JPH01124391A - 動物細胞用プラスミド性ベクター及びそれを用いたモノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents
動物細胞用プラスミド性ベクター及びそれを用いたモノクローナル抗体の製造方法Info
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- JPH01124391A JPH01124391A JP62281090A JP28109087A JPH01124391A JP H01124391 A JPH01124391 A JP H01124391A JP 62281090 A JP62281090 A JP 62281090A JP 28109087 A JP28109087 A JP 28109087A JP H01124391 A JPH01124391 A JP H01124391A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はＬ因子を利用した動物細胞用プラスミド性ベク
ター及びそれを用いたモノクローナル抗体の製造方法に
関するものである。
ター及びそれを用いたモノクローナル抗体の製造方法に
関するものである。
遺伝子工学的手法によるモノクローナル抗体の製造例は
大腸ｉＪ （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 ｓｔ。
大腸ｉＪ （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 ｓｔ。
３２７３−３２７７、１９８４及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １２＋３７９１−３８０６．１
９８４）、酵母（Ｎａｔｕｒｅ、 ３１４．４４６−４
４９゜１９８５）及び動物細胞（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １２＋３７９１−３８０６．１
９８４）、酵母（Ｎａｔｕｒｅ、 ３１４．４４６−４
４９゜１９８５）及び動物細胞（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
靭、 ８２５−８２９．１９８３．１ｂｉｄ、、靭、
６３５１−６３５５．１９８３゜１ｂｉｄ、、８１．６
８５１−６８５５．１９８４）について報告されている
。しかしながら、大腸菌の場合には合成された抗体蛋白
にはＨ鎖及びＬ鎖が再構成されておらず糖鎖も付加され
ていない。また、この抗体蛍白は菌体内にとどまり菌体
外への分泌も行なわれていない。酵母の場合には合成さ
れた抗体蛋白は再構成されたものであり糖鎖も付加され
た形で菌体外に分泌されている。しかし、この糖鎖は天
然のものと異なっており軽鎖重鎖のアセンブル効率の非
常に悪いものである。動物細胞の場合にはＢ細胞由来の
細胞株について抗体の分泌例が報告されている。そのベ
クターにはｐＳＶ２ベクターが使用されており、再構成
された抗体には天然と同し糖鎖が付加されている。
６３５１−６３５５．１９８３゜１ｂｉｄ、、８１．６
８５１−６８５５．１９８４）について報告されている
。しかしながら、大腸菌の場合には合成された抗体蛋白
にはＨ鎖及びＬ鎖が再構成されておらず糖鎖も付加され
ていない。また、この抗体蛍白は菌体内にとどまり菌体
外への分泌も行なわれていない。酵母の場合には合成さ
れた抗体蛋白は再構成されたものであり糖鎖も付加され
た形で菌体外に分泌されている。しかし、この糖鎖は天
然のものと異なっており軽鎖重鎖のアセンブル効率の非
常に悪いものである。動物細胞の場合にはＢ細胞由来の
細胞株について抗体の分泌例が報告されている。そのベ
クターにはｐＳＶ２ベクターが使用されており、再構成
された抗体には天然と同し糖鎖が付加されている。
一方、本発明者は動物細胞用のプラスミド性ベクターと
し、て使用可能なし因子を既に発見している（特開昭６
０−１９４９２号公報、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、ｓｃｉ。
し、て使用可能なし因子を既に発見している（特開昭６
０−１９４９２号公報、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、ｓｃｉ。
ｕｓ八、８４．１７８９−１７９３．１９８７）。この
