JPS6287088A - Ｌ―アラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＬ−アラニン（又は、Ｌ−アラニンとＤ−アメ
／４’ラギン酸）の製法に関し、更に詳しくはＬ−アス
・！ラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物のアラ
ニンラセマーゼ活性を除去し、該微生物を用いてＬ−ア
ラニンを単独であるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギ
ン酸とを同時に製造する方法に関する。

（従来の技術） Ｌ−アス・卆うギン酸β−脱炭酸酵素はＬ−アスパラギ
ン酸のみに作用してＬ−アラニンと炭酸ガスとを生成す
る反応を触媒する酵素である。

従来、上記し一アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を利用す
るし一アラニンの製造法としては、Ｌ−アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素活性を有する微生物を基質であるＬ−ア
スパラギン酸またはその塩含有培地に培養する方法や該
微生物の生産した酵素を基質に作用させる方法等多数知
られている。

しかしながら、一般に微生物の細胞壁の構成成分として
Ｄ−アラニンが必須であるため、これらの微生物は同時
にアラニンラセマーゼ活性を有することが知られており
、Ｌ−アラニンの生成と共にＤ−アラニンも副生してく
る。従ってＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有
する微生物を用いて光学純度の高いし一アラニンを効率
よく製造するためには該微生物のアラニンラセマーゼ活
性発現を田土する必要がある。

しかしながら現在知られている酵素を酸処理する方法（
特開昭５７−１３２８８２　）では、低−Ｉにおけるタ
ンツク変性を引き起すため、アラニンラセマー゛　ゼ活
性は抑えられるがＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活
性も共に抑えられるためＬ−アラニンの生成量が低下す
るという難点があった。

（本発明が解決しようとする問題点） 上記の従来技術のもっている欠点を解決し、低声による
タンツク変性を防ぎながらアラニンラセマーゼ活性を抑
え光学純度の高いＬ−アラニンおよびＤ−アスパラギン
酸の製造法を確立するととにある。

（問題点を解決するだめの手段） しかるに本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、微生物の
有するＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性には全く
失活を与えること々く微生物のもつアラニンラセマーゼ
活性のみを選択的に失活させ、同時に菌体内酵素である
Ｌ−アスパラギン酸−β−脱炭酸酵素の活性化を図る方
法を見出した。

即ち、本発明によれば、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸
酵素活性を有する微生物又はその固定化微生物をアルカ
リ処理することにより当該微生物又は固定化微生物のア
ラニンラセマーゼ活性が除去され、更にはこの様にして
得られた微生物又は固定化微生物にＬ−アスパラギン酸
（又はＤＬ−アスパラギン酸）を作用させることによシ
ム−アラニン（Ｌ−アラニンとＤ−アスパラギン酸）を
製造することができる。

本発明方法において用いられるし一アスパラギン酸β−
脱炭酸酵素活性を有する微生物としては上記活性を有す
る微生物であればいずれも用いることが出来、かかる微
生物としては、例えばシュードモナス・エスピーＡＴＣ
Ｃ１９１２１，シュードモナス・ダクネーＩＡＭ１１５
２．アセトバクター・ランセンスＯＵＴ　８３００．ア
クロモバクタ−・ペスチファーＩＡＭ　１４４６．アク
ロモバクタ−・被スチファ−ＡＴＣＣ２５０９、キサン
トモナス・ベゴニアエＩＡＭ１６４４　。

