８２〜
３８５（１９８６））、がＨＩＶ表面上に確認され、こ
のタンパク質がウィルスとリンパ球との間の融合を仲介
する作用をすることができる。細胞の内部に入るとウィ
ルスＲＮＡが逆転写酵素によりＯＮへ中へ転写される。
（分子量１２０，０００ ドルトンの糖タンパク質）
と称される〔マクドウガル（Ｍｃ Ｄｏｕｇａｌｌ）ほ
か、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３１．３８２〜
３８５（１９８６））、がＨＩＶ表面上に確認され、こ
のタンパク質がウィルスとリンパ球との間の融合を仲介
する作用をすることができる。細胞の内部に入るとウィ
ルスＲＮＡが逆転写酵素によりＯＮへ中へ転写される。
その後ＤＮＡが宿主ゲノム中へ組込まれる。しかし、Ｈ
ＩＶ ＤＮＡの大部分は組込まれないで細胞質中に保
たれる。現在、感染細胞が「活性化されるまでＨＩ Ｖ
複製がこの段階で制限されることが知られている〔マク
ドウガル（Ｍｅ Ｄｏｕｇａｌ）ほか、ジャーナル・オ
プ・イムノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）、
１３５ 、３１５１〜３１６２（１９８５））。ＨＩ
Ｖ感染後の複製の潜在的活性化因子にはウィルス例えば
Ｂ型肝炎、ヒトサイトメガロウィルスおよび単純ヘルペ
スウィルスが含まれると思われている。活性化後、ＨＩ
Ｖが複製され、次いで細胞表面上組立てられる。次いで
成熟ピリオンがＴ４１Ｊンパ球の表面膜からの出芽によ
り形成される。ＨＩＶ複製の開始後Ｔ４リンパ球が殺さ
れるであろう。
ＩＶ ＤＮＡの大部分は組込まれないで細胞質中に保
たれる。現在、感染細胞が「活性化されるまでＨＩ Ｖ
複製がこの段階で制限されることが知られている〔マク
ドウガル（Ｍｅ Ｄｏｕｇａｌ）ほか、ジャーナル・オ
プ・イムノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）、
１３５ 、３１５１〜３１６２（１９８５））。ＨＩ
Ｖ感染後の複製の潜在的活性化因子にはウィルス例えば
Ｂ型肝炎、ヒトサイトメガロウィルスおよび単純ヘルペ
スウィルスが含まれると思われている。活性化後、ＨＩ
Ｖが複製され、次いで細胞表面上組立てられる。次いで
成熟ピリオンがＴ４１Ｊンパ球の表面膜からの出芽によ
り形成される。ＨＩＶ複製の開始後Ｔ４リンパ球が殺さ
れるであろう。
Ｔ４リンパ球に対するＨＩＶウィルスの細胞変性効果は
現在知られていないけれども、ＨＩＶ感染が起ると、ウ
ィルスのｇＰ１２０抗原が感染Ｔ４リンパ球の表面上に
発現されることが観察された。
現在知られていないけれども、ＨＩＶ感染が起ると、ウ
ィルスのｇＰ１２０抗原が感染Ｔ４リンパ球の表面上に
発現されることが観察された。
このタンパク質の通常存在するＣＤ４抗原に対する親和
性のために他のＴ４１Ｊンパ球（未感染でＣＤ４抗原を
有する）が感染リンパ球と融合することができる。生じ
た細胞の結合および融合が、融合に含まれた両方または
すべての細胞を殺すと思われる（ザグリ （２ａｇｕｒ
ｙ）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、 ２３１．
８５０〜８５３ （１９８６） ］。
性のために他のＴ４１Ｊンパ球（未感染でＣＤ４抗原を
有する）が感染リンパ球と融合することができる。生じ
た細胞の結合および融合が、融合に含まれた両方または
すべての細胞を殺すと思われる（ザグリ （２ａｇｕｒ
ｙ）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、 ２３１．
８５０〜８５３ （１９８６） ］。
例えば、表面上にＣＤ４抗原のない細胞系のＴ４リンパ
球並びに細胞と抗ＣＤ４抗体との反応により抗原がマス
クされたＴ４細胞は通常状態下でＨＩ Ｖ感染Ｔ４細胞
との融合を示さない〔マク ドウガル（Ｍｃ Ｄｏｕｇ
ａｌｌ） 、前掲〕。
球並びに細胞と抗ＣＤ４抗体との反応により抗原がマス
クされたＴ４細胞は通常状態下でＨＩ Ｖ感染Ｔ４細胞
との融合を示さない〔マク ドウガル（Ｍｃ Ｄｏｕｇ
ａｌｌ） 、前掲〕。
この融合過程は若干のＨＩＶ感染および多数の非感染Ｔ
４細胞を包含することができ、大シンシチウムの形成を
生ずることができ、それが次いで細網内皮系の細胞によ
り循環から除去されるか、さもなければ溶解することが
できる（例えば脳のような脂管中）〔ショー（Ｓｈａｗ
）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７． １
７７〜１８Ｌ （１９８５）；ガードナー（Ｇａｒｔｎ
ｅｒ）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅ−ｎｃｅ）、２３３
．２１５〜２１９ （１９８６）］。
４細胞を包含することができ、大シンシチウムの形成を
生ずることができ、それが次いで細網内皮系の細胞によ
り循環から除去されるか、さもなければ溶解することが
できる（例えば脳のような脂管中）〔ショー（Ｓｈａｗ
）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７． １
７７〜１８Ｌ （１９８５）；ガードナー（Ｇａｒｔｎ
ｅｒ）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅ−ｎｃｅ）、２３３
．２１５〜２１９ （１９８６）］。
Ｔ４１Ｊンバ球は免疫応答において中心的役割を演する
。それはマクロファージ、細胞障害性Ｔ細胞、ＮＫ （
ナチュラルキラー）細胞およびＢ’Ｊンパ球とともに均
一に含まれる。従って、Ｔ４リンパ球集団の選択的消耗
でも多くの免疫欠損を生じ、エイズに特有の生命を脅か
す日和見感染を生ずる〔ボウエン（Ｂｏｗｅｎ）ほか、
アナルス・オブ・インターナル・メデイシン（Ａｎｎ、
ＩｎｔｅｒｎｏＭｅｄ、）、 Ｌ ０３゜７０４〜７０
９ （１９８５））。さらに単球およびマクロファージ
の一定集団もまたＣＤ４抗原を発現し、研究によりこれ
らの細胞もまたＨｒＶ感染されることができることが示
された〔ホー（ｌｌｏ）ほか、ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・インベスティゲーション（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、
Ｉｎｖｅｓｔ、’）、 ７７゜１７１２〜１７１５ （
１９８６））。単球のＨＩＶ惑染感染化性における欠損
を生ずることができ、それはエイズで報告された。感染
マクロファージはＨＩ Ｖウィルスを中枢神経系へ運ぶ
ことができ、この疾患に生ずる亜急性脳炎の発現を可能
にする〔ガブズダ（Ｇａｂｕｚｄａ）ほか、アナルス・
オブ・ノイｏロジー（Ａｎｎ、 Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）
、 ２０゜２８９〜２９５ （１９８６））。ＨＩＶ
惑染感染は腫瘍壊死因子を含む種々の因子を生ずること
ができ、それがエイズの慢性熱およびまた悪液質の関連
状態（一般栄養不良）を説明できた。
。それはマクロファージ、細胞障害性Ｔ細胞、ＮＫ （
ナチュラルキラー）細胞およびＢ’Ｊンパ球とともに均
一に含まれる。従って、Ｔ４リンパ球集団の選択的消耗
でも多くの免疫欠損を生じ、エイズに特有の生命を脅か
す日和見感染を生ずる〔ボウエン（Ｂｏｗｅｎ）ほか、
アナルス・オブ・インターナル・メデイシン（Ａｎｎ、
ＩｎｔｅｒｎｏＭｅｄ、）、 Ｌ ０３゜７０４〜７０
９ （１９８５））。さらに単球およびマクロファージ
の一定集団もまたＣＤ４抗原を発現し、研究によりこれ
らの細胞もまたＨｒＶ感染されることができることが示
された〔ホー（ｌｌｏ）ほか、ジャーナル・オブ・クリ
ニカル・インベスティゲーション（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、
Ｉｎｖｅｓｔ、’）、 ７７゜１７１２〜１７１５ （
１９８６））。単球のＨＩＶ惑染感染化性における欠損
を生ずることができ、それはエイズで報告された。感染
マクロファージはＨＩ Ｖウィルスを中枢神経系へ運ぶ
ことができ、この疾患に生ずる亜急性脳炎の発現を可能
にする〔ガブズダ（Ｇａｂｕｚｄａ）ほか、アナルス・
オブ・ノイｏロジー（Ａｎｎ、 Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）
、 ２０゜２８９〜２９５ （１９８６））。ＨＩＶ
惑染感染は腫瘍壊死因子を含む種々の因子を生ずること
ができ、それがエイズの慢性熱およびまた悪液質の関連
状態（一般栄養不良）を説明できた。
さらに、新抗原に対する低い抗体応答と結合した高濃度
の免疫グロブリンによる多クローン性活性化からなるＢ
リンパ球異常がエイズで普通であリ、ＨＴＶ感染の直接
的結果であることができる。
の免疫グロブリンによる多クローン性活性化からなるＢ
リンパ球異常がエイズで普通であリ、ＨＴＶ感染の直接
的結果であることができる。
エイズの一層進行した段階における患者は通常無力性で
ある（すなわち、普通の抗原に対する減退した免疫応答
を示す）。
ある（すなわち、普通の抗原に対する減退した免疫応答
を示す）。
エイズは治療が非常に困難なことが証明され、治癒する
に任される。これまでに若干の異なる方法が試みられた
。現在研究されている可能性のある処置は次のものであ
る： Ｔａ） 逆転写酵素の阻止因子 この型の治療は、標的酵素がヒト細胞中に見出されない
ので非常に選択的であることができる。この種の始原型
薬物はアジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）であ
る。この薬物は１１■および■期の研究に合格し、現在
エイズをもつ患者および以前にニューモジステイス（ｐ
ｎｅｕ−ｍｏｃｙｓ ｔｉｓ）感染を有した患者の治療
に承認されている。研究はこの薬物で処置した患者がヘ
ルパーＴリンパ球の高濃度を示しまた約１７３が陽性皮
膚試験を示すことを示した（後者は以前に無力性であっ
た）、さらに、その疾患に特有の神経系欠損に対する改
善がある〔ヤーチェン（Ｙａｒｃｈｏａｎ）ほか、ラン
セット（Ｌａｎｃｅｔ） 、５７５〜５８０頁（１９８
６）参照〕。しかし、臨床および免疫パラメーターにお
ける前記改善にもかかわらず、ウィルスがリンパ球中に
生き残ることが認められる。
に任される。これまでに若干の異なる方法が試みられた
。現在研究されている可能性のある処置は次のものであ
る： Ｔａ） 逆転写酵素の阻止因子 この型の治療は、標的酵素がヒト細胞中に見出されない
ので非常に選択的であることができる。この種の始原型
薬物はアジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）であ
る。この薬物は１１■および■期の研究に合格し、現在
エイズをもつ患者および以前にニューモジステイス（ｐ
ｎｅｕ−ｍｏｃｙｓ ｔｉｓ）感染を有した患者の治療
に承認されている。研究はこの薬物で処置した患者がヘ
ルパーＴリンパ球の高濃度を示しまた約１７３が陽性皮
膚試験を示すことを示した（後者は以前に無力性であっ
た）、さらに、その疾患に特有の神経系欠損に対する改
善がある〔ヤーチェン（Ｙａｒｃｈｏａｎ）ほか、ラン
セット（Ｌａｎｃｅｔ） 、５７５〜５８０頁（１９８
６）参照〕。しかし、臨床および免疫パラメーターにお
ける前記改善にもかかわらず、ウィルスがリンパ球中に
生き残ることが認められる。
（ｂ） 一般抗ウイルス剤
現在リバビリン（ｆｉｂａｖｉｒｉｎ）、ホスカーネッ
ト（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ） （ＨＰ Ａ −２３）およ
びスラミン（Ｓｕｒａｍｉｎ）のような化合物が研究中
である。現在これらの物質の有効性について利用できる
データがない。
ト（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ） （ＨＰ Ａ −２３）およ
びスラミン（Ｓｕｒａｍｉｎ）のような化合物が研究中
である。現在これらの物質の有効性について利用できる
データがない。
（ｃ） 免疫修飾物質
この型の処置にはエイズをもつ患者中の欠損免疫系を高
めまたは再構成する試みが包含される。そのような試み
は数年間行なわれた。試験された免疫修飾物質の１つは
α−インターフェロン、抗ウイルス免疫修飾および抗増
殖効果を有する白血球由来糖タンパク質である。この物
質はヒト患者に単に最少の有効性を示したが、許容でき
ない毒性水準を示した〔ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎｎ）ほ
か、アメリカン・ジャーナル・オブ・メデイシン（Ａｍ
、 Ｊ、 Ｍｅｄ、）、 ７８． ７３７〜７４１
（１９８５））。エイズ患者に試験された類似物質は
インターロイキン−２である。
めまたは再構成する試みが包含される。そのような試み
は数年間行なわれた。試験された免疫修飾物質の１つは
α−インターフェロン、抗ウイルス免疫修飾および抗増
殖効果を有する白血球由来糖タンパク質である。この物
質はヒト患者に単に最少の有効性を示したが、許容でき
ない毒性水準を示した〔ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎｎ）ほ
か、アメリカン・ジャーナル・オブ・メデイシン（Ａｍ
、 Ｊ、 Ｍｅｄ、）、 ７８． ７３７〜７４１
（１９８５））。エイズ患者に試験された類似物質は
インターロイキン−２である。
後者はＴリンパ球の全数を高め、リンパ球からのＨＩＶ
の分離を低下するが、しかし排除しないことが示された
。それはまたカボジ肉腫、後者はエイズの一層進行した
期に関連する悪性腫瘍、の最少程度の退行に関連づけら
れた〔プログ−（Ｂｒｏｄｅｒ）ほか、ランセット（Ｌ
ａｎｃｅｔ） ＋６２７〜６３０頁（１９８５））。
の分離を低下するが、しかし排除しないことが示された
。それはまたカボジ肉腫、後者はエイズの一層進行した
期に関連する悪性腫瘍、の最少程度の退行に関連づけら
れた〔プログ−（Ｂｒｏｄｅｒ）ほか、ランセット（Ｌ
ａｎｃｅｔ） ＋６２７〜６３０頁（１９８５））。
（ｄ）移植
骨髄移植が若干のエイズ患者に試みられ、その目的は患
者の免疫反応性の再構成であった。
者の免疫反応性の再構成であった。
そのような療法は長期経続よりはむしろ一過性の状態の
改善を生じたにすぎなかった。
改善を生じたにすぎなかった。
リポソームと細胞または核エンベロープとを有効に溶融
させる方法が記載された 〔アービンテ（Ａｒｖｉｎｔｅ）ほか、バイオケミスト
リー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２６，７６５〜７
７２（１９８６）参照〕。多（の場合に、そのような融
合は、タンパク質、ペプチド、ポリエチレングリコール
、ウィルスエンベローフタンパク質などであることがで
きるフソーゲンといわれる誘発性物質を用いて行なわれ
た。若干の場合に融合誘発性物質には媒質の改変状態が
包含される。従って、低ｐＨがリポソームと核エクベロ
ープとの融合の誘発に有利に使用された〔アービンテ（
Ａｒｙｉｎｔｅ）ほか、バイオケミストリー（Ｂ ｉｏ
ｃｈｅｍ １ｓｔｒｙ）、前掲〕。
させる方法が記載された 〔アービンテ（Ａｒｖｉｎｔｅ）ほか、バイオケミスト
リー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２６，７６５〜７
７２（１９８６）参照〕。多（の場合に、そのような融
合は、タンパク質、ペプチド、ポリエチレングリコール
、ウィルスエンベローフタンパク質などであることがで
きるフソーゲンといわれる誘発性物質を用いて行なわれ
た。若干の場合に融合誘発性物質には媒質の改変状態が
包含される。従って、低ｐＨがリポソームと核エクベロ
ープとの融合の誘発に有利に使用された〔アービンテ（
Ａｒｙｉｎｔｅ）ほか、バイオケミストリー（Ｂ ｉｏ
ｃｈｅｍ １ｓｔｒｙ）、前掲〕。
操作は以前には生体内の特定細胞に対する異なる分子の
標的送達のために開発された〔ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａ
ｕ）ほか、ビオシミ力・工・ヒ゛オフイジカ・アクタ（
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ）
、 ８０５゜３５４〜３６７ （１９８４）］。そ
のような標的性は二重層中に特定的に選択された糖脂質
を含有したリポソームの使用により実現された。そのよ
うな糖脂質はそれらの上の、標的細胞の形質膜上の１ま
