JP2000508892A

JP2000508892A - 多価および多特異的抗原結合タンパク

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Publication number: JP2000508892A
Application number: JP9535804A
Authority: JP
Inventors: デイビス、ポール・ジェイムズ; ログト・ヴァン・デァ、コルネリス・ポール・エリク; ヴェルホーイェン、マーティン・エリーザ
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ
Priority date: 1996-04-04
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2000-07-18
Also published as: EP0894135A1; DK0894135T3; US6239259B1; EP0894135B1; DE69730209T2; WO1997038102A1; DE69730209D1; ES2225961T3; AU2507397A

Abstract

(57)【要約】一連の３以上の抗体重鎖の可変ドメインを含む第一のポリペプチドおよび一連の３以上の抗体軽鎖の可変ドメインを含む第二のポリペプチドを含む多価抗原結合タンパクであって、上記第一および第二のポリペプチドが、それぞれの重鎖および軽鎖可変ドメインの会合により連結されており、会合した各可変ドメイン対が、抗原結合部位を形成する多価抗原結合タンパク。その製造方法、用途、特に治療および診断の応用のための用途を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】多価および多特異的抗原結合タンパク発明の属する技術分野本発明は、多価および多特異的抗原結合タンパク、その製造方法およびその用途に関する。特に、本発明は、会合して多価または多特異的マルチマーを形成するポリペプチドを含む結合タンパクに関する。発明の背景抗体は、ジスルフィド結合により共有結合的に互いに連結されている２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖という４つのポリペプチドを含む単位に基づく構造を有するタンパク分子である。これらの鎖の各々は、別個のドメインに折りたたまれている。重鎖および軽鎖のＣ末端領域は、配列が保存されており、定常領域と呼ばれ、いわゆるＣドメインを１つ以上含む。重鎖および軽鎖のＮ末端領域は、Ｖドメインとしても知られ、配列が変異しており、抗体の特異性を決定する。抗原結合活性に関与する軽鎖および重鎖の可変ドメイン中の領域（それぞれＶ_LおよびＶ_H）は、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている。天然の抗体は、重鎖および軽鎖の可変領域の会合により定義される少なくとも２つの同一の抗原結合部位を有する。抗体のタンパク分解的消化は、抗体フラグメントの産生をもたらすことが知られている。全抗体（whole antibody）のこのようなフラグメント（または部分）は、抗原結合活性を呈することができる。結合フラグメントの一例は、Ｆ_abフラグメントであり、これは、重鎖のＶ_HおよびＣ_H1ドメインと会合した軽鎖を含む。２価のＦ(ab¹)₂フラグメントは、ヒンジ領域を介して互いに連結された２つのこのようなＦ_abフラグメントを含み、２つの抗原結合部位を与える。互いに会合した重鎖および軽鎖のＶドメインのみからなるＦ_vフラグメントも得ることができる。これらのＦ_vフラグメントは、抗原結合に関して１価である。一般に、ほとんどの天然抗体は、十分な免疫反応性を保持するためにはＶ_HおよびＶ_Lの両方を必要とするものの、より小さいフラグメント、例えば個々のＶドメイン（ドメイン抗体、すなわちｄＡＢ、Ward et al.，Nature，341，544(1989)）および個々のＣＤＲ（Williams et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,5537(1989)）もまた、親抗体の結合特性を保持することが示されている。互いに会合して抗原結合活性を有するＶ_HおよびＶ_Lドメインを含む抗体フラグメントもまた、記載されている。単鎖Ｆvフラグメント（ｓｃＦｖ）は、両ドメインが会合して抗原結合部位を形成するようにフレキシブルなペプチドリンカーによりＶ_Lドメインに連結されたＶ_Hドメインを含む（例えば、ＥＰ−Ｂ−０２８１６０４、Enzon Labs Incを参照されたい）。活性抗体フラグメントを産生するための微生物発現系は、文献において知られている。例えば、E.coli(Better et al.,Science,240,104(1988))、酵母(Horwit z et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8678(1988))および糸状菌Trichoderma におけるＦ_abの産生は、従来記載されている。植物が、全抗体ならびにｓｃＦｖフラグメントの産生のための宿主として使用できることも、知られている（Owen et al.,Bio/Technology,10,790(1992))。診断および治療において全抗体でなくむしろ抗体フラグメントを用いることの利点は、それらのサイズが小さいことにある。これらは、全抗体より免疫原性が低く、より組織に浸透することができる可能性が高い。しかし、上述のＦ_ab、Ｆ_v およびｓｃＦｖ抗体フラグメントのようなフラグメントを用いることに付随する欠点は、全抗体には２以上の結合部位が含まれることに比べて、それらは抗原結合のための結合部位をただ１つしか持たないことにより、抗原への多価結合が防止され、それゆえアビディティの減少がもたらされることである。この問題を克服する１つの試みにおいて、多価抗原結合タンパク、すなわち２以上の抗原結合部位を有する結合タンパクを提供することに注意が向けられた。さらに、異なる抗原決定基に結合することができ、異なる供給源から由来する抗原結合ドメインを含む多特異性を有する抗原結合タンパクを産生することに興味が持たれた。異なる結合特異性を有する抗原結合タンパクは、例えば、その異なる結合ドメインの特異的結合の特性によりエフェクター細胞を標的細胞にターゲティングすることにおいて有用でありうる。説明のための一例としては、腫瘍細胞および細胞毒性薬物の両方に対する特異性を有する２特異的抗原結合タンパクは、効率的に細胞毒性薬物を特異的に腫瘍細胞にターゲティングするために用いることができる。化学修飾の必要を回避することにより、不利益な免疫応答を避けることができる。従来、多価および多特異的抗原結合タンパクの潜在的な応用は、そのような分子を生成し、精製することにおける困難により妨げられていた。２つの結合部位を有する組換え抗原結合タンパクは、Ｆ_vのＶ_HのＣ末端に導入されたシステイン残基を通じた(Cumber et al.,J.Immunol.,149,120(1992))、（ Fab¹）₂を生成するためのＦ_ab中のヒンジシステイン残基を通じた(Carter et al .,Bio/Technology.,10,163(1992))、またはｓｃＦｖのＶ_LのＣ末端での（Pack のような方法により製造することができる。あるいは、２量体化を促進するＣ末端ペプチド配列のＦ_abフラグメントの包含に基づく２価および２特異的抗体フラグメントの製造が記載されている（Kostelny et al.,J.Immunol.148,1547）。一方が一連の２つの重鎖可変ドメイン（Ｖ_H）を含み、他方が一連の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_L）を含む２つのポリペプチド鎖を含む結合複合体を含む２価または２特異的抗体フラグメントは、我々の係属中のヨーロッパ特許出願第９５３０７３３２．７に記載されている。多価および/または多特異的抗体フラグメントは、ＷＯ９４／０９１３１(Scot gen Limited)に記載されている。少なくとも部分的には第一および第二のポリペプチド鎖（これらの鎖はさらに互いに結合してポリペプチド鎖が一緒になることを引き起こすことができる会合ドメインを包含する）に含まれる２つの結合領域を有する特異的結合タンパクは、その中に開示されている。第一および第二の結合領域は、好ましくは抗体抗原結合ドメイン、例えばＦ_abフラグメント中または単鎖Ｆ_vフラグメント中に含まれるＶ_HおよびＶ_Lを含むものであり、または抗体のＶ_HまたはＶ_L領域のいずれか一方のみから由来していてもよい。会合ドメインは、好適には抗体から由来していてよく、特に抗体Ｖ_HおよびＶ_L領域であってよい。さらに、会合を達成するためにＶ_H／Ｖ_Lドメインの組合わせを用いることは製造される抗体が３価であることができるように補充的なＦｖドメインの生成をもたらすことが開示されている。