JPH01128785A - ６−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素およびその製造方法 - Google Patents
６−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素およびその製造方法Info
- Publication number
- JPH01128785A JPH01128785A JP28528087A JP28528087A JPH01128785A JP H01128785 A JPH01128785 A JP H01128785A JP 28528087 A JP28528087 A JP 28528087A JP 28528087 A JP28528087 A JP 28528087A JP H01128785 A JPH01128785 A JP H01128785A
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- Japan
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- acid
- tris
- enzyme
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、６−ヒドロキシカプロン酸を６−オクツカプ
ロン酸に変換する６−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素
（以下、ＲＯＡＤという）およびその製造方法に関する
ものである。
ロン酸に変換する６−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素
（以下、ＲＯＡＤという）およびその製造方法に関する
ものである。
本明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣＩ
ＵＢ生ｆヒ学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略記法
により表示され１例えば、下記の略号が使用される。な
お、アミノ酸などに関し光学異性体が、１得る場合は、
特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＵＢ生ｆヒ学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略記法
により表示され１例えば、下記の略号が使用される。な
お、アミノ酸などに関し光学異性体が、１得る場合は、
特に明示しなければＬ体を示すものとする。
Ｇｌｎ ：グルタミン残基
Ａｓｐ ：アスパラギン酸残基
Ｐｒｏ ニブロリン残基
Ｔｙｒ：チロシン残基
Ｖａｌ：バリン残基
Ｌｙｓ：リジン残基
Ｇｌｕ ：グルタミン酸残基
Ａｌａ ：アラニン残基
Ａｓｎ ：アスパラギン残基
Ｌｅｕ ：ロイン／残基
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン残基
ｃｔｙ ニゲリシン残基
Ｈｉｓ ：ヒスチジン残基
Ｓｅｒ：セリン残基
Ｔｈｒ ：スレオニン残基
１１ｅ：イソロイシン残基
Ｔｒｐ ： ）リプトファン残基
Ａｒｇ ：アルギニン残基
Ｍｅｔ：メチオニン残基
Ｃｙｓ ニジスティン残基
ＩＬポリデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチドは、下記の如き略号で表わされるデオキシリボヌ
クレオチドの配列によシ表記する。
オチドは、下記の如き略号で表わされるデオキシリボヌ
クレオチドの配列によシ表記する。
Ａ：２′−デオキシアデニル酸残基
Ｃ：２′−デオキシシチジル酸残基
Ｇ：２′−デオキシグアニル酸残基
Ｔ：チミジル酸残基
特にことわらない限り、デオキシリボヌクレオチド配列
の左端は５′端である。
の左端は５′端である。
（従来の技術）
１（ＣＡ Ｄは、６−ヒドロキシカプロン酸に作用する
脱水素酵素で、ＮＡＤを補酵素としてろ一ヒドロキシカ
プロン酸から６−オクソカプロン酸を生成させる。
脱水素酵素で、ＮＡＤを補酵素としてろ一ヒドロキシカ
プロン酸から６−オクソカプロン酸を生成させる。
従来、６−ヒドロキシカプロン１ｔ−６−オクソカブロ
／酸に変換する反応は、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ
）属に属する微生物ＣＤ、Ｂ、Ｎｏｒｒｉｓ、Ｐ。
／酸に変換する反応は、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ
）属に属する微生物ＣＤ、Ｂ、Ｎｏｒｒｉｓ、Ｐ。
Ｗ、Ｔｒｕｄｇｉｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、１２１
．５６３−３７０（１９７１））およびアシネトバクタ
−（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ）属に属する微生
物ＣＮ、Ａ、Ｄｏｎｏｇｈｕｅ、Ｐ、Ｗ、Ｔｒｕｄｇｉ
ｌｌ、Ｅｕｒ、Ｊ。
．５６３−３７０（１９７１））およびアシネトバクタ
−（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ）属に属する微生
物ＣＮ、Ａ、Ｄｏｎｏｇｈｕｅ、Ｐ、Ｗ、Ｔｒｕｄｇｉ
ｌｌ、Ｅｕｒ、Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、６０．＋−７（＋９７５）：ｌによ
ッテ行ワレルことは知られていた。
ッテ行ワレルことは知られていた。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、従来の報告では、無細胞抽出液を用いて
反応を行わせ、生産物の定性的な同定が行われていたに
すぎなかった。したがって、ＨＣＡＤの存在の確認は行
われておらず、ＨＣＡＤを特定できる諸性質も知られて
いなかった。そのために、ＨＣＡＤの工業的利用は不可
能であった。
反応を行わせ、生産物の定性的な同定が行われていたに
すぎなかった。したがって、ＨＣＡＤの存在の確認は行
われておらず、ＨＣＡＤを特定できる諸性質も知られて
いなかった。そのために、ＨＣＡＤの工業的利用は不可
能であった。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、微生物由来のＩ（ＣＡＤについて鋭意研
究金型ねた結果、アースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ）属に属する微生物に、従来確認されていな
かったＨＣＡＤが存在することを見い出し、さらに、ア
ースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属に属
する微生物から、このＨＣＡＤを単離棺襄し。
究金型ねた結果、アースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ）属に属する微生物に、従来確認されていな
かったＨＣＡＤが存在することを見い出し、さらに、ア
ースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属に属
する微生物から、このＨＣＡＤを単離棺襄し。
性質を明らかにし念。次めで、該微生物からＨＣＡＤの
遺伝子を単離し、その全塩基配列を決定し、さらに、全
アミノ酸配列を決定した。その後、該遺伝子を発現させ
、ＨＣＡＤが得られることを確認した。
遺伝子を単離し、その全塩基配列を決定し、さらに、全
アミノ酸配列を決定した。その後、該遺伝子を発現させ
、ＨＣＡＤが得られることを確認した。
以上の知見により本発明を完成するに至つ之。
本発明は、下記の特性を有し、６−ヒドロキシカプロン
酸から脱水素して６−オクソカプロン酸に変換するＨＣ
ＡＤを提供することにある。
酸から脱水素して６−オクソカプロン酸に変換するＨＣ
ＡＤを提供することにある。
ａ、ｐ）ｉ７．５〜９．５のトリス−塩酸緩衝液（０，
０５Ｍ）中での反応最適温度が３５〜５０Ｃ １）、４５Ｃのトリス−塩酸緩衝ｆＬ（０，０５Ｍ）中
で測定して最適ｐＨが８．５〜９．５ ｃ、４Ｃの緩衝液中でｐｌ（５，０〜１０．５）範囲で
安定 ｄ、 ｐｌ（ａ、ｏのトリス−塩酸緩衝液（０，０５
Ｍ）中で２５Ｃまで安定 ｅ、ＳＤＳポリアクリルアミド亀気泳動による測定で分
子量が５５，０００±２，０００ダルトンｆ、ゲルｐ過
による測定で分子量が７０，０００±２，０００ダルト
ン ｇ１等電点がｐ Ｈ５，０±０．２ ｈ、 Ｎ末端アミノ酸配列が下記に示す配列Ｍｅｔ−