ＤＮＡはマウスＬ細胞由来の細胞株Ｂ−８２より見出さ
れたもので、染色体外に一綱胞あたり数千コピー存在す
る環状２本鎖ＤＮＡである。このＤＮＡが大腸菌などに
固有なベクターと複合ＤＮＡをつ（って菌体内及び動物
細胞内で増殖しうろこと及び有用物質生産のためＤＮＡ
を導入することにより目的物質の生産可能なベクターと
なりうろことが考えられたがいまだ実用化されるに至っ
ていない。
ＤＮＡはマウスＬ細胞由来の細胞株Ｂ−８２より見出さ
れたもので、染色体外に一綱胞あたり数千コピー存在す
る環状２本鎖ＤＮＡである。このＤＮＡが大腸菌などに
固有なベクターと複合ＤＮＡをつ（って菌体内及び動物
細胞内で増殖しうろこと及び有用物質生産のためＤＮＡ
を導入することにより目的物質の生産可能なベクターと
なりうろことが考えられたがいまだ実用化されるに至っ
ていない。
〔発明が解決しようとする問題点］
抗体分子においてｔａ鎖は種々の生物活性、抗体の安定
性などに対して重要な役割を果たしていることから、前
記諸報告に鑑み、大腸菌や酵母よりも動物細胞を宿主に
用いて抗体生産を行なうことが好ましい。しかし、前記
の動物細胞を用いた報告例においては抗体遺伝子を含む
ベクターが宿主細胞の染色体内にランダムに組込まれそ
のなかで発現に都合のよい染色体部位に組込まれた遺伝
子のみが発現する（Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２２４．６８６
．１９８４）という欠点を有していた。
性などに対して重要な役割を果たしていることから、前
記諸報告に鑑み、大腸菌や酵母よりも動物細胞を宿主に
用いて抗体生産を行なうことが好ましい。しかし、前記
の動物細胞を用いた報告例においては抗体遺伝子を含む
ベクターが宿主細胞の染色体内にランダムに組込まれそ
のなかで発現に都合のよい染色体部位に組込まれた遺伝
子のみが発現する（Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２２４．６８６
．１９８４）という欠点を有していた。
本発明者は上記のような問題点を解決するべく鋭意検討
の結果、前記り因子を動物細胞に導入した際にこの細胞
を改変するとともにこれに抗体遺伝子を導入したプラス
ミド性ベクターを新たに構築するに至った。そしてこの
ベクターをＢ細胞由来の細胞に導入して培養を行うこと
により天然型抗体を発現させることに成功し、この知見
に基いて本発明を完成することができた。
の結果、前記り因子を動物細胞に導入した際にこの細胞
を改変するとともにこれに抗体遺伝子を導入したプラス
ミド性ベクターを新たに構築するに至った。そしてこの
ベクターをＢ細胞由来の細胞に導入して培養を行うこと
により天然型抗体を発現させることに成功し、この知見
に基いて本発明を完成することができた。
すなわち、本発明は、制限酵素ＥｃｏＲＩの切断点を基
準とし、制限酵素器ｎｄＩ［［により約０．１キロベー
ス（ｋｂ）及び約２．３５ｋｂの位置に、制限酵素Ｋｐ
ｎＩにより約０．６ｋｂ及び約３．１ｋｂの位置に、制
限酵素ＢａｍＨｒにより約３．０７ｋｂの位置°に、ま
た制限酵素５ａＩＩにより約１．４５ｋｂの位置に各々
切断点を有するプラスミド性ベクター（Ｌ因子ベクター
）に抗体遺伝子領域、プロモーター領域及びエンハンサ
−領域を挿入し、閉環してなる動物細胞用プラスミド性
ベクターと、このベクターが導入されたＢ細胞由来の動
物細胞を培地に培養することを特徴とする前記遺伝子部
分に対応するモノクローナル抗体の製造方法に関するも
のである。
準とし、制限酵素器ｎｄＩ［［により約０．１キロベー
ス（ｋｂ）及び約２．３５ｋｂの位置に、制限酵素Ｋｐ
ｎＩにより約０．６ｋｂ及び約３．１ｋｂの位置に、制
限酵素ＢａｍＨｒにより約３．０７ｋｂの位置°に、ま
た制限酵素５ａＩＩにより約１．４５ｋｂの位置に各々
切断点を有するプラスミド性ベクター（Ｌ因子ベクター
）に抗体遺伝子領域、プロモーター領域及びエンハンサ
−領域を挿入し、閉環してなる動物細胞用プラスミド性
ベクターと、このベクターが導入されたＢ細胞由来の動
物細胞を培地に培養することを特徴とする前記遺伝子部
分に対応するモノクローナル抗体の製造方法に関するも
のである。
Ｌ因子ベクターは制限酵素ＩＥｃｏＲＩの切断点を基準
とし、制限酵素器ｎｄＩ［Ｉにより約０．１キロベース
（ｋｂ）及び約２．３５ｋｂの位置に、制限酵素Ｋｐｎ
Ｉにより約０．６ｋｂ及び約３． ｌｋｂの位置に、