ブレビバクテリウム・インペリアルＡＴＣＣ８３６５。

アースロハクター・ウレアファシェンスＩＡＭ１６５８
゜エルビニア・アロイダエエＡＭ１０６８号等が好適に
あげられる。

こわらの微生物は遊離菌体のまま用いることができ、該
菌体をそれ自体公知の方法で固定化した微生物であって
もよく、例えば光重合性樹脂、ポリアクリルアミドゲル
、金儲多糖類ｒル（カラギーナン、ファーセレラン等、
コラーゲングル、アルギン酸グル、ポリビニルアルコー
ルグル、寒天グルで固定化した微生物をいずれも本発明
の目的に用いることができる。上記の内光重合性樹脂に
よる場合は例えば特開昭５８−１８７１８７号記載の通
り微生物菌体の水けん濁液に光重合性樹脂〔例えばＥＮ
Ｔ−４０００〕およびベンゾインエチルエーテルを混合
したのち光照射により重合せしめることによシ、固定化
微生物が得られる。また、カラギーナン、ファーセレラ
ン等の金儲多糖類による場合は例えば特開昭５３−６４
８３号に記載の通り微生物菌体をカラギーナン水溶液に
けん濁し、このけん濁液にｒル化剤（例えば第４周期以
上のアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムイ
オン等）を接触させるか冷却してｒル化させることによ
り固定化微生物が得られる。金儲多糖類としては分子内
の硫酸基含量ＩＱＷ／Ｗチ以上、とりわけ硫酸基含量１
２〜６２　Ｗ／Ｗ％のものを用いるのが好まり、イ。そ
の他、コラーゲングル、アルギン酸グル、ポリビニルア
ルコールグル、寒天グル等による場合も、それ自体公知
の方法例えば特開昭５１−１４４７８０号、特開昭４９
−３０５８２号、特開昭４９−８０２８５号、特開昭５
１−１３３４８４号記載の方法に従って当該微生物を処
理することによυ容易に相当する固定化微生物を得るこ
とができる。これらの固定化微生物は例えば立方体状（
１辺約３ｆｉ程度）、球状（直径約３瓢程度）、繊維状
（径約１ｆｉ程度）、膜状あるいは板状等の適当な形状
に成型すればつづいての処理操作を効率よ〈実施できる
ので好ましい。

上記の如き微生物又は固定化微生物のアルカリ処理は当
該微生物又は固定化微生物をアルカリ溶液中に浸漬する
か又は当該微生物又は固定化微生物を含有する液中にア
ルカリを加えることにより実施できる。アルカリとして
は、例えば苛性ソーダ、苛性カリ、水酸化カルシウム、
水酸化アンモニウム、炭酸ソーダ等の無機アルカリ、テ
トラヒドロ７ラン、トリスヒドロキシメチルエタン等の
有機アルカリのいずれも用いることができる。これらア
ルカリによる処理はｐＨ８〜１２、と夛わけ８．５〜１
０の条件下に実施するのが好ましく、又アルカリは水溶
液それ自体だけでなくアルカリ緩衝液をも用いることが
できる。

微生物又は固定化微生物含有液中にアルカリを加えて実
施する場合には前記アルカリを上記声範囲となるように
アルカリの添加量を調整することにより行なう。更に微
生物又は固定化微生物のアルカリ処理は約０〜６０℃、
とりわけ約２０〜５０℃で実施するのが好ましい。接触
時間は微生物が遊離菌体の場合約３分〜２４時間、とり
わけ約３分〜２４時間程度とするのが好ましく、固定化
微生物の場合には約１０分〜５日間、とシわけ約１〜４
８時間程度とするのが好ましい。

かくして得られたアラニンラセマーゼ活性の除去された
微生物又は固定化微生物にＬ−アスパラギン酸またはそ
の塩を作用させるとＬ−アラニンが得られ、またＤＬ−
アスパラギン酸またはその塩を作用させるとＬ−アラニ
ンとＤ−アスパラギン酸が得られる。ここでＬ−アスノ
ぐラギン酸またはＤＬ−アスパラギン酸の塩としては、
例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、アンモニウム塩等が好ましい。酵素反応は、０〜５
０℃の広い温度範囲で実施することができるが、微生物
の酵素の安定性を考慮して３０〜４０℃で実施するのが
好ましい。尚、上記酵素反応に際しては基質溶液にピリ
ドキサールリン酸、ケト酸（例えばピルビン酸、α−ケ
トゲルタール酸等）等を適宜添加することによシ該酵素
反応を一層促進させることが出来、また更にコバルトイ
オン、ニッケルイオン等の２価金属イオンを添加すると
微生物の酵素活性の安定性を高めることが出来る。