たはそれ以上のレクチン（一定の型の炭水化物構造に特
異的に結合する植物細胞から誘導された物質）により認
識された末端炭水化物の存在を基にして選択された〔ニ
コラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ほか、プロシーデインゲス・
オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ゛・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。
標的送達のために開発された〔ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａ
ｕ）ほか、ビオシミ力・工・ヒ゛オフイジカ・アクタ（
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ）
、 ８０５゜３５４〜３６７ （１９８４）］。そ
のような標的性は二重層中に特定的に選択された糖脂質
を含有したリポソームの使用により実現された。そのよ
うな糖脂質はそれらの上の、標的細胞の形質膜上の１ま
たはそれ以上のレクチン（一定の型の炭水化物構造に特
異的に結合する植物細胞から誘導された物質）により認
識された末端炭水化物の存在を基にして選択された〔ニ
コラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ほか、プロシーデインゲス・
オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ゛・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。
Ｓｃｉ、） 、８０．７１２８〜７１３２ （１９８３
）参照〕。
）参照〕。
そのような方法が働くには、標的細胞がその膜内に他の
細胞の膜内に存在する分子に対し特異性でそれに結合す
る受容体を含まねばならない。次に細胞の融合を誘発す
ることが必要であり、それはフソーゲン物質を用いて実
験的に、または自然にウィルス感染に由来するタンパク
質のような一定の融合剤により行なうことができる〔ガ
ロ（Ｇａｌｉｏ）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
＋ ２２４ ＋、 ５００〜５０３ （１９８３））
。
細胞の膜内に存在する分子に対し特異性でそれに結合す
る受容体を含まねばならない。次に細胞の融合を誘発す
ることが必要であり、それはフソーゲン物質を用いて実
験的に、または自然にウィルス感染に由来するタンパク
質のような一定の融合剤により行なうことができる〔ガ
ロ（Ｇａｌｉｏ）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
＋ ２２４ ＋、 ５００〜５０３ （１９８３））
。
発明の概要
本発明の目的は、種々の細胞毒素および溶菌物質、有利
にはタンパク質リシンを取込ませたＣＤ４保持細胞、有
利には赤血球、あるいはリポソームを生成させることに
よりＨＩＶ感染細胞とＣＤ４保持細胞との選択的融合を
利用することである。
にはタンパク質リシンを取込ませたＣＤ４保持細胞、有
利には赤血球、あるいはリポソームを生成させることに
よりＨＩＶ感染細胞とＣＤ４保持細胞との選択的融合を
利用することである。
そのような方法はＨＩＶ惑染感染の選択的な殺害を生ず
る。そのような目的は形質膜または脂質二重層（場合に
よる）中にＣＤ４抗原をもち、かつ細胞障害物質例えば
りシン、ゲロニンおよび（または）それらと等価の物質
を含有する一群のエンジニアド（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
）赤血球またはリポソームの構築により実現される。
る。そのような目的は形質膜または脂質二重層（場合に
よる）中にＣＤ４抗原をもち、かつ細胞障害物質例えば
りシン、ゲロニンおよび（または）それらと等価の物質
を含有する一群のエンジニアド（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
）赤血球またはリポソームの構築により実現される。
本発明の他の目的は抗原を細胞の形質膜中へ導入する方
法を提供することである。
法を提供することである。
本発明の目的はまた、毒性および細胞溶解物質を選定リ
ポソームおよび細胞中へ取込ませる方法を提供すること
である。
ポソームおよび細胞中へ取込ませる方法を提供すること
である。
本発明の他の目的は、そのようなエンジニアド細胞また
はリポソームの最適量を罹患患者中へ導入し、ウィルス
が感染標的細胞内で複製するかまたは他の健全細胞に対
する細胞の結合を促進してウィルスを拡散しまたはそれ
らに対する身体の防禦を阻害することができる前に、こ
れらの細胞またはリポソームを生体内でウィルス感染細
胞に結合させ、それと融合して破壊させることによりウ
ィルス疾患状態を軽減することである。
はリポソームの最適量を罹患患者中へ導入し、ウィルス
が感染標的細胞内で複製するかまたは他の健全細胞に対
する細胞の結合を促進してウィルスを拡散しまたはそれ
らに対する身体の防禦を阻害することができる前に、こ
れらの細胞またはリポソームを生体内でウィルス感染細
胞に結合させ、それと融合して破壊させることによりウ
ィルス疾患状態を軽減することである。
本発明、の目的はまた、ＣＤ４タンパク質を膜中へ挿入
することにより修飾した異種赤血球〔および（または）
リポソーム〕を投与し、その結果、これらの細胞〔およ
び（または）リポソーム〕をＨＩＶ感染細胞に選択的に
結合させ、付随して融合させてＨＩＶ惑染感染を循環か
ら排除させる方法を提供することである。
することにより修飾した異種赤血球〔および（または）
リポソーム〕を投与し、その結果、これらの細胞〔およ
び（または）リポソーム〕をＨＩＶ感染細胞に選択的に
結合させ、付随して融合させてＨＩＶ惑染感染を循環か
ら排除させる方法を提供することである。
これらおよび他の目的、目標および利点は本発明により
実現される。
実現される。
本発明は、細胞の他の細胞に対する結合およびそれとの
融合を誘発する抗原タンパク質を膜中へ導入された、例
えば人為的に取込ませた動物例えばヒト由来細胞に関す
る。
融合を誘発する抗原タンパク質を膜中へ導入された、例
えば人為的に取込ませた動物例えばヒト由来細胞に関す
る。
本発明はまた、薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁さ
れた前記動物由来細胞の、１種またはそれ以上の細胞障
害物質と協力した治療有効量を投与、例えば注射、する
ことを含むウィルス誘発疾患の治療に関する。
れた前記動物由来細胞の、１種またはそれ以上の細胞障
害物質と協力した治療有効量を投与、例えば注射、する
ことを含むウィルス誘発疾患の治療に関する。
本発明はまた、薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁さ
れた前記動物由来細胞の、１種またはそれ以上の細胞障
害物質と協力した治療有効量を含む組成物を指向する。
れた前記動物由来細胞の、１種またはそれ以上の細胞障
害物質と協力した治療有効量を含む組成物を指向する。
発明の詳細な説明
（ａ） 衾皿至性１
本発明は、ヒ）ＣＤ４抗原を形質膜中へ取込み、エンジ
ニアド細胞と融合する細胞を破壊できる１種またはそれ
以上の細胞障害物質を細胞内に含有する型のエンジニア
ド赤血球を具体化する。これらのエンジニアド赤血球の
代りにリポソームを製造して同様に用いることができる
。本発明はまたこれらの細胞を正常赤血球から製造する
方法に関する。本発明はさらにこれらのエンジニアド赤
血球（またはリポソーム）をウィルス感染により起され
た疾患、殊に後天性免疫不全症候群（エイズ）の治療に
使用する方法を具体化する。もちろん、エンジニアド赤
血球が示されるとき常に本明細書に記載する修飾リポソ
ームもまた使用できることを留意すべきである。
ニアド細胞と融合する細胞を破壊できる１種またはそれ
以上の細胞障害物質を細胞内に含有する型のエンジニア
ド赤血球を具体化する。これらのエンジニアド赤血球の
代りにリポソームを製造して同様に用いることができる
。本発明はまたこれらの細胞を正常赤血球から製造する
方法に関する。本発明はさらにこれらのエンジニアド赤
血球（またはリポソーム）をウィルス感染により起され
た疾患、殊に後天性免疫不全症候群（エイズ）の治療に
使用する方法を具体化する。もちろん、エンジニアド赤
血球が示されるとき常に本明細書に記載する修飾リポソ
ームもまた使用できることを留意すべきである。
提案した治療の主な特徴は次のとおりである。
膜上にＣＤ４受容体をもつ赤血球はウィルスｇｐ１２０
表面糖タンパク質を表現する循環ＨＩＶ惑染感染に結合
できる。そのような凝集体は次いで肺臓マクロファージ
および肝臓のタッパ−（Ｘｕｐｆｆｅｒ）細胞により循
環から除去される。
表面糖タンパク質を表現する循環ＨＩＶ惑染感染に結合
できる。そのような凝集体は次いで肺臓マクロファージ
および肝臓のタッパ−（Ｘｕｐｆｆｅｒ）細胞により循
環から除去される。
細胞凝集体の取込みによるこれらの食細胞の細胞の可能
な感染を防ぐために、一定の抗ＨＩＶ薬例えばＡＺＴ−
またはＤＤＣ−三リン酸（ＡＺＴはアジド−３′−デオ
キシチミジンであり、ＤＤＣはジデオキシシチジンであ
る）が注射前にＣ’Ｄ４保持赤血球中に封入される。食
作用は薬物の存在なくＨＩＶ惑染感染の破壊を有効に生
ずるけれども、赤血球中のそのような抗ＨＩＶ薬の取込
みにより追加の保護が生ずる。
な感染を防ぐために、一定の抗ＨＩＶ薬例えばＡＺＴ−
またはＤＤＣ−三リン酸（ＡＺＴはアジド−３′−デオ
キシチミジンであり、ＤＤＣはジデオキシシチジンであ
る）が注射前にＣ’Ｄ４保持赤血球中に封入される。食
作用は薬物の存在なくＨＩＶ惑染感染の破壊を有効に生
ずるけれども、赤血球中のそのような抗ＨＩＶ薬の取込
みにより追加の保護が生ずる。
ＨＩ Ｖ感染細胞が選択的に結合し、ついにはＣＤ４抗
原を有する非感染細胞と融合する傾向があるので、我々
はこの抗原を形質膜上に有する細胞が、赤血球であって
も、ＨＩＶ感染Ｔ細胞および（または）ＨＩＶウィルス
自体と選択的に結合し、おそらく融合することを仮定し
、証明した。
原を有する非感染細胞と融合する傾向があるので、我々
はこの抗原を形質膜上に有する細胞が、赤血球であって
も、ＨＩＶ感染Ｔ細胞および（または）ＨＩＶウィルス
自体と選択的に結合し、おそらく融合することを仮定し
、証明した。
ＨＩＶ’感染細胞が細胞溶解物質を含む他の細胞と融合
すると感染細胞が破壊される。
すると感染細胞が破壊される。
ウィルス感染細胞の破壊における作用物質として臨床的
に有効であるために、エンジニアド細胞は次の性質を有
さねばならない： （１）それらが長く持続する、すな
わち生体内で少くとも細胞、この場合赤血球、の正常寿
命に接近する寿命を有さねばならない； （２）それら
が、それらに含まれる細胞障害物質が身体の組織に無作
別に作用しないような低毒性でなければならない； （
３）それら自体が、それらの中に置かれた毒素により不
利に影響されてはならない（そうでないと、それらが標
的細胞を捜し出して選択的に融合できる前に毒されるで
あろう） ｉ （４）それらはまた標的（すなわち
感染した）細胞との融合にのみ選択的であって他の健全
な細胞とは結合も融合もしてはならない； （５）それ
らは、それらがレシピエンド中で不利な抗原反応を起し
従って患者のすでに負担のかかった免疫系にさらに負担
をかけることのないように非免疫源でなければならない
。本発明に含まれる修飾赤血球（およびリポソーム）が
そのような役割に対する良好な候補であることが発見さ
れた。これは、それらが他の細胞の生体繁殖装置を欠き
、それらの寿命の間実質的に血流中の酸素を運ぶ役目を
するヘモグロビンの嚢にすぎないためである。従って、
それらは、それら自体その中の種々の細胞障害物質の存
在により不利に影響されない。赤血球は血流中の最も多
い細胞の１つであるので、抗原修飾毒素積載細胞による
その受部の置換は生物体にとってほとんど重大でない。
に有効であるために、エンジニアド細胞は次の性質を有
さねばならない： （１）それらが長く持続する、すな
わち生体内で少くとも細胞、この場合赤血球、の正常寿
命に接近する寿命を有さねばならない； （２）それら
が、それらに含まれる細胞障害物質が身体の組織に無作
別に作用しないような低毒性でなければならない； （
３）それら自体が、それらの中に置かれた毒素により不
利に影響されてはならない（そうでないと、それらが標
的細胞を捜し出して選択的に融合できる前に毒されるで
あろう） ｉ （４）それらはまた標的（すなわち
感染した）細胞との融合にのみ選択的であって他の健全
な細胞とは結合も融合もしてはならない； （５）それ
らは、それらがレシピエンド中で不利な抗原反応を起し
従って患者のすでに負担のかかった免疫系にさらに負担
をかけることのないように非免疫源でなければならない
。本発明に含まれる修飾赤血球（およびリポソーム）が
そのような役割に対する良好な候補であることが発見さ
れた。これは、それらが他の細胞の生体繁殖装置を欠き
、それらの寿命の間実質的に血流中の酸素を運ぶ役目を
するヘモグロビンの嚢にすぎないためである。従って、
それらは、それら自体その中の種々の細胞障害物質の存
在により不利に影響されない。赤血球は血流中の最も多
い細胞の１つであるので、抗原修飾毒素積載細胞による
その受部の置換は生物体にとってほとんど重大でない。
さらに、毒素が修飾赤血球内に隔離されるので、単に注
射された治療薬の場合のように生物体の組織と不規則に
相互作用することが自由でない。
射された治療薬の場合のように生物体の組織と不規則に
相互作用することが自由でない。
（ｂｌ リポソーム
水性媒質を囲む脂質二重層（２分子の厚さ）からなる。
リポソームは一般に水性媒質中の脂質の音波処理により
、乾燥脂質層の緩衝液中の再懸濁により、または有機溶
媒中に溶解した脂質の選択緩衝液に対する透析により形
成することができる。
、乾燥脂質層の緩衝液中の再懸濁により、または有機溶
媒中に溶解した脂質の選択緩衝液に対する透析により形
成することができる。
リン脂質はそれを水と混合すると一部は分子が両性であ
る：それらが疎水性（水不溶性）連部および親水性（水
溶性）または「極性」頭部を有する、ので閉鎖流体充填
球体を形成する。２つの脂肪酸類、それぞれ１０〜２４
個の炭素原子を含む、が多くの天然存在リン脂質分子の
疎水性尾部を構成する。若干の水溶性分子に結合したリ
ン酸が親水性頭部を構成する。十分高い濃度のリン脂質
を水と混合すると疎水性尾部が自然に一緒に並んで水を
排除し、親水性頭部が水を結合する。
る：それらが疎水性（水不溶性）連部および親水性（水
溶性）または「極性」頭部を有する、ので閉鎖流体充填
球体を形成する。２つの脂肪酸類、それぞれ１０〜２４
個の炭素原子を含む、が多くの天然存在リン脂質分子の
疎水性尾部を構成する。若干の水溶性分子に結合したリ
ン酸が親水性頭部を構成する。十分高い濃度のリン脂質
を水と混合すると疎水性尾部が自然に一緒に並んで水を
排除し、親水性頭部が水を結合する。
その結果、脂肪酸連部が膜の内部へ向き、極性頭部基が
外方へ向く二重層である。膜の１表面における極性基は
リポソームの内部へ向き、他の表面におけるものは外部
環境の方へ向く。研究者に薬剤のリポソーム中への装入
を可能にさせるのはリン脂質と水とのこの顕著な反応性
である。リポソームが形成されると、水に加えた水溶性
分子が球の内部中の水性空間中に取込まれ、小胞形成中
に溶媒に加えた脂質可溶性分子が脂質二重層中へ取込ま
れる。
外方へ向く二重層である。膜の１表面における極性基は
リポソームの内部へ向き、他の表面におけるものは外部
環境の方へ向く。研究者に薬剤のリポソーム中への装入
を可能にさせるのはリン脂質と水とのこの顕著な反応性
である。リポソームが形成されると、水に加えた水溶性
分子が球の内部中の水性空間中に取込まれ、小胞形成中
に溶媒に加えた脂質可溶性分子が脂質二重層中へ取込ま
れる。
薬物送達に使用されるリポソームは典型的には直径が２
５０オングストロ一ム単位〜数ミクロンの範囲内にあり
（対照として、赤血球の直径は約１０ミクロンである）
、通常溶液中に懸濁される。
５０オングストロ一ム単位〜数ミクロンの範囲内にあり
（対照として、赤血球の直径は約１０ミクロンである）
、通常溶液中に懸濁される。
それらは２つの標準形態：流体により分離された若干の
脂質二重層で構成される「タマ゛ネギ状皮膚」をもつ多
重ラメラ小胞（ＭＬＶ）および完全に流体のコアを囲む
