JPH01132394A - 固定化菌体の熱処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産栗上■且■分国 本発明は、トリプトファン・シンターゼを含む固定化菌
体の熱処理方法に関する。更に詳しくは、インドール及
びＬ−セリンからＬ−トリプトファンを製造するに用い
る固定化菌体を、保存または酵素反応に用いるに際し、
該酵素を含む菌体を固定化した固定化菌体、或いは固定
化後培養した固定化菌体（以下、固定化菌体と称するこ
とがある）を熱処理して、酵素の初期活性を向上せしめ
ると共に、保存または酵素反応における酵素の活性を低
下させること無く長期間係たしめる為の、固定化菌体の
熱処理方法に関するものである。

本発明は、所謂バイオリアクターの運転に用いられる酵
素を含む固定化菌体を保存または酵素反応に利用するに
際し、該酵素の初期活性を向上せしめると共に、酵素の
活性を低下させること無く長期間係たしめようとする場
合に利用される。

従来の技術 トリプトファンは、輸液成分などの医薬品、睡眠誘発剤
などの健康食品として従来から利用されて来たが、近年
飼料添加物としての有効性が認められて需要が伸びつつ
あり、安価な製造法の開発が待たれているところである
。トリプトファンの製造方法としては、化学合成法、発
酵法、酵素法などが従来から知られている。

化学合成法は合成経路が長く複雑であり、合成されたト
リプトファンは、Ｌ一体とＤ一体の等景況合物であるラ
セミ体であり光学分割を行って有効なし一体だけを分離
する必要がある。一方、発酵法または酵素法では有効な
し一体のみが生成されるので光学分割の必要も無く有利
である。

しかしながら、発酵法においても、糖類などの培地成分
または微生物菌体と生成物であるトリプトファンが発酵
液中に混合して得られるので、目的のトリプトファンを
単離、精製することが非常に困難で効率が悪く、手間が
かかるなどの難点がある。

酵素法で使用される酵素源としては、目的の酵素を生産
する菌体の培養液から遠心分離等で得られる休止菌体、
或いは菌体から抽出法などにより分離された酵素などが
用いられる。また近年は菌体または酵素をアルギン酸カ
ルシウムなどの天然高分子物質、或いは膜状成形物など
に固定化して用いる方法であるとか、溶液に懸濁した菌
体または酵素を逆浸透膜または限外ろ過膜などで系内に
閉じ込めて使用する方法なども報告されている。

特に固定化して用いる方法は、目的生産物と固定化した
菌体または酵素との分離が容易であるとか、或いは固定
化した菌体または酵素を繰り返し使用できるのでその使
用量が少なくてすむなどの利点がある為、近年特に注目
を集めている方法である。

Ｈが”しようとする。　占 しかしながら、固定化法においても、粗または精製酵素
を用いる場合には問題とならないが、菌体を酵素源とし
て使用しようとする場合には以下のような問題点がある
。即ち、固定化菌体を長期間保存する必要が有る場合、
或いは固定化菌体を反応に長期間使用したいとする場合
に、固定化菌体中の酵素の活性を実質的に低下させるこ
と無く長期間維持させることは極めて困難である。

固定化菌体を使用する有価物製造プロセスにおいては、
固定化菌体中の酵素の活性の寿命の長短がプロセス全体
の成否を決定すると言っても過言ではないので、反応の
場において酵素活性を長期間低下させることなく維持す
ることは極めて重要である。菌体中の酵素活性の低下の
原因については種々考えられるが、本発明に用いる酵素
の場合には、菌体中に含まれる蛋白分解酵素により目的
反応に有効な酵素が分解されてしまう事によるものと推
定される。

さて、本発明者らは、固定化菌体を用いて酵素法により
インドール及びし−セリンからＬ−トリプトファンを製
造する方法を研究するに際し、固定化した菌体を、冷蔵
庫などの冷暗所に保存したり、或いは目的の反応に使用
すると短時間の内に酵素の活性が低下し使用に耐えなく
なってしまうという基本的で重大な問題に直面した。

５　占を７するための手 そこで本発明者らは、この問題点を解決すべ（鋭意研究
した結果、固定化菌体を熱処理することによって、長期
間酵素活性を低下させること無く維持させ、また酵素の
初期活性をも向上せしめる方法を見出し、本発明を完成
するに至った。

すなわち、本発明は、インドール及びＬ−セリンからＬ
−トリプトファンを生成させるトリプトファン・シンタ
ーゼを含む固定化菌体を、保存する場合、或いはこの固
定化菌体を目的の反応に使用しようとする場合に、固定
化した菌体をｐＨ６〜９の条件下で４０″Ｃ以上で熱処
理することを特徴とした固定化菌体の熱処理方法である
。

以下、本発明について詳しく説明する。

本発明の方法に使用するトリプトファン・シンターゼの
生産菌としては、エシェリヒア・コリＭＴ−１０２３２
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９）、エシェリヒア・コリＭＴ−
１０２４２（ＦＢＩ？Ｍ　ＢＰ−２０）、ノイスボ・ク
ラッサＡＴＣＣ−１４６９２などを挙げることが出来る
。