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｖａ １−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉ １ｅ
−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
− １，ｂ−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素活性が１ ｍ
ｇ当り１〜ｔ０．ｏｏｏ単位 さらに、本発明の目的は、次式で表わされるアミノ酸配
列 Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ −＝ ｅ ＞ （資）
（資） 六 φ −＝ ロ ψω −−
ｍ−−・−〜 −ｋ−４＞ ―−ｃｂｏ＜＜ｏ
工 〉 Ｃ← ０１ １ １ １
１ １ １ １ １ １
．１＝ −閃 コ − 関 飄
ψ 恥 ０ −一 −−００−−
菖 −−− ０＜＜ −ω ＜（５−＜：ｌ：Ｌ（５＝
＞ 顎 （１）＞ ニ − ＝
−−恥ω −−・−−Ｃ／） （Ｌ）
−閃 島 −一 〇 ＜ 工 ０＜、−２
０＞ ← くＱ ：１−−Ｏψ −−−Ｃ
） ψψ −閃 ；Ｃ）＞ 閃 閃
〇 −地＜Ｃ５＞Ｅ−１−一＞＞ ω −〇め
Ｑ −ｍ Ｑ Ｑ、 −−−ｋ
：Ｉ コ・−−■ ψ の ０ ０
〜 ＝ 〇 −国 へ 〉＜＜ Σ
Σ 〉 Ｅ−１−０υ −ψ −−−
０＞ −（社） 飄−ａ）＞＋！：＞ロー
−閃 −−一 ω −Ｅ＋ｌ ← φ
−０〉 く ｃｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ −〇 − ｔＡ＞ コ −−ロ、
−φコニ −■ 拳−−１（Ｌ） ＞
閃 ｒＡ 閃 ＸＥ−４Ｌ
−国 ０ ４ ← （く し ０１ １
’ Ｉ Ｉ Ｉ Ｉ Ｉ Ｉ
） ｌ ｌＱ ！ （Ｌ）
ｔＡ ＞ Ｃｈ ｅ
−＞ Ｑ ＞−二−飄−Ｏ−一〜−の− １：ＬＩ Ｅ−４−ｔｕｏｇｏ＞ｏ＜。
０５Ｍ）中での反応最適温度が３５〜５０Ｃ １）、４５Ｃのトリス−塩酸緩衝ｆＬ（０，０５Ｍ）中
で測定して最適ｐＨが８．５〜９．５ ｃ、４Ｃの緩衝液中でｐｌ（５，０〜１０．５）範囲で
安定 ｄ、 ｐｌ（ａ、ｏのトリス−塩酸緩衝液（０，０５
Ｍ）中で２５Ｃまで安定 ｅ、ＳＤＳポリアクリルアミド亀気泳動による測定で分
子量が５５，０００±２，０００ダルトンｆ、ゲルｐ過
による測定で分子量が７０，０００±２，０００ダルト
ン ｇ１等電点がｐ Ｈ５，０±０．２ ｈ、 Ｎ末端アミノ酸配列が下記に示す配列Ｍｅｔ−
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｖａ １−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉ １ｅ
−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
− １，ｂ−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素活性が１ ｍ
ｇ当り１〜ｔ０．ｏｏｏ単位 さらに、本発明の目的は、次式で表わされるアミノ酸配
列 Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ −＝ ｅ ＞ （資）
（資） 六 φ −＝ ロ ψω −−
ｍ−−・−〜 −ｋ−４＞ ―−ｃｂｏ＜＜ｏ
工 〉 Ｃ← ０１ １ １ １
１ １ １ １ １ １
．１＝ −閃 コ − 関 飄
ψ 恥 ０ −一 −−００−−
菖 −−− ０＜＜ −ω ＜（５−＜：ｌ：Ｌ（５＝
＞ 顎 （１）＞ ニ − ＝
−−恥ω −−・−−Ｃ／） （Ｌ）
−閃 島 −一 〇 ＜ 工 ０＜、−２
０＞ ← くＱ ：１−−Ｏψ −−−Ｃ
） ψψ −閃 ；Ｃ）＞ 閃 閃
〇 −地＜Ｃ５＞Ｅ−１−一＞＞ ω −〇め
Ｑ −ｍ Ｑ Ｑ、 −−−ｋ
：Ｉ コ・−−■ ψ の ０ ０
〜 ＝ 〇 −国 へ 〉＜＜ Σ
Σ 〉 Ｅ−１−０υ −ψ −−−
０＞ −（社） 飄−ａ）＞＋！：＞ロー
−閃 −−一 ω −Ｅ＋ｌ ← φ
−０〉 く ｃｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌｌ −〇 − ｔＡ＞ コ −−ロ、
−φコニ −■ 拳−−１（Ｌ） ＞
閃 ｒＡ 閃 ＸＥ−４Ｌ
−国 ０ ４ ← （く し ０１ １
’ Ｉ Ｉ Ｉ Ｉ Ｉ Ｉ
） ｌ ｌＱ ！ （Ｌ）
ｔＡ ＞ Ｃｈ ｅ
−＞ Ｑ ＞−二−飄−Ｏ−一〜−の− １：ＬＩ Ｅ−４−ｔｕｏｇｏ＞ｏ＜。
１１１１１１１１１ｔＩ
Ｑ、Ｏ−−コ＞ＱＪ ：ｌ ＞＞ＣＤ
ψ −〜 〜 −−ｍ−＋＋４ −一＜−〉〉
Φ ａ−ｏｏｏ −・−−閃 −−ｍ−
−ニ ー ０ ０ − へ ＝ −−六＜ ＜ に
−く ← 工 −−−の −閃 −’ｌ
Ｃ／） −Ｃ： Ｑ） −一（Ｌｌ ＞
０．１ 、、ｅ （Ｌ）−ψ＝−二一一 の −
−高 −閃 に −−−＜＞、−５） ト ＜＞
如 のＮ末端にメチオニンが結合したポリペプチド。
Φ ａ−ｏｏｏ −・−−閃 −−ｍ−
−ニ ー ０ ０ − へ ＝ −−六＜ ＜ に
−く ← 工 −−−の −閃 −’ｌ
Ｃ／） −Ｃ： Ｑ） −一（Ｌｌ ＞
０．１ 、、ｅ （Ｌ）−ψ＝−二一一 の −
−高 −閃 に −−−＜＞、−５） ト ＜＞
如 のＮ末端にメチオニンが結合したポリペプチド。
および上記アミノ酸配列のアミン末端に、シグナルペプ
チドの部分もしくは全部が結合し友中間体も包含する。
チドの部分もしくは全部が結合し友中間体も包含する。
自然の変異により、または人工の変異により、ポリペプ
チドの主友る活性に変化を与えることなく、ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの構造の一部を変化させることが
可能である。本発明のポリペプチドは、前記アミノ酸配
列を有するポリペプチドの相同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇ
ｏｕｓｖａｒｉａｎｔ ）に相当する構造を有するポリ
ペプチドも包含する。
チドの主友る活性に変化を与えることなく、ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの構造の一部を変化させることが
可能である。本発明のポリペプチドは、前記アミノ酸配
列を有するポリペプチドの相同変異体（Ｈｏｍｏｌｏｇ
ｏｕｓｖａｒｉａｎｔ ）に相当する構造を有するポリ
ペプチドも包含する。
さらに、本発明によれば、上記アミノ酸配列全有するＨ
ＣＡＤをコードするＤＮＡが提供される。
ＣＡＤをコードするＤＮＡが提供される。
ま念、次式で表わされる塩基配列
ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＣＧ ＴＴＣＧＣＴ ＧＴＣＣＴＣ
ＣＣＣＧＡＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴ ＣＡＴ ＧＡ
ＣＣＴＧ ＧＡＧ ＣＴＴＣＣＣＡＣＧ ＣＣＡ
ＡＧＣＣＣＴ ＧＡＡ ＧＧＣＣＧＧ ＣＡＧＧ
ＴＣＡＴＣＣＴＧ ＡＡＡ ＧＴＣＧＴＧ ＣＧ
Ｇ ＧＣＣＧＧＣＧＴＡ ＴＧＣＣＡＣＡＣＣＧＡＴ
ＡＣＧ ＣＡＣＣＴＧ ＡＧＧＧＡＡ ＧＧＣＧＧ
Ｔ ＴＡＣＧＡＣＧＧＧ ＣＡＣＴＴＧ ＡＧＣ
ＡＴＧＡＴＴ ＣＡＧ ＴＡＣＣＣＧ ＡＴＧＧ
ＡＧ ＧＴＡ ＧＴＣＧＧＣＧＴＣＧＧＣＧＧＧ
ＧＡＣＧＴＧ ＡＣＣＧＧＣＧＡＴ ＧＴＧ
ＣＧＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＡ ＣＧＣＧＡＡ ＧＧＧ ＣＡＣＧＡＣＣＣＣＧＡＴ
ＧＡＡ ＡＡＧ ＴＡＣＣＴＣＧＧＣＡＧＴ
ＣＧＣ ＡＡＧ ＧＡＣＣＧＧ ＧＧＣ ＧＴＣＣＴＣＧＧＴ ＣＡＣ ＧＴＣＧＡＧ ＡＡＡ ＧＴＣ ＴＣＣＧＴＣＣＧＧ ＧＡＡ ＡＴＣＴＡＣＣＣＣＴＧＧ ＴＧＣＣＧＧ ＣＡＧ ＴＧＣ ＡＡＣＣＧＴ ＴＧＴ ＧＣＣ” ＧＧＴ ＧＴＧ ＧＣＣＣＧＣ ＴＡＣＡＴＣＣＴＴ ＧＴＴ ＣＴＡ ＧＴＧ ＧＡＣＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＴＣＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＴＧＣＣＡＣＡＧＣＧ
ＣＣＧＴＧ ＣＴＣＧＡＡ ＣＣＧ ＧＡＣ ＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧＧＡ ＧＣＣＡＴＣＧＣＧ ＡＴＣ ＣＡＣＣＧＣＡＡＣＡＴＴ ＧＣＣＧＡＡ ＣＧＣＡＡＣ ＧＡＣＡＴＧ ＧＧＣＧＣＣ ＣＣＧ ＡＧＣＴＧＧ ＧＣＴ ＧＣＣＴＣＡ
ＧＧＴ ＣＴＣＡＣＡ ＧＣＣＧＡＣＡＡＧ
ＧＴＡ ＣＴＣＣＣＣＧＡＧ ＣＣＧ ＧＴＧ
ＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＴＴ ＧＧＣＣＴＡ ＡＣ
ＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧ ＧＧＣ ＴＧＣＧＣＧ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＴＣＣＴＣＡ
ＣＡ ＣＴＧ ＧＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＣＡｃｅ
ＧＴＣＣＴＣ Ｕ＜Ｕ ○ ト ぐ ＜１ 自然■渦により、１ｆ？：、は人工的変異によシ、主た
る活性に変化を与えることなく、ＤＮＡの構造およびそ
れから演憚されるポリペプチドの構造の一部を変異せし
めることが可能である。したがって１本発明のＤＮＡは
、前述のすべてのポリペプチドの相同変異体に相当する
構造を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有
することも可能である。
ＣＣＣＧＡＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴ ＣＡＴ ＧＡ
ＣＣＴＧ ＧＡＧ ＣＴＴＣＣＣＡＣＧ ＣＣＡ
ＡＧＣＣＣＴ ＧＡＡ ＧＧＣＣＧＧ ＣＡＧＧ
ＴＣＡＴＣＣＴＧ ＡＡＡ ＧＴＣＧＴＧ ＣＧ
Ｇ ＧＣＣＧＧＣＧＴＡ ＴＧＣＣＡＣＡＣＣＧＡＴ
ＡＣＧ ＣＡＣＣＴＧ ＡＧＧＧＡＡ ＧＧＣＧＧ
Ｔ ＴＡＣＧＡＣＧＧＧ ＣＡＣＴＴＧ ＡＧＣ
ＡＴＧＡＴＴ ＣＡＧ ＴＡＣＣＣＧ ＡＴＧＧ
ＡＧ ＧＴＡ ＧＴＣＧＧＣＧＴＣＧＧＣＧＧＧ
ＧＡＣＧＴＧ ＡＣＣＧＧＣＧＡＴ ＧＴＧ
ＣＧＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＡ ＣＧＣＧＡＡ ＧＧＧ ＣＡＣＧＡＣＣＣＣＧＡＴ
ＧＡＡ ＡＡＧ ＴＡＣＣＴＣＧＧＣＡＧＴ
ＣＧＣ ＡＡＧ ＧＡＣＣＧＧ ＧＧＣ ＧＴＣＣＴＣＧＧＴ ＣＡＣ ＧＴＣＧＡＧ ＡＡＡ ＧＴＣ ＴＣＣＧＴＣＣＧＧ ＧＡＡ ＡＴＣＴＡＣＣＣＣＴＧＧ ＴＧＣＣＧＧ ＣＡＧ ＴＧＣ ＡＡＣＣＧＴ ＴＧＴ ＧＣＣ” ＧＧＴ ＧＴＧ ＧＣＣＣＧＣ ＴＡＣＡＴＣＣＴＴ ＧＴＴ ＣＴＡ ＧＴＧ ＧＡＣＡＴＣ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＴＣＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＧ ＧＣＡ ＴＧＣＣＡＣＡＧＣＧ
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ＧＧＴ ＣＴＣＡＣＡ ＧＣＣＧＡＣＡＡＧ
ＧＴＡ ＣＴＣＣＣＣＧＡＧ ＣＣＧ ＧＴＧ
ＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＴＴ ＧＧＣＣＴＡ ＡＣ
ＧＣＴＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧ ＧＧＣ ＴＧＣＧＣＧ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＴＣＣＴＣＡ
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ＧＴＣＣＴＣ Ｕ＜Ｕ ○ ト ぐ ＜１ 自然■渦により、１ｆ？：、は人工的変異によシ、主た
る活性に変化を与えることなく、ＤＮＡの構造およびそ
れから演憚されるポリペプチドの構造の一部を変異せし
めることが可能である。したがって１本発明のＤＮＡは
、前述のすべてのポリペプチドの相同変異体に相当する
構造を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有
することも可能である。
遺伝暗号の縮重にしたがい、遺伝子から生産されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、その遺伝子
の塩基配列の少なくとも一つの塩基を他の種類の塩基に
置換することができる。したがって１本発明のＤＮＡは
まｆｃ、遺伝暗号ハフ重に基づく置換によって変化され
た塩基配列有することも可能である。この場合、上記置
換により得られた塩基配列から演理すれるアミノ酸配列
は前て定義し之式（Ｉ）のアミノは配列と一致する。
ペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、その遺伝子
の塩基配列の少なくとも一つの塩基を他の種類の塩基に
置換することができる。したがって１本発明のＤＮＡは
まｆｃ、遺伝暗号ハフ重に基づく置換によって変化され
た塩基配列有することも可能である。この場合、上記置
換により得られた塩基配列から演理すれるアミノ酸配列
は前て定義し之式（Ｉ）のアミノは配列と一致する。
ざらにｔた１本発明によれば、前記ＤＮＡと複製可能な
発現ベクターとからなる複製可能な組換ＤＮＡが提供さ
れる。該組換ＤＮＡは、それによって形質転換された微
生物または細胞中で、ポリペプチドを発現することがで
きる。
発現ベクターとからなる複製可能な組換ＤＮＡが提供さ
れる。該組換ＤＮＡは、それによって形質転換された微
生物または細胞中で、ポリペプチドを発現することがで
きる。
さらに１本発明によれば、アースロバフタ−属に属する
微生物を用いる）ＩＣＡＤの製造方法が提供される。
微生物を用いる）ＩＣＡＤの製造方法が提供される。
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明に用いた材料は１次のようにして入手できる。
［１１ＨＣＡＤのＮ末端ＤＮＡプローブ精製された酵素
（ＨＣＡＤ＞のＮ末端アミノ酸配列にもとづいて設計さ
れ之イノシンを含むプローブであシ、配列は以下のとお
りである。
（ＨＣＡＤ＞のＮ末端アミノ酸配列にもとづいて設計さ
れ之イノシンを含むプローブであシ、配列は以下のとお
りである。
プローブの合成はアプライド・バイオシステムズ（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ）社製の３８０Ａ
型ＤＮＡ合成機で行い、メーカーマニュアルにしたがっ
て得られたプローブＤＮＡを精製し、実験書〔マニアテ
イスら（ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、、 ｅｔ、ａｔ、
）、モレキュラークローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ） 。
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ）社製の３８０Ａ
型ＤＮＡ合成機で行い、メーカーマニュアルにしたがっ
て得られたプローブＤＮＡを精製し、実験書〔マニアテ
イスら（ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、、 ｅｔ、ａｔ、
）、モレキュラークローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ） 。
１２２頁、１９８２年〕だしたがって、Ｔ、ＤＮＡキナ
ーゼおよび〔ｒ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いてラベル化して
用いる。
ーゼおよび〔ｒ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いてラベル化して
用いる。
（２）大腸菌での遺伝子発現に用いたｔａＣプロモータ
ーを持ったプラスミドＰＫＫ２２３−３は、ファルマシ
ア・ジャパン株式会社よシ購入する（カタログ番号２７
−４９５５−０１）。
ーを持ったプラスミドＰＫＫ２２３−３は、ファルマシ
ア・ジャパン株式会社よシ購入する（カタログ番号２７
−４９５５−０１）。
（３）ポリペプチド発現用に用いる大腸菌ＪＭ−１０５
は、ファルマシア・ジャパン株式会社よシ購入する（カ
タログ番号２７−１ｓ ｓ ｏ−ｏ １ ）。
は、ファルマシア・ジャパン株式会社よシ購入する（カ
タログ番号２７−１ｓ ｓ ｏ−ｏ １ ）。
（４）その他の試薬類、酵素類は、全て市販のものを使
用する。
用する。
本発明において用いられる微生物は、アースロバクター
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属に属する微生物であ
シ、このようなものとしては、たとえば、アースロバフ
タ−オキシダンスＡＫ ６５−６ （Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ Ａ Ｋ ６５−６微工研菌寄
第９４３ｏ号）をあげることができる。