制限酵素ＢａｍＨＩにより約３．０７ｋｂの位置に、ま
た制限酵素５ａｉｌにより約１．４５ｋｂの位置に各々
切断点を有するものである。このベクターは１種ではな
く例えば分子サイズが５．３ｋｂの１、ＰＩと５．５ｋ
ｂのＬＰＩＩが知られている。ＬＰＩ及びＬＰＩ［の構
造を第６図に示す。ＬＰＩＩは同図に点線で示すように
基準点であるＥｃｏＲｒの切断点から３．１ｋｂの位置
に存在するＫｐｎ ｒの切断点から時計まわり方向に０
．２ｋｂのＤＮＡがさらに加わっているものである。こ
れらのし因子ベクターは例えばマウスＬ細胞由来の細胞
株Ｂ８２又はこれにＬ因子ベクターのコピー数の多い細
胞をクローンして得られた細胞株Ｂ ８２−２を培養し
、増殖細胞から抽出することによって取得することがで
きる。
とし、制限酵素器ｎｄＩ［Ｉにより約０．１キロベース
（ｋｂ）及び約２．３５ｋｂの位置に、制限酵素Ｋｐｎ
Ｉにより約０．６ｋｂ及び約３． ｌｋｂの位置に、
制限酵素ＢａｍＨＩにより約３．０７ｋｂの位置に、ま
た制限酵素５ａｉｌにより約１．４５ｋｂの位置に各々
切断点を有するものである。このベクターは１種ではな
く例えば分子サイズが５．３ｋｂの１、ＰＩと５．５ｋ
ｂのＬＰＩＩが知られている。ＬＰＩ及びＬＰＩ［の構
造を第６図に示す。ＬＰＩＩは同図に点線で示すように
基準点であるＥｃｏＲｒの切断点から３．１ｋｂの位置
に存在するＫｐｎ ｒの切断点から時計まわり方向に０
．２ｋｂのＤＮＡがさらに加わっているものである。こ
れらのし因子ベクターは例えばマウスＬ細胞由来の細胞
株Ｂ８２又はこれにＬ因子ベクターのコピー数の多い細
胞をクローンして得られた細胞株Ｂ ８２−２を培養し
、増殖細胞から抽出することによって取得することがで
きる。
その詳細は特開昭６０−１９４９２号公報に記載されて
いる。
いる。
抗体遺伝子は産生させる抗体の種類に応じて選択される
。抗体の種類は問わないが例えば、ＩｇＧ、Ｉ ｇＡ、
Ｉ ｇＥ、ＴｇＭ、ＩｇＤなどである。この抗体遺
伝子は天然型のもののはかＦｃ部が酵素、抗原となりう
るポリペプチドなどをコードしている遺伝子と置換され
たものであってもよい。例えばキメラ抗体の遺伝子工学
的手法による産生が報告されているが（Ｎａｔｕｒｅ、
３１２，６０４−６０８．１９８４．５ｃｉｅｎｃ
ｅ。
。抗体の種類は問わないが例えば、ＩｇＧ、Ｉ ｇＡ、
Ｉ ｇＥ、ＴｇＭ、ＩｇＤなどである。この抗体遺
伝子は天然型のもののはかＦｃ部が酵素、抗原となりう
るポリペプチドなどをコードしている遺伝子と置換され
たものであってもよい。例えばキメラ抗体の遺伝子工学
的手法による産生が報告されているが（Ｎａｔｕｒｅ、
３１２，６０４−６０８．１９８４．５ｃｉｅｎｃ
ｅ。
Ｕ虹１２０２−１２０７．１９８５）抗体遺伝子はこれ
らであってもよい。この抗体遺伝子は通常は人Ｂ細胞か
ら分離したものを用いる。例えば人Ｂ細胞をＥＢウィル
スで形質転換したものから得られる抗体遺伝子、人Ｂ細
胞とマウスミエローマ細胞とのノ曙プリドーマから得ら
れる抗体遺伝子、人Ｂ細胞と人ミエローマ細胞とのノｈ
イブリドーマから得られる抗体遺伝子などを利用するこ
とができる。これらの抗体遺伝子は例えばＩｎｔ、Ｊ、
Ｃａｎｃｅｒ、 １５＋ ２０３゜１９７５、 Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、 ７１．
２２０３．１９７４゜Ｌａｎｃｅｔ、 １ １１．１９
８２などに記載の方法によって調製することができる。
らであってもよい。この抗体遺伝子は通常は人Ｂ細胞か
ら分離したものを用いる。例えば人Ｂ細胞をＥＢウィル
スで形質転換したものから得られる抗体遺伝子、人Ｂ細
胞とマウスミエローマ細胞とのノ曙プリドーマから得ら
れる抗体遺伝子、人Ｂ細胞と人ミエローマ細胞とのノｈ
イブリドーマから得られる抗体遺伝子などを利用するこ
とができる。これらの抗体遺伝子は例えばＩｎｔ、Ｊ、
Ｃａｎｃｅｒ、 １５＋ ２０３゜１９７５、 Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、 ７１．
２２０３．１９７４゜Ｌａｎｃｅｔ、 １ １１．１９
８２などに記載の方法によって調製することができる。
抗体遺伝子は人由来のものに限らずマウス、ラット、サ
ル、ヒツジ、ウサギ等のその他の動物由来のものも利用
できることはいうまでもない。
ル、ヒツジ、ウサギ等のその他の動物由来のものも利用
