JPH01126557A - 免疫測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ産業上の利用分野 本発明は、固相を用いた免疫測定試薬であり、固相にア
ルミナ単結晶（Ａｌ□０３）を使い、ポリリジン層とグ
ルタルアルデヒド層と抗体または抗原層を順次形成して
、固相への抗体結合量及び抗体結合力を増加させ、測定
範囲の拡大、検出限界の感度の上昇、及び再現性の向上
を得た免疫測定試薬に関するものである。

Ｂ発明の概要 本発明は、アルミナ単結晶（Ａ＋＊ＯＳ）を固相として
、その固相上に、ポリリジン層とグルタルアルデヒド層
と抗体または抗原層を順次形成したことからなる免疫測
定試薬に関するものである。

Ｃ従来の技術 固相を用いる免疫学的測定法には、大きく分けて、競合
法と非競合法に分類される。前者の代表例は、第１抗体
固相法、後者は、サンドイッチ測定法がある。

このサンドイツチ法は、固相に抗体を吸着させ、そこに
抗原をトラップさせる。次に酵素標識抗体をその抗原に
結合させ、結合した酵素標識抗体量から抗原の量を測定
する方法である。

上記の原理のため、サンドイツチ法の検出感度を上昇さ
せるためには、固相への抗体結合量及び抗体結合力が、
大きく影響してくる。

従来、固相の材料としてはポリスチレン、ガラス、アク
リルニ１〜リルーブクジエンースチレン共重合樹脂（略
してＡＢＳ）などが多く用いられた。

これらの固相への抗体結合方法は、多くは物理的に吸着
させる方法であった。しかし、この方法では、固相の抗
体結合量が少ない、固相の抗体結合力が弱い、測定値の
バラツキが大きい、非特異的吸着が大きいなどの問題点
があった。

以前、特願昭６０−４５７４２で本発明者らが出願した
「免疫学的な測定試薬の調整法とこれによって得た試薬
」では、上記の問題点を解決するために、固相をアミノ
酸処理した後、二官能性アルデヒド処理し、抗体結合さ
せたものであり、その効果は上記問題点を解決するに至
った。

Ｄ発明が解決しようとする問題点 しかし、免疫測定試薬としての検出限界、測定範囲及び
再現性のより一層の向上が望まれていた。

本発明は、かかる問題点を解決するためになされたもの
で、固相の抗体結合量が多く、固相の抗体結合力も強く
、測定値のバラツキが小さい、非特異的吸着の少ない免
疫測定試薬を得ることはもちろんの事として、免疫測定
試薬としての測定範囲の拡大、検出限界の感度上昇及び
再現性のより一層の向上を成し得た免疫測定試薬を得る
ことを目的とする。

Ｅ問題点を解決するための手段 この発明に係わる免疫測定試薬では、ポリリジン層とグ
ルグルアルデヒド層と抗体または抗原層を順次形成した
、生体親和性の高いアルミナ単結晶（Ａ　ｌ　ｘ　Ｏ３
）を使い、そのアルミナ単結晶（人１ｚｏｉ）を固相と
したものである。

Ｆ作用 生体親和性の高いアルミナ単結晶（人１□０３）を固相
に使うことにより、固相とポリリジンの結合力と結合量
が増加する。それにより、架橋するグルタルアルデヒド
量が増加し、抗体結合量及び抗体結合力が増加する。

Ｇ実施例 （１１”’ｉｃ　Ｅ　Ａ　（ガン胎児性抗原）を用いた
抗体結合量の評価 実施例１゜ 第１図は本発明の一実施例を示す免疫測定試薬の調整方
法図である。

調整方法は、アルミナ単結晶（Ａ＋ｚＯ３）　（息下、
Ａ１．ｓボールと略す）をＡｌ（０，１ｍｇ／−ポリリ
ジンを含む０．１５ｍｏｌ／　ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８
，５）　）中に室温で、１晩浸漬してポリリジン処理を
行った。

蒸留水で洗浄し、５％グルタルアルデヒド水溶液ニ、３
０℃で２時間浸漬してグルクルアルデヒド処理を行った
。蒸留水で洗浄し、Ｂ液（Ｑ、ｌｌ１１ｇ／ｍｉ免疫グ
ロブリンＧ（ＩｇＧと略す）、０．１ｍｏｌ／　ｌリン
酸緩衝液（ＰＨ７，ｓ）　）　４℃で１晩浸漬した。さ
らにＢ液で洗浄した後、Ｃ液（０，Ｏ１ｍｏｌ／　ｊ　
リン酸緩衝液（ｐ［（７，０）、０．１ｍｏｌ／ｊ　Ｎ
ａ１ｌ、０．１＊牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａと略す
）、０．１ＸＮａＮｓ　ｆｆｌ、合液）で洗浄した後、
Ｃ液に浸漬し、４℃で保存した。