３価フラグメントを製造するためのＷＯ９４／０９１３１に示唆されている配置の模式図を図１Ａに示す。ＷＯ９３／１１１６１（Enzon Inc）には、２以上の単鎖タンパク分子を含む多価抗原結合タンパクが記載されている。その各々の単鎖分子は、第一および第二のポリペプチドを含み、各々抗体重鎖または軽鎖の可変領域の結合部分を含み、それらのポリペプチドはペプチドリンカーを介して互いに連結されている。適宜３つまたは４つの単鎖抗原結合タンパクを含む仮説的な３量体および４量体が考察されている。示唆されている３価の配置の模式図を図１Ｂに示す。ＷＯ９１／１９７３９（Celltech Limited）には、Ｆｖフラグメントを互いに連結するがそれらが隣接する抗原決定基に結合できるようにそれらを空間を空けて保持する連結構造により少なくとも１つのさらなるＦｖフラグメントに結合したＦｖフラグメントを含む多価抗原結合タンパクが開示されている。好都合には、連結構造は、空間をあけるポリペプチドおよび架橋マレイミドリンカーのような連結単位または非共有結合を可能にする分子からなる。開示されている特に好ましい連結構造は、抗体連結およびヒンジ領域配列に基づく。発明の概要本発明にしたがえば、・一連の３以上の抗体重鎖の可変ドメインを含む第一のポリペプチド、および・一連の３以上の抗体軽鎖の可変ドメインを含む第二のポリペプチドを含む多価抗原結合タンパクであって、上記第一および第二のポリペプチドが、それぞれの重鎖および軽鎖可変ドメインの会合により連結されており、各々の会合した可変ドメイン対が、抗原結合部位を形成する多価抗原結合タンパクが提供される。本明細書において用いる場合、多価という用語は、１を超える抗原結合部位を意味する。好ましくは、第一のポリペプチドは、抗体重鎖の３つの可変ドメインを含み、第二のポリペプチドは、抗体軽鎖の３つの可変ドメインを含み、３価のタンパクを提供する。ポリペプチドは、適宜、重鎖または軽鎖、可変ドメイン、またはその機能的等価物を含んでいてよいことは認識されるであろう。それぞれの重鎖または軽鎖可変ドメインは、好適にはいかなる介在リンカーもなしに連結されていてよい。しかし、好ましい態様にしたがえば、個々のポリペプチドに含まれる可変ドメインは、ペプチドリンカーにより連結されている。好ましくは、ペプチドリンカーは、フレキシブルであり、可変ドメインが複数の抗原決定基に同時に結合できるように互いに関して曲がることを可能にする。個々の重鎖または軽鎖可変ドメインへのリンカーの結合は、会合した可変ドメイン対により形成される結合部位の結合能力に影響しないようなものであることは認識されるであろう。好都合には、ペプチドリンカーは、１６〜１９アミノ酸残基を含む。好ましいペプチドリンカーの１つは、重鎖ドメインについては、（Ｇｌｙ₄ Ｓｅｒ）₃ＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｌａであり、軽鎖ドメインについては、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃Ｖａｌである。会合した可変ドメイン対（Ｖ_H／Ｖ_L対）の２以上が同じ抗原特異性を有する場合、例えば、それらが同じ親抗体もしくはそのフラグメントまたは同じエピトープに結合する異なる抗体に由来する場合、同じタイプの２以上の分子に結合する結合タンパクが製造されることは認識されるであろう。１つの態様にしたがえば、本発明の結合タンパクは、互いに異なるエピトープに結合しうる３つの抗原結合部位を含み、３価３特異的タンパクが製造される。別の態様にしたがえば、本発明の結合タンパクは、３つの会合した可変ドメイン対結合部位を含み、そのうち２つは同じエピトープに結合し、３価の２特異的タンパクが提供される。３つすべての結合部位が同じ抗原特異性を有する場合、３価の１特異的結合タンパクが提供される。本発明は、本発明の多価抗原結合タンパクのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびそのようなヌクレオチド配列を含むクローニングおよび発現ベクターをも提供する。本発明は、さらに、そのようなヌクレオチド配列を含むベクターにより形質転換された宿主細胞およびそのような宿主におけるヌクレオチド配列の発現によるそのようなポリペプチドの製造方法を提供する。本発明は、さらに、上記のとおりの多価抗原結合タンパクを調製するための方法を提供する。この方法は、 (1)上記第一および第二のポリペプチドをコードする遺伝子を包含させることにより、１以上の宿主を形質転換する工程； (2)上記遺伝子を上記単数または複数の宿主において発現させる工程； (3)上記第一および第二のポリペプチドが一緒になって抗原結合部位を形成することを可能にする工程を含むことを特徴とする。好適には、宿主は、例えばE.coliのようなグラム陰性細菌および例えばB.subt ilisまたは乳酸菌のようなグラム陽性細菌などの原核細菌、酵母のような下等真核生物、例えばSccharomyces、KluyveromycesまたはTrichoderma属に属するもの、AspergillusおよびNeurospora属に属するもののような糸状菌ならびに例えばタバコのような植物および例えばミエローマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞および昆虫細胞のような動物細胞などの高等真核生物から選択してもよい。本発明に関して使用するために特に好ましい宿主の１つは、ＣＯＳ（サル腎臓）細胞である。遺伝子を合成し、それらを宿主に包含させ、宿主中において遺伝子を発現させるための技術は、当業界で周知であり、当業者は、一般的な知見を用いて本発明を容易に実施することができる。本発明のタンパクは、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィまたはゲルろ過クロマトグラフィのような従来の技術を用いて回収し精製することができる。本発明の多価結合タンパクの活性は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ) 、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはバイオセンサーを用いるもののような当業界で公知の標準的な技術により好都合に測定することができる。本発明の多価抗原結合タンパクは、例えば腫瘍細胞をナチュラルキラー細胞および細胞毒性剤を用いてターゲティングするような、診断または治療において好適に用いることができる。本発明の多価抗原結合タンパクが有用である他の用途としては、イムノアッセイおよび精製を含む、抗体またはそのフラグメントが一般的に用いられる用途が挙げられる。特に好ましい態様にしたがえば、多酵素複合体を、標的、例えば細胞表面で組み立てることができる。一例として、本発明の多価結合タンパクは、オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ）およびペルオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）のような細胞殺傷酵素を、歯科的プラークの抗原性成分である標的種、例えばS．sanguisまたはS．mut ansにターゲティングするために用いることができる。酵素、補酵素および標的抗原を含む複合体は、好都合に組み立ててもよい。したがって、本発明は、好都合には化粧品または医薬的に許容されうるキャリア、希釈剤または賦形剤と組合わせて、本発明の多価抗原結合タンパクを含む組成物をも提供する。本発明の多価抗原結合タンパクを用いる処理方法もまた提供される。診断または治療における用途のためには、本発明の多価抗原結合タンパクは、好都合には、当業界の従来の方法により適切な診断的または治療的に有効な薬剤またはキャリアに付着されていてもよい。当業界で従来存する技術により調製した多価結合タンパクに比べて本発明の多価抗原結合タンパクを使用する１つの利点は、それぞれの重鎖および軽鎖可変ドメインの「自己アセンブリング性」会合による多価結合部位の形成が、多価構築体を安定化するための連結残基の導入または化学的カップリング工程の必要を回避し、それによって、生じた多価結合タンパクを治療において使用した場合にそのような分子に対する免疫応答を惹起する危険性を最小限にすることである。本発明の分子の特別の利点の１つは、それらは従来の精製技術を用いて上清から直接好都合に精製することができることである。それらの分子は自己アセンブリング性であるので、従来存する技術のように、カップリングに先立って個々のサブユニットを精製する必要はない。本発明は、以下の記載を参照し、添付の図面とともに読んだ場合に、より十分に理解することができる。