単二重層からなる単ラメラ小胞、を有する。単ラメラ小
胞は典型的には小（ＳＵＶ）または大（ＬＵＶ）である
特徴を有する。
脂質二重層で構成される「タマ゛ネギ状皮膚」をもつ多
重ラメラ小胞（ＭＬＶ）および完全に流体のコアを囲む
単二重層からなる単ラメラ小胞、を有する。単ラメラ小
胞は典型的には小（ＳＵＶ）または大（ＬＵＶ）である
特徴を有する。
適当な環境下で、リポソームはほとんどの任意の細胞型
に吸着できる。それらが球を吸着するとリポソームは若
干の細胞により取込まれ、または飲み込まれることがで
きる。吸着されたリポソームは細胞膜と脂質を交換する
ことができ、またときどき細胞と融合できる。融合が起
るとリポソーム膜は細胞膜中へ取込まれ、リポソームの
水性分は細胞中の流体と併合する。
に吸着できる。それらが球を吸着するとリポソームは若
干の細胞により取込まれ、または飲み込まれることがで
きる。吸着されたリポソームは細胞膜と脂質を交換する
ことができ、またときどき細胞と融合できる。融合が起
るとリポソーム膜は細胞膜中へ取込まれ、リポソームの
水性分は細胞中の流体と併合する。
多くの型の細胞により吸着され、結合され、ついには吸
収され、そのときそれらの内容物を徐々に遊離するリポ
ソームの能力が、リポソームを時間放出薬物供給系に対
する優れた候補にする。薬物がリポソームからどのよう
な速さで放出されるかはリポソームの組成、封入薬物の
型および細胞の性質を含む多くの因子による。
収され、そのときそれらの内容物を徐々に遊離するリポ
ソームの能力が、リポソームを時間放出薬物供給系に対
する優れた候補にする。薬物がリポソームからどのよう
な速さで放出されるかはリポソームの組成、封入薬物の
型および細胞の性質を含む多くの因子による。
リポソームのエンドサイト−シスは限定種類の細胞、す
なわち異質粒子を摂取できるもの、の中で生ずる。食細
胞の細胞がリポソームを吸収すると、細胞は球をリソソ
ームとして知られる細胞下オルガホラ中へ移動させ、そ
こでリポソームの膜が分解されると思われる。リポソー
ムの脂質成分はりソソームからおそらく外方へ移動して
細胞膜の一部となり、リソソームの分解に耐性の他のリ
ポソーム成分（例えば一定の薬物）は細胞質内へ入るこ
とができる。
なわち異質粒子を摂取できるもの、の中で生ずる。食細
胞の細胞がリポソームを吸収すると、細胞は球をリソソ
ームとして知られる細胞下オルガホラ中へ移動させ、そ
こでリポソームの膜が分解されると思われる。リポソー
ムの脂質成分はりソソームからおそらく外方へ移動して
細胞膜の一部となり、リソソームの分解に耐性の他のリ
ポソーム成分（例えば一定の薬物）は細胞質内へ入るこ
とができる。
脂質交換はリポソームからの形質膜中への個々の脂質分
子の移動（およびその逆）を含み；リポソームの水性分
は細胞内へ人らない。脂質交換が起るにはリポソーム脂
質が標的細胞に関連した特定の化学を有さねばならない
。リポソーム脂質が細胞膜に接合した後、それが長時間
膜中に保持され、または種々の細胞内の膜へ再分配され
ることができる。薬物がともかくそのような交換性脂質
に結合すれば、それは脂質交換中に潜在的に細胞中へ入
ることができる。
子の移動（およびその逆）を含み；リポソームの水性分
は細胞内へ人らない。脂質交換が起るにはリポソーム脂
質が標的細胞に関連した特定の化学を有さねばならない
。リポソーム脂質が細胞膜に接合した後、それが長時間
膜中に保持され、または種々の細胞内の膜へ再分配され
ることができる。薬物がともかくそのような交換性脂質
に結合すれば、それは脂質交換中に潜在的に細胞中へ入
ることができる。
（ｃ）Ｌｌ
本発明はヒトおよび動物の種々のウィルス、細菌、アレ
ルゲンおよび寄生虫疾患との戦いに使用できる。
ルゲンおよび寄生虫疾患との戦いに使用できる。
従って、本発明は次のウィルスとの戦いに使用できる：
ＨＩＶ、、Ｂ型肝炎ウィルス、インフルエンザ血球ａ集
素（Ａ／メンフイス／１０２／７２株、Ａ／Ｅｎｇ１８
７８／ ６９株、Ａ／ＮＴ／６０／ ６８ ／ ２９
ｃ株、およびＡ／Ｑｕ／７／７０株、Ａ ｏ ／ Ｐ
Ｒ８／ ３４、Ａｔ／ＣＡＭ／４６、並びにＡ２／シン
ガポール／１１５７．８型インフルエンザウイルス、例
えばＢ／Ｌｅｅ４０）、家禽ベストウィルス血球凝集素
、ワタシニア、ポリオ、風疹、サイトメガロウィルス、
痘渣、単純へルペス１および２型、黄熱、感染性エフト
ロメリアウィルス、生石ウィルス、ウシ伝染性鼻気管炎
ウィルス、ウマ鼻肺炎（ウマ流産）ウィルス、ウシの悪
性カタルウィルス、ネコ鼻気管炎ウィルス、イヌヘルペ
スウィルス、エプスタイン・バーウィルス（伝染性単核
症およびバグキット・リンパ腫と関連）、マレーク病ウ
ィルス、ヒツジ肺すンパ節腫症（ヒツジ肺腺症）ウィル
ス、サイトメガロウィルス、アデノウィルス群、ヒト乳
頭腫ウィルス、ネコ汎白血球減少症ウィルス、ミンク腸
炎ウィルス、サケ類（ｔｒｏｕｔ）の伝染性膵臓壊死ウ
ィルス、魚類肉腫ウィルス（種々の系統）、ニワ） Ｕ
白血病ウィルス（内臓、赤芽球および骨髄芽球）、大理
石骨病ウィルス、ニューカッスル病ウィルス、バライン
フルエンザウィルス１．２．３および４、ムンプスウィ
ルス、トルク （Ｔｕｒｋｅｙ） ウィルス、カナダ１
５８、イスジステンパーウィルス、麻疹ウィルス、ＲＳ
ウィルス、例えばインフルエンザＢ型ウィルス例えばＢ
／Ｌｅｅ／４０；狂犬病ウィルス；東部ウマ脳炎ウィル
ス；ベネズエラウマ脳炎ウィルス；西部ウマ脳炎ウィル
ス；黄熱ウィルス；デンつ１型ウィルス（＝６型）、デ
ング２型ウィルス（＝５型）、デンつ３型ウィルス、デ
ンジ４型ウィルス；日つ脳炎ウィルス；キャサナー森林
病つィルス；跳躍病ウィルス；ミューリー谷脳炎つィル
ス；オムスク出血熱ウィルス（Ｉおよび■型）；セント
ルイス脳炎ウィルス；ヒトライノウィルス；ロ蹄疫ウィ
ルス：ポリオウィルス１型；エンテロウィルスポリ第２
；エンテロウィルスポリ第３；ニワトリ伝染性気管支炎
ウィルス；ブタ伝染性胃腸炎ウィルス；リンパ球性腺絡
髄膜炎つィルス；ラッサウイルス；マチュボウイルス；
ビチンデ（Ｐ ｉｃｈ ｉ ｎｄｅ） ウィルス；タ
カリベウイルス；乳頭腫ウィルス；シンドビスウイルス
；など。
ＨＩＶ、、Ｂ型肝炎ウィルス、インフルエンザ血球ａ集
素（Ａ／メンフイス／１０２／７２株、Ａ／Ｅｎｇ１８
７８／ ６９株、Ａ／ＮＴ／６０／ ６８ ／ ２９
ｃ株、およびＡ／Ｑｕ／７／７０株、Ａ ｏ ／ Ｐ
Ｒ８／ ３４、Ａｔ／ＣＡＭ／４６、並びにＡ２／シン
ガポール／１１５７．８型インフルエンザウイルス、例
えばＢ／Ｌｅｅ４０）、家禽ベストウィルス血球凝集素
、ワタシニア、ポリオ、風疹、サイトメガロウィルス、
痘渣、単純へルペス１および２型、黄熱、感染性エフト
ロメリアウィルス、生石ウィルス、ウシ伝染性鼻気管炎
ウィルス、ウマ鼻肺炎（ウマ流産）ウィルス、ウシの悪
性カタルウィルス、ネコ鼻気管炎ウィルス、イヌヘルペ
スウィルス、エプスタイン・バーウィルス（伝染性単核
症およびバグキット・リンパ腫と関連）、マレーク病ウ
ィルス、ヒツジ肺すンパ節腫症（ヒツジ肺腺症）ウィル
ス、サイトメガロウィルス、アデノウィルス群、ヒト乳
頭腫ウィルス、ネコ汎白血球減少症ウィルス、ミンク腸
炎ウィルス、サケ類（ｔｒｏｕｔ）の伝染性膵臓壊死ウ
ィルス、魚類肉腫ウィルス（種々の系統）、ニワ） Ｕ
白血病ウィルス（内臓、赤芽球および骨髄芽球）、大理
石骨病ウィルス、ニューカッスル病ウィルス、バライン
フルエンザウィルス１．２．３および４、ムンプスウィ
ルス、トルク （Ｔｕｒｋｅｙ） ウィルス、カナダ１
５８、イスジステンパーウィルス、麻疹ウィルス、ＲＳ
ウィルス、例えばインフルエンザＢ型ウィルス例えばＢ
／Ｌｅｅ／４０；狂犬病ウィルス；東部ウマ脳炎ウィル
ス；ベネズエラウマ脳炎ウィルス；西部ウマ脳炎ウィル
ス；黄熱ウィルス；デンつ１型ウィルス（＝６型）、デ
ング２型ウィルス（＝５型）、デンつ３型ウィルス、デ
ンジ４型ウィルス；日つ脳炎ウィルス；キャサナー森林
病つィルス；跳躍病ウィルス；ミューリー谷脳炎つィル
ス；オムスク出血熱ウィルス（Ｉおよび■型）；セント
ルイス脳炎ウィルス；ヒトライノウィルス；ロ蹄疫ウィ
ルス：ポリオウィルス１型；エンテロウィルスポリ第２
；エンテロウィルスポリ第３；ニワトリ伝染性気管支炎
ウィルス；ブタ伝染性胃腸炎ウィルス；リンパ球性腺絡
髄膜炎つィルス；ラッサウイルス；マチュボウイルス；
ビチンデ（Ｐ ｉｃｈ ｉ ｎｄｅ） ウィルス；タ
カリベウイルス；乳頭腫ウィルス；シンドビスウイルス
；など。
本発明はまた細菌例えばらい病、結核、梅毒および淋疾
を起すものとの戦いに使用できる。
を起すものとの戦いに使用できる。
本発明はまた寄生虫、例えばマラリアを運ぶ生物体（熱
帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫など）、住血吸虫
症、回旋糸状虫および他のフイラリア寄生虫、トリパノ
ソーマ、リーシュマニア、シャガス病、アメーバ症、鉤
虫などとの戦いに使用できる。
帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫など）、住血吸虫
症、回旋糸状虫および他のフイラリア寄生虫、トリパノ
ソーマ、リーシュマニア、シャガス病、アメーバ症、鉤
虫などとの戦いに使用できる。
本発明は修飾細胞およびリポソームの特定細胞および組
織に対する標的性を可能にするので、それはまた癌増殖
との戦いに有効であることができる。
織に対する標的性を可能にするので、それはまた癌増殖
との戦いに有効であることができる。
（ｅｌ 独ＣＤ４（（社）Ｗ遺
ＨＩＶによる正常Ｔ細胞の破壊にはウィルスによる細胞
の感染とその後のウィルスによりコードされる特異糖タ
ンパク質の生成、並びに感染細胞の形質膜中へのこれら
の糖タンパク質の挿入が包含される。この糖タンパク質
は表面上にＣＤ４抗原を含む他の細胞に対する親和性を
有する。ヒト白血球抗原、ＣＤ４、は血液バンクからの
血液の遠心分離後に得られたバフィーコートを含む種々
の源から、並びにＴ細胞リンパ腫細胞系〔アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。
の感染とその後のウィルスによりコードされる特異糖タ
ンパク質の生成、並びに感染細胞の形質膜中へのこれら
の糖タンパク質の挿入が包含される。この糖タンパク質
は表面上にＣＤ４抗原を含む他の細胞に対する親和性を
有する。ヒト白血球抗原、ＣＤ４、は血液バンクからの
血液の遠心分離後に得られたバフィーコートを含む種々
の源から、並びにＴ細胞リンパ腫細胞系〔アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。
Ｍａｒｙｌａｎｄ 、 Ｕ Ｓ Ａ）から得られるＣＥ
Ｍ−細胞〕から分離することができる。ＣＤ４抗原はマ
トン（Ｍａｄｄｏｎ）ほか、セル（ｃｅｊｌ） 、４２
．９３〜１０４ （１９８５）の操作により精製でき
る。
Ｍ−細胞〕から分離することができる。ＣＤ４抗原はマ
トン（Ｍａｄｄｏｎ）ほか、セル（ｃｅｊｌ） 、４２
．９３〜１０４ （１９８５）の操作により精製でき
る。
この操作に対する一般的図式は次に示される：血液単位
↓ フ旬−ル・ハイパツク 比Ｍ 遠心分Ｈ単核細胞
（約７０％Ｔ細胞） ↓ 緩衝液Ａによる抽出 ＣＤ４粗抽出物 粗ＣＤ４ （廃棄） ↓ 緩衝液Ｂによる溶出部分精製ＣＤ
４ ＣＤ４ ↓ 緩衝液りに対する透析滅菌 純ＣＤ４ 精製ＣＤ４はすぐに使用でき、また−２０℃で２〜３月
安定である。上記図式中、緩衝液組成は次のとおりであ
ることができた： 緩衝液Ａ＝０．０２Ｍ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コシド（ＯＧＳ） ０．１５Ｍ Ｍａｃｌ ０．２Ｍ ＰＭＳＦ ０．０１Ｍ）リス、最終ｐｎ＝ａ、。
（約７０％Ｔ細胞） ↓ 緩衝液Ａによる抽出 ＣＤ４粗抽出物 粗ＣＤ４ （廃棄） ↓ 緩衝液Ｂによる溶出部分精製ＣＤ
４ ＣＤ４ ↓ 緩衝液りに対する透析滅菌 純ＣＤ４ 精製ＣＤ４はすぐに使用でき、また−２０℃で２〜３月
安定である。上記図式中、緩衝液組成は次のとおりであ
ることができた： 緩衝液Ａ＝０．０２Ｍ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コシド（ＯＧＳ） ０．１５Ｍ Ｍａｃｌ ０．２Ｍ ＰＭＳＦ ０．０１Ｍ）リス、最終ｐｎ＝ａ、。
緩衝液Ｂ ＝ ０．１ Ｍ β−マンノシドを含む
緩衝液Ａ 緩衝液Ｃ＝１％（Ｗ／Ｗ）デオキシコール酸ナトリウム
Ｉ Ｍ 酢酸ナトリウム 、 最終ｐＨ＝４
．０緩衝液Ｄ ＝ ０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム、
最終ｐＨ＝４．７上記緩衝液Ａ中のＰＭＳＦ （フェニ
ルメチルフルオロ硫酸）は抽出および精製操作の間タン
パク質分解の阻止に使用される毒性物質である。しかし
、それは後のクロマトグラフィー段階により完全に除去
される。
緩衝液Ａ 緩衝液Ｃ＝１％（Ｗ／Ｗ）デオキシコール酸ナトリウム
Ｉ Ｍ 酢酸ナトリウム 、 最終ｐＨ＝４
．０緩衝液Ｄ ＝ ０．１ Ｍ 酢酸ナトリウム、
最終ｐＨ＝４．７上記緩衝液Ａ中のＰＭＳＦ （フェニ
ルメチルフルオロ硫酸）は抽出および精製操作の間タン
パク質分解の阻止に使用される毒性物質である。しかし
、それは後のクロマトグラフィー段階により完全に除去
される。
ＯＧＳ （オクチルガラクトシド）はＣＤ４の抽出に使
用される洗浄剤である。後に精製工程においてそれは天
然存在胆汁酸塩であり、毒性でないＤＯＣ（デオキシコ
ール酸塩）により置換される。
用される洗浄剤である。後に精製工程においてそれは天
然存在胆汁酸塩であり、毒性でないＤＯＣ（デオキシコ
ール酸塩）により置換される。
ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム）は精製ＣＤ４中
にｏ、 ｏ ｏ ｓ％の濃度で存在し、本発明により治
療したエイズ患者の血液中に約０．０００００１％の濃
度で存在する（それは全く安全である）。
にｏ、 ｏ ｏ ｓ％の濃度で存在し、本発明により治
療したエイズ患者の血液中に約０．０００００１％の濃
度で存在する（それは全く安全である）。
ヒトＣＤ４タンパク質はまた種々の細胞中の組換えＣＤ
４分子として得ることができる〔ウオルトン（Ｗａｌｔ
ｏｎ）ほか、セル（ｃｅｌｌ）、１９８８、印刷中〕。
４分子として得ることができる〔ウオルトン（Ｗａｌｔ
ｏｎ）ほか、セル（ｃｅｌｌ）、１９８８、印刷中〕。
（ｆｌ エンジニアド７、血 を） する 融へ本
発明によるエンジニアド赤血球を形成する一般的操作が
次に略示される： 血液単位 （地域血液バンク） （赤および白血球） 純ＲＢＣ 修飾ＲＢＣ（４℃で２０日間安定） 精製ＲＢＣ−”Ｃｒ標識 上記図式中で生成された修飾ＲＢＣ（赤血球）（未標識
）は約５０，０００分子のＣＤＡ毎細胞を含み、２０℃
で２０日まで安定である。
発明によるエンジニアド赤血球を形成する一般的操作が
次に略示される： 血液単位 （地域血液バンク） （赤および白血球） 純ＲＢＣ 修飾ＲＢＣ（４℃で２０日間安定） 精製ＲＢＣ−”Ｃｒ標識 上記図式中で生成された修飾ＲＢＣ（赤血球）（未標識
）は約５０，０００分子のＣＤＡ毎細胞を含み、２０℃
で２０日まで安定である。
クロム標識修飾ＲＢＣは毒性研究のみに用いたのでそれ
らの製造は任意であり、それらは通常治療目的に対する
本発明の実際の実施に使用されないがしかしそれらを使
用できる。そのような標識細胞は活性物質として本発明
を用いる試験管内診断法における使用が見出されよう。
らの製造は任意であり、それらは通常治療目的に対する
本発明の実際の実施に使用されないがしかしそれらを使
用できる。そのような標識細胞は活性物質として本発明
を用いる試験管内診断法における使用が見出されよう。
赤血球膜中へＣＤ４を挿入する他の方法は初めにタンパ
ク質をリポソーム膜中へ挿入し、次いでそれを赤血球と
融合させて膜中にＣＤ４を含む細胞−リポソームハイブ
リソドを生成させることである。さらにこの方法は後の
融合で細胞、有利には赤血球に対するリポソーム封入分
子（有利には細胞毒または治療物￥ｔ）の送達を生ずる
。
ク質をリポソーム膜中へ挿入し、次いでそれを赤血球と
融合させて膜中にＣＤ４を含む細胞−リポソームハイブ
リソドを生成させることである。さらにこの方法は後の
融合で細胞、有利には赤血球に対するリポソーム封入分
子（有利には細胞毒または治療物￥ｔ）の送達を生ずる
。
赤血球を連続溶解および再封する技術は再封赤血球〔イ
ーシー（Ｉｈｌｅｒ）ほか、ＰＮＡＳ、７０．２６６３
〜２６６６ （１９７３））およびエンドサイト−シス
