JPH01137972A - 新規サチライシン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は蛋白質分解酵素として有用な枯草菌由来ノア
ルカリ性セリンゾロテアーゼ、サチライシンＥの変異体
に関する。

従来の技術 アルカリ性セリンプロテアーゼであるサチライシンは枯
草菌並びにその類縁菌が生産する菌体外酵素で弱アルカ
リ性側に至適ＰＨを有し、セリンが活性に関与する蛋白
分解酵素である。産業上の用途として洗剤用１食品加工
用はもとより、工業的利用として絹の精練、皮革加工そ
の他巾広く用いられており、きわめて重要な酵素である
。

本発明者らは枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕａ　ｓｕｂｔｉｌｌ
ｇ　１６８株よりサチライシンＥの遺伝子をクローニン
グし、大腸菌のイリグラズムに著１に蓄積せしめること
に成功している（他郷、高木、森永、井上　日本農芸化
学会昭和６２年度大会要旨集１）、　３５８　）。次い
で、大腸菌波リグラズムよシサチ２イシンＥ１に単離精
製し、その酵素化学的諸性質′ｆｒ調べたところ、本酵
素は比活性が低いという欠点を有していた。

さて、サチライシンをはじめ有用＃素を有効な触媒とし
て生体外で利用するには、温度、声、酸素、溶媒、圧力
などに対する蛋白質の安定性分高める必要がある。

特に温度；即ち熱安定性を高める試みが部位特異変異技
術を用いたいわゆるプロティンエンジニアリングによシ
盛んに行なわれている。例えば、サチライシンに関して
もＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｌｑｕｅ−ｆａｃｉ
ｅｎｓ由来のサチライシンＢＰＮ’（本発明のサチライ
シンＥとは異なる）で２個のシスティンを部位特異変異
で導入し、酸化的に結合させたジスルフィド結合による
安定化が試みられているが（ＷｅｌｌｓらＪ、Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈａｍ、、　２６１．６５６４−６５７０（１９
８６）　＋　ＰａｎｔｏｌｉａｎｏらＢｉｏｃｈｅｒｎ
ｉｓｔｒｙ　ｒ　２６　＋２０７７−２０８２　（１９
８７））　、ジスルフィド結合の導入位置が適当でない
ためかあまシ成功していない。

従って、本発明の目的は、サチライシンＥ遺伝子を変異
し、比活性及び熱安定性の向上した変異型サチライシン
Ｅｌ提供することにある。

本発明者等は、野生型サチライシンＥ酵素中の１〜２個
のアミノ酸をそれぞれ°他のアミノ酸に置換することよ
り、野生型に比べて比活性、熱安定性の向上した変異型
サチライシンＥｉ提供することができ、本発明を完成す
るに至らしめた。

即ち、本発明は野生型枯草菌サチライシンＥ酵素中の１
〜２個のアミノ酸を野生型とは異なる他のアミノ酸に置
換したものである変異型サチライシンＥ酵素である。

本発明に係る変異型サチライシンＥの具体例を示すと、
野生型のサチライシンＥの活性中心近傍に存在するＮ末
端から３１番目のイソロイシンを部位特異的変異によシ
ロイシンに変換した変異型並びに、野生型サチライシン
ＥのＮ末端かう６１番目のグリシン及び９８番目のセリ
ンを部位特異変異によシシステインに変換し、ジスルフ
ィド結合を導入した変異体である。

もちろん、本発明は上記具体例に限るものではなく、枯
草菌（バチルスズブチリス）由来のサチライシンＥの変
異体全てを含むものである。

さて、以下に本発明の詳細な説明する。

本発明において、置換されるアミノ酸の数は通常１〜２
個である。次に本発明で用いた部位特異的変異を説明す
ると、部位特異的変異とは二本鎖ＤＮＡグラスミドに組
み込んだ遺伝子を鋳型にして、変異目的部位に塩基置換
（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を有する合成オリゴヌクレオチド
を変異原とするＹ　、　Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２　、　６３６−６３９（１９
８４））の方法を改変したものである。なお、部位特異
的変異の方法としてはこの他に種々の方法、例えばＳｍ
１ｔｈら（Ｇｏｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　
Ｖａｌｅ　３　＋　ｐｍ　１−３２　＋　Ｓｅｔｌｏｗ
　＊　Ｊ−ａｎｄ　Ｈｏ１ｌａｅｎｄａｒ、　Ａ、（ａ
ｄｓ、）Ｐｌａｎｕｍａ　　ＮｅＷ　　Ｙｏｒｋ）　　
、　　Ｖｌａｓｕｋ　　ら　（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
＋Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｇｅｎｅ　Ｅ
ｘｐｒｅｓａｉｏｎ　＃　　Ｉｎｏｕｙｓ　會Ｍ（ａｄ
）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　、　ＮＩＩＷ　Ｙ
ｏｒｋ）の方法をもちいてもよい。