図面の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは、以下の３特異的または３価抗体フラグメントを製造するために示唆されてきた重鎖および軽鎖Ｖドメイン遺伝子フラグメントの刊行されている配置の模式的な図を示す： A)scFv1-VLa+scFv2-VHa（２鎖）ＷＯ９４／０９１３１ B)Fab1-Vla+Fab2-VHa（４鎖）ＷＯ９４／０９１３１ C)scFv1-VLa-CLa+scFv1-VHa-CHa（２鎖）ＷＯ９４／０９１３１ D)Fab1-VLa-CLa+Fab2-VHa-CHa（４鎖）ＷＯ９４／０９１３１ E)scFv1+scFv2+scFv3（３鎖）ＷＯ９３／１１１６１ F)VH1-VH2+VH2-VL3+VH3-VH1（３鎖）ＷＯ９３／１１１６１。図２Ａ／Ｂは、ｐｅ１Ｂリーダー−ＶＨ４７１５−リンカー−ＶＬ３４１８をコードするＤＮＡおよびｐｅ１Ｂリーダー−ＶＬ３４１８−リンカー−ＶＨ４７１５−ヒドロフィル２タッグをコードするＤＮＡを含むＰＧＯＳＡ．Ｅ２ｔのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIインサート（挿入片）のヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。図３ A）ｐｅｌＢリーダー−ＶＨＬｙｓ−リンカー−ＶＬＬｙｓをコードするＤＮＡを有するプラスミドｓｃＦｖ．ＬｙｓのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩインサートのヌクレオチド配列を示す（配列番号２）。 B）ｐｅｌＢリーダー−ＶＨ４７１５．２ｔをコードするＤＮＡを有するプラスミドｓｃＦｖ．４７１５．２ｔのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩインサートのヌクレオチド配列を示す（配列番号３）。図４は、抗ＮＰ抗体のゲノムリーダー配列のヌクレオチド配列を示す(Jones e t al.,Nature,321,522)。エクソン配列は、灰色の四角で示す。ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ制限部位は太字で下線を付して示す（配列番号４）。図５は、真核発現ベクターｐＳＶ．５１の模式的な図である。図６は、ｐＵＣ１９の２頭（ダブルヘッド；Ａ）および３頭（トリプルヘッド；Ｂ）構築体の概観である。２頭および３頭ｐＵＣ構築体を組み立てるのに使用したオリゴヌクレオチドおよび制限部位の位置を示す。図７ A）ＶＨ−Ｃ−リンカーおよびＶＬ−Ｃ−リンカーフラグメントの起源を示す。 B）ｐＵＣ１９の３頭ベクターの構築の模式的な図である。図８ A）Ｅｕｋａ．ＶＨおよびＥｕｋａ．ＶＬベクターの構築の模式的な図である。 B）ｐＳＶ．ＶＨ発現ベクターの構築の模式的な図である。 C）ｐＳＶ．ＶＬ発現ベクターの構築の模式的な図である。図９は、全ＣＯＳ細胞培養上清を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での３特異的Golysanタンパクの発現を示す。ｐＳＶ発現ベクターで形質転換したＣＯＳ細胞の粗上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。タンパクをニトロセルロース膜に移し、抗ＶＨおよび抗ヒドロフィル２タッグ特異的モノクローナル抗体を用いてそれぞれＶＨ３およびＶＬ３−２ｔを検出した。（Ａ＝抗Hydro-II、Ｂ＝抗 Hydro-II＋抗ＶＨ）。試料：Ｍ＝低分子量マーカー、１＝ｐＳＶ．Ｋ＋ｐＳＶ．Ｖ、２＝ｐＳＶ．Ｋ＋ｐＳＶ．Ｗ、３＝ｐＳＶ．Ｍ＋ｐＳＶ．Ｖ、４＝ｐＳＶ．Ｍ＋ｐＳＶ．Ｗ。図１０は、３つのＥＬＩＳＡの結果を示す。リゾチーム、グルコースオキシダーゼおよびS.sanguis結合活性を、１＝リゾチーム−グルコースオキシダーゼ(＝ＬＹＳＯＸ)、２＝グルコースオキシダーゼ−S.sanguis（＝ＧＯＳＡ）、および３＝リゾチーム−S.sanguis（＝ＬＹＳＡＮ）の２特異的結合活性を測定することにより、粗ＣＯＳ上清中で決定した。図１１は、３つのＥＬＩＳＡの結果を示す。精製したGolysan．Ａ（Ａ）およびGolysan．Ｂ（Ｂ）のリゾチーム、グルコースオキシダーゼおよびS.sanguis結合活性は、１＝リゾチーム−グルコースオキシダーゼ（＝ＬＹＳＯＸ）、２＝グルコースオキシダーゼ−S.sanguis（＝ＧＯＳＡ）、および３＝リゾチーム−S.s anguis（＝ＬＹＳＡＮ）の２特異的結合活性を測定することにより決定した。図１２は、Ｖ_LＬｙｓ−リンカー−Ｖ_HＬｙｓをコードするＤＮＡを含有するｐＵＲ．４１２４のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIインサートのヌクレオチド配列を示す（配列番号２３参照）。図１３は、ｐｅｌＢリーダー−Ｖ_H３４１８およびｐｅｌＢリーダー−Ｖ_L３４１８をコードするＤＮＡを含有するプラスミドＦｖ．３４１８のＨｉｎｄIII− ＥｃｏＲＩインサートのヌクレオチド配列を示す（配列番号２４参照）。図１４は、ｐｅｌＢリーダー−Ｖ_H４７１５およびｐｅｌＢリーダー−Ｖ_L４７１５−ＭｙｃタッグをコードするＤＮＡを含有するプラスミドＦｖ．４７１５− ｍｙｃのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩインサートのヌクレオチド配列を示す（配列番号２５参照）。図１５は、ｐｅｌＢリーダー−Ｖ_H４７１５−リンカー−Ｖ_L４７１５−ＭｙｃタッグをコードするＤＮＡを含有するｓｃＦｖ．４７１５−ｍｙｃのＨｉｎｄII I−ＥｃｏＲＩインサートのヌクレオチド配列を示す（配列番号２６参照）。図１６ａ／ｂは、ｐｅｌＢリーダー−Ｖ_H４７１５−リンカー−Ｖ_L３４１８およびｐｅｌＢリーダー−Ｖ_L３４１８−リンカー−Ｖ_H４７１５をコードするＤＮＡを含有するｐＧＯＳＡ．ＥのＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩインサートのヌクレオチド配列を示す（配列番号２７参照）。図１６ｃは、Ｖドメイン遺伝子フラグメントを置き換えるために用いることができるオリゴヌクレオチドおよびｐＧＯＳＡ．Ｅ中のその位置の概観である。図１７は、プラスミドｐＧＯＳＡ．Ａの構築を示す。図１８は、プラスミドｐＧＯＳＡ．Ｂの構築を示す。図１９は、プラスミドｐＧＯＳＡ．Ｃの構築を示す。図２０は、プラスミドｐＧＯＳＡ．Ｄの構築を示す。図２１は、プラスミドｐＧＯＳＡ．Ｅの構築を示す。図２２は、フラグメントＰＣＲ．ＩＢｓｔＥII／ＳａｃＩの供給源を示す。図２３は、フラグメントＰＣＲ．IV ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩの供給源を示す。図２４は、フラグメントＰＣＲ．ＶＳａＩＩ／ＥｃｏＲＩの供給源を示す。図２５は、フラグメントＰＣＲ．III ＮｈｅＩ／ＳａｃＩの供給源を示す。図２６は、フラグメントＰＣＲ．II ＳｆｉＩ／ＥｃｏＲＩの供給源を示す。表１は、記載した２頭および３頭構築体の構築に用いたすべてのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。表２は、本明細書において記載したすべてのｐＳＶ発現構築体を列挙する。以下の例は、説明のためのみに提供するものである。例一般的な実験株、プラスミドおよび培地すべてのクローニング工程は、E.coliＪＭ１０９またはE.coliＸＬ−１Ｂｌｕｅにおいて行った。培養は、２×ＴＹ／Ａｍｐ／グルコース培地(水１リットルあたり１６gのトリプトン、１０ｇの酵母エキストラクト、５ｇのＮａＣｌに、２％グルコースおよび１００μg／mlアンピシリンを添加したもの)中で生育させた。形質転換物は、ＳＯＢＡＧプレート（水１リットルあたり２０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキストラクト、１５ｇの寒天、０．５ｇのＮａＣｌに、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２％グルコース、１００μg/mlアンピシリンを添加したもの）上に展開した。用いたバイシストロン性（bicistronic）E.coliベクターは、ｐＵＣ１９の誘導体であった。ＣＯＳ発現ベクターｐＳＶ．５１（ＬＭＢＰ株ｎｒ１８２９）は、ＬＭＢＰカルチャーコレクション（Laboratory of Molecular Biol ogy University Gent）から入手した。ＣＯＳ−１細胞（ＥＣＡＣＣＮｏ．８８０３１７０１；アフリカミドリザル腎臓細胞）は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）から入手した。すべての組織培養試薬は、Gibco BRL（Life Technologies、Paisley、ＵＫ）から入手した。