できることはいうまでもない。
抗体遺伝子を挿入するし因子ベクターの位置はＥｃｏＲ
Ｉ切断点の基準位置から１．４５ｋｂのＳａｌ Ｉ切断
点から３．１ｋｂのＫｐｎ Ｉ切断点の間（両切断点を
含む）であればよく、例えばＳａｌ Ｉ 、 Ｓｍａ
Ｉ 、ＢａｍＨＴ ＋Ｋｐｎ Ｉなどの切断点を利用で
きる。従って制限酵素にはこれらのいずれかを利用する
ことができる。
Ｉ切断点の基準位置から１．４５ｋｂのＳａｌ Ｉ切断
点から３．１ｋｂのＫｐｎ Ｉ切断点の間（両切断点を
含む）であればよく、例えばＳａｌ Ｉ 、 Ｓｍａ
Ｉ 、ＢａｍＨＴ ＋Ｋｐｎ Ｉなどの切断点を利用で
きる。従って制限酵素にはこれらのいずれかを利用する
ことができる。
抗体の産生のために本発明のプラスミドを取込ませる動
物細胞は特に制限されないが、例えばヒト、マウス、サ
ル等の動物に由来するリンパ腫、Ｌ細胞、Ｃｏｓ細胞、
Ｈｅｌａ細胞等を利用できる。
物細胞は特に制限されないが、例えばヒト、マウス、サ
ル等の動物に由来するリンパ腫、Ｌ細胞、Ｃｏｓ細胞、
Ｈｅｌａ細胞等を利用できる。
Ｌ因子ベクターの動物細胞への導入は１ａ−ＰＯｎ法、
プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法等に
より行うことができる。
プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法等に
より行うことができる。
本発明のプラスミドを取込んだ形質転換細胞を例えばＧ
４１８を含む通常の細胞用培地に培養することにより目
的の抗体を細胞外に生成、蓄種させることができる。培
養後は必要により細胞を除去し、培養上清から抗体を分
離する常法に従って産生じたモノクローナル抗体を取得
することができる。
４１８を含む通常の細胞用培地に培養することにより目
的の抗体を細胞外に生成、蓄種させることができる。培
養後は必要により細胞を除去し、培養上清から抗体を分
離する常法に従って産生じたモノクローナル抗体を取得
することができる。
分離方法には例えば、アファニティークロマトグラフイ
ーなどを利用できる。
ーなどを利用できる。
本発明のベクターは導入した細胞の染色体に組込まれる
ことなくプラスミド性に存在し抗体産生を行う。
ことなくプラスミド性に存在し抗体産生を行う。
実施例１マウスに遺伝子の発現
（１）マウスに遺伝子を含むプラスミドｐＬｎｅｏｓ１
０７にの作製 マウスに遺伝子を含むプラスミドｐｓｖ２ｓ１０７−２
（Ｊ。
０７にの作製 マウスに遺伝子を含むプラスミドｐｓｖ２ｓ１０７−２
（Ｊ。
Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、 １５３．１３６６−１３６９．１
９８１）をＢａｍＨＩで部分切断して開環させた。そし
て、ｐｄＬｎｅｏΔＢＳＩＩのＢａ・Ｔｌｌｌｌｌ部位
にこの断片を挿入した。
９８１）をＢａｍＨＩで部分切断して開環させた。そし
て、ｐｄＬｎｅｏΔＢＳＩＩのＢａ・Ｔｌｌｌｌｌ部位
にこの断片を挿入した。
こうして得られたプラスミドｐＬｎｅｏｐｓＶ２ｓ１０
７Ｋを１１ａｍｌｌ ｒで部分切断し、アガロース電気
泳動により１４．２ｋｂのｐＬｎｅｏｓ１０７に断片を
単離した。このｐＬｎｅｏ５１０７ＫをＤＮＡライゲー
スで閉環して第１図に示す動物細胞用プラスミド性ベク
ターｐＬｎｅｏ５１０７Ｋを得た。
７Ｋを１１ａｍｌｌ ｒで部分切断し、アガロース電気
泳動により１４．２ｋｂのｐＬｎｅｏｓ１０７に断片を
単離した。このｐＬｎｅｏ５１０７ＫをＤＮＡライゲー
スで閉環して第１図に示す動物細胞用プラスミド性ベク
ターｐＬｎｅｏ５１０７Ｋを得た。
（２）プラスミドｐｄＬｎｅｏΔＢＳＩＩ及びｐＬｎｅ
ｏ５１０７Ｋによるマウスミエローマ細胞の形質転換 前項で得られたプラスミドｐｄＬｎｅｏΔＢＳｎ及びｐ
ｔ。
ｏ５１０７Ｋによるマウスミエローマ細胞の形質転換 前項で得られたプラスミドｐｄＬｎｅｏΔＢＳｎ及びｐ
ｔ。
ｎｅｏ５１０７Ｋをミエローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ３，６
５３ （Ｊ、Ｉｍ−ｍｕｎｏｌ、、 １２３．１５４８
．１９７９）にプロトプラスト融合法（Ｍｏｌｅ、Ｃｅ
１１．Ｂｅｏｌ、 、上、 ７４３−７５２．１９８１
）により導入した。すなわち、まずプラスミドを含む大
腸菌をＬ培地に接種してＯＤが０．６になるまで培養し
、クロラムフェニコールを加えて３７°Ｃでさらに１２