本実施例では、ＩｇＧを抗ガン胎児性抗原（抗ＣＥＡと
略す）−ＩｇＧとして被覆ＡＩ、ｓボールを調整した。

第２図は競合反応による抗体結き量の測定操作図であり
、第１図の方法で調整された抗ＣＥＡ−ＩｇＧ被覆Ａ１
．ｓボールを１”■−〇　Ｅ　Ａ溶液（約２Ｘ１０’Ｃ
ｐｍ［カウントバー・ミニフッ］）１００μ　Ｉ　　、
　ＣＥＡ溶液（０〜１１０００ｎ／ｍｔ’）１００μｌ
　ＳＣ液１００μｌの混合溶液で１晩反応させ、洗浄後
、γ−ウェルカウンターで計測した。

第１図で調整した抗ＣＥＡ−ＩｇＧ被覆Ａｔ、ｓボール
を第２図の通り、”’Ｉｃ　Ｅ　Ａにより、抗体結合量
を測定した。結果は、第３図に示す。

比較例１゜ 第１図と同様の方法で、抗ＣＥＡ−ＩｇＧ被覆ポリスチ
レンボールを調整し、第２図と同様の方法で、抗体結合
量を測定した。

結果は、第３図に示す。

第３図は、実施例１と比較例１の結果であり、Ａ１．ｓ
ボールとポリスチレンボールの抗体結合量変化図である
。図において（ａ）は実施例１、（ｂ）は比較例１の結
果を示している。

図より、抗体結合量はＡＩ、ｓボールの方がポリスチレ
ンボールより相対的に大であることが判明した。

これは、ＡＩ、ｓがポリスチレンに比べて生体親和性が
強いためである。

（２）酵素標識抗体の固相への非特異的吸着の評価実施
例２゜ 第４図は酵素免疫測定（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　
人５ｓａｙＥＩＡと略す）を行う時のＩｇＧ−ＣＯＤ（
グルコースオキシダーゼ）標識抗体調整方法図であり、
第５図は非特異的吸着の評価方法の操作図である。

ＩｇＧ−ＣＯＤ標識抗体調整方法は、まずＣＯＤ約３ｍ
ｇ７０．３ｍＮを４倍量のＯ，１ｍｏｌ／　ｌリン酸緩
衝ン戊（ＰＨ７，０）　ｌこ溶かし、ＧＯＤ：　ＧＭＢ
Ｓ（ザクシンイミジル−４−マレイミドブチレイ１−）
＝１：５Ｇの比で添加し、それをＯ，１ｍｏｌ／　ｌリ
ン酸ｌ！衛液（ｐｌ（６，０）で平衡化したセファデッ
クスＧ　２５　（１ｘ３０カラム）を用いて１２ｎＪ／
ｈｒで脱塩し、１ｒｎｌずつ分取し、マレイミドＣＯＤ
を得た。次に、ＩｇＧに２ｍ＆’の０．１ｍｏｌ／ｊ’
　リン酸緩衝’７５　（ｐ［［６，ｏ）　　５ｍｍｏｌ
／　ｌ　ＥＤＴ人を加又、Ｓ−アセチルメルカプトこは
く酸を（Ｓ−アセチルメルカプトこはく酸：　　ＩｇＧ
＝３００：　　１の比で）ジメチルフォルマイトに溶解
し添加する。室温で３０分間攪拌後、０．１ｍｏｌ／＃
　Ｉ・リス−塩酸（ｐ［Ｈ，Ｏ）　０．１−１０．１ｍ
ｏｌ／１ＥＤＴＡ（ｐＨ７，０）０．０２ｍ１．１　ｍ
ｏｌ／／　ヒドロキシジアミン水溶液（ｐｌｉ７．　Ｏ
）　０．１＋ｎｊを各々加え、３０℃４分間反応させた
。Ｄ液で平衡化したセファデックスＧ　２５　（１ｘ３
０カラム）を用いて、１２ｍＮ／ｈｒの速度て脱塩し、
１　ｍｅずつ分取し、水冷中コロジオンバッグで濃縮し
、ＳＨ−１ｇＧＪｅ得た。得られたマレイミドＣＯＤと
ＳＨ−ＩｇＧを等モル混和し、３０℃１時間静置後、４
℃で１晩静置した。０．１ｍｏｌ／ｅリン酸緩衝液（ｐ
ＨＧ、５）、５　ｍｍｏｌ／　ｌ　ＥＤＴ人で平衡化し
たセファクリル３００　（１ｘ９０カラム）に、６ｍｔ
’／ｈｒで上記試料を溶出し、１−ずつ分取し、ＩｇＧ
−ＣＯＤ標識抗体を得た。これを０．１％Ｎａｐ、、０
．１％ＢＳＡとなるように添加し、４℃で保存する。