ＤＮＡ操作＊オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲＰＣＲ反応に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、ホスホルアミダイド法によりApplied Biosystems３８１ＡＤＮＡ合成機で合成した。３特異的ｐＳＶ構築体（表２）の構築に用いたオリゴヌクレオチドの一次構造を表１に示す。ＤＮＡフラグメントの増幅に用いた反応混合物は、１０ｍＭトリス−塩酸、pH８．３、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、０．０１％ゼラチン(W/V)、０．１％トリトンＸ−１００、４００ｍＭの各ｄＮＴＰ、５．０単位のベントＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）、１００ngの鋳型ＤＮＡ、および５００n gの各プライマー（１００μl反応について）であった。反応条件は、９４℃で４分、続いて３３回の９４℃で１分、５５℃で１分および７2℃で１分のサイクルであった。＊プラスミドＤＮＡ／ベクター／インサート調製および連結／形質転換プラスミドＤＮＡは、「Quagen P-１００およびP-５００Midi／Maxi−ＤＮＡ調製」システムを用いて調製した。ベクターおよびインサートは、１０μg（べクタ一調製用）または２０μg（インサート調製用）を適切な条件下（販売者により指定されたとおりの緩衝液および温度）で特定の制限エンドヌクレアーゼにより消化することによって調製した。クレノウ充填反応およびウシ腸ホスホリラーゼを用いる脱リン酸化は、製造者の指示にしたがって行った。ベクターDＮＡおよびインサートは、Maniatisらにより記載されたとおりに、アガロースゲル電気泳動を通して分離し、ＤＥＡＥ膜ＮＡ４５（Schleicher ＆ Schnell）を用いて精製した（Molecular Ｃｌ2oning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbou r、NY(1982)）。連結は、３０ｍＭトリス−塩酸、pH７．８、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、３００〜４００ngのベクターＤＮＡ、１００〜２００ngのインサートＤＮＡ、および１Weiss単位のＴ₄ＤＮＡリガーゼを含む２０μlの容積中で行った。室温で２〜４時間の連結後、７．５μlの連結反応物を用いてＣａＣｌ₂コンピテントE.coli ＪＭ１０９またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Maniatis et al.）を形質転換した。形質転換混合物は、ＳＯＢＡＧプレートにプレーティングし、３７℃で一晩生育させた。正しいクローンは、制限酵素分析により同定し、自動化ジデオキシ配列決定（Applied Biosystems）により確認した。＊ＰＣＲ産物の制限消化増幅後、各反応物を適切なサイズのバンドの存在についてアガロースゲル電気泳動によりチェックした。各ＰＣＲ反応の１または２の１００μｌのＰＣＲ反応混合物（合わせて約２〜４μgのＤＮＡ産物を含む）を、フェノール−クロロホルム抽出、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に供した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥させた。次に、ＰＣＲ産物を過剰量の適切な制限酵素を用いて２００μlの１×緩衝液中で一晩（１８時間）消化した。ＣＯＳ細胞の形質転換ＣＯＳ−１細胞は、１０％ＦＣＳを含有するグルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（１００μg／ml）を添加したＤＭＥＭ培地中で維持した。一過性トランスフェクションアッセイのためには、１〜３ ×１０⁵個のＣＯＳ−１細胞を直径３cmの組織培養シャーレ(２ml)中に播いた。細胞は、５０〜８０％コンフルエントになるまで（一晩）炭酸ガスインキュベーター中で３７℃でインキュベートした。各トランスフェクションについて以下の混合物を調製した：A）１００μlのOpti−ＭＥＭ−Ｉリデュースト血清培地中の特定のＤＮＡの各々の１μg、B）１００μlのOpti−ＭＥＭ−Ｉリデュースト血清培地中の１μlのリポフェクトアミン（LipofectAmine）。混合物ＡおよびＢを（穏やかに）一緒にした。室温で３０〜４５分、ＤＮＡ−リポソーム複合体の形成を可能にした後、０．８mlのOpti−ＭＥＭ−Ｉリデュースト血清培地を各脂質ＤＮＡ複合体含有チューブに添加した。ＣＯＳ−１細胞を、２mlのOpti−ＭＥＭ −Ｉリデュースト血清培地で１回洗浄し、希釈した複合体溶液に重層した。ＣＯＳ−１細胞を３7℃で５時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、２mlの生育培地を添加した。トランスフェクションの２０時間後、培地を０．１ｍＭ酪酸ナトリウムを含む２mlの新鮮な生育培地と交換した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、上清を回収し、抗体フラグメントの存在についてアッセイした。ＥＬＩＳＡ A）ＧＯＳＡ：グルコースオキシダーゼおよびB.sanguis結合活性９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Greiner HCプレート）を、２００μｌ／ウェルの０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、pH９．５中の１／１０希釈のStreptococ cus sanguis細胞の一晩培養物を用いて３7℃で一晩活性化し、各ウェルを感作した。ＰＢＳＴで１回洗浄した後、抗原感作プレートを２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ、０．１５％Tween）を用いて３７℃で１時間予備ブロッキングした。５０μlのＣＯＳ培養上清(そのまま、またはＰＢＳで希釈したもの)と５０μlのグルコースオキシダーゼ含有（５０μ g／ml）ブロッキング緩衝液をStreptococcus sanguis感作プレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、結合したグルコースオキシダーゼを、１００μlの基質（７０ｍＭクエン酸ナトリウム、３２０ｍＭリン酸ナトリウム、２７mg／mlグルコース、０．５μg／ml ＨＲＰ、１００μg／ml ＴＭＢ）を各ウェルに添加することにより検出した。発色反応は、１時間後、３５μlの２Ｍ塩酸を添加することにより停止し、Ａ４５０を測定した。 B）ＬＹＳＯＸ：リゾチームおよびグルコースオキシダーゼ結合活性９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Greiner HCプレート）を、リゾチーム（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、pH９．５中、５０μg／ml；２００μl／ウェル）を用いて３７℃で一晩活性化した。ＰＢＳＴで１回洗浄した後、抗原感作プレートを２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ、０．１５％Tween）を用いて３７℃で１時間予備ブロッキングした。５０μlのＣＯＳ培養上清（そのまま、またはＰＢＳで希釈したもの）と５０μlのグルコースオキシダーゼ含有（５０μg／ml）ブロッキング緩衝液をStreptococcus sanguis感作プレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、結合したグルコースオキシダーゼを、１００μlの基質（７０ｍＭクエン酸ナトリウム、３２０ｍＭリン酸ナトリウム、２７mg／mlグルコース、０．５ μg／ml ＨＲＰ、１００μg/mlＴＭＢ）を各ウェルに添加することにより検出した。発色反応は、１時間後、３５μlの２Ｍ塩酸を添加することにより停止し、Ａ４５０を測定した。 C）ＬＹＳＡＮ：S.sanguisおよびリゾチーム結合活性９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Greiner HCプレート）を、２００μｌ／ウェルの０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、pH９．５中の１／１０希釈の Streptococcus sanguis細胞の一晩培養物を用いて３７℃で一晩活性化し、各ウェルを感作した。ＰＢＳＴで１回洗浄した後、抗原感作プレートを２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ、０．１５％Tween）を用いて３７℃で１時間予備ブロッキングした。