〜１６時間培養した。培養液３０ｒｎｌを遠心して上清
液を除き、残った菌体に２０％シュクロース５０ｍＭ
トリス−塩酸ｐＨａ、ｏ溶液１．５ｍｌと５ｍｇ７ｍ１
リゾチ一ム２５０ｍＭ ）リスー塩酸ｐＨｓ、ｏ溶液０
．３ｍ１ｌを加えて０°Ｃで５分間反応させた。これに
２５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ８８．０溶液０．６ｄを加え
てＯ″Ｃで１０分間放置し、続いて５０ｍＭ ）リス塩
酸９１１８．０溶液０．６ｔｔｒｌを加えて３７°Ｃで
さらに１０分間放置した。１０％シュクロース及び１０
ｍＭ ＭｇＣ１ｚを含むＲＰ Ｍ Ｉ −１，６４０培
地１２１ｄを加えて３７°Ｃで１０分間放置し、これに
１０７個の前記ミエローマ細胞を加えてから遠心して上
清液を除いた。５０％ＰＥＧ１５４０溶液２１ｒｄｌを
加えて２分間遠心し、１分後にＲＰ Ｍ ｌ−１６４０
培地７ｄを加えて遠心した。このミエローマ細胞を１０
％牛脂児血清含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培地に懸濁
して３５°Ｃで培養した。
５３ （Ｊ、Ｉｍ−ｍｕｎｏｌ、、 １２３．１５４８
．１９７９）にプロトプラスト融合法（Ｍｏｌｅ、Ｃｅ
１１．Ｂｅｏｌ、 、上、 ７４３−７５２．１９８１
）により導入した。すなわち、まずプラスミドを含む大
腸菌をＬ培地に接種してＯＤが０．６になるまで培養し
、クロラムフェニコールを加えて３７°Ｃでさらに１２
〜１６時間培養した。培養液３０ｒｎｌを遠心して上清
液を除き、残った菌体に２０％シュクロース５０ｍＭ
トリス−塩酸ｐＨａ、ｏ溶液１．５ｍｌと５ｍｇ７ｍ１
リゾチ一ム２５０ｍＭ ）リスー塩酸ｐＨｓ、ｏ溶液０
．３ｍ１ｌを加えて０°Ｃで５分間反応させた。これに
２５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ８８．０溶液０．６ｄを加え
てＯ″Ｃで１０分間放置し、続いて５０ｍＭ ）リス塩
酸９１１８．０溶液０．６ｔｔｒｌを加えて３７°Ｃで
さらに１０分間放置した。１０％シュクロース及び１０
ｍＭ ＭｇＣ１ｚを含むＲＰ Ｍ Ｉ −１，６４０培
地１２１ｄを加えて３７°Ｃで１０分間放置し、これに
１０７個の前記ミエローマ細胞を加えてから遠心して上
清液を除いた。５０％ＰＥＧ１５４０溶液２１ｒｄｌを
加えて２分間遠心し、１分後にＲＰ Ｍ ｌ−１６４０
培地７ｄを加えて遠心した。このミエローマ細胞を１０
％牛脂児血清含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培地に懸濁
して３５°Ｃで培養した。
４８時間後に０．４ｍｇ／ＩｎｌＧ４１８を含む１０％
牛脂児血清含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培地を加えて
形質転換細胞を選択的に増殖させ、４Ｘ１０−’〜４Ｘ
１０−’の効率で形質転換細胞を得た。
牛脂児血清含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０培地を加えて
形質転換細胞を選択的に増殖させ、４Ｘ１０−’〜４Ｘ
１０−’の効率で形質転換細胞を得た。
（３）形質転換細胞のＤＮＡ解析
前項で得られたＧ４１８耐性形質転換細胞を上記６４１
８を含む１０％牛脂児血清含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４
０培地に培養し、Ｈｉｒｔ法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
、２６，３６５−３６９゜１９６７）に従って染色体外
ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをさらにプロテアーゼに
で処理し、フェノール抽出法により精製した。このＤＮ
Ａを無処理でアガロース電気泳動し、続いて酸処理及び
アルカリ変性を行なった。ナイロンメンブレンに移して
ニックトランスレーションを行ない、０ｐで標識したｐ
ｄＬｎｅｏΔＢＳＩ［をプローブとしてサザンハイプリ
ダイゼーションを行なった。オートラジオグラフィーに
より” Ｐ −ｐｄＬｎｅｏΔＢＳＩＩとハイブリダイ
ズするＤＮＡの位置がｐｄＬｎｅｏΔ［１ＳＩＩとｐＬ
ｎｅｏ５１０７にであることを確認した。そして、導入
した遺伝子が形質転換細胞中でそのＤＮＡに欠失や組換