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属に属する微生物であ
シ、このようなものとしては、たとえば、アースロバフ
タ−オキシダンスＡＫ ６５−６ （Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ Ａ Ｋ ６５−６微工研菌寄
第９４３ｏ号）をあげることができる。
アースロバフタ−・オキシダンスＡＫ６５−６の菌学的
性状は次のとおシである。
性状は次のとおシである。
（ａ） 形態学的性状
■細胞の形および大きさ：短桿菌、 ０，６ Ｘ Ｏ，
８〜１μ■細胞の多形性の有無：多形性（分枝等）■運
動性の有無：なし ■胞子の有無：なし ■ダラム染色性：陽性 ■抗酸性：陰性 （ｂ） 培養性状 ■肉汁寒天平板培養：乳白色、クリーム状、生育良好■
肉汁寒天斜面培養二元白色、クリーム状、生育良好■肉
汁液体培養：白色＊ ０Ｄ６６Ｇ！＝、４％生育良好■
肉汁ゼラチン穿刺培養：液化 ■リドマス・ミルク：アルカリ性、０（ヒ（Ｃ） 生
理学的性質 ■硝酸塩の還元：陰性 ■脱窒反応：陰性 ■ＭＲテスト：陰性 ■ｖｐテスト：陰性 （５）インドールの生成：陰性 ：６）硫化水素の生成：陽性 ■デンプンの加水分解二陽性 ■クエン酸の利用：陽性 ■無機窒素源の利用：陽性 ［相］色素の生成：生成しない ■ウレアーゼ：陰性 ［株］カタラーゼ：陽性 Ｏ生育の温度およびｐＨ＝２０〜３ｏｃ、ｐＨ６，５〜
８．０ｏｒ：ＩＲ素に対する態度：好気性 ◎Ｏ−Ｆテスト：陰性 Ｏ糖類から酸およびガスの生成の有無：（１） Ｌ−ア
ラビノース − （２）Ｄ−キシロース − （３）Ｄ−グルコース 士 （４）Ｄ−マンノース 士 （５）Ｄ−フラクトース 士 （６）Ｄ−ガラクトース − （７）麦芽糖 − （８）ショ循 士（９）乳 塘
− ｕＯ）トレハロース − （１１）Ｄ−ンルビノト 士 αＺＤ−マンニット ± （１３１イノジツト − α褐グリセリン − ＋１５１デンプン − 本菌は土壌より分離され、化学分類、生理試候ニヨリア
ースロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏ−ｂａｃ
ｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ）と同定されたものである。
８〜１μ■細胞の多形性の有無：多形性（分枝等）■運
動性の有無：なし ■胞子の有無：なし ■ダラム染色性：陽性 ■抗酸性：陰性 （ｂ） 培養性状 ■肉汁寒天平板培養：乳白色、クリーム状、生育良好■
肉汁寒天斜面培養二元白色、クリーム状、生育良好■肉
汁液体培養：白色＊ ０Ｄ６６Ｇ！＝、４％生育良好■
肉汁ゼラチン穿刺培養：液化 ■リドマス・ミルク：アルカリ性、０（ヒ（Ｃ） 生
理学的性質 ■硝酸塩の還元：陰性 ■脱窒反応：陰性 ■ＭＲテスト：陰性 ■ｖｐテスト：陰性 （５）インドールの生成：陰性 ：６）硫化水素の生成：陽性 ■デンプンの加水分解二陽性 ■クエン酸の利用：陽性 ■無機窒素源の利用：陽性 ［相］色素の生成：生成しない ■ウレアーゼ：陰性 ［株］カタラーゼ：陽性 Ｏ生育の温度およびｐＨ＝２０〜３ｏｃ、ｐＨ６，５〜
８．０ｏｒ：ＩＲ素に対する態度：好気性 ◎Ｏ−Ｆテスト：陰性 Ｏ糖類から酸およびガスの生成の有無：（１） Ｌ−ア
ラビノース − （２）Ｄ−キシロース − （３）Ｄ−グルコース 士 （４）Ｄ−マンノース 士 （５）Ｄ−フラクトース 士 （６）Ｄ−ガラクトース − （７）麦芽糖 − （８）ショ循 士（９）乳 塘
− ｕＯ）トレハロース − （１１）Ｄ−ンルビノト 士 αＺＤ−マンニット ± （１３１イノジツト − α褐グリセリン − ＋１５１デンプン − 本菌は土壌より分離され、化学分類、生理試候ニヨリア
ースロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏ−ｂａｃ
ｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ）と同定されたものである。
すなわち、細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸配列につ
いては、内円吹成ら〔微生物の１ヒ学分類実議法。
いては、内円吹成ら〔微生物の１ヒ学分類実議法。
学会出版センター（１９８２））、用本勲ら〔放線菌の
同定実験法１日本放線菌研究会編（１９８５）〕の方法
にしたがって、菌体脂肪酸組成およびインプレノイドキ
ノンについては、鈴木漣一部ら〔放線菌の同定実験法１
日本放線菌研究会編（１９８５）］の方法にし友がって
分析し、生理試験については。
同定実験法１日本放線菌研究会編（１９８５）〕の方法
にしたがって、菌体脂肪酸組成およびインプレノイドキ
ノンについては、鈴木漣一部ら〔放線菌の同定実験法１
日本放線菌研究会編（１９８５）］の方法にし友がって
分析し、生理試験については。
駒形和男ら〔微生物の分類と同定（１９８５）］。
シャーリングら（Ｅ、Ｂ、Ｓｈｉｒｌｉｎｇ、 Ｉｎｔ
、Ｊ、５ｙｓｔ。
、Ｊ、５ｙｓｔ。
ＢａＣ１ｅｒｌＯ１，，１６，５１３−３４０（１９６
６）］、 スタックブランドら（Ｅ、５ｔａｃｋｅｂｒ
ａｎｄｔ、 ５ｙｓｔ、Ａｐｐｌ。
６）］、 スタックブランドら（Ｅ、５ｔａｃｋｅｂｒ
ａｎｄｔ、 ５ｙｓｔ、Ａｐｐｌ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、 ４．４７０−４８６（１，９
８３）］の方法にし友がって行った。
８３）］の方法にし友がって行った。
これらの結果を既存菌株の試験結果および文献記載［Ｋ
、Ｈ，５ｃｈｌｅｉｆｅｒ、 Ｏ，Ｋａｎｄｌｅｒ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
、Ｈ，５ｃｈｌｅｉｆｅｒ、 Ｏ，Ｋａｎｄｌｅｒ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
Ｒｅｖ、、 ３４，４０７（１９７２）、 Ｋ、５ｕｚ
ｕｋｉ。
ｕｋｉ。
Ｋ、Ｋｏｍａｇａｔａ、 Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、、 ３３ 、１８８（１９８３）、
Ｙ、Ｙａｍａｄａ、 Ｇ、Ｉｎｏｕｅ、 Ｙ、Ｔａｈａ
ｒａ。
ｃｔｅｒｉｏｌ、、 ３３ 、１８８（１９８３）、
Ｙ、Ｙａｍａｄａ、 Ｇ、Ｉｎｏｕｅ、 Ｙ、Ｔａｈａ
ｒａ。
Ｈ，０ｙａｉｚｕ、 Ｋ、Ｋｏｍａｇａｔａ、 Ｊ、Ｇ
ｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。
ｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。
２２，２０３−２１４（１９７６）、 Ｍ、Ｄ、Ｃｏ１
１ｉｎｓ、 Ｊ、Ａｐｐｌ。
１ｉｎｓ、 Ｊ、Ａｐｐｌ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、５２，４５７−４６０（１９８
２）］と照合した結果、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏ
ｘｙｄａｎｓであると同定され、 Ａｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ＡＫ６５−６と命名され念（
表１ないし表４）。
２）］と照合した結果、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏ
ｘｙｄａｎｓであると同定され、 Ａｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ＡＫ６５−６と命名され念（
表１ないし表４）。
表２ 生理試験
×１普通寒天培地、 ×２硝酸、こはく酸培地、 ｒ：
赤色衣 ５ 有機化合物の資化性試験 （注）ｗ：弱い生育 表４ 糖から酸の生成 次に、該微生物を用いてＨＣＡＤを製造する方法を説明
する。
赤色衣 ５ 有機化合物の資化性試験 （注）ｗ：弱い生育 表４ 糖から酸の生成 次に、該微生物を用いてＨＣＡＤを製造する方法を説明
する。
アースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属て
属する微生物の培養は２０〜４０Ｃ１好ましくは２４〜
５３Ｃの範囲で行われる。培養液の初発のｐＨは６．５
〜８．５．好ましくは６．８〜７．５である。培養ｉＫ
は、炭素源としてシクロヘキサノール、シクロヘキサノ
ンあるいはその７昆合物、窒素源としてアンモニウム塩
、硝酸塩１例えば、硫安、塩酸アンモニウム、硝酸ア／
モニウム、燐酸アンモニウム、硝酸カリ、硝酸ナトリウ
ムなどの無機塩、および／またはポリペプトン、カザミ
ノ酸、酵母エキス、コーンスチープリカー肉エキスなど