５０μlのＣＯＳ培養上清(そのまま、またはＰＢＳで希釈したもの)と５０μlのアルカリホスフアターゼ結合リゾチーム含有（１００μ／ml）ブロッキング緩衝液を添加し、３7℃で２時間インキユュベートした。結合していないリゾチームは、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄することにより除去した。結合したリゾチームを、１００μlの基質溶液（１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭＭｇＣｌ₂中、１mg／ml ｐＮＰＰ）を各ウェルに添加することにより検出した。１時間後、Ａ４０５を測定した。例１：ｐＳＶ．Golysan発現ベクターの構築ｐＳＶＣＯＳ発現ベクターの構築は、以下の３つの段階からなっていた： 1A）ｐＵＣベースのE.coli発現ベクターにおける２つの重鎖可変ドメインおよび２つの軽鎖可変ドメインのアセンブリー、したがってそれぞれＶＨ_A−ＶＨ_B およびＶＬ_A−ＶＬ_Bモジュールの構築。 1B）ｐＵCベースのE.coli発現ベクターにおける３つの重鎖可変ドメインおよび３つの軽鎖可変ドメインのアセンブリー、したがってそれぞれＶＨ_A−ＶＨ_B −ＶＨ_CおよびＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_Cモジュールの構築。 2）ＣＯＳ細胞における効率的な発現を確実にするための、中間体「ＥＵＫＡ」ベクター中のゲノム抗NＰリーダー配列へのＶＨ_A−ＶＨ_B、ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_CおよびＶＬ_A−ＶＬ_B、ＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_Cの連結 3）ＣＯＳ発現ベクターｐＳＶ．５１中のＳＶ４０プロモーターの下流への、ＸｂａＩ／ＸｂａＩフラグメントとしてのリーダー−ＶＨ_A−ＶＨ_B、リーダー −ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_Cおよびリーダー−ＶＬ_A−ＶＬ_B、リーダー−ＶＬ_A− ＶＬ_B−ＶＬ_Cの挿入 ad.1)E.coli発現ベクター E.coli発現ベクターは、ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩフラグメントを含むｐＵＣ１９の誘導体である。これは、ｓｃＦｖ．ｌｙｓ−ｍｙｃの場合には、フレキシブルなペプチド（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃をコードする連結配列を通じて抗体の対応する軽鎖Ｖドメインに直接連結された重鎖Ｖドメインの５’末端に融合されたｐｅｌＢシグナル配列を含み、したがって単鎖分子を形成する。「２頭」発現ベクターにおいては、単一の誘導可能プロモーターの制御下の人工ジシストロン性オペロンにおいて抗体の重鎖および軽鎖の両方のＶドメインの前にリボソーム結合部位およびｐｅｌＢシグナル配列が先行している。これらの構築体の発現は、誘導可能なｌａｃＺプロモーターにより制動される。３特異的抗体フラグメントの生成に用いたｓｃＦｖ．ｌｙｓ−ｍｙｃ、ｓｃＦｖ．４７１５．２ｔおよびｐＧＯＳＡ．Ｅ２ｔ構築体のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩインサートのヌクレオチド配列を、図３および２にそれぞれ示す。 ad.1A）２特異的または２頭フラグメントのアセンブリー構築体ｐＧＯＳＡ．Ｅ２ｔ（図２および６Ａ）は、E.coli発現構築体ｐＧＯＳＡ．Ｅに由来する。ｐＧＯＳＡ．Ｅの構築は、以下の「調製１」に詳細に記載する。ｐＧＯＳＡ．Ｅと対照的に、ｐＧＯＳＡ．Ｅ２ｔは、可変軽鎖のＣ末端にペプチドタッグを含有する。オリゴヌクレオチドＤＢＬ３およびＤＢＬ４を用いて、ＶＬ４７１５遺伝子フラグメントを、鋳型としてｓｃＦｖ．４７１５．２ｔを用いて増幅した。ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩＶＨ４７１５．２ｔＰＣＲフラグメントおよびヒドロフィル２タッグを含むｓｃＦｖ．４７１５．２ｔからのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（図３Ｂ）を用いて、ｐＧＯＳＡ．ＥのＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩＶＨ４７１５フラグメントを置き換えてｐＧＯＳＡ.Ｅ２ｔを製造した。ベクターｐＧＯＳＡ．Ｅ２ｔおよび表１のオリゴヌクレオチドは、ほとんどの特異性をＰＧＯＳＡ．Ｅ２ｔ構築体にクローニングすることができるように設計した（図６Ａ）。上流Ｖ_Hドメインは、オリゴヌクレオチドＰＣＲ．５１およびＰＣＲ．８９を用いて得られるあらゆるＰｓｔＩ−ＢｓｔＥII Ｖ_H遺伝子フラグメントにより置き換えることができる。オリゴヌクレオチドＤＢＬ．１およびＤＢＬ．２は、Ｖ_H遺伝子フラグメントにＳｆｉＩおよびＮｈｅＩ制限部位を導入し、したがってそれらのＶ_H遺伝子フラグメントを下流Ｖ_HドメインとしてＳｆｉＩ−ＮｈｅＩ部位中にクローニングすることができるように設計した。このアプローチを用いて、以下のＶＨ_A−ＶＨ_Bの組合わせを構築した：ＶＨ４７１５−ＶＨ３４１８、ＶＨ４７１５−ＶＨｌｙｓｍＶＨ３４１８−ＶＨｌｙｓ、ＶＨｌｙｓ−ＶＨ３４１８。オリゴヌクレオチドＰＣＲ．１１６およびＰＣＲ．９０を用いて得られるすべてのＶ_L遺伝子フラグメントは、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして３４１８ＶL遺伝子フラグメントの位置にクローニングすることができる。しかし、ここでの問題は、３４１８Ｖ_H遺伝子フラグメント中の内部ＳａｃＩ部位の存在である。オリゴヌクレオチドＤＢＬ．３およびＤＢＬ．４は、ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして４７１５Ｖ_L遺伝子フラグメントの位置にＶ_L遺伝子のクローニングを可能にするように設計されている。しかし、ここでの問題は、ヒドロフィル２タッグ遺伝子フラグメント（２ｔ）中の内部ＢａｍＨＩ部位の存在である。このアプローチを用いて以下のＶＬ_A−ＶＬ_Bの組合わせを構築した：ＶＬ３４１８−ＶＬ４７１５．２ｔ、ＶＬｌｙｓ−ＶＬ４７１５．２ｔおよびＶＬｌｙｓ−ＶＬ３４１８．２ｔ。 ad.1B）３頭または３特異的フラグメントのアセンブリープライマー組合わせＤＢＬ．１／ＤＢＬ．５とともに鋳型としてｓｃＦｖ（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）または２特異的構築体（ＶＨ−リンカー−ＶＨ）のいずれかを用いるＶＨ−リンカーフラグメントの増幅（図７Ａ）は、ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_Cモジユールの構築のための建築ブロックの１つを生じる。ＶＨ−リンカーＤＢＬ．１／ＤＢＬ．５ＰＣＲフラグメントは、ＳｆｉＩで消化し、すべての２特異的構築体のリンカー配列と下流ＶＨドメインとの間に存在するＳｆｉＩ部位に挿入して（図７Ｂ）、ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_Cモジュールを製造する。このアプローチを用いて、以下のＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_Cの組合わせを本願のために構築した：ＶＨ４７１５−ＶＨｌｙｓ−ＶＨ３４１８およびＶＨｌｙｓ−ＶＨ４７１５− ＶＨ３４１８。増幅反応においてプライマー組合わせDＢＬ．３／ＤＢＬ．６とともに鋳型として２特異的構築体（ＶＬ−リンカー−ＶＬ）を用いると（図７Ａ）、ＶＬ_A− ＶＬ_B−ＶＬ_Cモジュールの構築のためのＶＬ−リンカー建築ブロックを生じる。ＶＬ−リンカ−ＤＢＬ．３／ＤＢＬ．６ＰＣＲフラグメントは、Ｓａ１Ｉで消化し、すべての２特異的構築体のリンカー配列と下流ＶＬドメインとの間に存在するＳａｌＩ部位に挿入して（図７Ｂ）、ＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_Cモジュールを製造する。このアプローチを用いて、以下のＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_Cの組合わせを構築した：ＶＬｌｙｓ−ＶＬ４７１５−ＶＬ３４１８．２ｔおよびＶＬ３４１８−ＶＬｌｙｓ−Ｖｌ４７１５．２ｔ。最終の３特異的構築体の模式的な図を、図６Ｂに示す。 ad.2）リーダー配列への可変領域ドメインの連結ｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩポリリンカーを、合成ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 「Ｅｕｋａ」ポリリンカーで置き換えた。