を起こすことなく同じ大きさで染色体外に数十コピー存
在して自己増殖することが第２図に示すように認められ
た。第２図はサザン分析の結果を示すものであり、第１
例はｐＬｎｅｏｓ１０７に５０コピー、第２例は同１０
コピー、第３例は同１コピー、そして第４〜９例はいず
れも形質転換細胞のものである。
８を含む１０％牛脂児血清含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４
０培地に培養し、Ｈｉｒｔ法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
、２６，３６５−３６９゜１９６７）に従って染色体外
ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをさらにプロテアーゼに
で処理し、フェノール抽出法により精製した。このＤＮ
Ａを無処理でアガロース電気泳動し、続いて酸処理及び
アルカリ変性を行なった。ナイロンメンブレンに移して
ニックトランスレーションを行ない、０ｐで標識したｐ
ｄＬｎｅｏΔＢＳＩ［をプローブとしてサザンハイプリ
ダイゼーションを行なった。オートラジオグラフィーに
より” Ｐ −ｐｄＬｎｅｏΔＢＳＩＩとハイブリダイ
ズするＤＮＡの位置がｐｄＬｎｅｏΔ［１ＳＩＩとｐＬ
ｎｅｏ５１０７にであることを確認した。そして、導入
した遺伝子が形質転換細胞中でそのＤＮＡに欠失や組換
を起こすことなく同じ大きさで染色体外に数十コピー存
在して自己増殖することが第２図に示すように認められ
た。第２図はサザン分析の結果を示すものであり、第１
例はｐＬｎｅｏｓ１０７に５０コピー、第２例は同１０
コピー、第３例は同１コピー、そして第４〜９例はいず
れも形質転換細胞のものである。
なお、染色体ＤＮＡについても制限酵素処理して同様に
サザンハイブリダイゼーションを行ったが染色体へ導入
した遺伝子の組込は認められなかった。
サザンハイブリダイゼーションを行ったが染色体へ導入
した遺伝子の組込は認められなかった。
（４）形質転換細胞のＲＮＡ分析
プラスミドｐＬｎｅｏ５１０７にの形質転換細胞から細
胞質ＲＮＡをＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
１９１−１９３＋ １９８２記載の方法に従って抽出し
た。１０μｇのＲＮＡをホルムアルデヒドゲル電気泳動
しくＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
胞質ＲＮＡをＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
１９１−１９３＋ １９８２記載の方法に従って抽出し
た。１０μｇのＲＮＡをホルムアルデヒドゲル電気泳動
しくＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
２０２−２０３．１９８２）、ナイロンメンブレンに移
してニックトランスレーションにより３１１ｐ標識した
５１０７Ｋをプローブに用いてノザンハイブリダイゼー
ションを行った。そしてオートラジオグラフィーにより
１．２ｋｂのＫＳ１０７ｍ ＲＮ Ａを検出した。ミエ
ローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ３．６５３株はＫｍＲＮＡを合
成していないので（Ｊ、Ｌｍｍｕｎｏｌ、、 １２３．
１５４８−１５５０．１９７９）、このＫＳ１０７ｍ
ＲＮ Ａは導入したに遺伝子由来のものであることがわ
かる。ノザンハイプリダイゼーションの結果を第３図に
示す。図中第１〜第３例は形質転換細胞の、第４例はミ
エローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ３゜６５３のそして第５例は
ハイブリドーマ（Ｙ、Ｋ）のものである。
してニックトランスレーションにより３１１ｐ標識した
５１０７Ｋをプローブに用いてノザンハイブリダイゼー
ションを行った。そしてオートラジオグラフィーにより
１．２ｋｂのＫＳ１０７ｍ ＲＮ Ａを検出した。ミエ
ローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ３．６５３株はＫｍＲＮＡを合
成していないので（Ｊ、Ｌｍｍｕｎｏｌ、、 １２３．
１５４８−１５５０．１９７９）、このＫＳ１０７ｍ
ＲＮ Ａは導入したに遺伝子由来のものであることがわ