による装入細胞（イーシー（Ｉｈｌｅｒ）ほか、ジャー
ナル・オブ・アプライド・バイオケミストリー（Ｊ、
Ａｐｐ、 Ｂｉｏｃｈｅｏ＋ ）、土、４１８〜４３５
（１９８２））の既知概念を基にして開発された。
ーシー（Ｉｈｌｅｒ）ほか、ＰＮＡＳ、７０．２６６３
〜２６６６ （１９７３））およびエンドサイト−シス
による装入細胞（イーシー（Ｉｈｌｅｒ）ほか、ジャー
ナル・オブ・アプライド・バイオケミストリー（Ｊ、
Ａｐｐ、 Ｂｉｏｃｈｅｏ＋ ）、土、４１８〜４３５
（１９８２））の既知概念を基にして開発された。
これらの方法は、種々の分子を細胞中へ封入し、その寿
命を不変に保つことを可能にする〔ニコラウ（Ｎｉｃｏ
ｌａｕ）ほか、Ｅ Ｐ ８３ ４０１３６４−１（１９
８３）およびニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ほか、アナル
ス・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（Ａｎｎ、 Ｎ、 Ｙ、 Ａｃａｄ、 ５ｃｉ）
、４４５．３０４〜３１５（１９８５））。本発明には
生体中のウィルス感染細胞との最終融合およびその破壊
に対する「標的化弾丸」として作用できる修飾赤血球（
またはリポソーム）が含まれる。
命を不変に保つことを可能にする〔ニコラウ（Ｎｉｃｏ
ｌａｕ）ほか、Ｅ Ｐ ８３ ４０１３６４−１（１９
８３）およびニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ほか、アナル
ス・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（Ａｎｎ、 Ｎ、 Ｙ、 Ａｃａｄ、 ５ｃｉ）
、４４５．３０４〜３１５（１９８５））。本発明には
生体中のウィルス感染細胞との最終融合およびその破壊
に対する「標的化弾丸」として作用できる修飾赤血球（
またはリポソーム）が含まれる。
リゾチームが酸性ｐＨでリポソームと赤血球ゴーストと
の融合を誘発することが既に示された〔アービンテ（Ａ
ｒｖｉｎｔｅ）ほか、プロシーデインゲス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、）＋ ８３巻、９６
２〜９６６ （１９８６））。その操作においてリゾチ
ームは音波処理小胞（リポソーム）の外部膜に共有結合
させ、これらの小胞とヒト赤血球ゴーストとの融合の誘
発に作用させた。融合の強い誘発が最適リゾチームｐＨ
で認められた（それはりゾチームを単に懸濁液に加えた
ときに認められなかった）。この操作は、リゾチームが
電気的に中性のリポソーム相互の融合を誘発しないので
有用であり、従って、リポソームと細胞との融合に十分
適する。
の融合を誘発することが既に示された〔アービンテ（Ａ
ｒｖｉｎｔｅ）ほか、プロシーデインゲス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、）＋ ８３巻、９６
２〜９６６ （１９８６））。その操作においてリゾチ
ームは音波処理小胞（リポソーム）の外部膜に共有結合
させ、これらの小胞とヒト赤血球ゴーストとの融合の誘
発に作用させた。融合の強い誘発が最適リゾチームｐＨ
で認められた（それはりゾチームを単に懸濁液に加えた
ときに認められなかった）。この操作は、リゾチームが
電気的に中性のリポソーム相互の融合を誘発しないので
有用であり、従って、リポソームと細胞との融合に十分
適する。
本発明には媒質中にリゾチームを全く存在させないで融
合を誘発させる方法が含まれる。これは大規模臨床使用
に対するエンジニアド赤血球の形成を非常に容易にする
。
合を誘発させる方法が含まれる。これは大規模臨床使用
に対するエンジニアド赤血球の形成を非常に容易にする
。
（ｇ） エンジニアド２、血トの毒
エンジニアド赤血球（種々の捕捉物質例えばイノシトー
ル六リン酸イソチオシアナート標識リシンを含む）の寿
命がぼり正常値であることが示された〔ニコラウ（Ｎ１
ｃｏｌａｕ ）ほか、アナルス・オブ・ザ・ニューヨ
ーク・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ａｎｎ、 Ｎ、
Ｙ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） 、前掲〕。
ル六リン酸イソチオシアナート標識リシンを含む）の寿
命がぼり正常値であることが示された〔ニコラウ（Ｎ１
ｃｏｌａｕ ）ほか、アナルス・オブ・ザ・ニューヨ
ーク・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ａｎｎ、 Ｎ、
Ｙ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） 、前掲〕。
さらに、これらの細胞の、子豚中の３０日の期間にわた
る生体内毒性が追跡された。簡単に記載すると、少量の
エンジニアド細胞の注射（３０〜４０％薬物積載細胞、
すなわち細胞懸濁液のへマドクリットが３０〜４０％で
ある、約０．１〜１ｍｌを静脈内に注射した）後、動物
血液、例えば子豚の血液、の試料を３０日の経過にわた
ってときどきとった。これをイオン（Ｋ、 Ｎａ、
Ｃｊ！、 Ｃａなどを含む）の濃度並びにタンパク質、
尿素おらびグルコース濃度について検定した。
る生体内毒性が追跡された。簡単に記載すると、少量の
エンジニアド細胞の注射（３０〜４０％薬物積載細胞、
すなわち細胞懸濁液のへマドクリットが３０〜４０％で
ある、約０．１〜１ｍｌを静脈内に注射した）後、動物
血液、例えば子豚の血液、の試料を３０日の経過にわた
ってときどきとった。これをイオン（Ｋ、 Ｎａ、
Ｃｊ！、 Ｃａなどを含む）の濃度並びにタンパク質、
尿素おらびグルコース濃度について検定した。
ゲロニンを封入したマウスＲＢＣの寿命測定値は正常マ
ウスＲＢＣの寿命に比べて有意な変化を示さなかった（
ともにマウス中で約１１日の半減期を有する）。
ウスＲＢＣの寿命に比べて有意な変化を示さなかった（
ともにマウス中で約１１日の半減期を有する）。
毒性試験の間、動物を３０日の期間にわたって種々の時
間間隔で剖検し、肝臓タッパ−細胞およびｐｍマクロフ
ァージの状態を調べた。遊離免疫毒素（リシンが毒素で
あった）の直接接種は細網内皮系中の組織損傷を示した
。膵臓および肝臓中のマクロファージは毒素を循環から
除去する〔ビテッタ（Ｖｉｔｅｔｔａ）ほか、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 。
間間隔で剖検し、肝臓タッパ−細胞およびｐｍマクロフ
ァージの状態を調べた。遊離免疫毒素（リシンが毒素で
あった）の直接接種は細網内皮系中の組織損傷を示した
。膵臓および肝臓中のマクロファージは毒素を循環から
除去する〔ビテッタ（Ｖｉｔｅｔｔａ）ほか、サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 。
２１９．６４４〜６５０ （１９８３））。しかし、
本発明により用いた免疫毒素による腎臓細胞に対する損
傷がなく、毒素積載エンジニアド細胞が毒性でないこと
を示した。他のエンジニアド赤血球に対する含有毒素の
主標的は膵臓マクロファージであろう。これらの細胞が
幹細胞により置換されることができるので、生ずる損傷
は不可逆性でないであろう。さらに実験証拠は、骨髄中
の細胞からのマクロファージの置換のために細網内皮系
を消耗させることが不可能なことを示した〔ファン・フ
ァース・アンド・コーン（Ｖａｎ Ｆｕｒｔｈ ａｎｄ
Ｃｏｈｎ ）、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル
・メデイシン（Ｊ、Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、） 、１２８．
４１５〜４２４ （１９６８））。
本発明により用いた免疫毒素による腎臓細胞に対する損
傷がなく、毒素積載エンジニアド細胞が毒性でないこと
を示した。他のエンジニアド赤血球に対する含有毒素の
主標的は膵臓マクロファージであろう。これらの細胞が
幹細胞により置換されることができるので、生ずる損傷
は不可逆性でないであろう。さらに実験証拠は、骨髄中
の細胞からのマクロファージの置換のために細網内皮系
を消耗させることが不可能なことを示した〔ファン・フ
ァース・アンド・コーン（Ｖａｎ Ｆｕｒｔｈ ａｎｄ
Ｃｏｈｎ ）、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル
・メデイシン（Ｊ、Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、） 、１２８．
４１５〜４２４ （１９６８））。
（ｈ） 榎負星夏旦■監金
適当な免疫系の機能化に必要なＴ４細胞がＣＤ４抗原を
有するので、それらが感染細胞に選択的に結合し、つい
には溶解される。溶解は培養細胞中への放射性成分例え
ばＣｒ−５１の取込みにより試験管内で測定できる。細
胞上の媒質中への同位元素の遊離（ウェル型カウンター
を用いてモニターした）は溶解の尺度である。そのよう
な溶解はシンシチウムの形成と（ｃＤ４含有細胞とＨＩ
Ｖ怒染細胞との融合により発生するので）相関する。
有するので、それらが感染細胞に選択的に結合し、つい
には溶解される。溶解は培養細胞中への放射性成分例え
ばＣｒ−５１の取込みにより試験管内で測定できる。細
胞上の媒質中への同位元素の遊離（ウェル型カウンター
を用いてモニターした）は溶解の尺度である。そのよう
な溶解はシンシチウムの形成と（ｃＤ４含有細胞とＨＩ
Ｖ怒染細胞との融合により発生するので）相関する。
そのような融合は後記の実施例５の操作によりモニター
され、結果は相当する表１ （後掲）に示される。
され、結果は相当する表１ （後掲）に示される。
ＣＤ４抗原を挿入された赤血球はフリーズエツチング電
子顕微鏡検査並びに薄片電子顕微鏡検査により調べるこ
とができる。簡単に記載すると、ＣＤ４抗原を有する赤
血球をマウス単りローン性抗ＣＤ４とともにインキュベ
ートする。洗浄後、これらの細胞を、ヤギ抗マウスＩｇ
ＧでコートしたｌＱｎｍ金ビーズとともにインキュベー
トした。
子顕微鏡検査並びに薄片電子顕微鏡検査により調べるこ
とができる。簡単に記載すると、ＣＤ４抗原を有する赤
血球をマウス単りローン性抗ＣＤ４とともにインキュベ
ートする。洗浄後、これらの細胞を、ヤギ抗マウスＩｇ
ＧでコートしたｌＱｎｍ金ビーズとともにインキュベー
トした。
フリーズワラクチャ−レプリカ中で１０ｎｍビーズがク
ロス割断赤血球の周囲の周りに観察された。
ロス割断赤血球の周囲の周りに観察された。
観察ビーズの数毎細胞はフラクチャーの偶然性に依存し
、必らずしもその細胞に結合したビーズの実際の数の尺
度ではない。最良の場合にビーズはクロス割断赤血球の
１側に沿って４０〜５Ｑｎｍの間隔で規則的に並んで見
える。エツチングにより生じた「タマネギ環」効果のた
めに赤血球膜からのビーズの距離を正確に決定すること
ができない。同一試料の薄片中に電子濃密１０ｎｍ金ビ
ー求もまた赤血球の膜表面に観察される。ＨＩＶ怒染Ｈ
９細胞とともにインキュベートした後のＣＤ４保持赤血
球のフリーズエツチング像は赤血球膜面上の膜タンパク
質の分布を変えた１１００ｎの「不規則性」または「押
出」を示した。これはウィルスの赤血球との（おそら＜
ＣＤ４抗原に対する）融合を示唆する。
、必らずしもその細胞に結合したビーズの実際の数の尺
度ではない。最良の場合にビーズはクロス割断赤血球の
１側に沿って４０〜５Ｑｎｍの間隔で規則的に並んで見
える。エツチングにより生じた「タマネギ環」効果のた
めに赤血球膜からのビーズの距離を正確に決定すること
ができない。同一試料の薄片中に電子濃密１０ｎｍ金ビ
ー求もまた赤血球の膜表面に観察される。ＨＩＶ怒染Ｈ
９細胞とともにインキュベートした後のＣＤ４保持赤血
球のフリーズエツチング像は赤血球膜面上の膜タンパク
質の分布を変えた１１００ｎの「不規則性」または「押
出」を示した。これはウィルスの赤血球との（おそら＜
ＣＤ４抗原に対する）融合を示唆する。
二重層中にＣＤ４を有する調製リポソーム（実施例１、
後記、による）はフリーズエツチング電子顕微鏡検査に
より調べることができ、３００〜５００ｎｍの範囲の直
径の単ラメラおよび多重ラメラの両方であると認められ
る。リポソームをＨＩＶ感染Ｈ９細胞とともに８時間イ
ンキュベートした後、ウィルス粒子はＣＤ４タンパク質
挿入リポソームに結合されるが、しかしこのタンパク質
のないものには結合しないことが認められる。
後記、による）はフリーズエツチング電子顕微鏡検査に
より調べることができ、３００〜５００ｎｍの範囲の直
径の単ラメラおよび多重ラメラの両方であると認められ
る。リポソームをＨＩＶ感染Ｈ９細胞とともに８時間イ
ンキュベートした後、ウィルス粒子はＣＤ４タンパク質
挿入リポソームに結合されるが、しかしこのタンパク質
のないものには結合しないことが認められる。
これはまた、本発明により膜中へ挿入されるとタンパク
質が適当に配向されることを示す。ウィルス粒子は大き
さ（約１０１００ｎおよび膜タンパク質の存在の両方に
より確認することができる。
質が適当に配向されることを示す。ウィルス粒子は大き
さ（約１０１００ｎおよび膜タンパク質の存在の両方に
より確認することができる。
リポソームは大きさおよび封入デキストランにより確認
された。
された。
ＣＤ４リポソームと感染細胞との融合およびリポソーム
の内容物の細胞内部への送達を示すために次の操作を用
いることができる。フェリチンを封入しているＣＤ４−
リポソーム〔実施例１（後記）の一般操作による〕をＨ
ＩＶ感染Ｈ９細胞または正常Ｈ９細胞とともに８時間イ
ンキュベートする。次いで細胞を洗浄して固定する。Ｃ
Ｄ４を有しないがしかしフェリチンを封入しているリポ
ソームを同様に用いる。
の内容物の細胞内部への送達を示すために次の操作を用
いることができる。フェリチンを封入しているＣＤ４−
リポソーム〔実施例１（後記）の一般操作による〕をＨ
ＩＶ感染Ｈ９細胞または正常Ｈ９細胞とともに８時間イ
ンキュベートする。次いで細胞を洗浄して固定する。Ｃ
Ｄ４を有しないがしかしフェリチンを封入しているリポ
ソームを同様に用いる。
薄片電子顕微鏡検査はリポソームに封入されたフェリチ
ンが感染細胞中の脂質小滴へ移動したことを示した。リ
ポソームが感染細胞内の大細胞質液泡内に認められた。
ンが感染細胞中の脂質小滴へ移動したことを示した。リ
ポソームが感染細胞内の大細胞質液泡内に認められた。
細胞の形質膜とのリポソームの融合の例もまた認められ
た。これらの結果はリポソームがＣＤ４抗原を有しなか
った場合に認められなかった。
た。これらの結果はリポソームがＣＤ４抗原を有しなか
った場合に認められなかった。
膜中にホスファチジルエタノールアミンリサミンローダ
ミン〔ローダミンは蛍光染料であり、こ５では脂質に結
合している）を有して形成され、Ｆｌ−デキストランを
封入するＣＤ４保持リポソームをＨＩ Ｖ感染Ｈ９細胞
とともに８時間インキュベートし、次いで洗浄して固定
する。同様の、しかし二重層中に存在するＣＤ４抗原の
ないリポソームを用いて類似の操作を追跡する。
ミン〔ローダミンは蛍光染料であり、こ５では脂質に結
合している）を有して形成され、Ｆｌ−デキストランを
封入するＣＤ４保持リポソームをＨＩ Ｖ感染Ｈ９細胞
とともに８時間インキュベートし、次いで洗浄して固定
する。同様の、しかし二重層中に存在するＣＤ４抗原の
ないリポソームを用いて類似の操作を追跡する。
フリーズエツチング像は、ウィルス粒子がＣＤ４をもつ
リポソームに結合したが、それのないものに結合しなか
ったことを示した。さらにＣＤ４抗原を有するリポソー
ムがＨＩＶ感染Ｈ９細胞との融合の過程中に示された（
すなわち、それらが明らかな膜の連続性を示した）。Ｃ
Ｄ４抗原の存在しないリポソームは細胞膜上の上に載っ
ているが、しかし実際の融合の証拠を示さなかった。
リポソームに結合したが、それのないものに結合しなか
ったことを示した。さらにＣＤ４抗原を有するリポソー
ムがＨＩＶ感染Ｈ９細胞との融合の過程中に示された（
すなわち、それらが明らかな膜の連続性を示した）。Ｃ
Ｄ４抗原の存在しないリポソームは細胞膜上の上に載っ
ているが、しかし実際の融合の証拠を示さなかった。
これらの細胞の蛍光分析は、リポソームがそれらの二重
層中にＣＤ４抗原、並びに脂質−口−ダミン接合体を有
した実験で有意なローダミン蛍光を示した。この蛍光は
拡散し、また中断したが、しかしすべての場合に細胞の
核から排除された。
層中にＣＤ４抗原、並びに脂質−口−ダミン接合体を有
した実験で有意なローダミン蛍光を示した。この蛍光は