変異のための鋳型としては枯草菌バチルス　ズブチリス
１６８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　１６８
）よシフローン化した野生型サチライシンＥの遺伝子を
大腸菌のプラスミドベクターｐＴＮｌｌ　ｏｍｐＡ　（
Ｇｈｒａｙｅｂ　Ｃ）　＊ＥＭＢＯＪ、　３　、　２４
３７−２４４２（１９８４））のり？プロティンブロモ
−ター・ｔａｃプロモーターオベレーター・ｏｍｐＡシ
グナルイプチドの下流に組み込んだものを使用する。宿
主菌としては、大腸菌ＪＡ　２２１（Ｎａｋａｍｕｒａ
ら、Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ＊ｔ、　１　１
２８９−２９９　（１９８２）　）　ｔ−使用して、変
異型サチライシンＥの生産は、インプロビル−β−チオ
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によってｔａｅ
オペレータの抑制を解除し、リポプロティンプロモーＩ
　　ｓ　ｔａｃプロモーターを誘導することによって変
異型サチライシンＥ遺伝子を大腸菌ＪＡ　２２１（以下
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＡ　２２１　　と略する。）中で発
現させることによシ行なう。こうしてＥｓｃｈｅｒｉｅ
ｈｌａｃｏｌｉ　（以下ｌｉ１：、ｃｏｌｉと略する）
中で生産された変異型サチライシンＥは細胞のペリプラ
ズムに著量蓄積される（他郷、高木、森永、弁上、日本
農芸化学会、昭和６２年度大会要旨集　１）−３５８）
。以下、常法に従ってペリプラズムから浸透圧ショック
法（Ｋｏｓｈｌａｎｄら、Ｃａ１ｌ　、　２０　、７４
９（１９８０）　）によって４リプラズム画分のタン／
４′り質を抽出し、これを限外濾過濃縮にて高分子画分
を集め濃縮後、ＣＭセルロースカラム（ミリボア製、　
ＳＥＰ　−ＰＡＫなど）で分別することによ、９　ＳＤ
Ｓ電気電気的動的一にまで変異型サチライシンＥｔ−精
製できる。なお、変異型サチライシンＥの生産は以上の
ようにＥ　＊　ｃ　ｏ　１１を宿主としてもちいる方法
に限定されるわけでなく枯草菌を宿主とする組換えＤＮ
Ａ法によってもまた変異した遺伝子を枯草菌の染色体に
相同組換えを利用して野生型遺伝子と入れかえてやるこ
とも可能でいかなる方法でもよい。また、精製法も上記
方法に制限されるものではない。

以下実施例をもって、変異型サチライシンＥの構築方法
、Ｅ、ｅｏｌｉにおける発現生産、酵素化学的性質につ
いて示す。

〔実施例１〕 野生型サチライシンのＮ末端よシ３１番目のｌｉｅ　ｆ
各種アミノ酸で置換した変異体を以下のように構築した
。

野生型サチライシンＥのＤＮＡ塩基配列を第１図に示す
。この酵素と類縁のバチルス・アミロリクイファシェン
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕａｆａｅｉ
＊ｎｓ　）由来のサチライシンＢＰＮ’では３２番目の
Ａｓｐ　。

６４番目Ｈｉｓ、２２１番目Ｓｅｔが活性中心を形成し
ていることが知られている（　Ｍａｒｋｌａｎｄ＋　Ｆ
−８゜ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ＋　Ｅ、Ｌ＋　Ｔｈｅ　Ｅｎ
ｚｙｍｅｓ　＋　Ｖｏｌ＊　３Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ　ｐ　５６１−６０８（１９７１）　）。

本発明者らは活性中心３２番目Ａｓｐ（Ａａｐ３２）の
隣に存在する３１番目１１ｅ　（ｌ１ｅ３１）に着目し
、このアミノ酸残基を他のアミノ酸に変換することによ
って活性の向上した変異型サチライシンＥが得られない
かどうか検討し、疎水性や側鎖などの性質がＴｌｅと関
連する８種類のアミノ酸に置換した変異型サチライシン
Ｅを構築し、その特性を調べた。部位特異変異の概略を
第２図に示す。