非特異的吸着は、第５図に示すように、第１図で得られ
た抗ＣＥＡ−ＩｇＧ被覆・Ａ１．ｓボールを、Ｃ液で希
釈した抗ＣＥＡ−ＩｇＧ−ＧＯＤ標識抗体０．１−とＣ
液０．２ｍｌに室温で１晩静置し、蒸留水で洗浄後、０
．５ｍｏＩ／Ｉグルコース、Ｏ，Ｏ１ｍｏｌ／　ｌ酢酸
緩衝液（ｐＨ’５．１）　０．３ｍｊを加え、３７℃２
時間静置した。

０．１ｒ＋ｔ’サンプリングし、２Ｘ１Ｇ−’＋ｏｌ／
Ｊ’ルミノール、０、２ｍｏｌ／　（ｌ炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，８）０．５ｍｊ、６Ｘ１０−’ＩＩＩｏ　ｌ　／
ｌフェリシアン化カリ水溶ｗ１０．５＋ｎｌ！を各添加
し、１５秒待ち、１６〜４５秒間の発光量を算出する乙
とによって求めた。

比較例２゜ 第１図と同様に調整した抗ＣＥ　Ａ’−Ｉ　ｇＧ被覆ポ
リスチレンボールを用いて、第５図の様にポリスチレン
ボールの非特異的吸着量を求めた。

実施例２と比較例２で、酵素標識抗体の固相への非特異
的吸着を比較した。なお、評価法は、添加ＩｇＧ−ＧＯ
Ｄ標識抗体に対するＩｇＧ−ＣＯＤ標識抗体の固相への
吸着量の割合（％）とした。結果を表１に示す。

表ＩＡ１．ｓボールとポリスチレンボールサンドイッチ
測定法の感度を左右する主な要因の１つである酵素標識
抗体の固相への非特異的吸着ば両者に差がないという結
果を得た。これは抗体を固相へ吸着後、牛血清アルブミ
ンによるブロックがＡ１．ｓの場合でも、ポリスチレン
と同程度に有効であるためである。

（３）検出限界、測定範囲の評価 第６図は測定範囲および検出限界の比較操作図である。

以下にその操作を示す。第１図の操作で得られた抗ＣＥ
Ａ−ＩｇＧ被覆Ａ１．ｓボールおよび抗ＣＥＡ−ＩｇＧ
被覆ポリスチレンボールをＣＥＡ標準１々（Ｃ液で希釈
）０．１−とＣ液０．２ｍｌ’に室温で６時間静置し、
蒸留水で洗浄後、Ｃ液で希釈した抗ＣＥＡ−ＩｇＧ−Ｇ
ＯＤ標識抗体０．１ｍｔ’とＣ液０．２ｍｌに室渇で１
晩静置し、蒸留水で洗浄後、０．５ｍｏ　１７１グルコ
ース、０．０１ｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐ［５，１）　
０．３ｍｊを加え、３７℃２時間静置した。０．１−サ
ンプリングし、２Ｘ１０−’＋ｏｌ／　ｌルミノール、
０．２ｍｏｌ／ｌ’炭酸緩衝液（ｐＨ９，８）Ｏ，Ｓｍ
Ｊ’、　８Ｘ１０−”ｍｏｌ／Ｊ　７　エリシアン化カ
リ水溶液０．５ｍｊを各添加し、１５秒待ち、１６〜４
５秒間の発光量を算出する。

実施例２と比較例２について検出限界および測定範囲を
比較した。第７図は、その結果であり、ＣＥＡ濃度−発
光量変化図である。図において、（ｅ）は実施例２、（
ｄ）は比較例２の結果を示している。

図よりＡ１．ｓの方が、ポリスチレンよりＣＥＡの検出
限界、測定範囲いずれも優れていることが判明した。

これは、Ａ１．ｓの抗体結合量が、大であることと、固
相への抗体結合の際、抗体の免疫活性が失われにくいこ
との２点が挙げられる。また、ＡＩ、ｓとポリスチレン
の測定上限が同値なのは、添加した酵素標識抗体量が制
限因子になっているためと考える。