拡散し、また中断したが、しかしすべての場合に細胞の
核から排除された。
拡散蛍光はリポソームが細胞の形質膜と融合したことを
示す。中断蛍光は細胞表面上に集まるがしかし融合しな
いけれどもおそらく結合および融合の初期段階にあるリ
ポソームのためであることができる。それはまた細胞の
消化画室中のリポソーム成分の隔離、並びにリポソーム
のエンドサイト−シスの結果に基くことができる。しか
し、核からの染料の排除が細胞がなお生存可能なことを
示す。
示す。中断蛍光は細胞表面上に集まるがしかし融合しな
いけれどもおそらく結合および融合の初期段階にあるリ
ポソームのためであることができる。それはまた細胞の
消化画室中のリポソーム成分の隔離、並びにリポソーム
のエンドサイト−シスの結果に基くことができる。しか
し、核からの染料の排除が細胞がなお生存可能なことを
示す。
同様の試験に未感染健全Ｈ９細胞を用いた場合に、単に
ときどき蛍光が細胞表面に付着したリポソームから検出
された。ＣＤ４抗原をもたないリポソームを用いたとき
にＨ９細胞の感染または非感染に関係なく有意な蛍光が
検出されなかった。
ときどき蛍光が細胞表面に付着したリポソームから検出
された。ＣＤ４抗原をもたないリポソームを用いたとき
にＨ９細胞の感染または非感染に関係なく有意な蛍光が
検出されなかった。
ＣＤ４抗原をもつ細胞はまたウィルス糖タンパク質（ｇ
ｐ１２０）をもつ感染細胞に結合するので、毒素積載細
胞またはリポソーム（膜中に取込まれたＣＤ４抗原を有
する）の使用はこれらの細胞またはリポソームとＨＩＶ
感染細胞とを融合させ、その後、それらが健全なＴ４細
胞に結合してそれと融合できる前に後者が破壊される。
ｐ１２０）をもつ感染細胞に結合するので、毒素積載細
胞またはリポソーム（膜中に取込まれたＣＤ４抗原を有
する）の使用はこれらの細胞またはリポソームとＨＩＶ
感染細胞とを融合させ、その後、それらが健全なＴ４細
胞に結合してそれと融合できる前に後者が破壊される。
これは患者の免疫系をＨＩＶ感染細胞によるそれ以上の
破壊から、望ましくはそれが修復できない損傷をうける
前に防止作用をする。
破壊から、望ましくはそれが修復できない損傷をうける
前に防止作用をする。
本発明に有利に使用できる毒素の限定的でない例にはり
シン（ＭＷ２５．０００のタンパク質、その毒性Ａ鎖が
必要なすべてである）、アブリン（一定植物の種子から
得られる有毒アルブミン）、ゲロニン（ＭＷ２３．００
０の、非免疫源である利点を有するタンパク質）および
ジフテリア毒素が含まれる。
シン（ＭＷ２５．０００のタンパク質、その毒性Ａ鎖が
必要なすべてである）、アブリン（一定植物の種子から
得られる有毒アルブミン）、ゲロニン（ＭＷ２３．００
０の、非免疫源である利点を有するタンパク質）および
ジフテリア毒素が含まれる。
これらの多くは市販されている。ゲロニンはビール（Ｐ
ｉｈｌ）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、２５５
．６９４７〜６９５３ （１９８０）の方法により調製
される。本発明の実施例が後に示され、毒素としてリシ
ンおよび（または）ゲロニンの使用に関して示されるが
、しかし、任意の適当な細胞障害物質を、基本操作を大
きく変形することなくこれらの代りに用いることができ
る。
ｉｈｌ）ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、２５５
．６９４７〜６９５３ （１９８０）の方法により調製
される。本発明の実施例が後に示され、毒素としてリシ
ンおよび（または）ゲロニンの使用に関して示されるが
、しかし、任意の適当な細胞障害物質を、基本操作を大
きく変形することなくこれらの代りに用いることができ
る。
（ｉ） 嵐未便里
本発明を構成する修飾細胞を、ＨＩＶ感染リンパ球を抹
梢循環から選択的に排除することによるエイズの治療に
用いることができる。操作にはエイズウィルスに対する
受容体（ｃＤ４抗原）を自己赤血球膜中へ挿入すること
を包含される。感染細胞はその外部表面上にｇｐ１２０
フソーゲンタンパク質を発現し従ってＣＤ４含有細胞を
結合する。エイズ患者中でリンパ球（通常ＣＤ４抗原を
もつ）はＨＩＶ感染細胞（通常ｇｐ １２０タンパク質
をもつ）に結合し、これが、すべての細胞が感染するか
または死ぬまで感染の拡散を生じ、従って免疫系の一般
的減退をもたらす。もちろん、ＨＩｖ感染リンパ球は、
正確にＴヘルパーリンパ球とではなく、ＣＤ４をもつ細
胞と結合し、融合する。前記のように、これにはＣＤ４
をもつ赤血球が含まれる。ＣＤ４−赤血球がその中に細
胞障害物質を含む場合に、融合は両細胞の死を生ずる。
梢循環から選択的に排除することによるエイズの治療に
用いることができる。操作にはエイズウィルスに対する
受容体（ｃＤ４抗原）を自己赤血球膜中へ挿入すること
を包含される。感染細胞はその外部表面上にｇｐ１２０
フソーゲンタンパク質を発現し従ってＣＤ４含有細胞を
結合する。エイズ患者中でリンパ球（通常ＣＤ４抗原を
もつ）はＨＩＶ感染細胞（通常ｇｐ １２０タンパク質
をもつ）に結合し、これが、すべての細胞が感染するか
または死ぬまで感染の拡散を生じ、従って免疫系の一般
的減退をもたらす。もちろん、ＨＩｖ感染リンパ球は、
正確にＴヘルパーリンパ球とではなく、ＣＤ４をもつ細
胞と結合し、融合する。前記のように、これにはＣＤ４
をもつ赤血球が含まれる。ＣＤ４−赤血球がその中に細
胞障害物質を含む場合に、融合は両細胞の死を生ずる。
さらに、ウィルス自体がＣＤ４タンパク質に結合するの
で、血流中の遊離ウィルスがＣＤ４保持赤血球に結合し
、その中に隔離される。赤血球が遺伝装置を欠くのでウ
ィルスはその中で繁殖できない。従って二重の効果があ
り：血流中の少量の遊離ウィルスを隔離し、また−層重
要なことにはｇｐ１２０をもつ感染リンパ球が健全なＴ
細胞に結合しウィルスを拡散することができる前にそれ
と融合し、破壊する。
で、血流中の遊離ウィルスがＣＤ４保持赤血球に結合し
、その中に隔離される。赤血球が遺伝装置を欠くのでウ
ィルスはその中で繁殖できない。従って二重の効果があ
り：血流中の少量の遊離ウィルスを隔離し、また−層重
要なことにはｇｐ１２０をもつ感染リンパ球が健全なＴ
細胞に結合しウィルスを拡散することができる前にそれ
と融合し、破壊する。
エンジニアド赤血球の静脈内注射に加えて、毒素をリポ
ソームの使用により他の組織中へ選択的に導入すること
ができる。例えば、リポソーム（その二重層内にＣＤ４
抗原をもち、リポソーム内に封入されたゲロニン、リシ
ンまたは若干の他の毒素を含有する）のリンパ節内への
Ｍｉ織内（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）注射（例えば指
間）によりリンパ節中に存在する感染細胞を選択的に攻
撃することができる。そのような治療の方法の利点は、
こ＼に提供される方法により発生されるリポソームが小
細胞の大きさに接近する大きさであり、従って注射後の
エンドサイト−シスにより分解されないことである。
ソームの使用により他の組織中へ選択的に導入すること
ができる。例えば、リポソーム（その二重層内にＣＤ４
抗原をもち、リポソーム内に封入されたゲロニン、リシ
ンまたは若干の他の毒素を含有する）のリンパ節内への
Ｍｉ織内（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）注射（例えば指
間）によりリンパ節中に存在する感染細胞を選択的に攻
撃することができる。そのような治療の方法の利点は、
こ＼に提供される方法により発生されるリポソームが小
細胞の大きさに接近する大きさであり、従って注射後の
エンドサイト−シスにより分解されないことである。
さらに、本発明を構成するＣＤ４をもつ細胞およびリポ
ソームは、試験管内検定の一部としてｇｐ１２０をもつ
（すなわち、感染した）リンパ球の存在の検出に使用で
きる（後記実施例５の操作を用いる）。そのような操作
には本発明による細胞またはリポソームの生成が包含さ
れる。診断試薬を構成する細胞またはリポソームはそれ
らの膜中にＣＤ４抗原を有し、それらの細胞質中に細胞
障害物質を含有し、放射性物質、有利にはクロム−５１
で標識される。ＨＩＶ感染細胞がｇｐ１２０ウィルスタ
ンパク質をそれらの膜内にもつのでそのような細胞は、
ＣＤ４をもち、毒素を含有し、放射性標識した細胞と融
合し、次いで放射性標識を周囲媒質中へ遊離する。
ソームは、試験管内検定の一部としてｇｐ１２０をもつ
（すなわち、感染した）リンパ球の存在の検出に使用で
きる（後記実施例５の操作を用いる）。そのような操作
には本発明による細胞またはリポソームの生成が包含さ
れる。診断試薬を構成する細胞またはリポソームはそれ
らの膜中にＣＤ４抗原を有し、それらの細胞質中に細胞
障害物質を含有し、放射性物質、有利にはクロム−５１
で標識される。ＨＩＶ感染細胞がｇｐ１２０ウィルスタ
ンパク質をそれらの膜内にもつのでそのような細胞は、
ＣＤ４をもち、毒素を含有し、放射性標識した細胞と融
合し、次いで放射性標識を周囲媒質中へ遊離する。
本発明を診断試薬として用いるには、患者、場合により
エイズをもつ疑いのあるもの、から血液をとり、白血球
（殊にリンパ球）を標準操作（例えば、本明細書に既に
記載した操作）により捕集し、リポソームが例示のため
に使用される後記実施例５に記載されるように、小分割
量を試験管内で本発明の細胞またはリポソームの分割量
と混合する。３７℃またはその付近で細胞融合が起る十
分な時間、最適には２４時間まで、インキュベートした
後、細胞媒質の試料を捕集し、放射能を測定する。測定
は正常なヒトの血液の白血球を対照として用いて二重に
行なわれる。対照細胞と比較して患者からとった細胞の
周囲の媒質中の放射能（補正式による計算後）の高水準
の検出は融合、それにより患者の血液中にｇｐ１２０タ
ンパク質を含む細胞の存在することを示す。後者は前記
細胞がエイズウィルスで感染されたことおよび従って患
者がエイズをもつことを意味すると解釈される。ＣＤ４
以外の抗原を本発明の細胞またはリポソームの膜内に導
入できるので他のウィルス疾患を、この操作を用いて診
断することができる。これまでは、エイズに対する診断
操作は通常エイズをもつ疑いのある患者の血液中の抗Ｈ
ＩＶ抗体の存在の検出による。しかし、そのような所見
は必らずしも疾患の発生を示さないで、単に患者がウィ
ルスまたはその抗原の若干にさらされたことを示す。こ
＼に開示された診断法は、ウィルスが複製されている感
染細胞の存在、すなわち活性感染、を示す利点を有する
。出願人はそれらのすべての等個物を期待する意図であ
る。
エイズをもつ疑いのあるもの、から血液をとり、白血球
（殊にリンパ球）を標準操作（例えば、本明細書に既に
記載した操作）により捕集し、リポソームが例示のため
に使用される後記実施例５に記載されるように、小分割
量を試験管内で本発明の細胞またはリポソームの分割量
と混合する。３７℃またはその付近で細胞融合が起る十
分な時間、最適には２４時間まで、インキュベートした
後、細胞媒質の試料を捕集し、放射能を測定する。測定
は正常なヒトの血液の白血球を対照として用いて二重に
行なわれる。対照細胞と比較して患者からとった細胞の
周囲の媒質中の放射能（補正式による計算後）の高水準
の検出は融合、それにより患者の血液中にｇｐ１２０タ
ンパク質を含む細胞の存在することを示す。後者は前記
細胞がエイズウィルスで感染されたことおよび従って患
者がエイズをもつことを意味すると解釈される。ＣＤ４
以外の抗原を本発明の細胞またはリポソームの膜内に導
入できるので他のウィルス疾患を、この操作を用いて診
断することができる。これまでは、エイズに対する診断
操作は通常エイズをもつ疑いのある患者の血液中の抗Ｈ
ＩＶ抗体の存在の検出による。しかし、そのような所見
は必らずしも疾患の発生を示さないで、単に患者がウィ
ルスまたはその抗原の若干にさらされたことを示す。こ
＼に開示された診断法は、ウィルスが複製されている感
染細胞の存在、すなわち活性感染、を示す利点を有する
。出願人はそれらのすべての等個物を期待する意図であ
る。
本発明を構成する細胞およびリポソームは、さらに治療
量の抗ウィルス薬を細胞例えばマクロファージおよびタ
ッパ−細胞に直接送達する手段として利用できる。後者
の型の細胞（細網内皮系の一部）はＨＩＶに対する受容
体をもたない。しかしＨｒ Ｖ感染細胞はそれらの表面
上に異質抗原を発現し、ついにはマクロファージおよび
タッパ−細胞により吸収され捕食される。この経路は細
網内皮系の細胞の感染に、不本意にもそれらの表面上の
ＣＤ４抗原がウィルスにより使用される。これらの細胞
を、ウィルスの住拠となりその複製を許すことから保護
するために本発明の細胞およびリポソームを、治療量の
抗エイズ薬をマクロファージ、クツパー細胞および細網
内皮系の他の細胞に直接送達するために使用できる。こ
れは、これらの食細胞の細胞が感染細胞および他のウィ
ルス汚染砕片を摂取した後ウィルスで感染されるのを保
護する効果を有する。
量の抗ウィルス薬を細胞例えばマクロファージおよびタ
ッパ−細胞に直接送達する手段として利用できる。後者
の型の細胞（細網内皮系の一部）はＨＩＶに対する受容
体をもたない。しかしＨｒ Ｖ感染細胞はそれらの表面
上に異質抗原を発現し、ついにはマクロファージおよび
タッパ−細胞により吸収され捕食される。この経路は細
網内皮系の細胞の感染に、不本意にもそれらの表面上の
ＣＤ４抗原がウィルスにより使用される。これらの細胞
を、ウィルスの住拠となりその複製を許すことから保護
するために本発明の細胞およびリポソームを、治療量の
抗エイズ薬をマクロファージ、クツパー細胞および細網
内皮系の他の細胞に直接送達するために使用できる。こ
れは、これらの食細胞の細胞が感染細胞および他のウィ
ルス汚染砕片を摂取した後ウィルスで感染されるのを保
護する効果を有する。
例としてＡＺＴ（アジド−３′−デオキシチミジン）、
リババリンおよびＤＤＣが本発明の細胞およびリポソー
ム内に容易に封入される。これは１９８７年３月２４日
に発行された米国特許第４．６５２．４４９号に開示さ
れた封入操作を用いることにより最も容易に達成され、
それらの開示は特にこ＼に参照される。治療薬の封入の
前または後に、本発明の操作を用いて適当な抗原タンパ
ク質（エイズが治療される疾患である場合にはＣＤ４）
を赤血球およびリポソームの膜中へ挿入する。その結果
、赤血球またはリポソームは中に治療量の活性抗エイズ
薬を含有し、それをエイズウィルスで感染された細胞へ
向かわせ、その細胞との融合を誘発させる作用をするＣ
Ｄ４抗原を膜中に取込んでいる。融合後、この融合細胞
複合体は異質（感染細胞または細胞類の膜中のウイルス
コードタンバク質のため）と認識され、マクロファージ
および他の細網内皮細胞により捕食される。その結果、
抗エイズ薬が直接食細胞の細胞内へ導入され、これらの
細胞中のウィルスの複製を防ぎ、従ってウィルスがそれ
自体複製できる他の道筋を閉鎖する。
リババリンおよびＤＤＣが本発明の細胞およびリポソー
ム内に容易に封入される。これは１９８７年３月２４日
に発行された米国特許第４．６５２．４４９号に開示さ
れた封入操作を用いることにより最も容易に達成され、
それらの開示は特にこ＼に参照される。治療薬の封入の
前または後に、本発明の操作を用いて適当な抗原タンパ
ク質（エイズが治療される疾患である場合にはＣＤ４）
を赤血球およびリポソームの膜中へ挿入する。その結果
、赤血球またはリポソームは中に治療量の活性抗エイズ
薬を含有し、それをエイズウィルスで感染された細胞へ
向かわせ、その細胞との融合を誘発させる作用をするＣ
Ｄ４抗原を膜中に取込んでいる。融合後、この融合細胞
複合体は異質（感染細胞または細胞類の膜中のウイルス
コードタンバク質のため）と認識され、マクロファージ
および他の細網内皮細胞により捕食される。その結果、
抗エイズ薬が直接食細胞の細胞内へ導入され、これらの
細胞中のウィルスの複製を防ぎ、従ってウィルスがそれ
自体複製できる他の道筋を閉鎖する。
そのような方法の利点は、薬物が血液中に遊離しておら
ず、従って望ましくなく有害な副作用の生起に利用でき
ないことである。さらに、薬物を運ぶ細胞またはリポソ
ームの膜内の抗原が、膜中にｇｐ１２０タンパク質をも
つ細胞（すなわち、ＨＴＶ惑染感染）に対し特異性であ
り、健全な細胞が薬物にさらされず、従って薬物の固有
の毒性が非常に低下する。最終の結果は薬物の全量を減
少でき、従って全コストが低下され、薬物の有効治療細
胞質濃度がまた増加される（それが身体全体に無駄に拡
散しないため）。他の利点は、薬物が抗原修飾された赤