１１ｅ　　ｆ各アミノ酸に変換するための変異原オリゴ
ヌクレオチドとしては第３図に示すように各アミノ酸に
対応する合成オリゴヌクレオチド１〜８をそれぞれＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ’に４ちいて５′末端を常法
によりリン酸化して用いた。

一方、変異の鋳型は以下のようにして造成した。

まず第４図に示した野生型ブチ２４フフ８発現グラスミ
ドｐＨｒ　２１２をＰｓｔｌで完全に切断後、ＤＮＡポ
リメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ）で３′に突出した一本鎖Ｄ
ＮＡ部分を削シとシＤＮＡ断片Ｉを得た（第２図）。

また、ｐＨｒ　２１２をＸｂａ　ｌおよびＨｉｎｄｌ［
［で完全に切断した後、変異のターゲット部位、即ちＩ
ｌｅ”をコードするＡＴＣを含む小型のＤＮＡ断片とそ
の他の領域よシなる大型のＤＮＡ断片■とをアガロース
ダル電気泳動で分画し、大型のＤＮＡ断片■をアガロー
スよシ抽出・精製した（第２図）。

以上のように調製した変異原オリゴヌクレオチド、ＤＮ
Ａ断片１１およびｎ　ｆ　１７０　ｍＭ　ＮａＣｔ、　
　１１ｍＭ　Ｔｒｌ　５−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、１４
ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１７　ｍＭβ−メルカグトエタノー
ルを含むバッファー中で混合後、３分間沸とう水中で加
熱しＤＮＡ　＠を一本鎖に解離させた後、徐々に冷却し
て、二本鎖を再構成させると同時に変異の目的部位にオ
リゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた（第２図）。

次にこのＤＮＡ混合液にｄ　ＴＴＰ％ｄＣＴＰ％ｄＡＴ
ＰおよびｄＧＴＰを各０．５　ｍＭになるように、また
ＡＴＰを１ｍＭになるように添加後、ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｋｌｓｎｏｗ）およびＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１
２．５℃で一夜放置して−重鎖ＤＮＡ部分を修復し、閉
場せしめた。その後、このＤＮＡ混合物’ｆ　Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　ＪＡ　２２１に導入しアンピシリン耐性のコロニ
ーを選択した。出現しｆｔ−：ｆｆ　Ｋｆｆ　＝　−（
ｉ−釣シ上げ、アンピシリン５０１１＆１ｍｌを含むＭ
９カザミノ酸培地（組成：カザミノ酸０．２チ、グルコ
ース０．４％、０．８　ｍＭ　Ｍｇ５ｏ４、トリゾ）７
アン５０Ａ９フｍＡ、サイアミン塩酸塩０．５ｐｌｉ／
ｒｎｉ　。

Ｎａ　２ＨＰＯ４０，６％、ＫＨ２ＰＯ４０，３％、Ｎ
ａＣｔＯ，０５％、ＮＨ４Ｃｌ　Ｏ，１ｔｌｙ　）平板
上にのせたＷｈａｔｍａｎ　３　ＭＭ濾紙上にスポット
し、３７℃−夜生育させた。次いでＦ紙を平板よりはが
し、０．５　Ｎ　ＮａＯＨに７分間浸漬を２回縁シ返し
、次に０．５Ｍ　Ｔｒｉｍ−ＨＣｔ（ｐＨ７，４）に３
．５分間浸漬を２回縁シ返し、さらに１　ｘ　ｓｓｃ（
１５０ｍＭＮａＣ６１１５ｍＭクエン酸ソーダｐＨ７，
２＞に３．５分間浸漬を２回縁シ返した後、９５％エタ
ノールに７分間浸漬し振とうした。こうして変性処理を
したｒ紙を乾燥後、８０℃で２時間加熱してＤＮＡをＦ
紙に固定した。

一方、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼをもちいて合成オ
リゴヌクレオチドの５′末端ヲ〔γ−３２Ｐ）　−ＡＴ
Ｐ（３０００Ｃ１／ｍｒｎｏｌ　：　７　マシャＡ社Ｍ
＞テｔＲＷｌｔシタもの’１ＤＮＡグローブとしてもち
いて、叙上の濾紙上に固定したＤＮＡのスポットの中よ
シ合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするものを
選び出した。選び出されたスポットに対応するコロニー
から常法によりプラスミドを抽出精製した後、再びＥ、
ｃｏｌｉ　ＪＡ　２２１に導入しアンピシリン耐性コロ
ニーを選択して、前述２と同様にＤＮＡの変性処理後標
識化した合成オリコ°ヌクレオチドを用いたハイプリダ
イゼーシ、ンで、確実にプラスミド上に、合成オリゴヌ
クレオチドと相補的な配列が存在することを確認した。

