JPH01134246A - バイオセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、種々の微量の生体試料中の特定成分について
、試料液を希釈することなく迅速かつ簡易に定量するこ
とのできるバイオセンサに関する。

従来の技術 従来、血液などの生体試料中の特定成分について、試料
液の希釈や撹拌などの操作を行なうことなく高精度に定
量する方式としては、第６図に示す様なバイオセンサを
提案してきた。（例えば特開昭６１−２９４３１５１号
公報） このバイオセンサは、絶縁性の基板１に、スレリーン印
刷によシ導電性カーボンペーストヲ印刷し加熱乾燥する
ことにより、対極２．測定極３゜参照極４からなる電極
系を形成する。次に、電極系を部分的に覆い、各々の電
極の電気化学的に作用する部分となる２’　、　３’　
、　４’を残す様に絶縁性ペーストを前記同様印刷し、
加熱処理して絶縁層５を形成する。次に、穴をあけた樹
脂製の保持枠９を絶縁層６に接着し、前記電極系２’、
３’、４’を覆う様に多孔体１ｏを穴の中に保持し、さ
らに多孔体よシ小さい径の開孔部を有する樹脂製カバー
１１を接着し、全体を一体化する。上記多孔体には、酸
化還元酵素と電子受容体が担持されておシ、基質を含む
試料液を多孔体に添加すると、酵素反応が進行し、電子
受容体が還元される。酵素反応が終了した後、この還元
された電子受容体を前記電極で電気化学的に酸（１，−
し、この時得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度
を求める。

発明が解決しようとする問題点 この様な従来の構成では、尿や血清の様な低粘度のサン
プルでは微量を添加するだけで基質濃度が精度よく短時
間で測定できるが、全血のように、血球が混在すると、
電極表面に血球が付着して応答が大きく低下し、さらに
高粘度のため、酵素反応が遅く、５分取上反応終了まで
に時間がかかシ測定値がばらついた。さらに、酸化還元
酵素および電子受容体を同じ多孔体に担持すると、湿度
や光の影響によシ初期特性を維持できない場合があった
。

本発明は、これらの点について種々検討した結果、濾過
膜および電極系の表面に吸水性高分子層を設けて、多孔
体と一体化し、さらに、濾過膜の下に誘導層を設けこれ
に酸化還元酵素を担持させることで、多孔体中の電子受
容体と分離して担持し生体試料中の特定成分を極めて容
易に迅速かつ高精度に定量ができるディスポーザブルタ
イプで長期保存可能なバイオセンサを提供するものであ
る。

問題点を解決するための手段 本発明は上記問題点を解決するため、絶縁性基板に少な
くとも測定極と対極からなる電極系を設け、酵素と電子
受容体と試料液の反応に際しての物質濃度変化を電気化
学的に前記電極系で検知し、試料液中の基質濃度を測定
するバイオセンサにおいて、前記電極系の表面に吸水性
高分子層を設け、電極を前後からはさむ様に酸化還元酵
素を担持した誘導層を配し、電極を覆う様にろ過膜を、
さらにその上に電子受容体を担持した多孔体を配し、各
要素を一体化したものである。

作用 本発明によれば、電極系をも含めたディスポーザブルタ
イプのバイオセンサを構成することができ、試料液を多
孔体に添加することによシ、極めて容易に基質濃度を測
定することができる。

しかも、酵素と電子受容体を分離して担持することによ
シ作成時および保存において、光や湿度の影響をうけず
、長期安定な応答が得られるようになった。さらに、電
極系をはさむように誘導層を設置しているため、濾過膜
を濾過した試料液が確実に電極系上に誘導され、酵素反
応が行なわれるようになった。電極系上の吸水性高分子
によりぬれ性が向上され、試料中の蛋白質の吸着を防ぐ
ことによシ、精度のよい測定が可能となった。さらに、
濾過膜を濾過した低粘度の試料液のみが酵素と反応する
ため、短時間で反応が終了し、しかも酵素の担持量も微
量で足シることかできる。