血球およびリポソーム内に有効に隔離されるので、身体
の組織液（ウィルス感染細胞が存在することがほとんど
ない場所）に拡散することができないことである。
ず、従って望ましくなく有害な副作用の生起に利用でき
ないことである。さらに、薬物を運ぶ細胞またはリポソ
ームの膜内の抗原が、膜中にｇｐ１２０タンパク質をも
つ細胞（すなわち、ＨＴＶ惑染感染）に対し特異性であ
り、健全な細胞が薬物にさらされず、従って薬物の固有
の毒性が非常に低下する。最終の結果は薬物の全量を減
少でき、従って全コストが低下され、薬物の有効治療細
胞質濃度がまた増加される（それが身体全体に無駄に拡
散しないため）。他の利点は、薬物が抗原修飾された赤
血球およびリポソーム内に有効に隔離されるので、身体
の組織液（ウィルス感染細胞が存在することがほとんど
ない場所）に拡散することができないことである。
本発明は次に以下の限定的でない実施例に関して記載さ
れる。
れる。
実施例
実施例１
ヒト白血球抗原ＣＤ４の赤血球形質膜中への（ａｌ
リポソームの典型的な調製を次のように行なった：使用
する脂質（使用前に２ ： １ （ｖ／ｖ）クロロホ
ルム／エタノール中に一３０℃で保存した）を種々の割
合で混合した。最も普通の抛作にはホスファチジルエタ
ノールアミン〔シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｓ＋１ｃａｌ Ｇｏ、、Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ。
リポソームの典型的な調製を次のように行なった：使用
する脂質（使用前に２ ： １ （ｖ／ｖ）クロロホ
ルム／エタノール中に一３０℃で保存した）を種々の割
合で混合した。最も普通の抛作にはホスファチジルエタ
ノールアミン〔シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｓ＋１ｃａｌ Ｇｏ、、Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ。
ＭＯ）から購入し、シンブレトン（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ
）ほか、ジャーナル・オプ・ジ・アメリカン・オイル・
ケミスツ・ソサイエテイー（Ｊ、 Ａｍ、 Ｏｉｌ。
）ほか、ジャーナル・オプ・ジ・アメリカン・オイル・
ケミスツ・ソサイエテイー（Ｊ、 Ａｍ、 Ｏｉｌ。
Ｃｈｅｗ、 Ｓｏｃ、） 、４２巻、５３〜６１ （１
９６５）に従って精製〕、ホスファチジルコリン（シグ
マ・ケミカル社製〕ホスファチジルセリン（シグマ社製
）およびコレステロール（シグマ社製）をそれぞれ１：
２：１：１．５のモル比で混合することか含まれ、典型
的には５■の全重量を用いた。この混合物（最終濃度１
０〜３０ｍＭ）を窒素の流れ下に、次に真空下に１時間
（残留する微量の有機溶媒を除去するため）薄膜に乾燥
した。リポソームは逆相蒸発（ｆｅｖｅｒｓｅ ｐｈａ
ｓｅｅｖａｐｏｒａｔ、１ｏｎ）により調製した〔スゾ
カ（Ｓｚｏｋａ） ＋プロシーデインゲス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔ。
９６５）に従って精製〕、ホスファチジルコリン（シグ
マ・ケミカル社製〕ホスファチジルセリン（シグマ社製
）およびコレステロール（シグマ社製）をそれぞれ１：
２：１：１．５のモル比で混合することか含まれ、典型
的には５■の全重量を用いた。この混合物（最終濃度１
０〜３０ｍＭ）を窒素の流れ下に、次に真空下に１時間
（残留する微量の有機溶媒を除去するため）薄膜に乾燥
した。リポソームは逆相蒸発（ｆｅｖｅｒｓｅ ｐｈａ
ｓｅｅｖａｐｏｒａｔ、１ｏｎ）により調製した〔スゾ
カ（Ｓｚｏｋａ） ＋プロシーデインゲス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） 、ＵＳＡ、 ７５巻、４１
９４〜４１９８（１９７８）参照〕。簡単に記載すると
、脂質物質を新蒸留エーテル４．５−に溶解し、浴型音
波処理器中でリン酸塩緩衝食塩水（Ｐ Ｂ Ｓ）１、５
ｍｌとともに１５秒間音波処理した。可溶化は洗浄剤
／脂質モル比が８：１にあるようにｎ−オクチル−Ｄ−
グルコピラノシド（ＯＧ）の添加により補助した。エー
テルを回転蒸発器中で減圧下に除去し、リポソーム懸濁
液をＰＢＳで、またはホウ酸塩緩衝液ｐ）１７．２、中
に４．５−に希釈した。あるいはリポソームを、疎水性
ビーズ上の吸着を用いるフイリボット（Ｐｈｉｌｉｐｐ
ｏｔ）ほか、ビオシミ力・工・ビオフィジ力・アクタ（
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｆｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ）
、１３７〜１４３（１９８３）に記載された操作により
発生させることができる。
９４〜４１９８（１９７８）参照〕。簡単に記載すると
、脂質物質を新蒸留エーテル４．５−に溶解し、浴型音
波処理器中でリン酸塩緩衝食塩水（Ｐ Ｂ Ｓ）１、５
ｍｌとともに１５秒間音波処理した。可溶化は洗浄剤
／脂質モル比が８：１にあるようにｎ−オクチル−Ｄ−
グルコピラノシド（ＯＧ）の添加により補助した。エー
テルを回転蒸発器中で減圧下に除去し、リポソーム懸濁
液をＰＢＳで、またはホウ酸塩緩衝液ｐ）１７．２、中
に４．５−に希釈した。あるいはリポソームを、疎水性
ビーズ上の吸着を用いるフイリボット（Ｐｈｉｌｉｐｐ
ｏｔ）ほか、ビオシミ力・工・ビオフィジ力・アクタ（
Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｆｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ）
、１３７〜１４３（１９８３）に記載された操作により
発生させることができる。
（′ｂ）細構成のために、リポソームの懸濁液（ホウ酸
塩緩衝液ｐＨ７，・２、ｌａｄ中に脂質５可を含む）を
取込ませるタ゛ンパク質を含む溶液と混合した。
塩緩衝液ｐＨ７，・２、ｌａｄ中に脂質５可を含む）を
取込ませるタ゛ンパク質を含む溶液と混合した。
精製ＣＤ４ （１％のＯＧを含むＰＢＳ中４〜６■タン
パク質／ＩＲ１の濃度で）を脂質−洗浄剤混合物に加え
た。脂質とタンパク質との重量比は５〜１０に維持した
。ジメチルスペルイミダート（シグマ社から購入）を１
０’Ｃの温度で１．５■／−の最終スペルイミダートｔ
ａ度に達するまで徐々に加えた。次いで混合物を１０”
Ｃの温度で３０分間インキュベートし、次いでホウ酸塩
緩衝液に対して４℃の温度で２時間透析した。
パク質／ＩＲ１の濃度で）を脂質−洗浄剤混合物に加え
た。脂質とタンパク質との重量比は５〜１０に維持した
。ジメチルスペルイミダート（シグマ社から購入）を１
０’Ｃの温度で１．５■／−の最終スペルイミダートｔ
ａ度に達するまで徐々に加えた。次いで混合物を１０”
Ｃの温度で３０分間インキュベートし、次いでホウ酸塩
緩衝液に対して４℃の温度で２時間透析した。
生じた混合物を次に、未反応タンパク質がらりボソーム
を分離するためにセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
４ Ｂカラム上でクロマトグラフにかけた。
を分離するためにセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
４ Ｂカラム上でクロマトグラフにかけた。
コノ操作はＣＤ４抗原約５，０００〜２０，０００分子
毎リポソームを生ずる。リポソームはフローサイトメト
リーおよびフリーズフラクチャーを用いて確認した。そ
れらの内部容積は１２〜１６リソトル毎モル脂質である
と認められ、それらの平均外径は約４５０ｎｍであると
認められた。
毎リポソームを生ずる。リポソームはフローサイトメト
リーおよびフリーズフラクチャーを用いて確認した。そ
れらの内部容積は１２〜１６リソトル毎モル脂質である
と認められ、それらの平均外径は約４５０ｎｍであると
認められた。
純ＣＤ４を存する再構成に加えて、またタンパク質混合
物の一部としてＣＤ４の量に等しい量のりゾチームを用
いて操作を行なった。これはそのときＣＤ４とともに取
込まれ、修飾赤血球を生成させる後者の融合段階中のリ
ポソーム相互の融合を防ぐ利点を有する。
物の一部としてＣＤ４の量に等しい量のりゾチームを用
いて操作を行なった。これはそのときＣＤ４とともに取
込まれ、修飾赤血球を生成させる後者の融合段階中のリ
ポソーム相互の融合を防ぐ利点を有する。
リゾチームの酵素活性は（リゾチームが使用されれば）
ミクロコツカス・レイソディクチヵス（Ｍｉｃｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ １ｅ：５ｏｄｅｉｋｔ：ｃｕｓ）検定（アー
ビンテ（Ａｒｖｉｎｔｅ）ほか、プロシーデインゲス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）、
ＵＳＡ、１主、９６２〜９６６ （１９８６））により
検定することができる。
ミクロコツカス・レイソディクチヵス（Ｍｉｃｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ １ｅ：５ｏｄｅｉｋｔ：ｃｕｓ）検定（アー
ビンテ（Ａｒｖｉｎｔｅ）ほか、プロシーデインゲス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）、
ＵＳＡ、１主、９６２〜９６６ （１９８６））により
検定することができる。
（ｃ１新全血を同容積のリン酸塩緩衝食塩水（Ｐｕｓ、
５ｍＭリン酸塩、１４５ｍＭ−ＮａＣ１１ｐＨ７，４）
で希釈し、遠心分離（６４０ｇ、４℃で３０分）により
血漿から分離した。上澄みおよび白血球のバフィーコー
トはともに廃棄した。多形核白血球を吸収性綿濾過によ
り除去した。次いで赤血球をＰ Ｂ Ｓ、 ｐｔ＋７．
４、中に再懸濁し、次いでさらに３回洗浄する（各２．
ＯＯＯｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離）。
５ｍＭリン酸塩、１４５ｍＭ−ＮａＣ１１ｐＨ７，４）
で希釈し、遠心分離（６４０ｇ、４℃で３０分）により
血漿から分離した。上澄みおよび白血球のバフィーコー
トはともに廃棄した。多形核白血球を吸収性綿濾過によ
り除去した。次いで赤血球をＰ Ｂ Ｓ、 ｐｔ＋７．
４、中に再懸濁し、次いでさらに３回洗浄する（各２．
ＯＯＯｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離）。
（ｄ） へマドクリットを７０％に調整し、次いで赤
血球（約５００〜１０００万）を等容積のリポソーム相
互液（リゾチームを有するかまたは有さす、１〜１０リ
ポソ一ム毎赤血球の比を与える十分なリポソームを使用
）および酢酸ナトリウム緩衝液（０，０２Ｍ＃酸ナトリ
ウム１０．１４５Ｍ−ＮａＣｆ）１．４−とともに最終
ｐＨ５，５で、３７℃の温度で３０分間インキュベート
した。
血球（約５００〜１０００万）を等容積のリポソーム相
互液（リゾチームを有するかまたは有さす、１〜１０リ
ポソ一ム毎赤血球の比を与える十分なリポソームを使用
）および酢酸ナトリウム緩衝液（０，０２Ｍ＃酸ナトリ
ウム１０．１４５Ｍ−ＮａＣｆ）１．４−とともに最終
ｐＨ５，５で、３７℃の温度で３０分間インキュベート
した。
次いで１４００ ｇで、２０℃で２０分間遠心分離する
ことにより赤血球を捕集した。蛍光標識抗ＣＤ４抗体に
よる免疫蛍光検定を用いて赤血球／リポソームハイブリ
ッドの小試料の形質膜中のＣＤ４抗原の存在を定量的に
測定した。
ことにより赤血球を捕集した。蛍光標識抗ＣＤ４抗体に
よる免疫蛍光検定を用いて赤血球／リポソームハイブリ
ッドの小試料の形質膜中のＣＤ４抗原の存在を定量的に
測定した。
あるいは、ＣＤ４をリポソームの使用なく挿入すること
ができる。このとき、酢酸ナトリウム緩衝液（０，０２
Ｎ、 ｐＨ４，７，０，１４５Ｍ−ＮａＣ１）１５ｍｆ
ｆ１．ＣＤ４を０．１〜０．４ Ｎ含む溶液（１％オク
チルグルコシド中）６０μ！および赤血球懸濁液（ＲＢ
’Ｃペレット５０μｌとＰＢＳ、ρ■７．４、■−との
混合により生成）３０ｔｔｌをエッペンドルフ（Ｅｐｐ
ｅｎｄｏｒｆ ）遠心管（１５−サイズが便宜であった
）中で混合し、３７℃で６０〜９０秒間インキュベート
した。
ができる。このとき、酢酸ナトリウム緩衝液（０，０２
Ｎ、 ｐＨ４，７，０，１４５Ｍ−ＮａＣ１）１５ｍｆ
ｆ１．ＣＤ４を０．１〜０．４ Ｎ含む溶液（１％オク
チルグルコシド中）６０μ！および赤血球懸濁液（ＲＢ
’Ｃペレット５０μｌとＰＢＳ、ρ■７．４、■−との
混合により生成）３０ｔｔｌをエッペンドルフ（Ｅｐｐ
ｅｎｄｏｒｆ ）遠心管（１５−サイズが便宜であった
）中で混合し、３７℃で６０〜９０秒間インキュベート
した。
上記３溶液（緩衝液、タンパク質およびＲＢＣ）は混合
前に３７℃に加温すべきである。インキュベーション後
、Ｐ Ｂ Ｓ、 ｐＨ７，４，１ｏｒＩＩｌを加え（細
胞の低ｐＨに対する暴露を停止するため）、次いで反応
混合物をエフベンドルフ遠心分離機の固定角ローター中
で３０００ｒｐ、ｍで４分間遠心分離することにより細
胞を濃縮した。上澄みを除き、次いで細胞をＰ Ｂ Ｓ
、 ｐＨ７、４、中に再懸濁させた。さらにＰＢＳ中で
同条件下に３洗浄を行なった。
前に３７℃に加温すべきである。インキュベーション後
、Ｐ Ｂ Ｓ、 ｐＨ７，４，１ｏｒＩＩｌを加え（細
胞の低ｐＨに対する暴露を停止するため）、次いで反応
混合物をエフベンドルフ遠心分離機の固定角ローター中
で３０００ｒｐ、ｍで４分間遠心分離することにより細
胞を濃縮した。上澄みを除き、次いで細胞をＰ Ｂ Ｓ
、 ｐＨ７、４、中に再懸濁させた。さらにＰＢＳ中で
同条件下に３洗浄を行なった。
実施例２ 箪゛入みＣＤ４ 原の演
取込みＣＤ４抗原の抗原活性の存在をフルオレセインイ
ソチオシアナート標識抗ＣＤ４抗体を用いて蛍光活性化
細胞選別法〔コールタ−（ｃｏｕ ｌ ｔｅｒ）からの
エピックス（Ｅｐｉｃｓ） Ｖ細胞選別器を使用〕によ
り測定した。この測定に２試料を用いた：試料Ａ：Ｃ０
４分子を取込んだ赤血球、試料Ｂ：ＣＤ４タンパク質を
含まない赤血球。
ソチオシアナート標識抗ＣＤ４抗体を用いて蛍光活性化
細胞選別法〔コールタ−（ｃｏｕ ｌ ｔｅｒ）からの
エピックス（Ｅｐｉｃｓ） Ｖ細胞選別器を使用〕によ
り測定した。この測定に２試料を用いた：試料Ａ：Ｃ０
４分子を取込んだ赤血球、試料Ｂ：ＣＤ４タンパク質を
含まない赤血球。
以下の記載においてＦ ＩＴＣはタンパク質類に対する
蛍光標識のフルオレセインイソチオシアナートを示す。
蛍光標識のフルオレセインイソチオシアナートを示す。
用いた操作は次のとおりであった：
両試料、ＡおよびＢ、をＰＢＳ、ｐＨ７，４、で洗浄し
、遠心分離（エソペンドルフ蓮心分離機中で３．０００
ｒｐｔｓで４分間）により濃縮した。各試験において
、細胞ペレット上に次の単クローン性抗体の１溶液、各
１６μｌを層にした： （１）抗Ｔ ４− Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅ
ｚ単クローン性抗体、Ｍ １０２ １０ ０ＡＸ％ Ｂ
ｒｏｗｎ Ｄｅｅｒ。
、遠心分離（エソペンドルフ蓮心分離機中で３．０００
ｒｐｔｓで４分間）により濃縮した。各試験において
、細胞ペレット上に次の単クローン性抗体の１溶液、各
１６μｌを層にした： （１）抗Ｔ ４− Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅ
ｚ単クローン性抗体、Ｍ １０２ １０ ０ＡＸ％ Ｂ
ｒｏｗｎ Ｄｅｅｒ。
Ｗ Ｉ ５３２２３） １０μ１１（２） ｒＬ
ｅｕ ”３ａ −ＰｅＪ （抗ヒトＬｅｕ −３ａフ
イコ工リトリン接合体、ベクトン・デイキンソン（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ 、 Ｍｏｕｎｔａｉ
ｎ Ｖｉｅｗ 、 ＣＡ９４０３９製）１０Ｉ！ｆｆ
ｉ、 （３１ｒＯＫＴ−４Ａ−Ｆ ＩＴＣＪ （Ｏｒｔｈｏ
−ｍｕｎｅＯＫＴ−４３マウス単クロ一ン性抗体−ＦＩ
ＴＣ接合体、抗−ヒトインデューサー／ヘルパーＴ細胞
、オルト・ディアグノスティック・システムズ社（Ｏｒ
ｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ 、
Ｉｎｃ、。
ｅｕ ”３ａ −ＰｅＪ （抗ヒトＬｅｕ −３ａフ
イコ工リトリン接合体、ベクトン・デイキンソン（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ 、 Ｍｏｕｎｔａｉ