上記において、遊離の微生物を用いる場合の反応はパッ
チ法で実施するのが好ましい。又、固定化微生物を用い
る場合の反応は使用する固定化微生物が水に不溶性であ
るため、パッチ法によるのみならず力２ム法によって連
続的に実施することが出来る。例えばカラム法による場
合、該固定化微生物をカラムに充填し、このカラムにＬ
−アスパラギン酸、ＤＬ−アスパラギン酸またはそれら
の塩を有する溶液を適尚な速度で導通すればＬ−アラニ
ンのみ、あるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギン酸と
を含む流出液が得られる。なおこの場合、酵素反応によ
シ生成する炭酸ガスのカラム内への滞留を避けるため基
質溶液はカラム下部よシ上部に向けて流すのが好ましい
。またパッチ法による場合、該固定化微生物を上記基質
溶液にけん濁し、かく拌する如き方法によ！１ｌＬ−ア
ラニンのみあるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギン酸
とを含む反応液が得られる。この場合には反応終了液か
ら固定化微生物をろ過あるいは遠心分離する如き方法に
より取得すれば再びこれを反覆使用することができる。

これらの方法において、基質としてＤＬ−アス・ぐラギ
ン酸またはその塩を用いる場合Ｌ−アラニンとＤ−アス
パラギン酸とを含む溶液が得られるが、これらの両者は
例えば直接晶析法、イオン交換樹脂処理等の公知の単離
精製操作を適宜組合せることにより容易に分離採取する
ことができる。上記反応を実施するにあたって反応進行
率は固定化微生物の量、温度、反応時間、基質の流速そ
の他により影響される。例えばカラム法による場合は使
用する固定化微生物の量に従い基質溶液の導通速度を、
またパッチ法による場合はその反応時間を適描に調整す
ることにより反応進行率を１００％にまで高める至適条
件を見出すことも容易である。

（作用及び効果） 以上の如く、本発明方法は（１）Ｌ−アスパラギン酸β
−脱炭酸酵素活性を有する微生物をアルカリ処理すると
いう極めて簡単な操作で該微生物のアラニンラセマーゼ
活性を完全に除去できること。

（２）アルカリ処理によシ菌体内酵素であるＬ−アスパ
ラギン酸−β−脱炭酸酵素が活性化されること。

（３）該方法は遊離の微生物にも固定化微生物にもとも
に適用できること。（４）又、一旦除去されたアラニン
ラセマーゼ活性は長期間酵素反応を実施しても再び出現
することがないこと。（５）更にアラニンラセマーゼ活
性の除去された微生物を公知の方法で固定化してもその
得られる効果には何ら変りがない等、種々のすぐれた特
徴及び効果を有するものである。又、本発明方法により
アラニンラセマーゼ活性の除去された微生物あるいは固
定化微生物を用いてＬ−アスパラギン酸（又はＤＬ−ア
スパラギン酸）からＬ−アラニン（又はＬ−アラニンと
Ｄ−アスパラギン酸）を製造すれば生成物中にＤＬ−ア
ラニンが含まれていないので再結晶等後処理が不用であ
り、この点からも本発明方法ばＬ−アス・母うギンの工
業的に極めてすぐれた製造方法となるものである。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ 下記により調製した微生物を用いてＬ−アスパラギン酸
からＬ−アラニンを生成させ、その際副生するＤ−アラ
ニン生成物を比較した。

（１）微生物の調製 （本発明方法による微生物の調製） フマール酸０．５　ｊｊ／ｄｉ、大豆蛋白加水分解物（
全窒素６．４１７７ｄｉ　）　１．８　ａｔ／ｄｉ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，１ｊ；ｌ／ｄｉ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０，１ｊｌ／ｄｉ　、大豆油０．５　ｇ／ｄｉおよびオ
レイン酸０．５１７７ｄｔを含む溶液をＰＨ６，ｓに調
整後、５００ｄ容肩付フラスコに５０ｄ分注し、１１５
℃で１０分間殺菌した。

この培地に、ブイヨン寒天培地で３０℃にて２４時間生
育させたシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ、ａｐ、）　ＡＴＣＣ１９１２１を１白金耳植菌
し、３０℃にて１６時間振盪培養した。培養終了後苛性
ソーダを加え−を９．５に調整し３７℃で１時間放置し
た。

（対照微生物の調製） 苛性ソーダ処理をしない以外は上記と同様にして微生物
を調製した。

（２）実験方法 上記で得られた微生物各ＩＩを、１０−’Ｍピリドキサ
ールリン酸を含むＩ　ＭＬ−アスパラギン酸アンモニウ
ム水溶液（アンモニアでＰＨ５，０に調整）７０ｍを入
れた２　００　ｍｌ容三角フラスコに加え３７℃にて撮
とり反応させ反応中の全アラニン量とＤ−アラニン量を
経時的に測定した。