これは、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで消化したｐＵＣ１９ベクターに、合成オリゴヌクレオチドＥｕｋａ．１およびＥｕｋａ．２（表１）をアニーリングさせ、挿入することにより達成した。得られたＥｕｋａ．ｐＵＣベクターは、リーダー配列、およびＶＨおよびＶＬドメインのサブクローニングに必要なすべての制限部位を含む。ＮｃｏＩ／ＰＳｔＩゲノム抗ＮＰリーダー配列フラグメントは、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化したＥｕｋａ．ｐＵＣベクターにクローニングしてＥｕｋａ．ＶＨ構築体を生じた（図８Ａ）。オリゴヌクレオチドＭＬ．１およびＭＬ．２（表１）は、増幅反応に用いて、リーダー−ＶＬ融合体の構築を可能にするリーダー配列の３'末端のＳａｌＩ部位を導入した。ＮｃｏＩ／ＳａｃＩリーダー配列ＰＣＲフラグメントは、ＮｃｏＩ／ＳａｃＩで消化したＥｕｋａ．ｐＵＣベクターに挿入してＥｕｋａ．ＶＬ構築体を生じた（図８Ａ）。ＶＨ_A−ＶＨ_BおよびＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_Cモジュールは、ｐＵＣ発現ベクターからＰｓｔＩ／ＮｈｅＩフラグメントとして切り出して、ＰｓｔＩ／ＮｈｅＩで消化したＥｕｋａ．ＶＨベクターに挿入した（図８Ｂ）。このアプローチを用いて以下のリーダー−ＶＨ_A−ＶＨ_Bおよびリーダー−ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_Cの組合わせを本願のために構築した：Ｅｕｋａ．Ｂ：リーダー−ＶＨ４７１５−ＶＨ３４１８、Ｅｕｋａ．Ｄ：リーダー−ＶＨ４７１５−ＶＨｌｙｓ、Ｅｕｋａ．Ｇ：リーダー−ＶＨ３４１８−ＶＨｌｙｓ、Ｅｕｋａ．Ｋ：リーダー−ＶＨ４７１５− ＶＨｌｙｓ−ＶＨ３４１８、およびＥｕｋａ．Ｍ：リーダー−ＶＨｌｙｓ−ＶＨ４７１５−ＶＨ３４１８。ＶＬ_A−ＶＬ_BおよびＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_Cモジュールは、ｐＵＣ発現ベクターからＥｃｏＲＩ−クレノウ／ＳａｃＩフラグメントとして切り出して、ＮｏｔＩ −クレノウ／ＳａｃＩで処理したＥｕｋａ．ＶＬベクターに挿入した（図８Ｃ）。このアプローチを用いて以下のリーダー−ＶＬ_A−ＶＬ_Bおよびリーダー−ＶＬ_A −ＶＬ_B−ＶＬ_Cの組合わせを構築した：Ｅｕｋａ．Ｎ：リーダー−ＶＬ３４１８−ＶＬ４７１５．２ｔ、Ｅｕｋａ．Ｐ：リーダー−ＶＬｌｙｓ−ＶＬ４７１５．２ｔ、Ｅｕｋａ．Ｓ：リーダー−ＶＬｌｙｓ−ＶＬ３４１８．２ｔ、Ｅｕｋａ．Ｖ：リーダー−ＶＬｌｙｓ−ＶＬ４７１５−ＶＬ３４１８．２ｔ、およびＥｕｋａ．Ｗ：リーダー−ＶＬ３４１８−ＶＬｌｙｓ−ＶＬ４７１５．２ｔ。 ad.3）ｐＳＶ．５１発現ベクターへのリーダー−可変ドメイン融合体のサブクローニングすべてのリーダー−ＶＨ_A−ＶＨ_B、リーダー−ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_C、リーダー−ＶＬ_A−ＶＬ_Bおよびリーダー−ＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_Cの組合わせは、「Ｅｕｋａ」ベクターからＸｂａＩ／ＸｂａＩフラグメントとして切り出して、ＸｂａＩ部位に挿入することによりｐＳＶ．５１のＳＶ４０プロモーターの下流に（図５）サブクローニングした（図８Ｂ、８Ｃ）。インサートの配向が正しいことを確認した後、ｐＳＶ発現ベクターを用いてＣＯＳ−１細胞をトランスフェクションした（例２参照）。用いたｐＳＶ発現ベクターを表２に示す。例２：Golvsan３頭体の２機能性結合活性この例では、対応するＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_C およびＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_C遺伝子フラグメントをコードする発現プラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ− １細胞による３タイブの２特異的結合活性の生成を記載する。１．ＣＯＳ−１細胞による抗体フラグメントの産生ＰＳＶ−ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_CおよびＰＳ_V−ＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_C発現プラスミドの組合わせでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の上清を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移した。得られたウェスタンブロットを、ＶＨドメインのフレームワーク４中のペプチド配列（ＰＣＲ．８９によりコードされる領域；用いたすべてのＶＨドメインにおいて保存されている）を認識するモノクローナル抗体、（内部試薬）および／またはヒドロフィル２タッグに特異的なモノクローナル抗体を用いてスクリーニングした。図９に示すように、すべての上清は、ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_CおよびＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_Cフラグメントの予想される分子量の産物を含有しており、ＣＯＳ細胞が成功裡にトランスフェクションされ、検出可能なレベルで抗体フラグメントを培地中に分泌していることが示された。２．２機能性結合活性単一のｐＳＶ発現プラスミドおよびｐＳＶ発現プラスミドの組合わせでトランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞の上清を、ＥＬＩＳＡフォーマットを用いて２機能性結合活性の生成について試験した。＊２特異的陽性対照「ＬＹＳＡＮ」（ｐＳＶ．Ｄ＋ｐＳＶ．Ｐ）、「ＬＹＳＯＸ」（ｐＳＶ．Ｇ＋ｐＳＶ．Ｓ）および「ＧＯＳＡ」（ｐＳＶ．Ｂ＋ｐＳＶ．Ｎ）でトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の上清は、それぞれＬＹＳＡＮ、ＬＹＳＯＸおよびＧＯＳＡ２特異的活性のみを生じた（図１０）。有意な交差反応は検出されなかった。＊ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_Cフラグメント（ｐＳＶ．ＫおよびｐＳＶ．Ｍ）のいずれか１つまたはＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_Cフラグメント（ｐＳＶ．ＶおよびｐＳＶ．Ｗ）のいずれか１つをコードする１つの発現ベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の上清は、まったく２特異的結合活性を呈さず、バックグラウンドの結合または特異的結合活性がまったく生成されないことが示された。＊ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_Cフラグメント（ｐＳＶ．ＫおよびｐＳＶ．Ｍ）のいずれか１つをコードする発現ベクターおよびＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_Cフラグメント（ｐＳＶ．ＶおよびｐＳＶ．Ｗ）のいずれか１つをコードする発現ベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞のすべての試験した上清は、有意なレベルの３つすべての２機能性結合活性ＬＹＳＯＸ、ＧＯＳＡおよびＬＹＳＡＮを示した。これらの結果は、ＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_Cをコードする発現ベクターおよびＶＬ_A −ＶＬ_B−ＶＬ_Cフラグメントをコードする発現ベクターでトランスフェクションしたＣＯS細胞は３つの結合活性を含む分子を産生し分泌することを示す。この例においては、これらの３つの活性は、グルコースオキシダーゼ結合、S.sangui s結合およびリゾチーム結合である。さらに、図１０に説明した結果は、少なくとも２つのこれらの結合活性は１つの自己アセンブリー性分子複合体中に存在することを明らかに示す。この例においては、これらの組合わせは、ＧＯＳＡ（グルコースオキシダーゼ＋S.sanguis）、ＬＹＳＯＸ（リゾチーム＋グルコースオキシダーゼ）およびＬＹＳＡＮ（リゾチーム＋S.sanguis）である。