ｎ Ｖｉｅｗ 、 ＣＡ９４０３９製）１０Ｉ！ｆｆ
ｉ、 （３１ｒＯＫＴ−４Ａ−Ｆ ＩＴＣＪ （Ｏｒｔｈｏ
−ｍｕｎｅＯＫＴ−４３マウス単クロ一ン性抗体−ＦＩ
ＴＣ接合体、抗−ヒトインデューサー／ヘルパーＴ細胞
、オルト・ディアグノスティック・システムズ社（Ｏｒ
ｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ 、
Ｉｎｃ、。
Ｒａｒｉｔａｎ、 Ｎ Ｊ ０８８６９製）１０μｍ懸
濁液をかくはんして細胞塊を抗体溶液と混合した。細胞
を２２℃で１５分間蛍光標識抗ＣＤ４抗体と反応させた
。
濁液をかくはんして細胞塊を抗体溶液と混合した。細胞
を２２℃で１５分間蛍光標識抗ＣＤ４抗体と反応させた
。
インキュベーション後、ＰＢＳ、ｐｔ１７．４．１ｍｌ
を２試料に加え、細胞懸濁液を再び遠心分離（前記のよ
うに）により濃縮した。上澄み（ＡおよびＢ）は細胞に
結合しなかった抗体を含有し、これを除去した。ＰＢＳ
による洗浄および遠心分離機による濃縮の操作を２回繰
返して各上澄みを除去した。
を２試料に加え、細胞懸濁液を再び遠心分離（前記のよ
うに）により濃縮した。上澄み（ＡおよびＢ）は細胞に
結合しなかった抗体を含有し、これを除去した。ＰＢＳ
による洗浄および遠心分離機による濃縮の操作を２回繰
返して各上澄みを除去した。
細胞をＰＢＳ中に懸濁させて試験した。試料Ａの細胞の
みが顕微鏡検査、分光測光およびＦＡＣＳ検定により蛍
光性であったので、それらだけがそれらの膜中へＣＤ４
抗原を取込んだと考えることができた。
みが顕微鏡検査、分光測光およびＦＡＣＳ検定により蛍
光性であったので、それらだけがそれらの膜中へＣＤ４
抗原を取込んだと考えることができた。
さらに、プールした上澄み中の蛍光物質（ＦＩＴＣ）の
量を、４７０ｎｍの励起波長および４８０〜６００ｎｍ
における発光波長検定を用いて蛍光分光法により測定し
た。
量を、４７０ｎｍの励起波長および４８０〜６００ｎｍ
における発光波長検定を用いて蛍光分光法により測定し
た。
タンパク質蛍光測定は２８０ｎｍの励起波長を前記と同
じ発光範囲で用いた。
じ発光範囲で用いた。
プールした上澄みＡおよびＢ間の蛍光強度の差異は赤血
球に結合した蛍光標識の量に正比例した。
球に結合した蛍光標識の量に正比例した。
従って、初期抗体濃度および赤血球の数を知るとＣＤ４
分子毎細胞の数に対する平均値を計算することが簡単で
あった。
分子毎細胞の数に対する平均値を計算することが簡単で
あった。
上記操作において、各試料ＡおよびＢは約１４００万の
細胞を含み、蛍光単クローン性抗体の全量は約０．００
２１ｒＮｌであった。ＣＤ４抗原の平均分子量が約５８
，０００ドルトンであり、各インキュベーション混合物
は約７兆個の抗体分子を含有した。
細胞を含み、蛍光単クローン性抗体の全量は約０．００
２１ｒＮｌであった。ＣＤ４抗原の平均分子量が約５８
，０００ドルトンであり、各インキュベーション混合物
は約７兆個の抗体分子を含有した。
これらの値を
上澄みＢの蛍光
および、Ｎ＝抗体分子の数Ｘ（１ｍｌＲ）に用い、タン
パク質蛍光スペクトル（励起＝２８゜ｎｍ）から計算し
た値はＲ＝ １．１であった。
パク質蛍光スペクトル（励起＝２８゜ｎｍ）から計算し
た値はＲ＝ １．１であった。
ＦＩＴＣ蛍光に対する相当する値はＲ＝１．３３であっ
た。
た。
細胞膜中のＣＤ４分子が抗体により飽和されたと仮定す
ると、結合した抗体の数は取込んだＣＤ４分子の数（上
式中のＮ）に等しい。Ｒ＝ １．１を用いるとＮに対す
る値は３７ 、０００であった。
ると、結合した抗体の数は取込んだＣＤ４分子の数（上
式中のＮ）に等しい。Ｒ＝ １．１を用いるとＮに対す
る値は３７ 、０００であった。
Ｒ＝１．３３を用いると値はＮ＝５９，３００であった
。
。
用いた値はタンパク質蛍光またはタンパク質結合ＦＩＴ
Ｃ蛍光を測定するかにより、結果は従ってこれらの値の
平均である。従って我々の計算は３７．０００〜６０，
０ＯＯＣＤ ４分子毎細胞を示した。
Ｃ蛍光を測定するかにより、結果は従ってこれらの値の
平均である。従って我々の計算は３７．０００〜６０，
０ＯＯＣＤ ４分子毎細胞を示した。
実施例３ 迩ｊＵ引せ辺」−乞２」口１ｑ月ノ、（ａ）
実施例１に示した操作により調製した赤血球を冷０
．１５ Ｍ−ＮａＣｌで数回洗浄し、遠心分離してベレ
ットを得た。次いで細胞をＰＢＳ中にｐｌ＋７．４で再
懸濁した。
実施例１に示した操作により調製した赤血球を冷０
．１５ Ｍ−ＮａＣｌで数回洗浄し、遠心分離してベレ
ットを得た。次いで細胞をＰＢＳ中にｐｌ＋７．４で再
懸濁した。
（ｂｌ 次いで赤血球の懸濁液をＰＢＳ、ｐＨ７，４
、中に０．１ｍＭまでの純リシン毒素（シグマ・ケミカ
ル社の精製Ａ鎖）を含む溶液で洗浄した。赤血球を１．
０００ ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、最
終へマトクリソトを食塩水で７０％に調整した。
、中に０．１ｍＭまでの純リシン毒素（シグマ・ケミカ
ル社の精製Ａ鎖）を含む溶液で洗浄した。赤血球を１．
０００ ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、最
終へマトクリソトを食塩水で７０％に調整した。
（ｃ１赤血球懸濁液を４℃に冷却し、０．４１平方メー
トルの透析表面および１３．４ミクロンの膜厚を有する
普通の血液透析器の血液画室中へ連続的に流れさせた。
トルの透析表面および１３．４ミクロンの膜厚を有する
普通の血液透析器の血液画室中へ連続的に流れさせた。
螺動ポンプで２０〜６０−７分の定赤血球流量を維持し
た。血液透析器は低イオン強度緩衝液（０，０１Ｍリン
酸ナトリウム、０．０１Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．０
０２Ｍグルコース）をｐＨ７，４で、温度を４℃に維持
して５００ｄ／分の定流量で供給した。この透析段階の
間に、赤血球を、８．３のに対Ｎａ比で１Ｍ塩化物塩を
含む（毎リフドル）高張液１／１ｏ容積の添加による再
封の前に３７℃で溶解して捕集した（高ＡＴＰ含量を再
封細胞中に維持するため）。
た。血液透析器は低イオン強度緩衝液（０，０１Ｍリン
酸ナトリウム、０．０１Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．０
０２Ｍグルコース）をｐＨ７，４で、温度を４℃に維持
して５００ｄ／分の定流量で供給した。この透析段階の
間に、赤血球を、８．３のに対Ｎａ比で１Ｍ塩化物塩を
含む（毎リフドル）高張液１／１ｏ容積の添加による再
封の前に３７℃で溶解して捕集した（高ＡＴＰ含量を再
封細胞中に維持するため）。
（ｄ） 次いで細胞懸濁液を捕集し、３７℃で３０分
間維持して細胞を再封させた。次いで赤血球を、１ｍＭ
塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウムおよび２ｍＭ
グルコースを含む（毎リットル）０、１５ Ｍ−ＮａＣ
１溶液で２回洗浄する。次いで赤血球を、選択へマドク
リットで融合前に未変性自己血漿中に懸濁させる。
間維持して細胞を再封させた。次いで赤血球を、１ｍＭ
塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウムおよび２ｍＭ
グルコースを含む（毎リットル）０、１５ Ｍ−ＮａＣ
１溶液で２回洗浄する。次いで赤血球を、選択へマドク
リットで融合前に未変性自己血漿中に懸濁させる。
実施例４
赤血球中ヘリシンまたはゲロニン毒素を封入させる の
１ （ａ） 実施例１の同じ脂質混合物で開始し、残留有
機溶媒の蒸発によりそれをとり、封入させる毒性物質（
例えば、リシン、ゲロニンなど）をフイリボット（Ｐｈ
ｉ １ ｉ ｐｐｏ ｔ）ほかにより記載された操作
によりＨＥＰＥＳ緩衝液 （１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７，４）／１ｍＭ−
ＥＣ；ＴＡ／１５０ｍＭ−ＮａＣｇ）中で導入した。約
０．０１〜０．０２μｇ毎十億リポソームの最終値を与
える十分な毒素を用いた。２相系を短時間渦動し、脂質
を混合物中の成分の最高転移温度以上の温度で３０分間
永和させた。
１ （ａ） 実施例１の同じ脂質混合物で開始し、残留有
機溶媒の蒸発によりそれをとり、封入させる毒性物質（
例えば、リシン、ゲロニンなど）をフイリボット（Ｐｈ
ｉ １ ｉ ｐｐｏ ｔ）ほかにより記載された操作
によりＨＥＰＥＳ緩衝液 （１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７，４）／１ｍＭ−
ＥＣ；ＴＡ／１５０ｍＭ−ＮａＣｇ）中で導入した。約
０．０１〜０．０２μｇ毎十億リポソームの最終値を与
える十分な毒素を用いた。２相系を短時間渦動し、脂質
を混合物中の成分の最高転移温度以上の温度で３０分間
永和させた。
少量の洗浄剤〔トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ −１
００）を加え、試料の容積をＨＥＰＥＳ緩衝液で０、６
２５−に調整した。激しく振りまぜた後洗浄剤を除去し
た。
００）を加え、試料の容積をＨＥＰＥＳ緩衝液で０、６
２５−に調整した。激しく振りまぜた後洗浄剤を除去し
た。
山） ３つの異なる方法を洗浄剤の除去に用いた：ｉ
試料を１（３幅の透析袋中に置き、０．０１Ｍトリス−
ＨＣｌ （ｐＨ７、４） ／ １ ｍＭ −ＥＤＴＡ
ｌｏ、 １５ Ｍ−ＮａＣｌ ｌ Ｉ！に対し、媒質を
４交換して透析した。
試料を１（３幅の透析袋中に置き、０．０１Ｍトリス−
ＨＣｌ （ｐＨ７、４） ／ １ ｍＭ −ＥＤＴＡ
ｌｏ、 １５ Ｍ−ＮａＣｌ ｌ Ｉ！に対し、媒質を
４交換して透析した。
ｉｉ 透析媒質の量を１００−に減少し、バイオ−ビ
ーズ（Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ） （型５Ｍ−２、バイオ−
ラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 ＣＡ
）製〕を袋の外側緩衝液中に加えた。媒質は交換しなか
った。
ーズ（Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ） （型５Ｍ−２、バイオ−
ラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 ＣＡ
）製〕を袋の外側緩衝液中に加えた。媒質は交換しなか
った。
ｉｉｌ 若干の試験において、パイオービーズを試験
管中のリポソーム調製物に直接加え、回転ミキサー上に
置き、ＩＯＲＰＭで少くとも３時間回転した。
管中のリポソーム調製物に直接加え、回転ミキサー上に
置き、ＩＯＲＰＭで少くとも３時間回転した。
（ｃ） 必要なときには、リポソーム懸濁液をセファ
ロース４Ｂカラムに通して非封入物質を除去した。次い
でリシン含有リポソームを実施例１ ニおけるようにリ
ゾチームおよびＣＤ４の挿入に用いる。
ロース４Ｂカラムに通して非封入物質を除去した。次い
でリシン含有リポソームを実施例１ ニおけるようにリ
ゾチームおよびＣＤ４の挿入に用いる。
（ｄ） 次いで赤血球を実施例１に記載のようにリシ
ン（またはゲロニン）含有リポソームとともにインキュ
ベートする。融合効率は蛍光顕微鏡検査により、および
ＦＡＣ３分析によりモニターした。大規模製造に対し、
蛍光標識が単にモニターのために要求されたので蛍光標
識なくリシンを用いて操作を行なうことができる。
ン（またはゲロニン）含有リポソームとともにインキュ
ベートする。融合効率は蛍光顕微鏡検査により、および
ＦＡＣ３分析によりモニターした。大規模製造に対し、
蛍光標識が単にモニターのために要求されたので蛍光標
識なくリシンを用いて操作を行なうことができる。
実施例５
ゲロニンを含むＣＤ４−リポソームにょるＨ Ｉ Ｖ横
さ の量 互 ｆａ） Ｔ細胞集団、Ｈ９、をＨＴ細胞系からクロー
ン化し、細胞の若干をＨＩ Ｖ ／））雌株で持続感染
した。次いで細胞をＲＰＭ１１６４０媒質（１０％補体
除去ウシ胎仔血清、０．２ｍＭグルタミンを含む）中で
ヨフェ（Ｙｏｆｆｅ ）はが、プロシーデインゲス・オ
プ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、 Ｈａｔ、 Ａｃａｄ。
さ の量 互 ｆａ） Ｔ細胞集団、Ｈ９、をＨＴ細胞系からクロー
ン化し、細胞の若干をＨＩ Ｖ ／））雌株で持続感染
した。次いで細胞をＲＰＭ１１６４０媒質（１０％補体
除去ウシ胎仔血清、０．２ｍＭグルタミンを含む）中で
ヨフェ（Ｙｏｆｆｅ ）はが、プロシーデインゲス・オ
プ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、 Ｈａｔ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８土、１４２９〜１４３３ （、１
９８７）に記載されたように培養する。Ｈ９／ＨｒＶｌ
ｌｌ胞は光学顕微鏡検査により試験したときに未感染細
胞とは形態的に区別できない。従って、Ｈ９／ＨＩＶ細
胞によるウィルス生成は電子検微鏡ヰ★査並びに標準逆
転写酵素検定によりモニターした。
９８７）に記載されたように培養する。Ｈ９／ＨｒＶｌ
ｌｌ胞は光学顕微鏡検査により試験したときに未感染細
胞とは形態的に区別できない。従って、Ｈ９／ＨＩＶ細
胞によるウィルス生成は電子検微鏡ヰ★査並びに標準逆
転写酵素検定によりモニターした。
（ｂ） 若干が抗ＨＩＶ抗体に対し陰性であり、若干
が陽性であった血液供与者からＣＤ４抗原を含む細胞を
得た〔ヨフエ（Ｙｏｆｆｅ ）ほか、前掲、に記載され
たように〕。
が陽性であった血液供与者からＣＤ４抗原を含む細胞を
得た〔ヨフエ（Ｙｏｆｆｅ ）ほか、前掲、に記載され
たように〕。
（ｃ） 細胞を、（ｃｒ−５１）クロム酸ナトリウム
０．５ｍＣ１にュー・イングランド・ニュークリア社（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、 Ｂｏｓｔ
ｏｎ ＋ＭＡ）製〕を用いて３７℃で９０分間標識し、
次いでリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄した。次いで標識
細胞を１０，０００細胞毎ウェルの濃度に培養皿中へ塗
布した。
０．５ｍＣ１にュー・イングランド・ニュークリア社（
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、 Ｂｏｓｔ
ｏｎ ＋ＭＡ）製〕を用いて３７℃で９０分間標識し、
次いでリン酸塩緩衝食塩水で３回洗浄した。次いで標識
細胞を１０，０００細胞毎ウェルの濃度に培養皿中へ塗
布した。
（ｄ）ＣＤ４−リポソーム、ＣＤ４−リポソームプラス
遊離ゲロニン、およびゲロニン封入ＣＤ４−リポソーム
のそれぞれを、Ｔ＄ｌ胞を入れた個々のウェルに、５リ
ポソーム毎Ｔ細胞の比に加えた。次いで非感染Ｈ９細胞
およびＨＩＶ／Ｈ９細胞を個々にそれぞれのリポソーム
調製物とともに３７℃で１８時間インキュベートする。
遊離ゲロニン、およびゲロニン封入ＣＤ４−リポソーム
のそれぞれを、Ｔ＄ｌ胞を入れた個々のウェルに、５リ
ポソーム毎Ｔ細胞の比に加えた。次いで非感染Ｈ９細胞
およびＨＩＶ／Ｈ９細胞を個々にそれぞれのリポソーム
調製物とともに３７℃で１８時間インキュベートする。
（ｅ） インキュベーション後、培養から上澄み液の
１００μβ分割量を捕集し、放射能を液体シンチレーシ
ョンにより測定した。各試験に対し試験を３回行なった
（すなわち、３培養を各試験に用いる）。結果はパーセ
ント比クロム−５１遊離（ＳＰ ＲＥＬ）に関して解
釈され、それは細胞融合の程度を示し、式、 Ｒ−３Ｒ （式中、 ＥＲ＝試験遊離 ＭＲ＝最大遊離 ＳＲ＝自然遊離 である） により示される。
１００μβ分割量を捕集し、放射能を液体シンチレーシ
ョンにより測定した。各試験に対し試験を３回行なった
（すなわち、３培養を各試験に用いる）。結果はパーセ
ント比クロム−５１遊離（ＳＰ ＲＥＬ）に関して解
釈され、それは細胞融合の程度を示し、式、 Ｒ−３Ｒ （式中、 ＥＲ＝試験遊離 ＭＲ＝最大遊離 ＳＲ＝自然遊離 である） により示される。
自然遊離（Ｓ Ｒ）は標識細胞（すなわち、Ｈ９または
ＨＩＶ／Ｈ９）のみを入れたウェル中の上澄み液から０
． Ｉ Ｗ１１分割量を捕集することにより測定した。
ＨＩＶ／Ｈ９）のみを入れたウェル中の上澄み液から０
． Ｉ Ｗ１１分割量を捕集することにより測定した。
最大遊離は１％トライトンＸ−１００，０，１ｍｌで溶