熱処理に供する固定化菌体の形態としては、培養液から
遠心分離などにより集菌した菌体を固定化した固定化菌
体でも良いし、固定化した菌体を更に培養した状態のも
のでも良い。

熱処理後、固定化菌体を保存またはＬ−トリプトファン
の合成反応に使用する。

菌体を固定化する方法としては特に制限は無いが、−殻
内に良（用いられている、アルギン酸カルシウム、カラ
ギーナン、アクリルアミド重合物、光架橋性樹脂などで
包括固定化する方法、ナイ　　・ロンのマイクロカプセ
ルに包括する方法、イオン交換樹脂、アミノ酸ポリマー
などに結合させる方法などが良い。また固定化する形態
としても特に制限は無いが、通常、球状、筒状、棒状、
或いは膜状に成形された形態のものが良い。

固定化した菌体を更に培養する方法としては、該菌体を
得る為の通常の培養法で良いが、固定化用担体の種類に
よっては、培地成分などに工夫が必要な場合も有る。

熱処理時の温度は、４０℃以上、更に詳しくは４０〜７
５℃の範囲である。酵素の活性劣化が温度に敏感に左右
されるので、熱処理温度は十分に管理する必要がある。

本発明に係る酵素の場合は、３０〜４０℃に於いて最も
高い活性を示すが、熱処理温度が４０未満であると目的
酵素以外の、例えば蛋白分解酵素などを失活させること
が出来ず、本発明の目的を達し得ない。また７５℃を越
える温度では本来の酵素の活性が低下してしまうので好
ましくない。熱処理の温度は上記の温度範囲が好ましく
、担体の種類によっては高温での処理により担体が収縮
して反応時に基質、生成物の担体内での物質移動速度が
低下し、反応に悪影響を与える場合もあるので、適宜選
択する必要がある。

熱処理時のｐＨは６〜９の範囲が好ましく、更に好まし
くは、６．５〜８．０の範囲である。本発明で使用する
酵素は、ｐｕ　７．５〜８．５に於いて最も高い活性を
示し、熱処理時のｐＨも温度と同様に十分に上記範囲に
管理する必要がある。

ｐｕを調整する為の薬剤としては一般的に多用されてい
る、アンモニア、苛性ソーダ、苛性カリ、塩酸または硫
酸などが使用できる。

また熱処理時間は、４５℃程度の温度で熱処理するとき
は、１０〜２０分の範囲が最適であるが、目的酵素の活
性を低下させることなく熱処理の目的を達成させる為に
は、処理温度が高い場合には短時間で、処理温度が低い
場合には、より長い時間で処理することが好ましい。

上記のように熱処理を実施すると、固定化菌体中の酵素
の初期活性が、熱処理をしない場合に比較して、１０〜
４０χ向上するばかりでなく、固定化菌体を保存または
Ｌ−トリプトファンを製造する反応に使用すると、酵素
の活性が低下すること無く長期間維持される。

固定化菌体を保存する方法としては、合成樹脂またはス
テンレスなどの金属製密閉容器に該菌体を保存液に浸漬
、格納して冷蔵庫内に保管すれば良い。

また酵素反応によりインドール及びＬ−セリンからＬ−
トリプトファンを製造するのに用いる方法としては、特
に制限は無いが例えば、該固定化菌体を反応仕込液中に
懸濁して用いる方法、また膜に固定化して用いる場合に
は、反応供給液を膜面上に流通させる方法などを挙げる
ことが出来る。

光里■カ果 本発明の方法により熱処理した固定化菌体は、酵素の初
期活性が向上する上に、冷蔵庫などで酵素の活性を長期
間低下させること無く保存することが出来、また反応に
使用する場合にも長期間活性を維持させることが可能と
なり、固定化菌体を用いたＬ−トリプトファンの工業的
な製造が可能となったのである。

実巖拠 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

実施例１ トリプトファン・シンターゼ生産菌であるエシェリヒア
・コリＭＴ−１０２３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９）を５
００ｍ　ｌの坂ロフラスコ中の第１表に示す組成の培地
Ｌｏｏｍ　Ｉ。

に接種し、３５℃で２４時間培養した。この培養液２０
０ｍｊｌ！　（フラスコ２本）を３０１　のジャーファ
ーメンタ−中の第２表に示す組成の培地１５１に接種し
、３５°ｃ、　ｐＨ６，８（２８χアンモニア水で調整
）で３０時間培養した。

培養液を分取して、第３表に示した条件で熱処理後、遠
心集菌して酵素の活性を測定し、熱処理の効果及び熱処
理条件の比較を行った。

酵素の活性の測定は以下の通り行った。

インドール、Ｌ−セリン、ピリドキサール−５゛−リン
酸（ＰＬＰ）及び菌体を乾燥菌体として０．２ｇ＃！含
む反応液を１０ｍ！調合し、振とう培養機で、３５℃１
１時間振とうして反応を行い、生成したＬ−トリプトフ
ァンを高速液体クロマトグラフィーで分析した。