（４）検出限界における再現性の評価 実施例２と比較例２で検出限界における口内変動と日間
変動を比較した。結果を表２に示す。

表２Ａ１．ｓボールとポリスチレンボール日内変動　測
定回数ｎ　＝　８ 日間変動　測定回数ｎ＝６ 表中（）は、ＣＥＡ濃度を示す。

検出限界でのＡ１．Ｓボールの再現性が、ポリスチレン
ボールよりも優れている。これは、ＡＩ。

Ｓボールの抗体結合量が多く、比較する固相の個体差が
、ポリスチレンボールよりも小さいためである。

（５）固相の抗体結合調整法の評価 比較例３゜ 第８図は、比較例３を示す操作方法図である。

調整方法は、Ｂ液に４℃で１晩浸漬し、さらにＢ液で洗
浄した後、Ｃ液で３回洗浄した後、Ｃ液に浸漬し、４℃
で保存する。

比較例４゜ 第９図は、比較例４を示す操作方法図である。

調整方法は、Ａ１．ｇボールをＡ液中に室温で、１晩浸
漬してポリリジン処理を行った。蒸留水で洗浄し、Ｂ液
で４℃で１晩浸漬した。さらにＢ液で洗浄した後、Ｃ液
で３回洗浄した後、Ｃｗｌに浸漬し、４℃で保存する。

比較例５゜ 第１０図は、比較例５を示す操作方法図である。

Ｆｌ整方法は、ＡＩ、Ｓボールを５％グルタルアルデヒ
ド水溶液に、３０℃で２時間浸漬してグルタルアルデヒ
ド処理を行った。蒸留水で洗浄し、ＢｗＲ４℃で１晩浸
漬した。さらにＢ液で洗浄した後、Ｃ液で３回洗浄した
後、Ｃ液に浸漬し、４℃で保存する。

実施例２と比較例３，４，５について測定範囲及び検出
限界を第６図の方法で比較した。第１１図はその結果で
、処理条件の比較図である。

図において、（ｅ）は比較例３、（ｆ）は比較例４、（
に）は比較例５の結果を示している。

図より、第１図の方法で、ＷＭしたＡ１．ｓの方がＣＥ
Ａの検出限界及び測定範囲のいずれにおいても優れてい
ることが判明した。

第１図の調整法はボールをポリリジンで被覆後、グルタ
ルアルデヒドで架橋されるため、固相が安定する。この
様な安定した固相に結合した抗体により、抗体結合量及
び抗体結合力が増加しな。

今回は抗体量を検出するための標識物を酵素（ＣＯＤ）
の場合のみ記したが、酵素のみならず蛍光発光物質、放
射性同位元素でも同様な結果を得ている。以下に標識物
の例を示す。酵素（グルコースオキシダーゼ、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシグーゼ、グル
コース６リン酸、脱水素酵ズ、アルカリホスファターゼ
等）、発光［ｔ　（フルオレセインイソチオシアネ−１
・、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等）、
化学発光物質（アミノエチルエチルイソルミノール、ア
ミノブチルエチルイソルミノール、アミノペンチルエチ
ルイソルミノール、アミノヘキシルエチルイソルミノー
ル等）、放射性同位光？（’Ｈ。

目Ｃ，３２Ｐ、　１２’Ｉ　、””Ｉ等）Ｈ発明の効果 ポリリジン層とグルクルアルデヒド層と抗体または抗原
層を順次形成した、生体親和性の高いアルミナ単結晶（
Ａｌｔｏｓ）を固相としたので、ポリリジンの被覆量が
上昇し、グルタルアルデヒド処理によって、ポリリジン
の一部のアミノ基が互いにグルタルアルデヒドで、架橋
されるため固相が安定する。この様な安定しな固相に結
合した抗体により、抗体結合量及び抗体結合力が増加す
る。

そのため、従来よりも測定範囲が拡大し、検出限界が上
昇し、再現性が向上するという効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を示す免疫測定試薬の調整方
法図、第２図は競合反応による抗体結合量の測定操作図
、第３図はＡ１．ｓボールとポリスチレンボールの抗体
結合量変化図、第４図は■ｇＧ−ＧＯＤ標識抗体Ｆｌ整
方法図、第５図は非特異的吸着の評価方法の操作図、第
６図は測定範囲および検出限界の比較操作図、第７図は
ＣＥＡ濃度−発光量変化図、第８図は比較例３を示す操
作方法図、第９図は比較例４を示す操作方法図、第１θ
図は比較例５を示す操作方法図、第１１図はその結果で
、処理条件の比較図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリリジン層とグルタルアルデヒド層と抗体また
   は抗原層を順次形成したアルミナ単結晶を固相としたこ
   とを特徴とする免疫測定用試薬。
2. （２）前記抗体は、抗ガン胎児性抗原−免疫グロブリン
   Ｇとしたことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   免疫測定用試薬。