の有ｆ億栄養源を加える。無機イオンとしては、ナトリ
ウム、カリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜ｉ１
Ｍ、コバルト、カルシウム、燐（’７１．．クロル、硫
酸などを加える。これらの栄養源は、すべてま友は一部
を組み合わせて用いる。
属する微生物の培養は２０〜４０Ｃ１好ましくは２４〜
５３Ｃの範囲で行われる。培養液の初発のｐＨは６．５
〜８．５．好ましくは６．８〜７．５である。培養ｉＫ
は、炭素源としてシクロヘキサノール、シクロヘキサノ
ンあるいはその７昆合物、窒素源としてアンモニウム塩
、硝酸塩１例えば、硫安、塩酸アンモニウム、硝酸ア／
モニウム、燐酸アンモニウム、硝酸カリ、硝酸ナトリウ
ムなどの無機塩、および／またはポリペプトン、カザミ
ノ酸、酵母エキス、コーンスチープリカー肉エキスなど
の有ｆ億栄養源を加える。無機イオンとしては、ナトリ
ウム、カリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜ｉ１
Ｍ、コバルト、カルシウム、燐（’７１．．クロル、硫
酸などを加える。これらの栄養源は、すべてま友は一部
を組み合わせて用いる。
培養終了後、遠心分離、濾過などによって菌体を集め、
ｐＨを調製した緩衝液等に懸−謁した後。
ｐＨを調製した緩衝液等に懸−謁した後。
ホモゲナイズしＨＣＡＤを含む遠心上清液を得る。
この遠心上清液を粗酵素液とし、これより酵素の一般的
分離精製法、すなわち、硫安塩祈法、除核酸法、イオン
交換樹脂、逆相分配、アフィニティー、ゲル濾過等のク
ロマトグラフィー、電気泳動。
分離精製法、すなわち、硫安塩祈法、除核酸法、イオン
交換樹脂、逆相分配、アフィニティー、ゲル濾過等のク
ロマトグラフィー、電気泳動。
限外ｐ過膜等を用いｆｃａ縮法等を組み合わせることに
よって、１（ＣＡＤを精製することができる。
よって、１（ＣＡＤを精製することができる。
次に、上記で得られるＨＣＡ’Ｄの性質について述べる
。
。
（ａ） 作用
ＨＣＡＤが補酵素の存在下で６−ヒドロキシカプロン酸
に作用した場合、６−オクソカプロン酸が生成する。す
なわち、下記のよ、うな反応を触媒する。
に作用した場合、６−オクソカプロン酸が生成する。す
なわち、下記のよ、うな反応を触媒する。
翰 最適ｐＨおよびｐＨ安定性
種々のｐＨの緩衝液を用いて測定したＨＣＡＤの作用ｐ
Ｈ範囲はｐ Ｈ６，５〜１０．５．最適ｐＨは８．５〜
９．５である。ＨＣＡＤを４Ｃにおいて、それぞれのｐ
Ｈで２４時間処理し九場合 ｐ Ｈ５，０〜１０．５．
好ましくはＩ） Ｈ５，５〜９．５ ｔＤ範囲テ安定で
ある。
Ｈ範囲はｐ Ｈ６，５〜１０．５．最適ｐＨは８．５〜
９．５である。ＨＣＡＤを４Ｃにおいて、それぞれのｐ
Ｈで２４時間処理し九場合 ｐ Ｈ５，０〜１０．５．
好ましくはＩ） Ｈ５，５〜９．５ ｔＤ範囲テ安定で
ある。
（Ｃ） 最適温度および温度安定性
様々の温度で測定したＨＣＡＤの作用温度は５〜６０Ｃ
，最適温度は３５〜５０Ｃである。ＨＣＡＤをｐ Ｈ８
，０の緩衝液中において、それぞれの温度で２０分間処
理した場合、２５Ｃまで安定である。
，最適温度は３５〜５０Ｃである。ＨＣＡＤをｐ Ｈ８
，０の緩衝液中において、それぞれの温度で２０分間処
理した場合、２５Ｃまで安定である。
（ｄ） 分子量
高速液体クロマトグラフィー（５ｈｏｄｅｘ ８０３Ｆ
）を用いたゲル濾過法によシ求めたＨＣＡＤの分子量は
７０，０００±２，０００である。ドデンルＩＡ敵ナ
トリウムを含む電気泳動によ）求めｆ？−ＨＣＡＤの分
子量は３５，０００±２，０００である。
）を用いたゲル濾過法によシ求めたＨＣＡＤの分子量は
７０，０００±２，０００である。ドデンルＩＡ敵ナ
トリウムを含む電気泳動によ）求めｆ？−ＨＣＡＤの分
子量は３５，０００±２，０００である。
（ｅ） 等電点
等１点電気泳動法によシ求められたＨＣＡＤの等電点は
ｐ Ｈ５，０±０．２である。
ｐ Ｈ５，０±０．２である。
（ｆ） Ｎ末端アミノ酸配列
エドマン分解法により求められ７ｊＨＣＡＤのＮ末端ア
ミノ酸配列は、下記のとおりである。
ミノ酸配列は、下記のとおりである。
Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−ＶａＩ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉ
１ｅ−）（ｉ ５−Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ − （ω 酵素活性測定法 ＨＣＡＤの酵素活性の測定は、ＮＡＤ存在下で６−ヒド
ロキシカプロン酸を基質として生成するＮＡＤＨＯ量を
３４０ ｎｍの吸光度の増加を追跡することによって測
定される。すなわち、１５ｍＭ６−ヒドロキシカプロン
歌５０μｊ、−Ｌ６ｍＭＮＡＤ Ｓ ＯｐＬ、５０ ｍ
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５） ２３５μｔお
よび適当に希釈した酵素液５μｔをよく混合し、３０Ｃ
で反応させ、ＮＡＤＨＶＣ基づ（３４０ｎｍの吸収の増
加を測定した。ＨＣＡＤの活性単位は、３０Ｃで１分間
当りに生成するＮＡＤＨのマイクロモル数を１単位とし
た。このようにして測定し、’ＣＨＣＡＤの酵素活性は
１１ｎｇ当り１〜１０，０００ｕ’″′Ｃある。
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉ
１ｅ−）（ｉ ５−Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ − （ω 酵素活性測定法 ＨＣＡＤの酵素活性の測定は、ＮＡＤ存在下で６−ヒド
ロキシカプロン酸を基質として生成するＮＡＤＨＯ量を
３４０ ｎｍの吸光度の増加を追跡することによって測
定される。すなわち、１５ｍＭ６−ヒドロキシカプロン
歌５０μｊ、−Ｌ６ｍＭＮＡＤ Ｓ ＯｐＬ、５０ ｍ
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５） ２３５μｔお
よび適当に希釈した酵素液５μｔをよく混合し、３０Ｃ
で反応させ、ＮＡＤＨＶＣ基づ（３４０ｎｍの吸収の増
加を測定した。ＨＣＡＤの活性単位は、３０Ｃで１分間
当りに生成するＮＡＤＨのマイクロモル数を１単位とし
た。このようにして測定し、’ＣＨＣＡＤの酵素活性は
１１ｎｇ当り１〜１０，０００ｕ’″′Ｃある。
次に、ＨＣＡＤ遺伝子のクローニングおよヒ発現方法に
ついて説明する。
ついて説明する。
（１１アース０バクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
）属に属する微生物から常法にしたがって（Ｓ Ｄ Ｓ
、 １ ｙｓｏｚｙｍｅ。
）属に属する微生物から常法にしたがって（Ｓ Ｄ Ｓ
、 １ ｙｓｏｚｙｍｅ。
ＲＮａｓｅ Ａ 、 ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋを使用）、全
ＤＮＡを調製する。
ＤＮＡを調製する。
（２）すでに決定しているＨＣＡＤのＮ末端アミノ酸配
列から合成プローブを設計し、該プローブをＤＮＡ合成
機を用いて合成する。
列から合成プローブを設計し、該プローブをＤＮＡ合成
機を用いて合成する。
（３）上記（１１で得られる全ＤＮＡを各制限酵素で切
断し、５ｏｕｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法にし九がって、
上記（２）で得られる合成プローブに７１イプリダイズ
したところ、各レーンに単一バンドが検出されることを
確認する。
断し、５ｏｕｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法にし九がって、
上記（２）で得られる合成プローブに７１イプリダイズ
したところ、各レーンに単一バンドが検出されることを
確認する。
（４）上記（１１で得られるＤＮＡをＰｓｔＩで切断し
。
。
ｐＵＣ１８ベクターに組み込み、該組換ＤＮＡによって
形質転換された大腸菌（Ｅ、ｃＯｌｉ ）につめて。
形質転換された大腸菌（Ｅ、ｃＯｌｉ ）につめて。
上記プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション
を行う。
を行う。
（５）上記で得られたクローンの断片上でＨＣＡＤがコ
ードされていると思われる領域の塩基配列を解析し、そ
の塩基配列がち決定されるアミノ酸配列が、先に決め７
’ＣＮ末端ア末端アミノ酸一致することを確認する。
ードされていると思われる領域の塩基配列を解析し、そ
の塩基配列がち決定されるアミノ酸配列が、先に決め７
’ＣＮ末端ア末端アミノ酸一致することを確認する。
（６）次に、ＨＣＡＤをコードするＤＮＡを発現ベクタ