実施例 以下、本発明の一実施例について説明する。

バイオセンサの一例として、グルコースセンサについて
説明する。第１図は、グルコースセンサの一実施例につ
いて示したもので、構成部分の分解図である。ポリエチ
レンテレフタレートからなる絶縁性基板１に、スクリー
ン印刷により導電性カーボンペーストを印刷し、加熱乾
燥することにより、対極２．測定極３．参照極４からな
る電極系を形成する。次に、この電極系を部分的に覆い
、各々の電極の電気化学的に作用する部分となる２′。

ｓ’、４’（各１　ｒｔｍ！　）を残す様に、絶縁性ペ
ーストを前記同様印刷し、加熱処理して絶縁層６を形成
する０ この電極系（２／　、　３／　、　４／　）の表面をセ
ルロース性の吸水性高分子の１種であるａｕａｅ＜カル
ボキシメチルセルロース）の０．５％水溶液を塗布し４
６℃で３０分乾燥した。

次に、第１図に示すように両面接着テープ７で電極系上
に溝を作り、両側に電極を前後からはさむ様に誘導層８
としてセルロースのテープを設置する。このセルロース
のテープには、酸化還元酵素としてグルコースオキシダ
ーゼ１０ｍｇをリン酸緩衝液（ＰＨｓ、ｅ）に溶かした
液を含浸させた後、乾燥している。次に、穴をあけた樹
脂製の保持枠１０に濾過膜として孔径１μｍのポリカー
ボネート多孔体膜９を接着し、前記電極系２’　、　３
′、　４’を覆う様に両面接着テープ７で固定する。さ
らに、保持枠１０の開孔部に多孔体１１を置き、多孔体
より小さい径の開孔部を有する樹脂製カバー１２を接着
して全体を一体化する。多孔体１１はナイロン不織布に
電子受容体としてフェリシアン化カリウムをＰＨ５，６
のリン酸緩衝液に溶解した液を含浸後、減圧乾燥して作
製したものである。この一体化されたバイオセンサにつ
いて、測定極３に沿った断面図を第２図に示す。

上記の様に構成したグルコースセンサの多孔体へ試料液
としてグルコース標準液を滴下し、２分後に参照極４′
を基準にして測定極３′の電位をアノード方向へ＋０．
５ｖパルス電圧を印加し、５秒後の電流を測定する。こ
の場合、添加されたグルコース標準液により多孔体に担
持されたフェリシアン化カリウムが溶解する。ポリカー
ボネート多孔体膜を通過した後、電極系を前後からはさ
むように置かれたセルローステープに誘導されて電極系
上へ液が達する。その際、セルロースのテープ上に担持
されたグルコースオキシダーゼが溶は出てグルコースを
酸化し、フェリシアン化カリウムが同時に還元されてフ
ェロシアン化カリウムが生成する。そこで、上記のパル
ス電圧の印加によシ、生成したフェロシアン化カリウム
の濃度に基づく酸化電流が得られ、これは基質であるグ
ルコース濃度に対応する。酸化電流はグルコース濃度が
−ｒ　ｏ　ｏ　ｍ　ｆ／ｅｌｌまで良好な直線性が得ら
れた。

上記のグルコースセンサに血液サンプル２０μ！を滴下
して２分後の応答電流を測定すると、非常に再現性の良
い応答が得られた。血液の場合は血球が混在しているた
め粘度が高く、酵素反応をすみやかに行なわせるのは非
常に難しく、従来では遠心分離や撹拌するという操作が
不可欠であった。

又電極表面に蛋白質が付着して応答がばらつく現象がみ
られた。しかし、孔径１μｍのポリカーボネート多孔体
膜を濾過膜として用いると、血球が’ｆ５過されその後
グルコースオキシダーゼと反応するので粘度が低下し、
すみやかに酵素反応を行なうことができた。さらに、ポ
リカーボネート多孔体膜上の液を電極上へ供給するため
誘導層として電極をはさむように設置されたセルロース
のテープにより、迅速に効率よく濾過液を誘導すること
ができ、血液を滴下後３０秒で電極系上に反応液を供給
することができた。セルロースのテープがない場合は、
反応液が電極系に達するまでにかかった。溝の高さを低
くすると、反応液は早く達するが、溝が１００μｍよシ
低くなると気泡が残ったシ、応答電流がポリカーボネー
ト多孔体膜の影響をうけてばらつくという現象がみられ
た。セルロースのテープを電極上にかかる様に置くと、
反応液はすみやかに電極上に達するが、気泡が発生する
場合が見られ、応答も低目にばらついた。セルロースの
テープは、電極上にかからない様に、しかも接近した所
に設置すれば、反応液は有効にすみやかに電極上に供給
され、安定な応答が得られることが判明した。セルロー
スの他にもレーヨン、パルプなど親水性の薄い多孔体が
使用できた。