次いで、このコロニーからプラスミドＤＮＡ　ｉ抽出し
、サチライシンＥ遺伝子領域の塩基配列を決定し、合成
オリゴヌクレオチドと同様の塩基配列に変異しているこ
と、即ち、１１ｅ３１がそれぞれ８種類のアミノ酸に変
異していることを確認した。

〔実施例２〕 実施例で調製した各種変異型サチライシンＥの特性を調
べた。

野生型サチライシンＥとＮ末端よシ３１番目のＩｌｅを
他のアミノ酸に置換した各種変異型サチライシンＥの比
活性を調べた結果を第１表に示す。

この結果よｌ）　、Ｉｌｅ　３１をＬｅｕに置換すると
活性が５倍以上に増大すること、また、Ｖａｌｉ除くそ
の他のアミノ酸（Ｔｈｒ　ｒ　Ｃｙｓ　＋　Ｓｅｒ　＋
　Ｇｌｙ　＋　Ａｌａ　＋　Ｐｈａ　）では活性が著し
く低下することが示された。尚、これらの変異型サチラ
イシンＥは０．１３ｍＭ　５ｕｃｅｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌ
ａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉｔ
ｒｏａｎｉｌｉｄｅ　　を基質として、３７℃で反応さ
れることにょシ測定した。尚、以下、野生型サチライシ
ンＥの３１番目のＨｅをＬｅｕに変換した変異体を変異
型Ｌｅｕ３１サチライシンＥと称する。

風下余白 表１表　野生型サチライシンＥと各種変異型サチライシ
ンＥの比活性の比較 比活性（相対値）＊ 野生型　ＩＩｓ　３１　　１．０ 変異型　Ｔｈｒ　３１　　０．００２ Ｇｙｓ　　３１　　　　０．０２ Ｓｓｒ　　３１　　　　　０．００１ Ｇｌｙ　　３１　　　　０．００１ Ａ１ｍ　　３１　　　　０．０１ Ｍａｌ　　３１　　　　　０．８ Ｌｓｕ　　３１　　　　　５．２ Ｐｈｅ　　３１　　　　　０．０３ ＊　　０．１３　ｍＭ　　５ｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌ
ａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈａ−ｐ−ｎｌｔ
ｒｏａｎ目１ｄａを基質として３７℃反応時の活性の相
対値 〔実施例３〕 次に変異型Ｌｅｕ　　サチライシンＥの特性について解
析した。

変異型Ｌｅｕ”サチライシンＥの遺伝子を組み込ンＥの
遺伝子を組み込んだプラスミドｐＨＩ　２１２を保有す
るＥ、ｃｏｌｌ　ＪＡ　２２１　ｆ、アンピシリン５０
μム冗。

１　ｍＭ　ＣａＣＺ２ｆ！：含むＭ９カザミノ酸培地で
３７℃２時間振とり培養後、培養温度を２３℃に下げ、
ＩＰＴＧ　ｆ　１　ｍＭとなるよう添加しさらに４時間
２３℃で振とうした。次いでこの培養液１１を遠心分離
により集菌後、菌体を２０チシユークロース、１０　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　・ＨＣＬ　（ｐＨ７，５）　５０　ｍＡ
に懸濁し、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｄ４８．０　）　２
．５　ｄを添加後、３０分間水中に放置した。１２００
０　ｒｐｍ、１０分間遠心し、上澄と菌体を分離後、菌
体画分を蒸留水４５ｄに懸濁し３０分間水中に放置後、
５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣＬ（ｐＨ８，０）　１０　
ｍＭ　ＣａＣＬ２５ｍＪを添加し、１２０００ｒｐｍ、
１０分間遠心し、上澄と菌体を分離した。

次にこれらの上澄液を合わせて、限外濾過にょシ５０反
にまで濃縮後、３８０００　ｒｐｍ、６０分間超遠心し
た。その上澄を０Ｍ５２カラムにて処理して、ＳＤＳ電
気電気的動的一になるまで変異型Ｌａｕ３１サチライシ
ンＥおよび野生型サチライシンＥｉ精製した。

次に、この精製標品をもちいて各酵素の特性を比較検討
した。

第５図には、１０℃から６５℃までの温度域での５ｕｃ
ｅｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ
−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎ目１ｄｅ　　全１ｄｅす
る比活性を比較した結果を示す。いずれの温度において
も変異型１ｅｕ３１サチライシンＥは野生型の５〜６倍
の比活性を示した。