ーに組み込み、該組換ＤＮＡを宿主中で発現させ、ＨＣ
ＡＤの酵素活性を確認する。
ーに組み込み、該組換ＤＮＡを宿主中で発現させ、ＨＣ
ＡＤの酵素活性を確認する。
（実施例）
以下に実施例をめげて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
アースロバフタ−オキシダンスＡＫ６５−６（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ＡＫ６５−６微工
研菌寄第９４３０号）を表゛Ｓに示した組成の培養液２
ｔを含む３を容量のジャーファーメンタ−に植菌し。
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ＡＫ６５−６微工
研菌寄第９４３０号）を表゛Ｓに示した組成の培養液２
ｔを含む３を容量のジャーファーメンタ−に植菌し。
３０Ｃ，２４時間、６００ｒｐｍで攪拌培養した。
表 ５
バクトドリプトン １０？
イーストエキス ５７
食 塩 ５ｔシクロヘキ
サノール ０．５２水
１ を培養中のｐＨは、ＩＮの塩酸で７
．２にコントロールした。同時にシクロヘキサノールの
消費に合せて、シクロヘキサノールを添加した。全シク
ロヘキサノール添加量は８？であつ之。培養液から遠心
分離によって菌体を集め、約５０２の湿菌体を得た。５
２の菌体をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） １５ｍ
１Ｋ懸濁し１等容のガラスピーズと共にブラウンセルホ
モゲナイザーを用いて４．００ Ｏｒｐｍで１分間、菌
体を破砕した。破砕物を４Ｃで１０，０００１で３０分
間遠心分離し、上清を得、その上清に。
サノール ０．５２水
１ を培養中のｐＨは、ＩＮの塩酸で７
．２にコントロールした。同時にシクロヘキサノールの
消費に合せて、シクロヘキサノールを添加した。全シク
ロヘキサノール添加量は８？であつ之。培養液から遠心
分離によって菌体を集め、約５０２の湿菌体を得た。５
２の菌体をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） １５ｍ
１Ｋ懸濁し１等容のガラスピーズと共にブラウンセルホ
モゲナイザーを用いて４．００ Ｏｒｐｍで１分間、菌
体を破砕した。破砕物を４Ｃで１０，０００１で３０分
間遠心分離し、上清を得、その上清に。
終ｄ［２％になるようにストレプトマイシン硫酸を加え
、除核酸した後、５０ｍＭＩＪスー塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）に対して一昼夜透析し、粗酵素液とし几。粗酵素
液を七ントリコン（アミコン社製）を用いて濃縮した後
ｓｏｍＭト！ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，，０）を用
いて高速液体クロマドグシフイー （ＤＥＡＥ−５ＰＷ
： ２，２ ｔ−ｒｒＩＸ １５ ｃｒｎ東洋曹達社
製）にかけ、流速５ ｒｎｔ／ ｍｉｎで２８０ ｎｍ
の吸光度を追跡しながら、０〜０．５Ｍ食塩の直線的濃
度勾配によってＨＣＡＤを溶出した。活性画分を集め、
七ントリコン（アミコン社製）を用いて濃縮した後、さ
ラニ、高速液体クロマトグラフィー（５ｈｏｄｅｘ Ｐ
Ｈ８１４： ７．５１１＋１ Ｘ ７，５ ＣＩＩＭ、
昭和電工社製）にかけ比。
、除核酸した後、５０ｍＭＩＪスー塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）に対して一昼夜透析し、粗酵素液とし几。粗酵素
液を七ントリコン（アミコン社製）を用いて濃縮した後
ｓｏｍＭト！ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，，０）を用
いて高速液体クロマドグシフイー （ＤＥＡＥ−５ＰＷ
： ２，２ ｔ−ｒｒＩＸ １５ ｃｒｎ東洋曹達社
製）にかけ、流速５ ｒｎｔ／ ｍｉｎで２８０ ｎｍ
の吸光度を追跡しながら、０〜０．５Ｍ食塩の直線的濃
度勾配によってＨＣＡＤを溶出した。活性画分を集め、
七ントリコン（アミコン社製）を用いて濃縮した後、さ
ラニ、高速液体クロマトグラフィー（５ｈｏｄｅｘ Ｐ
Ｈ８１４： ７．５１１＋１ Ｘ ７，５ ＣＩＩＭ、
昭和電工社製）にかけ比。
５’ＯｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用いて
、１．８〜ＯＭの硫安の直線的濃度勾配によって溶出し
たところ、ＨＣＡＤの酵素活性は、硫安濃度約ＯＭの位
置に溶出された。この活性画分について、ドデシル硫酸
ナトリウムを含む電気泳動を行ったところ１分子量約５
５，０００の単一なバンドが認められた。また、この両
分を高速液体クロマトグラフィー（５ｈｏｄｅｘ ８０
３Ｆ ： ８；ｏｘ ３０ｚ、昭和電工社製）にかけた
ところ、ＨＣＡＤの活性画分は１分子量約７０，０００
の位置に溶出され、その酵素活性は１２５ ｕ ／ ＋
すであつｔｏこの精製された本発明の酵素のＮ末端アミ
ノ酸配列を、アミノ酸シークエンサー（アプライド バ
イオシステム社製）を用いて分析したところ、以下に示
すような配列であることが判明した。
、１．８〜ＯＭの硫安の直線的濃度勾配によって溶出し
たところ、ＨＣＡＤの酵素活性は、硫安濃度約ＯＭの位
置に溶出された。この活性画分について、ドデシル硫酸
ナトリウムを含む電気泳動を行ったところ１分子量約５
５，０００の単一なバンドが認められた。また、この両
分を高速液体クロマトグラフィー（５ｈｏｄｅｘ ８０
３Ｆ ： ８；ｏｘ ３０ｚ、昭和電工社製）にかけた
ところ、ＨＣＡＤの活性画分は１分子量約７０，０００
の位置に溶出され、その酵素活性は１２５ ｕ ／ ＋
すであつｔｏこの精製された本発明の酵素のＮ末端アミ
ノ酸配列を、アミノ酸シークエンサー（アプライド バ
イオシステム社製）を用いて分析したところ、以下に示
すような配列であることが判明した。
Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉ
Ｉ ｅ−）（ｉ ５−Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ 一 実施例２ アースロバフタ−オキシダンスＡＫ６５−６ （微工研
菌寄第９４３０号）を１００７のシクロヘキサノール５
０μ２を含む実施例１の表５に示した組成の培養液で、
６０Ｃで１８時間培養し、菌体を得た。菌体を洗浄後、
１６０ｍ９のリゾチーム、２ｍｔｙのプロテアーゼにお
よび１０％ｓＤ３溶液を用いて溶菌し、フェノール抽出
、フェノール・クロロホルム抽出、イノプロパツール抽
出を繰り返し。
ｅｕ−Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉ
Ｉ ｅ−）（ｉ ５−Ａｓｐ−Ｌｅｕ −Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ 一 実施例２ アースロバフタ−オキシダンスＡＫ６５−６ （微工研
菌寄第９４３０号）を１００７のシクロヘキサノール５
０μ２を含む実施例１の表５に示した組成の培養液で、
６０Ｃで１８時間培養し、菌体を得た。菌体を洗浄後、
１６０ｍ９のリゾチーム、２ｍｔｙのプロテアーゼにお
よび１０％ｓＤ３溶液を用いて溶菌し、フェノール抽出
、フェノール・クロロホルム抽出、イノプロパツール抽
出を繰り返し。
最後にエタノール沈澱を行い、全ＤＮＡを得た。
ＨＣＡＤの１〜１１番目のＮ末端アミノ酸配列（Ｍｅｔ
−ＨＩｓ−ＡＪａ−Ｐｈｅ−ＡＪａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ）に基づいて、イノ
シンを含む下記の配列の合成グローブをＤＮＡ合成材（
アプライド・バイオシステム社製）を用いて合成し、高
速液体クロマトグラフィーを用いて精製した。
−ＨＩｓ−ＡＪａ−Ｐｈｅ−ＡＪａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ）に基づいて、イノ
シンを含む下記の配列の合成グローブをＤＮＡ合成材（
アプライド・バイオシステム社製）を用いて合成し、高
速液体クロマトグラフィーを用いて精製した。
Ｔ Ｔ
ＡＴＧＣＡ ＧＣＩＴＴ ＧＣＩＧＴＩ ＴＩＣＣ
ＩＧＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣ （注）Ｉ：イノシン プローブはＴ、−カイネースおよび”−”［））ＡＴｐ
を用いて３２ｐでラベル以後の実験に用いた。
ＩＧＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣ （注）Ｉ：イノシン プローブはＴ、−カイネースおよび”−”［））ＡＴｐ
を用いて３２ｐでラベル以後の実験に用いた。