ナイロン不織布からなる多孔体１１に、グルコースオキ
シダーゼとフェリシアン化カリウムを担持しても測定は
可能であるが、作成および保存の際、グルコースオキシ
ダーゼとフェリシアン化カリウムが湿度や光の影響で反
応することがわかったので、別々に担持した方が簡易に
作成でき、長期保存にも有効と考えられる。さらに、濾
過された液量は、滴下された液の約〃〜晃となるので、
酵素の担持量も微量でよくなった。

電極表面にＣＭＣを塗布することにより、電極のぬれ性
がよくなり、わずか２〜３μｌの反応液でも充分電極系
上を覆うことができた。又、反応液中の蛋白質等が電極
表面へ付着するのを阻止し、再現性の良い応答が得られ
た。吸水性高分子としてはカルボキシメチルセルロース
系、ゼラチン系。

アクリル酸塩系、ビニルアルコール系、ビニルピロリド
ン系、無水マレイン酸系のものが好ましい。

本発明のバイオセンサにおける一体化の方法としては実
施例に示した枠体、カバーなどの形や組み合わせに限定
されるものではない。又、酸化還元酵素と電子受容体の
組み合わせも前記実施例に限定されることはなく、本発
明の主旨に合致するものであれば用いることができる。

一方、上記実施例においては、電極系として３電極力式
の場合について述べたが、対極と測定極からなる２電極
力式でも測定は可能である。

発明の効果 このように本発明のバイオセンサは、絶縁性基板、電極
系、酸化還元酵素を担持した多孔体、多孔体膜および電
子受容体を担持した多孔体を一体化することにより、極
めて容易に生体試料中の基質濃度を測定することができ
、酵素と電子受容体を多孔体膜を介して担持することに
よシ、迅速に測定し長期保存を可能にした。さらに、電
極表面に吸水性高分子を塗布し妨害物質の電極への吸着
を防ぎ、測定精度を高めた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例であるバイオセンサの分解斜
視図、第２図はその縦断面図、第３図は従来のバイオセ
ンサの分解斜視図である。 １・・・・・・絶縁性基板、２・・・・・・対極、３・
・・・・・測定極、４・・・・・・参照極、６・・・・
・・絶縁層、６・・・・・・ＣＭＣ１７・・・・・・両
面接着テープ、８・・・・・・誘導層、９・・・・・・
ｐ過膜、１ｏ・・・・・・保持枠、１１・・・・・・多
孔体、１２・・・・・・カバー〇 代理人の氏名　弁理士　中　尾　敏　男　ほか１名！−
１［渣１ ＠＠球婦゛く 貴へ孝迩快

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも測定極と対極からなる電極系を設けた
   絶縁性基板を備え、酵素と電子受容体と試料液の反応に
   際しての基質濃度を測定するバイオセンサにおいて、前
   記電極系の表面に吸水性高分子層を設け、電極系を前後
   からはさんだ位置に酸化還元酵素を担持した誘導層を設
   け、電極を覆う様にろ過膜を置き、さらにその上に電子
   受容体を担持した多孔体を配し、前記各要素を一体化し
   たことを特徴とするバイオセンサ。
2. （２）吸水性高分子が、カルボキシメチルセルロース系
   、ゼラチン系、アクリル酸系、ビニルアルコール系、ビ
   ニルピロリドン系、無水マレイン酸系からなる群のいず
   れかもしくはそれらの混合物である特許請求の範囲第１
   項記載のバイオセンサ。