第１表　培養培地の組成 ＮａＣ１５ｇ 蒸留水ＩＩ！、に希釈して使用（ｐＨ６，８）第２表　
増殖培地の組成 蒸留水ＩＩ！、に希釈して使用（ｐＨ６，８）（以下余
白） 第３表　　熱処理の効果 実施例２ 実施例１と同様に培養して、熱処理をしない菌体と熱処
理を行った菌体を得た。熱処理条件は、ｐ１１７．０、
温度５５℃ｌ２Ｏ分である。これらの菌体を密封容器に
入れ３〜５　”Ｃの冷蔵庫に保管して所定時間経過後の
活性を測定し、その結果を第４表に示した。

第４表　　菌体の保存結果 保存後の活性は、初期の活性に対する相対値で示した。

実施例３ 実施例１と同様にして得た、熱処理をしない菌体と、ｐ
Ｈを変えて熱処理を実施した菌体を用いて、固定化酵素
を作成し、インドールとＬ−セリンからＬ−トリプトフ
ァンを合成する反応を実施して８、酵素活性の寿命を見
た。インドールを基準としたＬ−トリプトファンの収率
が５０χに落ちるまでの時間を酵素の寿命としその結果
を第５表に示した。

固定化酵素の作成は以下の要領で行った。

遠心集菌した湿菌体１部と生理食塩液１部とを撹はん混
合した。一方蒸留水７．７６部と、アルギン酸ナトリウ
ム（記文フードケミファ社製Ｎ５ＰＬＬ　）０．２４部
とを撹はん混合しｐＨを８．５に苛性カリで調整した。

菌体の懸濁液２部と、上記のアルギン酸ナトリウムの溶
解液８部を撹はん混合し、注射器に充填、内径が０．５
〜０．８ｍｍ程度の注射針の先端より、ゲル化液に滴下
した。ゲル化液は、０．５モル濃度の塩化カルシウムニ
水塩水溶液を６規定苛性カリ水溶液でｐＨを８．５に調
整し、１０℃に保った液を５０部使用した。ゲル化液に
滴下されて生成した粒子は液中で約１時間撹はん熟成後
、液中より取り出し固定化酵素源として使用した。

また上記で作成した固定化酵素を用いてＬ−１−リプト
ファンを合成して酵素活性の寿命を見る反応試験は以下
の要領で実施した。

５００ｍ　１２の撹はん機付ガラス製反応器に第６表に
示した組成からインドールだけを除いた溶液１００ＩＩ
ｌｌと固定化酵素５０ｍ　Ｑを装入し、この反応器を温
水浴中に保持して温度を常に３０℃に保った。次に第６
表で示した組成の反応供給液を、内容を撹はんしている
反応器に毎時５０ｍ１の速度で連続的に供給し、一方反
応器からも同速度で連続的に抜液を行い、一定時間毎の
サンプルをとり生成したＬ−トリプトファン濃度及び残
存インドール、Ｌ−セリン濃度を液体クロマトグラフ法
により求めた。反応の結果は、供給したインドール量を
基準として生成したＬ−トリプトファンの収率を求め、
この収率が良好に維持される時間の長さで検討した。こ
の収率が１００χである場合とは、反応器から抜液した
液中のＬ−トリプトファン濃度が４．３６ｇ／βに達す
る場合である。

第５表　固定化酵素の寿命 酵素の寿命：インドールに対する収率が５０χに低下す
るまでの時間 熱処理条件：温度５５℃１時間２０分 第６表　反応供給液の組成 ｐＨ８，５ 実施例４ 熱処理条件をｐＨ７，５、温度５５℃１時間２０分とし
て処理して得た菌体を、第６表に示した組成の液からイ
ンドール及び塩化カルシウムを除いた組成の反応液５０
１に乾燥菌体としてＬｏｇ／　Ｉｌの濃度で仕込み、ジ
ャケット及び撹はん機付ステンレス製反応器内で撹はん
しなから３５℃に保った。この反応器に第６表で示した
組成の液から塩化カルシウムを除いた組成の反応液を、
毎時１８４２の速度で供給し、Ｌ−トリプトファンの合
成反応を行なわしめた。同時に反応液の一部を連続的に
抜き出して、限外ろ過装置に供給して液中に生成したＬ
−トリプトファンを限外ろ過膜の透過液側に透過せしめ
、菌体を非透過液側に残した。限外ろ過装置はＤＤＳ社
製ＧＲ８１ＰＰ膜を０．３６ｍ２セツトし、供給液量８
１／分、３５℃１５Ｋｇ／ｃｍ２の条件で使用した。透
過液中に溶解しているＬ４リプトファンはイオン交換樹
脂吸着法などの常法により分離回収した。また菌体を含
んだ非透過液はそのまま反応器に循環してＬ−トリプト
ファンの合成反応に供した。反応器、限外ろ過装置は連
続運転を行い、インドールに対するＬ−トリプトファン
の収率が５０χに低下するまで１２０時間の運転を継続
することができた。

特許出願人　　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）インドール及びＬ−セリンからＬ−トリプトファン
   を製造するに用いるトリプトファン・シンターゼを含む
   固定化菌体を、ｐＨ６〜９の条件下で４０℃以上で加熱
   処理することを特徴とする固定化菌体の熱処理方法。