上記のようにして得られた全ＤＮＡを４種類の制限酵素
（Ｈｉｎｄｌｌｌ、 ＥｃｏＲＩ、 ＢａｍＨＩ、 Ｐ
ｓｔ Ｉ ）で切断し、上記のプローブを用いてハイプ
リダイゼイションヲ行ったところ、各レーンに単一のバ
ンドが検出された。全ＤＮＡをＰｓｔｌで切断し、１チ
アガロースゲル電気泳動を行ない、ゲルから３〜ｄ Ｋ
ｂ付近のＤＮＡを回収し、ｐＵＣ−１８のＰｓｔ■サイ
トに組み込み、大腸菌（ＭＢ６Ｓ）へ導入した。
（Ｈｉｎｄｌｌｌ、 ＥｃｏＲＩ、 ＢａｍＨＩ、 Ｐ
ｓｔ Ｉ ）で切断し、上記のプローブを用いてハイプ
リダイゼイションヲ行ったところ、各レーンに単一のバ
ンドが検出された。全ＤＮＡをＰｓｔｌで切断し、１チ
アガロースゲル電気泳動を行ない、ゲルから３〜ｄ Ｋ
ｂ付近のＤＮＡを回収し、ｐＵＣ−１８のＰｓｔ■サイ
トに組み込み、大腸菌（ＭＢ６Ｓ）へ導入した。
目的のＤＮＡ断片が組み込まれ友プラスミドを含む国体
を得るため、上記のプローブを用いてコロニーへイブリ
ダイゼイションを行ない、約８ｏｏ。
を得るため、上記のプローブを用いてコロニーへイブリ
ダイゼイションを行ない、約８ｏｏ。
個のコロニーから１５個の目的のクローンを得た。
このクローンを解析したところ、約３，２ ＫｂのＰｓ
ｔｉ断片を含み、そのうちのＨｉｎｄｌｌ［、５ｔｕ（
断片上がプローブとハイブリダイズする領域が含まれる
ことが判明した。Ｈｉ ｎｄｌｌＩからＢａｍＨＩまで
約１，５Ｋｂの断片についてサンガーらの方法［： Ｓ
ａｎｇｅｒ Ｆ、ｅｔ。
ｔｉ断片を含み、そのうちのＨｉｎｄｌｌ［、５ｔｕ（
断片上がプローブとハイブリダイズする領域が含まれる
ことが判明した。Ｈｉ ｎｄｌｌＩからＢａｍＨＩまで
約１，５Ｋｂの断片についてサンガーらの方法［： Ｓ
ａｎｇｅｒ Ｆ、ｅｔ。
ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
Ｓ Ａ ７４ 、５４６３（１９７７））ＫＬ、たがっ
てＤＮＡ塩基配列を決定した。このようにして得られ友
塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列と、実施例１で得
られたＨＣＡ［＞のＮ末端アミノ酸配列が完全疋一致し
たことにょシ、この塩基配列は、ＨＣＡＤをコードする
ＤＮＡであることを確認した。
Ｓ Ａ ７４ 、５４６３（１９７７））ＫＬ、たがっ
てＤＮＡ塩基配列を決定した。このようにして得られ友
塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列と、実施例１で得
られたＨＣＡ［＞のＮ末端アミノ酸配列が完全疋一致し
たことにょシ、この塩基配列は、ＨＣＡＤをコードする
ＤＮＡであることを確認した。
実施例３
大腸菌内でｔａｃをプロモーターとして、ＨＣＡＤをコ
ードするＤＮＡより、ＨＣＡＤのアミノ騒配列を有する
ポリペプチドを発現させることを目的に。
ードするＤＮＡより、ＨＣＡＤのアミノ騒配列を有する
ポリペプチドを発現させることを目的に。
プラスミドの構築を行なう。
第１図に示すように、プラスミド１）ＡＨＣＡＤ ２０
μ２を１０ユニツトのＨｌｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨＩ
で３７Ｃで２時間消化し、１．０％のＬｏｗ Ｍｅｌｔ
ｉｎｇ Ｐｏ１ｎｔのアガロース（ＢＲＬ社製）電気泳
動で約１．３に塩基対のｈ−ＰＣＩをコードするＢｉｎ
ｄ ［［−ＢａｍＨＩ断片を単離する。約４μｍの断片
がゲルから電気兆動溶出される。さらに、ＢｓｔＮ（で
部分消化し、１．２Ｋｂの塩基対を単離した（約２μ？
）。
μ２を１０ユニツトのＨｌｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨＩ
で３７Ｃで２時間消化し、１．０％のＬｏｗ Ｍｅｌｔ
ｉｎｇ Ｐｏ１ｎｔのアガロース（ＢＲＬ社製）電気泳
動で約１．３に塩基対のｈ−ＰＣＩをコードするＢｉｎ
ｄ ［［−ＢａｍＨＩ断片を単離する。約４μｍの断片
がゲルから電気兆動溶出される。さらに、ＢｓｔＮ（で
部分消化し、１．２Ｋｂの塩基対を単離した（約２μ？
）。
前述と同様の方法によって、第１図に示す２個のデオキ
シオリゴヌクレオチド、すなわち、５′−ＡＡＴＴＣＡ
ＴＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣ−３’と５’−
ＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＴＧ−３’とを
合成し、約１００ Ｐｍｏｌの各デオキシオリゴヌクレ
オチドの５′末端をＴ４キナーゼを用いてリン酸化する
。反応終了後１反応混合物をフェノールを用いて抽出し
、さらにクロロフォルムを用いて抽出した後、オリゴマ
ーを約１μｍの約２に塩基対のＳｍａＩ断片と合せる。
シオリゴヌクレオチド、すなわち、５′−ＡＡＴＴＣＡ
ＴＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣ−３’と５’−
ＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＴＧ−３’とを
合成し、約１００ Ｐｍｏｌの各デオキシオリゴヌクレ
オチドの５′末端をＴ４キナーゼを用いてリン酸化する
。反応終了後１反応混合物をフェノールを用いて抽出し
、さらにクロロフォルムを用いて抽出した後、オリゴマ
ーを約１μｍの約２に塩基対のＳｍａＩ断片と合せる。
通常によく行なわれている条件で、１０ユニツトのＴ、
Ｄ Ｎ Ａリガーゼで前記の断片を４Ｃで１夜反応さ
せ結合する。反応終了液をエタノール沈澱後、２０ユニ
ツトのＥＣＯＲＩで３７ｔ？、３時間消化し、１％のＬ
ｏｗ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏ１ｎｔのアガロース電気泳
動にかけ、約１に塩基対の対の断片を単離する。市販の
゛プラスミドＰＫＫ２２５−３１／ｊｒをＥｃｏＲｉ
、 Ｂａｍ）ＩＩで消化してフェノール抽出、′クロロ
フォルム抽出、エタノール沈澱をして調製したベクター
０．５μｔに、約ＩＫ塩基対のＨＣＡＤの構造遺伝子を
含む両端にＥｃｏＲＩサイトを持つ之断片をＴ４ Ｄ
Ｎ Ａ ＩＪガーゼを用いて結合する。実験書〔メソッ
ド・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） １０１巻、２０頁。
Ｄ Ｎ Ａリガーゼで前記の断片を４Ｃで１夜反応さ
せ結合する。反応終了液をエタノール沈澱後、２０ユニ
ツトのＥＣＯＲＩで３７ｔ？、３時間消化し、１％のＬ
ｏｗ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏ１ｎｔのアガロース電気泳
動にかけ、約１に塩基対の対の断片を単離する。市販の
゛プラスミドＰＫＫ２２５−３１／ｊｒをＥｃｏＲｉ
、 Ｂａｍ）ＩＩで消化してフェノール抽出、′クロロ
フォルム抽出、エタノール沈澱をして調製したベクター
０．５μｔに、約ＩＫ塩基対のＨＣＡＤの構造遺伝子を
含む両端にＥｃｏＲＩサイトを持つ之断片をＴ４ Ｄ
Ｎ Ａ ＩＪガーゼを用いて結合する。実験書〔メソッ
ド・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） １０１巻、２０頁。
アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
）刊〕にしたがって、大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換
し、５０μ２／−のアンピシリンを含む寒天培地で培養
して約３００個のコロニーを得る。これらの形質転換体
５０個からプラスミドＤＮＡを調製し、 ＥｃｏＲｊで
消化したところ、６個が目的の約１に塩基対のＥｃｏＲ
Ｉ断片を含んでいた。塩基配列の解析によシ。
）刊〕にしたがって、大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換
し、５０μ２／−のアンピシリンを含む寒天培地で培養
して約３００個のコロニーを得る。これらの形質転換体
５０個からプラスミドＤＮＡを調製し、 ＥｃｏＲｊで
消化したところ、６個が目的の約１に塩基対のＥｃｏＲ
Ｉ断片を含んでいた。塩基配列の解析によシ。
この６個のプラスミドは同一で、ｔａｃプロモーター、
合成りＮＡおよびｃＤＮＡの順に、所望のヌクレオチド
配列を有することが確認された。
合成りＮＡおよびｃＤＮＡの順に、所望のヌクレオチド
配列を有することが確認された。
上記で得られたプラスミドを含有する大腸菌株Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐＡＨＣＡＤを５０μＦ／