かる。ノザンハイプリダイゼーションの結果を第３図に
示す。図中第１〜第３例は形質転換細胞の、第４例はミ
エローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ３゜６５３のそして第５例は
ハイブリドーマ（Ｙ、Ｋ）のものである。
実施例２マウスに、Ｈ遺伝°子の発現
（１）マウスα遺伝子を含むプラスミドρＬｎｅｏＳ１
０７ＫＳ１０７Ｈの作製 シャロン２８ベクターに挿入されているマウスα遺伝子
（Ｎａｔｕｒｅ、 ２９３ ５８５−５８７．１９８１
）をＰＵＣ１９ベクターに２つの断片に分けてサブクロ
ーニングし、これを第４図に示すような完全な１本のα
遺伝子とした。このＰＯＣｌ２に挿入したα遺伝子は抗
体遺伝子のプロモーター及びエンハンサ−を含む１１．
３ｋｂの断片である。次に、先のｐＬｎｅｏ３１０７Ｋ
にα鎖をＳａｌ １部位に挿入し、ｐＬｎｅｏｓ１０７
Ｋｓ１０７１１を得た。
０７ＫＳ１０７Ｈの作製 シャロン２８ベクターに挿入されているマウスα遺伝子
（Ｎａｔｕｒｅ、 ２９３ ５８５−５８７．１９８１
）をＰＵＣ１９ベクターに２つの断片に分けてサブクロ
ーニングし、これを第４図に示すような完全な１本のα
遺伝子とした。このＰＯＣｌ２に挿入したα遺伝子は抗
体遺伝子のプロモーター及びエンハンサ−を含む１１．
３ｋｂの断片である。次に、先のｐＬｎｅｏ３１０７Ｋ
にα鎖をＳａｌ １部位に挿入し、ｐＬｎｅｏｓ１０７
Ｋｓ１０７１１を得た。
（２）形質転換細胞培養上清の抗体活性このプラスミド
を実施例１（２）項と同様にして、ミエローマ細胞に導
入して、この形質転換細胞と培養した。そして、形質転
換細胞培養上清の抗体活性をＩｌ：ＬＩＳＡ法により測
定した。ウサギ抗マウス１ｇα抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）
を吸着させた固相に各培養上清を加えて反応させた後Ｈ
ＲＰウサギ抗マウスＩｇαの抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を
加えた。その後基質として２．２°−アジノージ−（３
−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴ
Ｓ）を加え、発色濃度を測定することにより各培養上清
のＩｇＡ量を測定した。得られた結果を下記に示す。
を実施例１（２）項と同様にして、ミエローマ細胞に導
入して、この形質転換細胞と培養した。そして、形質転
換細胞培養上清の抗体活性をＩｌ：ＬＩＳＡ法により測
定した。ウサギ抗マウス１ｇα抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）
を吸着させた固相に各培養上清を加えて反応させた後Ｈ
ＲＰウサギ抗マウスＩｇαの抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を
加えた。その後基質として２．２°−アジノージ−（３
−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴ
Ｓ）を加え、発色濃度を測定することにより各培養上清
のＩｇＡ量を測定した。得られた結果を下記に示す。
形質転換細胞 Ｉｇ八
１ ＋
３十
５＋
次に、得られた抗体の抗原特異性をＥＬＩＳＡ法により
調べた。ホスホコリンを吸着させた固相に各培養上清を
加えて反応させた後ＨＲＰウサギ抗マウスＩｇα抗体（
Ｚｙｍｅｄ社製）を加えた。その後基質としてＡＢＴＳ
を加えて発色濃度を測定した結果、この発色濃度が抗原
量に比例することを確認した。
調べた。ホスホコリンを吸着させた固相に各培養上清を
加えて反応させた後ＨＲＰウサギ抗マウスＩｇα抗体（
Ｚｙｍｅｄ社製）を加えた。その後基質としてＡＢＴＳ
を加えて発色濃度を測定した結果、この発色濃度が抗原
量に比例することを確認した。
本発明のベクターを動物細胞に導入してこれを培養する
ことにより目的の抗体を産生させ、細胞外へ分泌させる
ことができる。この抗体は完全に再構成されたものであ
り、糖鎖も付加されていて医療用その他の用途に使用し
うるものである。抗体は細胞外に分泌されることから培
養液からの取得も容易である。
ことにより目的の抗体を産生させ、細胞外へ分泌させる
ことができる。この抗体は完全に再構成されたものであ
り、糖鎖も付加されていて医療用その他の用途に使用し