例３：Golysan３頭体の３機能性結合活性この例では、対応するＶＨ_A−ＶＨ_B−ＶＨ_C およびＶＬ_A−ＶＬ_B−ＶＬ_C遺伝子フラグメントをコードする発現プラスミドでトランスフェクションしたＣＯＳ− １細胞により生成される３タイプの２特異的結合活性が１つの自己アセンブリー性分子複合体に存在することを示す実験を記載する。 Golysan．Ａ（ＶＨｌｙｓ−ＶＨ４７１５−ＶＨ３４１８＋ＶＬｌｙｓ−ＶＬ４７１５-ＶＬ３４１８．２ｔ）よびGolysan．Ｂ（ＶＨｌｙｓ-ＶＨ４７１５− ＶＨ３４１８＋ＶＬ３４１８−ＶＬｌｙｓ−ＶＬ４７１５．２ｔ）を、アフィニティクロマトグラフィにより精製した。発現プラスミドｐＳＶ．Ｍ／ｐＳＶ．Ｖ（Golysan．Ａ）またはｐＳＶ．Ｍ／ｐＳＶ．Ｗ（Golysan．Ｂ）でトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の１００mlの上清を、リゾチーム−セファロースカラム（ＣＮＢｒ−セファロース、Pharmacia；カラムは製造者の指示書にしたがい調製した）に供した。ＰＢＳで十分に洗浄した後、結合したGolysan抗体フラグメントをpH２．２の０．１Ｍグリシン緩衝液中に溶出した。画分をトリスで中和し、３特異的結合活性の存在について試験した。図１１に示すように、カラムの素通り(fall-through)物中にはまったく２特異的結合活性は検出されなかった。３つすべての２特異的結合活性（ＧＯＳＡ、ＬＹＳＯＸおよびＬＹＳＡＮ）は、リゾチームアフィニティマトリックスを通過させることによりＣＯＳ−１上清から抽出された。酸溶出後、３つすべての２特異的結合活性（ＧＯＳＡ、ＬＹＳＯＸおよびＬＹＳＡＮ）はカラムから回収された。Golysan．ＡおよびＢは、ともにリゾチームに結合する能力に基づいてアフィニティ精製されたのであるから、これらの分子はS.sanguisおよびグルコースオキシダーゼにもまた結合するという知見は、３つすべての結合活性は１つの自己アセンブリー性分子複合体に存在することを示す。調製１．ｐＧＯＳＡ．Ｅ２頭発現ベクターの構築ｐＧＯＳＡ発現ベクターにおいては、抗体のＶ_HおよびＶ_Lの両方をコードするＤＮＡフラグメントは、その前にリボソーム結合部位およびｐｅｌＢシグナル配列をコードするＤＮＡ配列が先行しており、単一の誘導可能なプロモーターの制御下で人工ジシストロン性オペロン中にある。これらの構築体の発現は、誘導可能なｌａｃＺプロモーターにより制動される。２特異的抗体フラグメントの生成に用いたプラスミドｐＵＲ．４１２４（配列番号２３）、Ｆｖ．３４１８（配列番号２４）、Ｆｖ．４７１５−ｍｙｃ（配列番号２５）およびｓｃＦｖ．４７１５−ｍｙｃ（配列番号２６）構築体のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩインサートのヌクレオチド配列を、それぞれ図１２〜１５に示す。さらに、プラスミドｓｃＦｖ．４７１５−ｍｙｃを担持するE.coli細胞の培養物およびプラスミドＦｖ．３４１８を担持するE.coli細胞の培養物は、ブタペスト条約に基づいてロンドン(英国)のthe National Collection of Type Cultures(Central Public Health Labo ratory)に、それぞれ寄託番号ＮＣＴＣ１２９１６およびＮＣＴＣ１２９１５として寄託した。ＥＰＣ規則２８（４）、またはＥＰＣの締約国でない国についての同様の協定にしたがって、そのような寄託物の試料は、請求により、専門家のみに付託されることが要求される。ｐＧＯＳＡ．Ｅの構築（ｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩインサートについては図１６を参照されたい）は、いくつかのクローニング工程を含むものであった。種々のドメイン中の適切な制限部位は、以下の表１に挙げるオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲディレクテッド突然変異誘発により導入した。ｐＧＯＳＡ．Ｅの構築は、４つの中間体の構築体ｐＧＯＳＡ．ＡからｐＧＯＳＡ．Ｄを生じるいくつかのクローニング工程を含むものであった（図１７〜２１参照）。最終発現ベクターであるｐＧＯＳＡ．Ｅおよび表１のオリゴヌクレオチドは、最終ｐＧＯＳＡ．Ｅ構築体にほとんどの特異性をクローニングすることができるように設計した（図１６ｃ）。上流Ｖ_Hドメインは、オリゴヌクレオチドＰＣＲ．５１およびＰＣＲ．８９（表１参照）を用いて得られるあらゆるＰｓｔＩ−ＢＳｔＥII Ｖ_H遺伝子フラグメントによって置き換えることができる。オリゴヌクレオチドＤＢＬ．１およびＤＢＬ．２（表１参照）は、Ｖ_H遺伝子フラグメントにＳｆｉＩおよびＮｈｅＩ制限部位を導入し、したがってこれらのＶ_H遺伝子フラグメントを下流Ｖ_HドメインとしてＳｆｉＩ−ＮｈｅＩ部位にクローニングすることを可能にするように設計した。オリゴヌクレオチドＰＣＲ．１１６およびＰＣＲ．９０（表１参照）を用いて得られるすべてのＶ_L遺伝子フラグメントは、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてＶ_L．３４１８遺伝子フラグメントの位置にクローニングすることができる。しかし、ここでの問題は、Ｖ_H．３４１８遺伝子フラグメント中の内部ＳａｃＩ部位の存在である。オリゴヌクレオチドＤＢＬ．３およびDＢＬ．９（表１参照）は、ＶL遺伝子フラグメントをＳａ１Ｉ−ＮｏｔＩフラグメントとしてＶ_L.４７１５遺伝子フラグメントの位置にクローニングすることを可能にするように設計されている。ｐＧＯＳＡ．Ａこのプラスミドは、Ｆｖ．４７１５−ｍｙｃ構築体（配列番号２５）およびｓｃＦｖ．４７１５−ｍｙｃ構築体（配列番号２６）の両方から由来する。ＳｆｉＩ制限部位は、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーをコードするＤＮＡ配列とｓｃＦｖ．４７１５−ｍｙｃ構築体のＶ_Lをコードする遺伝子フラグメントとの間に導入した（図１７参照）。これは、後者の構築体のＢｓｔＥII−ＳａｃＩフラグメントを、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーをコードするＤＮＡとＶ_L．４７１５遺伝子フラグメントとの間にＳｆｉＩ部位を含むフラグメントｐＣＲ−ＩＢＳｔＥII／ＳａｃＩ（図２２）で置き換えることにより達成した。ＳｆｉＩ部位の導入は、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーとＶ_L．４７１５との間に４個の付加的なアミノ酸（ＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｌａ）をも導入し、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｌａリンカー（リンカーＡ）を生じた。ＰＣＲ−Ｉの生成に用いたオリゴヌクレオチド（ＤＢＬ．５およびＤＢＬ．７、表１参照）は、それぞれ、Ｖ_H．４７１５のフレームワーク３領域の配列と一致するよう、また、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーをコードするＤＮＡとＶ_L.４７１５遺伝子フラグメントとの接合部で開始するよう、設計した。したがって、ｐＧＯＳＡ．Ａは、以下のように示すことができる：ｐｅｌＢ−Ｖ_H４７１５−リンカーＡ−（ＳｆｉＩ）−Ｖ_L４７１５−ｍｙｃｐＧＯＳＡ．Ｂこのプラスミドは、Ｆｖ．３４１８から由来する（図１８参照）。停止コドンを含むＶ_Lのフレームワーク４をコードするＤＮＡの３'末端を含むプラスミドＦｖ．３４１８のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを除去し、フラグメントＰＣＲ−IV ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで置き換えた（図２３）。ＰＣＲ−IVの生成に用いたオリゴヌクレオチド（ＤＢＬ．８およびＤＢＬ．６、表１参照）は、Ｖ_Lおよび（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーの接合部の配列と完全に一致するよう（ＤＢＬ．８）、また、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーとｐＵＲ．４１２４（ＤＢＬ．６）のＶ_Hとの接合部で開始するよう（ＤＢＬ．６）、設計した。ＤＢＬ．６は、Ｖ_H のＰｓｔＩ部位を除去し（サイレント突然変異）、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーとＶ_Hとの接合部にＳａｌＩ制限部位を導入し、したがって、リンカーの最後のＳｅｒをＶａｌ残基で置き換えて、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₂Ｇｌｙ₄Ｖａｌリンカー（リンカーＶ）の生成をもたらした。