尚、全アラニン量の測定はロイｄノストック・チトロボ
ラムＡＴＣＣ８０８１を用いるバイオアッセイによシ行
ない、Ｄ−アラニン量の測定は豚腎よｐ調製したＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼを作用させ生成したピルビン酸をヒ
ドラゾンとして測定する方法で行なった。

（３）結果 結果は表１に示す通りであり本発明方法により調製した
微生物はＤ−アラニンを全く生成しないのに対し対照の
微生物は２０時間目におけるＤ−アラニン生成量が約２
５％に達することが認められた。

表　　１ 実施例２ 下記により調製した固定化微生物を用い反応を実施し反
応終了液中のＤ−’アラニン生成量を比較した。

（１）固定化微生物の調製 （本発明方法による固定化微生物■の調製）実施例１（
１）と同様の培地を５００ｄ容坂ロフラクコ１０本に５
０ｍＡ’宛分注しこれにシュードモナス・エスピーＡＴ
ＣＣ１９１２１を植菌した。３０℃で１６時間振とり培
養したのちこれに苛性カリを加えＰＨを１０．０に調整
し３０℃で１時間放蓄した。

これに酢酸を加えＰＨ５，０に調整したのち遠心分離す
ることによりシー−トモナス・エスピー菌体１０ｇ（湿
重量）を集めた。

０．０５Ｍ酢酸バッファー（…５　）　２５ｍに光重合
性樹Ｉｌｌ　ＥＮＴ〜４０００１０　ｇおよびペンゾイ
ヂエチルエーテル１００ｍ９を溶解した溶液に上記菌体
１０ｇを投入した。混合した後、透明フィルム上に流し
込み、３００〜４００ｎｍの近紫外線を表裏に３分づつ
照射した。得られた重合物を５×５曙の大きさに切断し
固定化シー−トモナス・エスピーを得た。

（本発明方法の固定化微生物■の調製）上記と同様の培
地、菌体を用いて上記と同様に３０℃で２４時間振と９
培養したのち遠心分離してシュードモナス・エスピー菌
体１０ｇ（湿重量）を集めた。

この菌体を用い上記固定化操作を行ない固定化シュード
モナス・エスピーを得た。このゲルを１０ｍＭＬ−アス
・やラギン酸を含む０，２Ｍ炭酸ソーダ緩衝液（ｐ）ｆ
ｌ　Ｏ，０）　２６０ｍｌ中に浸漬し３０℃にて２４時
間放置した。その後０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５
）で洗浄することにより固定化シュードモナス・ダクネ
ーを得る。

（対照微生物の調製） 上記本発明方法による微生物■と同様にして調製した。

固定化微生物を以後何ら処理することなく用いた。

（２）実験方法 固定化シュードモナス・エスピー４０ｇをそれぞれ実容
２００　ｒｕｌの攪拌型反応器に入れ、１０−’Ｍピリ
ドキサールリン酸を含むＩＭＬ−アスパラギン酸アンモ
ニウム溶液（アンモニアにてｐＨ６，０Ｋ　Ｗ４整）に
なるように添加し、３７℃で２０時間反応したその反応
液の全アラニンとＤ−アラニンＩｉｆを測定した。

尚、全アラニン量およびＤ−アラニン量の測定は実施例
１と同様にして行なった。

（３）結果 結果は下記表２に示す通りであり、本発明方法により調
製した固定化微生物はＤ−アラニンを全く生成しないの
に対し、対照の固定化微生物は約７係のＤ−アラニンを
生成することが認められた。

表　　２

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する
   微生物又はその固定化微生物をアルカリ処理することを
   特徴とする該微生物のアラニンラセマーゼ活性を除去す
   る方法。
2. （２）Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する
   微生物又はその固定化微生物をアルカリ処理した後、ア
   ラニンラセマーゼ活性の除去された当該微生物又は固定
   化微生物にＬ−アスパラギン酸又はその塩を作用させる
   ことを特徴とするＬ−アラニンの製法。
3. （３）Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する
   微生物又はその固定化微生物をアルカリ処理した後、ア
   ラニンラセマーゼ活性の除去された当該微生物又は固定
   化微生物にＤＬ−アスパラギン酸又はその塩を作用させ
   ることを特徴とするＬ−アラニンおよびＤ−アスパラギ
   ン酸の製法。