うるものである。抗体は細胞外に分泌されることから培
養液からの取得も容易である。
第１図は本発明のプラスミドの１例の構造の概要を示す
地図であり、第２図はこのプラスミドを取込んだ形質転
換細胞のサザン分析の結果として第３図はノザン分析の
結果をそれぞれ示す展開図である。第４図はＩｇαの制
限酵素地図であり、第５図は本発明のプラスミドの他の
例の構造の概要を示す地図である。第６図はＬ因子プラ
スミドの構造の概要を示す地図である。 特許出願人 冨士レビオ株式会社 代理人 弁理士 国中 政治 はか１名第１図 第２図 第５図 第６図
地図であり、第２図はこのプラスミドを取込んだ形質転
換細胞のサザン分析の結果として第３図はノザン分析の
結果をそれぞれ示す展開図である。第４図はＩｇαの制
限酵素地図であり、第５図は本発明のプラスミドの他の
例の構造の概要を示す地図である。第６図はＬ因子プラ
スミドの構造の概要を示す地図である。 特許出願人 冨士レビオ株式会社 代理人 弁理士 国中 政治 はか１名第１図 第２図 第５図 第６図
Claims (5)
- （１）制限酵素ＥｃｏＲ I の切断点を基準とし、制限
酵素ＨｉｎｄIIIにより約０．１キロベース（ｋｂ）及
び約２．３５ｋｂの位置に、制限酵素Ｋｐｎ I により
約０．６ｋｂ及び約３．１ｋｂの位置に、制限酵素Ｂａ
ｍＨ I により約３．０７ｋｂの位置に、また制限酵素
Ｓａｌ I により約１．４５ｋｂの位置に各々切断点を
有するプラスミド性ベクターに抗体遺伝子領域、プロモ
ーター領域及びエンハンサー領域を挿入し、閉環してな
る動物細胞用プラスミド性ベクター - （２）抗体遺伝子領域がキメラ抗体を産生する遺伝子領
域である特許請求の範囲第１項記載の動物細胞用プラス
ミド性ベクター - （３）制限酵素ＥｃｏＲ I の切断点を基準とし、制限
酵素ＨｉｎｄIIIにより約０．１キロベース（ｋｂ）及
び約２．３５ｋｂの位置に、制限酵素Ｋｐｎ I により
約０．６ｋｂ及び約３．１ｋｂの位置に、制限酵素Ｂａ
ｍＨ I により約３．０７ｋｂの位置に、また制限酵素
Ｓａｌ I により約１．４５ｋｂの位置に各々切断点を
有するプラスミド性ベクターに抗体遺伝子領域、プロモ
ーター領域及びエンハンサー領域を挿入し、閉環してな
る動物細胞用プラスミド性ベクターが導入された動物培
養細胞を培地に培養することを特徴とする前記遺伝子部
分に対応するモノクローナル抗体の製造方法 - （４）抗体遺伝子領域がキメラ抗体を産生する遺伝子領
域である特許請求の範囲第３項記載のモノクローナル抗
体の製造方法 - （５）動物培養細胞がＢ細胞、Ｔ細胞、Ｈｅｌａ細胞、
Ｌ細胞又はＣｏｓ細胞のいずれかの由来のものである特
許請求の範囲第３項記載のモノクローナル抗体の製造方
法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62281090A JPH01124391A (ja) | 1987-11-09 | 1987-11-09 | 動物細胞用プラスミド性ベクター及びそれを用いたモノクローナル抗体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62281090A JPH01124391A (ja) | 1987-11-09 | 1987-11-09 | 動物細胞用プラスミド性ベクター及びそれを用いたモノクローナル抗体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01124391A true JPH01124391A (ja) | 1989-05-17 |
Family
ID=17634196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62281090A Pending JPH01124391A (ja) | 1987-11-09 | 1987-11-09 | 動物細胞用プラスミド性ベクター及びそれを用いたモノクローナル抗体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01124391A (ja) |
-
1987
- 1987-11-09 JP JP62281090A patent/JPH01124391A/ja active Pending
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