したがって、ｐＧＯＳＡ．Ｂは、以下のように示すことができる：ｐｅｌＢ−Ｖ_H３４１８＋ｐｅｌＢ−Ｖ_L３４１８−リンカーＶ−（ＳａｌＩ− ＥｃｏＲＩ）ｐＧＯＳＡ．Ｃこのプラスミドは、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｌａリンカーによりＶ_H．３４１８に連結されたＶ_H．４７１５をコードするＤＮＡを含み（図１９）、したがって、以下のように示される：ｐｅｌＢ−Ｖ_H４７１５−リンカーＡ−Ｖ_H３４１８この構築体は、Ｖ_L．４７１５をコードするｐＧＯＳＡ．ＡからのＳｆｉＩ− ＥｃｏＲＩフラグメントを、Ｖ_H.３４１８遺伝子を含むフラグメントＰＣＲ−II ＳｆｉＩ／ＥｃｏＲＩにより置き換えることによって得られた。ＰＣＲ−IIを生成するために用いたオリゴヌクレオチド（ＤＢＬ．１およびＤＢＬ．２、表１参照）は、それぞれ、Ｖ_H．３４１８をコードする遺伝子のフレームワーク１およびフレームワーク４領域にハイブリダイズする。ＤＢＬ．１は、Ｖ_H遺伝子の上流のＰｓｔＩ制限部位を除去し（サイレント突然変異）、ＳｆｉＩ制限部位を導入するように設計した。ＤＢＬ．２は、フレームワーク４領域のＢｓｔEII制限部位を破壊し、停止コドンの下流にＮｈｅＩ制限部位を導入する。ｐＧＯＳＡ．Ｄこのプラスミドは、Ｖ_H．３４１８遺伝子および（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₂Ｇｌｙ₄ＶａｌリンカーによりＶ_L．４７１５に連結されたＶ_L．３４１８をコードするＤＮＡを含むジシストロン性オペロンを含む（図２０参照）。したがつて、以下のように示される：ｐｅｌＢ−Ｖ_H３４１８＋ｐｅｌＢ−Ｖ_L３４１８−リンカーＶ−Ｖ_L４７１５この構築体は、プラスミドｐＧＯＳＡ．ＢをＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、Ｖ_L．４７１５遺伝子を含むフラグメントＰＣＲ−ＶＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ（図２４）を挿入することにより得られた。ＰＣＲ−Ｖを得るために用いたオリゴヌクレオチド（ＤＢＬ．３およびＤＢＬ．９、表１参照）は、それぞれ、Ｖ_L．４７１５遺伝子のフレームワーク１およびフレームワーク４領域のヌクレオチド配列に一致するように設計した。ＤＢＬ．３は、フレームワーク１領域からＳａｃＩ部位を除去し（サイレント突然変異）、Ｖ_L．４７１５遺伝子の上流にＳａｌＩ制限部位を導入した。ＤＢＬ．９は、Ｖ_L．４７１５遺伝子のフレームワーク４領域のＸｈｏＩ制限部位を破壊し（サイレント突然変異）、停止コドンの下流にＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を導入した。ｐＧＯＳＡ．Ｅこのプラスミドは、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｌａリンカーによりＶ_H．３４１８に連結されたＶ_H．４７１５をコードするＤＮＡおよび（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃Ｇｌy₄ＶａｌリンカーによりＶ_L．４７１５に連結されたＶ_L．３４１８をコードするＤＮＡを含むジシストロン性オペロンを含む。したがって、以下のように示される：ｐｅｌＢ−Ｖ_H４７１５−リンカーＡ−Ｖ_H３４１８＋ｐｅｌＢ−Ｖ_L３４１８ −リンカーＶ−Ｖ_L４７１５両翻訳単位の前には、リボソーム結合部位およびｐｅＬＢリーダー配列をコードするＤＮＡが先行する。このプラスミドは、Ｖ_H．３４１８をコードするＰｓｔＩ−ＳａｃＩインサートを除去した後にｐＧＯＳＡ．Ｄから生じるベクターを、Ｖ_H．３４１８に連結されたＶ_H．４７１５を含むＰｓｔＩ−ＮｈｅＩｐＧＯＳＡ．ＣインサートおよびＰＣＲ−III ＮｈｅＩ／ＳａｃＩフラグメントと混合することにより、３ポイント連結により得られた（図２５参照）。残りのＰｓｔＩ−ＳａｃＩｐＧＯＳＡ．Ｄベクターは、Ｖ_H．３４１８のフレームワーク１領域の５'末端をＰｓｔＩ制限部位まで、および（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₂Ｇｌｙ，ＶａｌリンカーによりＶ_L．４７１５に連結されたＶ_L．３４１８のＳａｃＩ制限部位から開始するＶ_L．３４１８を含む。ＰｓｔＩ−ＮｈｅＩｐＧＯＳＡ．Ｃインサートは、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｌａリンカーによりＶ_H．３４１８に連結されたＶ_H．４７１５を含み、Ｖ_H．４７１５のフレームワーク１領域のｐｓｔＩ制限部位から開始する。ＮｈｅＩ−ＳａｃＩＰＣＲ−IIIフラグメントは、Ｖ_L．３４１８−（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₂Ｇｌy₄Ｖａｌ−Ｖ_L．４７１５構築体のためのリボソーム結合部位およびｐｅｌＢリーダー配列をコードするＤＮＡを提供する。ＰＣＲ−IIIを生成するために用いたオリゴヌクレオチドＤＢＬ．１０およびＰＣＲ．１１６（表１参照）は、Ｆｖ．４７１５中のＶ_L４７１５のリボソーム結合部位の上流の配列に一致し、ＮｈｅＩ制限部位を導入するように（ＤＢＬ．１０）、また、Ｖ_L．３４１８のフレームワーク４領域に一致するように（ＰＣＲ．１１６）、設計した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ログト・ヴァン・デァ、コルネリス・ポール・エリク英国、ノーザンプトン、エヌエヌ10・０ティーユー、ラシュデン、ペヴェラル・マナー・エステイト、ブルーベル・ライズ１ (72)発明者ヴェルホーイェン、マーティン・エリーザ英国、ノーザンプトン、エヌエヌ10・０キューエヌ、ラシュデン、マナー・ファーム・エステイト、ティンタゲル・クローズ１

Claims

【特許請求の範囲】１．以下のもの：一連の３以上の抗体重鎖の可変ドメインを含む第一のポリペプチド；および一連の３以上の抗体軽鎖の可変ドメインを含む第二のポリペプチドを含む多価抗原結合タンパクであって、上記第一および第二のポリペプチドが、それぞれの重鎖および軽鎖可変ドメインの会合により連結されており、会合した各可変ドメイン対が、抗原結合部位を形成する多価抗原結合タンパク。２．３価抗原結合タンパクを含む、請求項１記載のタンパク。３．上記第一のポリペプチドの抗体重鎖の可変ドメインが、ペプチドリンカーによって連結されており、上記第二のポリペプチドの抗体軽鎖の可変ドメインが、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項１または２記載のタンパク。４．会合した可変ドメイン対結合部位が、互いに異なるエピトープに結合することができる、請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク。５．会合した可変ドメイン対結合部位が、互いに同じエピトープに結合することができる、請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク。６．請求項１〜５のいずれか１項に記載の多価抗原結合タンパクのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。７．１以上の発現ベクターに含まれる請求項６記載のヌクレオチド配列。８．請求項７記載のベクターにより形質転換され、ヌクレオチド配列を発現して多価抗原結合タンパクのポリペプチドを産生することができる宿主細胞。９．発現されるポリペプチドが、会合して多価抗原結合タンパクを形成する、請求項８記載の宿主細胞。１０．請求項１〜５のいずれか１項記載の多価抗原結合タンパクの製造方法であって、以下の工程： (1)上記第一および第二のポリペプチドをコードする遺伝子を包含させることにより１以上の宿主を形質転換する行程； (2)上記遺伝子および上記宿主を発現させる工程；および (3)上記第一および第二のポリペプチドが会合してタンパクを形成するのを可能にする工程を含む方法。１１．医療において用いるための、請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパク。１２．請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパクを含む診断または治療組成物。１３．診断または治療における使用のための薬剤の調製における請求項１２記載の組成物の用途。１４．請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパクを投与することを含む診断または治療の方法。１５．イムノアッセイ方法または精製における請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパクの用途。