−のアンピシリンを含有するＬＢ培地５〇−中３７Ｃで
一夜培養し、１ｔの同上の培地に移して、さらに２時間
培養する。イソプロピルβ−ローチオガラクトピラノシ
ド（シグマ社）を終濃度１ｍＭになるように添加し、さ
らに８時間培養を続け１Ｌ冷却し、遠心分離によシ菌株
を集める。菌体を冷却遠心して集め、０．０４ＭＩＪス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）５００−にＳ濁し１次いで
、超音波破砕し、冷却遠心して菌体蛋白溶液を得る。な
お。
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐＡＨＣＡＤを５０μＦ／
−のアンピシリンを含有するＬＢ培地５〇−中３７Ｃで
一夜培養し、１ｔの同上の培地に移して、さらに２時間
培養する。イソプロピルβ−ローチオガラクトピラノシ
ド（シグマ社）を終濃度１ｍＭになるように添加し、さ
らに８時間培養を続け１Ｌ冷却し、遠心分離によシ菌株
を集める。菌体を冷却遠心して集め、０．０４ＭＩＪス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）５００−にＳ濁し１次いで
、超音波破砕し、冷却遠心して菌体蛋白溶液を得る。な
お。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐＡＨＣＡＤは受
託できる微生物の範囲外である之め、寄託受託拒否通知
書を受けた。
託できる微生物の範囲外である之め、寄託受託拒否通知
書を受けた。
ＨＣＡＤのＤＮＡを持たないプラスミドＰＫＫ２２３−
３を含有する大腸菌を同様にして培養して得之菌体蛋白
溶液をコントロールとして、この菌体がＨＣＡＤのｉ素
活性を有するかどうか検定した。すなわち、１５ｍＭ６
−ヒドロキシカプロン酸３０μｉ、１．６ ｍＭ Ｎ
Ａ Ｄ ５０ μｌ、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（
＋） Ｈ８，５） ２３５μｔ、菌体蛋白溶液５μｔを
よく混合し、５０Ｃで反応させ、ＮＡＤＨに基づ（３４
０ｎｍの吸収の増力口を測定した。
３を含有する大腸菌を同様にして培養して得之菌体蛋白
溶液をコントロールとして、この菌体がＨＣＡＤのｉ素
活性を有するかどうか検定した。すなわち、１５ｍＭ６
−ヒドロキシカプロン酸３０μｉ、１．６ ｍＭ Ｎ
Ａ Ｄ ５０ μｌ、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（
＋） Ｈ８，５） ２３５μｔ、菌体蛋白溶液５μｔを
よく混合し、５０Ｃで反応させ、ＮＡＤＨに基づ（３４
０ｎｍの吸収の増力口を測定した。
その結果、コントロールの菌体蛋白溶液には酵素活性が
検出されないが、上記で得られｔプラスミドを含有する
大腸菌から調製した菌体蛋白溶液のものからは６強い酵
素活性が検出された。
検出されないが、上記で得られｔプラスミドを含有する
大腸菌から調製した菌体蛋白溶液のものからは６強い酵
素活性が検出された。
第１図は本発明の酵素の高速液体クロマトグラフィー（
ＤＥＡＥ−５ＰＷ）からの溶出の様子を示すグラフ、第
２図は本発明の酵素のドデシル硫酸す） ＩＪウムを含
む電気泳動の結果を示す模式図。 第３図は本発明のＨＣＡＤのポリペプチドをコードする
組換ＤＮＡ、ｐＨＣＡＤの調製方法を示すフローシート
である。 標 準 蛋 白 質 フォスフォリラーゼｂ −１− 生血溝アルブミシ −・ オボアルブミシ −一 カーポニツクア）ヒドラーゼ−・− 大うトリプシシイシヒビターーー 枢−ラクトアルブミ′） へ１ 図 精 製 蛋 白 −一分子量３５，０００
ＤＥＡＥ−５ＰＷ）からの溶出の様子を示すグラフ、第
２図は本発明の酵素のドデシル硫酸す） ＩＪウムを含
む電気泳動の結果を示す模式図。 第３図は本発明のＨＣＡＤのポリペプチドをコードする
組換ＤＮＡ、ｐＨＣＡＤの調製方法を示すフローシート
である。 標 準 蛋 白 質 フォスフォリラーゼｂ −１− 生血溝アルブミシ −・ オボアルブミシ −一 カーポニツクア）ヒドラーゼ−・− 大うトリプシシイシヒビターーー 枢−ラクトアルブミ′） へ１ 図 精 製 蛋 白 −一分子量３５，０００
Claims (5)
- （１）下記の特性を有し、６−ヒドロキシカプロン酸か
ら脱水素して６−オクソカプロン酸に変換する酵素 ａ、ｐＨ７．５〜９．５のトリス−塩酸緩衝液（０．０
５Ｍ）中での反応最適温度が３５〜５０℃ ｂ、４５Ｃのトリス−塩酸緩衝液（０．０５Ｍ）中で測
定して最適ｐＨが８．５〜９．５ ｃ、４℃の緩衝液中でｐＨ５．０〜１０．５の範囲で安
定 ｄ、ｐＨ８．０のトリス−塩酸緩衝液（０．０５Ｍ）中
で２５℃まで安定 ｅ、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による測定で分
子量が３５，０００±２，０００ダルトンｆ、ゲル濾過
による測定で分子量が７０，０００±２，０００ダルト
ン ｇ、等電点がｐＨ５．０±０．２ ｈ、Ｎ末端アミノ酸配列が下記に示す配列 【遺伝子配列があります】 ｉ、６−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素活性が１ｍｇ
当り１〜１０，０００単位 - （２）次式で表わされるアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項記載の酵素。
- （３）次式で表わされるアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 を有する６−ヒドロキシカプロン酸脱水素をコードする
塩基配列からなるＤＮＡ。 - （４）次式で表わされる塩基配列 【遺伝子配列があります】 および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選
ばれる少なくとも一つの塩基配列からなる特許請求の範
囲第５項記載のＤＮＡ。 - （５）アースロバクター属に属する微生物を培養し、菌
体から下記の特性を有し、６−ヒドロキシカプロン酸か
ら脱水素して６−オクソカプロン酸に変換する酵素を採
取することを特徴とする６−ヒドロキシカプロン酸水素
酵素の製造方法。 ａ、ｐＨ７．５〜９．５のトリス−塩酸緩衝液（０．０
５Ｍ）中での反応最適温度が３５〜５０℃ ｂ、４５℃のトリス−塩酸緩衝液（０．０５Ｍ）中で測
定して最適ｐＨが８．５〜９．５ ｃ、４℃の緩衝液中でｐＨ５．０〜１０．５の範囲で安
定 ｄ、ｐＨ８．０のトリス−塩酸緩衝液（０．０５Ｍ）中
で２５℃まで安定 ｅ、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による測定で分
子量が３５，０００±２，０００ダルトンｆ、ゲル濾過
による測定で分子量が７０，０００±２，０００ダルト
ン ｇ、等電点がｐＨ５．０±０．２ ｈ、Ｎ末端アミノ酸配列が下記に示す配列 【遺伝子配列が有ります。】 ｉ、６−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素活性が１ｍｇ
当り１〜１０，０００単位
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28528087A JPH01128785A (ja) | 1987-11-13 | 1987-11-13 | ６−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28528087A JPH01128785A (ja) | 1987-11-13 | 1987-11-13 | ６−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素およびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01128785A true JPH01128785A (ja) | 1989-05-22 |
Family
ID=17689467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28528087A Pending JPH01128785A (ja) | 1987-11-13 | 1987-11-13 | ６−ヒドロキシカプロン酸脱水素酵素およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01128785A (ja) |
-
1987
- 1987-11-13 JP JP28528087A patent/JPH01128785A/ja active Pending
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