解した標識細胞の上澄み液０．１ｍｌをとることにより
測定した。
解した標識細胞の上澄み液０．１ｍｌをとることにより
測定した。
放射能はウェルカウンターを用いて測定した。
（ｆ）１Ｒ時間のインキュベーション後にＨ９細胞およ
びＨＩＶ’／Ｈ９細胞の両方を回収し、洗浄し、トリパ
ンブルーで常法により染色して生存の程度を測定した。
びＨＩＶ’／Ｈ９細胞の両方を回収し、洗浄し、トリパ
ンブルーで常法により染色して生存の程度を測定した。
有意量のＣｒ−５１遊離がＨＩＶ感染Ｈ９細胞をＣＤ４
抗原およびゲロニンの両方を含むリポソームに暴露した
試験にのみ認められ、ＣＤ４−リポソームのみを用いた
場合、またはゲロニンが媒・質中に遊離しＣＤ４−リポ
ソーム内に封入されなかった場合には認められなかった
。この試験に対する結果は表１に示される。
抗原およびゲロニンの両方を含むリポソームに暴露した
試験にのみ認められ、ＣＤ４−リポソームのみを用いた
場合、またはゲロニンが媒・質中に遊離しＣＤ４−リポ
ソーム内に封入されなかった場合には認められなかった
。この試験に対する結果は表１に示される。
表１
エンジニアトリポソームと感染および正常Ｈ９細胞１
１１９ ２８００ ｃｐ
ｎ＋２ １１９ ＣＤ４−リポソーム ２
８００ ｃｐｍ５ ＨｒＶ／Ｈ９２８００ｃｐｍ ６ ＨＩＶ／１１９ ＣＤ４−リポソーム ２
８００ ｃｐｍ＊ 実施例５により３７℃で１８時間イ
ンキュベートした後の１０．０００細胞当りのｃｐｍと
して示した比遊離 ＊＊ 遊離ゲロニン濃度は０．０２■毎１０目リポソー
ムであった。
１１９ ２８００ ｃｐ
ｎ＋２ １１９ ＣＤ４−リポソーム ２
８００ ｃｐｍ５ ＨｒＶ／Ｈ９２８００ｃｐｍ ６ ＨＩＶ／１１９ ＣＤ４−リポソーム ２
８００ ｃｐｍ＊ 実施例５により３７℃で１８時間イ
ンキュベートした後の１０．０００細胞当りのｃｐｍと
して示した比遊離 ＊＊ 遊離ゲロニン濃度は０．０２■毎１０目リポソー
ムであった。
実施例６
エンジニアド赤血球による抗ＨＩＶ
” ２１翫 の １エ ン１５、抗ＨＩＶ抗体に
対して陽性と試験されたヒト患者はりシン、アブリン、
ゲロニンまたはジフテリア毒素を含有するエンジニアド
赤血球で次のように治療される。患者は充填エンジニア
ド赤血球（実質的にすべての細胞がＣＤ４抗原および細
胞毒を含む）の食塩水懸濁液２０ｄまでを静脈内（例え
ば膜中）に注射される。患者の状態を循環中の抗ＨＩＶ
抗体の濃度の測定並びに患者の状態の一般的進行により
モニターする。初期注射は医師が是認されると考えると
追加注射により事後処置することができる。
対して陽性と試験されたヒト患者はりシン、アブリン、
ゲロニンまたはジフテリア毒素を含有するエンジニアド
赤血球で次のように治療される。患者は充填エンジニア
ド赤血球（実質的にすべての細胞がＣＤ４抗原および細
胞毒を含む）の食塩水懸濁液２０ｄまでを静脈内（例え
ば膜中）に注射される。患者の状態を循環中の抗ＨＩＶ
抗体の濃度の測定並びに患者の状態の一般的進行により
モニターする。初期注射は医師が是認されると考えると
追加注射により事後処置することができる。
実施例７
リポソームおよびエンジニアド赤血球
を いるＡＲＣを する愚 の汐７、
ＡＲＣ（エイズ関連コンプレックス）を有すると思われ
るヒト患者は実施例６とはソ゛同様に容態に対して治療
される。しかし、このとき患者はエンジニアド赤血球と
リポソーム（ともに膜中のＣＤ４および細胞毒を含有す
る）との組合せで注射される。この疾患状態における主
標的がリンパ節であるので、有利には患者は組織内（例
えば指間）に約１０００億個のリポソームおよび最適活
性量の修飾赤血球の混合物を注射される。患者の状態は
実施例６におけるようにモニターされ、必要に応じて追
加治療が与えられる。
るヒト患者は実施例６とはソ゛同様に容態に対して治療
される。しかし、このとき患者はエンジニアド赤血球と
リポソーム（ともに膜中のＣＤ４および細胞毒を含有す
る）との組合せで注射される。この疾患状態における主
標的がリンパ節であるので、有利には患者は組織内（例
えば指間）に約１０００億個のリポソームおよび最適活
性量の修飾赤血球の混合物を注射される。患者の状態は
実施例６におけるようにモニターされ、必要に応じて追
加治療が与えられる。
実施例８
ＡＺＴを含有するエンジニアド赤血球によるｔ″′Ｈ■
Ｖ″性患者の臨 治療 量ＨＩ Ｖ抗体に対しまたは本出願において開示された
診断法により陽性と試験された患者はアジド−３′−デ
オキシチミジン（ＡＺＴ）を含む本発明の抗原修飾赤血
球またはリポソームで次のように治療される。患者は充
填赤血球またはリポソーム（該細胞またはリポソームは
実質的にすべてＣＤ４抗原および細胞質隔離治療量のＡ
ＺＴを含有する）の食塩水懸濁液２０−までを静脈内（
例えば膜中）に注射される。そのような処置は臨床医に
より調整され、薬物の全用量は安全限界内、最適には４
〜６時間当り１００〜３００■、に保たれる。次いで患
者の状態が循環中の抗ＨＩＶ抗体の存在の測定（または
本出願において示される診断法により）、並びに患者の
状態の一般的進行がモニターされる。次いで初期注射は
、主治医が是認されると考えると４〜６時間毎に追加注
射により事後処置される。
Ｖ″性患者の臨 治療 量ＨＩ Ｖ抗体に対しまたは本出願において開示された
診断法により陽性と試験された患者はアジド−３′−デ
オキシチミジン（ＡＺＴ）を含む本発明の抗原修飾赤血
球またはリポソームで次のように治療される。患者は充
填赤血球またはリポソーム（該細胞またはリポソームは
実質的にすべてＣＤ４抗原および細胞質隔離治療量のＡ
ＺＴを含有する）の食塩水懸濁液２０−までを静脈内（
例えば膜中）に注射される。そのような処置は臨床医に
より調整され、薬物の全用量は安全限界内、最適には４
〜６時間当り１００〜３００■、に保たれる。次いで患
者の状態が循環中の抗ＨＩＶ抗体の存在の測定（または
本出願において示される診断法により）、並びに患者の
状態の一般的進行がモニターされる。次いで初期注射は
、主治医が是認されると考えると４〜６時間毎に追加注
射により事後処置される。
明細書および特許請求の範囲が本発明の例示であって限
定でなく、また発明の精神および範囲内の他の態様が当
業者に連想されると理解される。
定でなく、また発明の精神および範囲内の他の態様が当
業者に連想されると理解される。
Claims (36)
- （１）細胞の他の細胞に対する結合およびそれとの融合
を誘発する抗原タンパク質を膜中へ導入された動物由来
細胞。 - （２）動物細胞が血液由来細胞である、請求項（１）記
載の動物由来細胞。 - （３）細胞が赤血球である、請求項（１）記載の動物由
来細胞。 - （４）細胞と、挿入させるタンパク質を二重層内に含む
リポソームとのｐＨ誘発融合により抗原タンパク質が細
胞内に挿入された、請求項（１）記載の動物由来細胞。 - （５）動物由来細胞と、挿入させる抗原タンパク質を二
重層内に含むリポソームとのフソーゲン誘発融合により
抗原タンパク質が動物由来細胞内に挿入された、請求項
（１）記載の動物由来細胞。 - （６）フソーゲンがタンパク質またはペプチドである、
請求項（５）記載の動物由来細胞。 - （７）フソーゲンがポリエチレングリコールである、請
求項（５）記載の動物由来細胞。 - （８）さらに、中に取込まれた１種またはそれ以上の細
胞障害物質を含む、請求項（１）記載の動物由来細胞。 - （９）細胞障害物質がタンパク質である、請求項（８）
記載の動物由来細胞。 - （１０）細胞障害物質がリシン、アブリン、ゲロニン、
およびジフテリア毒素、並びにそれらの毒物学的活性フ
ラグメントからなる群から選ばれる、請求項（８）記載
の動物由来細胞。 - （１１）細胞障害物質がゲロニンまたはその毒物学的活
性フラグメントである、請求項（８）記載の動物由来細
胞。 - （１２）抗原タンパク質がヒトＣＤ４抗原である、請求
項（１）記載の動物由来細胞。 - （１３）さらに、中に取込まれた１種またはそれ以上の
細胞障害物質を含む、請求項（１２）記載の動物由来細
胞。 - （１４）細胞障害物質がリシン、グロニン、アブリン、
およびジフテリア毒素、並びにそれらの毒物学的活性フ
ラグメントからなる群から選ばれる、請求項（１３）記
載の動物由来細胞。 - （１５）さらに、中に取込まれた１種またはそれ以上の
治療薬を含む、請求項（１２）記載の動物由来細胞。 - （１６）治療薬が抗ウィルス薬である、請求項（１５）
記載の動物由来物質。 - （１７）治療薬がＡＺＴ、アジド−３′−デオキシチミ
ジン（ＡＺＴ）三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸
およびリバビリンからなる群から選ばれる、請求項（１
５）記載の動物由来物質。 - （１８）二重層内にヒトＣＤ４抗原を取込んだリポソー
ム。 - （１９）さらに、中に取込まれた１種またはそれ以上の
細胞障害物質を含む、請求項（１８）記載のリポソーム
。 - （２０）細胞障害物質がリシン、ゲロニン、アブリン、
およびジフテリア毒素、並びにそれらの毒物学的活性フ
ラグメントからなる群から選ばれる、請求項（１９）記
載のリポソーム。 - （２１）さらに、中に取込まれた１種またはそれ以上の
治療薬を含む、請求項（１８）記載のリポソーム。 - （２２）治療薬がＡＺＴ、アジド−３′−デオキシチミ
ジン（ＡＺＴ）三リン酸、ジデオキシシチジン三リン酸
、およびリババリンからなる群から選ばれる、請求項（
２１）記載のリポソーム。 - （２３）薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁された請
求項（８）記載の細胞の治療有効量を含む組成物。 - （２４）薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁された請
求項（１５）記載の細胞の治療有効量を含む組成物。 - （２５）薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁された請
求項（１９）記載のリポソームの治療有効量を含む組成
物。 - （２６）請求項（８）記載の細胞の治療有効量を患者に
投与することを含む患者中の疾患を治療する方法。 - （２７）薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁された請
求項（１９）記載のリポソームの治療活性量を患者に投
与することを含む患者中の疾患を治療する方法。 - （２８）薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁された請
求項（８）記載の細胞と請求項（１９）記載のリポソー
ムとの混合物の治療活性量を患者に投与することを含む
患者中の疾患を治療する方法。 - （２９）疾患が後天性免疫不全症候群である、請求項（
２６）記載の方法。 - （３０）疾患が後天性免疫不全症候群である、請求項（
２７）記載の方法。 - （３１）疾患がエイズ関連コンプレックスである、請求
項（２８）記載の方法。 - （３２）薬理学的に許容される希釈剤中に懸濁された請
求項（１７）記載の細胞の治療活性量を患者に投与する
ことを含む患者中の疾患を治療する方法。 - （３３）血液細胞中のウィルス粒子の存在を測定する定
量的検定法であって、 （ａ）請求項（１９）記載のリポソームの試料（試薬リ
ポソームと称す）を調製する、 （ｂ）ウィルス疾患をもつ疑いのある患者から血液の試
料をとり、それから白血球（試験血液細胞と称する）を
捕集する、 （ｃ）健康なヒトから血液の試料をとり、それから白血
球（対照血液細胞と称する）を捕集する、 （ｄ）試験血液細胞および対照血液細胞を放射性同位体
の元素で標識する、 （ｅ）等数の放射性標識試験血液細胞を培養皿の３ウェ
ルのそれぞれ中へ、および等数の対照血液細胞を前記培
養皿の他の３ウェル中へ、６ウェルがそれぞれ同数の細
胞を含むように塗布する、 （ｆ）３対照細胞含有ウェルの１つおよび３試験細胞含
有ウェルの１つに試薬リポソームの分割量を加えて少く
とも１〜１０リポソーム毎細胞の最終最適比で、しかし
ともかく対照および試験細胞試料のそれぞれに対して等
しいリポソーム／細胞比を生成させる、 （ｇ）６ウェルのそれぞれの中の細胞を約３７℃の最適
温度で細胞−リポソーム融合を起させる十分な時間（最
適には約１０〜２４時間）インキュベートする、 （ｈ）４つの非リポソーム含有ウェルの、１つのウェル
が試験細胞を含み他のウェルが対照細胞を含む２つのウ
ェルに、１％トライトンＸ−１００または他の適当な洗
浄剤０．１ｍｌを加えることにより２ウェル中の細胞を
溶解する、（ｉ）培養のそれぞれの上澄み液を少くとも
１００μｌの分割量とり、それらの中の放射能を液体シ
ンチレーションまたは等価の操作により測定する、 （ｊ）試験血液細胞および対照血液細胞の両試料に対す
る比遊離（ＳＰＲＥＬ）の値を式、 ＳＰＲＥＬ＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）（式中、
ＳＰＲＥＬ、ＥＲ、ＭＲおよび ＳＲは本明細書の実施例５においてそれらに帰着させた
意味を有する） を用いて計算する、 ことを含む方法。 - （３４）試験血液細胞および対照血液細胞がリンパ球で
ある、請求項（３３）記載の検定法。 - （３５）放射性元素がクロム−５１である、請求項（３
３）記載の検定法。 - （３６）存在を測定されるウィルス粒子がエイズウィル
ス粒子である、請求項（３３）記載の検定法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6828887A | 1987-06-30 | 1987-06-30 | |
| US68288 | 1987-06-30 | ||
| US19744588A | 1988-05-27 | 1988-05-27 | |
| US197445 | 1988-05-27 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9134805A Division JP2825804B2 (ja) | 1987-06-30 | 1997-05-26 | 抗原を導入したリポソーム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01124382A true JPH01124382A (ja) | 1989-05-17 |
| JP2728166B2 JP2728166B2 (ja) | 1998-03-18 |
Family
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Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP63164103A Expired - Fee Related JP2728166B2 (ja) | 1987-06-30 | 1988-06-30 | 導入抗原タンパク質を有する動物由来細胞 |
| JP9134805A Expired - Lifetime JP2825804B2 (ja) | 1987-06-30 | 1997-05-26 | 抗原を導入したリポソーム |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9134805A Expired - Lifetime JP2825804B2 (ja) | 1987-06-30 | 1997-05-26 | 抗原を導入したリポソーム |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0298280B1 (ja) |
| JP (2) | JP2728166B2 (ja) |
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| AU (2) | AU1821988A (ja) |
| CA (1) | CA1327332C (ja) |
| DE (1) | DE3852221T2 (ja) |
| ES (1) | ES2067457T3 (ja) |
| IL (1) | IL86650A0 (ja) |
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| JP2013507379A (ja) * | 2009-10-08 | 2013-03-04 | 大塚製薬株式会社 | 悪性腫瘍の治療のための免疫活性化血液灌流フィルタ |
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