第６図には、５０℃および６０Ｃにおける熱安定性を示
した。５０℃においてはいずれのサチライシンＥも安定
であったが、６０℃では変異型は野生型に比べやや安定
性が低いものの、はとんど同様に活性低下を起こすこと
から、両者とも熱安定性には大きな違いはないものと考
えられた。

第７図には、基質（５ｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ
−Ａｌｔ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａ
ｎｉｌｉｄｓ　）　　濃度と反応速度の逆数プロット（
Ｌｉｎａｗｅａｖｅｒ　Ｂｕｒｋグロット）を示したが
、この結果よシ、各酵素のＫｍ　＋　ｋｃａｔ　。

ｋｃａｔ／Ｋｙｎ値はそれぞれ第２表のようになシ、変
異型Ｌｅｕ　３１サチライシンＥは野生型に比べｂ値は
ほとんど変らないが、ｋｃａｔ値が５．５倍で、ｋｃａ
ｔ　／　Ｋｍの値が５．２倍に上昇していた。

第２表　変異型Ｌｅｕ　３１サチライシンＥと野生型サ
チライシンＥの反応速度ツクラメ −ター Ｋｍ　　　ｋｃａｔ　　　ｋｃａｔ／　Ｋｍ〔実施例４
〕 野生型サチライシンＥとほとんど変わらないが、変異型
Ｌｅｕ−３１サチライシンＥの酵素化学的諸性質を以下
に示した。

（、）作用　　：タンパク質のポリ被グチド鎖を切断す
るグロテアーゼ作用の他にエステ ラーゼ作用も有していた。

（ｂ）基質特異性：かなシ広範囲のベグチド結合に作用
するが、−船釣に芳香族アミノ酸 （’［’ｙｒ　、　Ｐｈｅ　）やＬａｕ　ｒ　Ａｌａの
Ｃ末端側を切断する活性が強いことが知られて いる。さらに変異型Ｌｅｕ　　サチライシンは天然基質
であるカゼイン蛋白 の分解活性も野生型に比べ約２倍増 加していた。

（ｃ）至適−：基質により若干異なるが弱アルカリ性で
ある。５ｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ　−
Ｌ−Ｐｒ　ｏ−Ｌ−Ｐｈｓ−ｐ−ｎ　ｉ　ｔｒ　ｏａｎ
　ｉ　ｌ　ｉ　ｄｏ　を基質とした場合の至連声は８．
５〜９．０であった・ （ｄ）　ｐＨ安定性：ｐＨ５以下では不可逆的に変性失
活した。

（、）金属イオンの影響：　Ｃａ２＋の存在で安定性が
向上した。

（ｆ）阻割剤の影響：インドール、フェノール、ヒドロ
キシケイ皮酸、ジイソプロピルフ ルオロリン［（ＤＦＰ）　、フェニルメタンスルホニル
フルオリド（ＰＭＳＦ）　、　タンハク質性のサチライ
シンインヒビ ターにより阻害された。

（ｇ）熱安定性：野生型とほとんど同程度の熱安定性を
示した。すなわち５０℃で３０分 処理後も活性の低下はみられなかっ た。

（ｈ）分子量　：約２７０００（ダル電気原電による測
定） 尚、念の為に、変異型Ｌｅｕ−３１サチライシンＥのア
ミノ酸配列を第８図に示した。

〔実施例５〕 ＹＴ−１が菌体外に分泌し、各種サチライシンと一次構
造の相同性の高いアルカリ性セリングロテアーゼ、アク
アライシンＩの知見をもとにサチライシンＥにジスルフ
ィド結合を導入して熱安定性を高めることを試みた。

即ち、アクアライシン■は２８１アミノ酸残基から成る
分子量的２８３ｆｆＯのアルカリ性セリンプロテアーゼ
で８０℃付近に至適温度がある耐熱性酵素である（　Ｍ
ａｔｓｕｚａｗａらＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ　
。

１７１　４４１−４４７（１９８８）　）。アクアライ
シンＩとサチライシンＥとのアミノ酸配列を比較した結
果、アクアライシンＩはサチライシンＥと相同性が高く
（３８憾）、　　　　− 卒ブ妻湘　　　　　　　４同？Ｌかも分子内に耐熱性の
原因の１つと考えられるＣｙｓによるジスルフィド結合
が６７番目と９９番目のＣｙｓ間（Ｃｙｓ　６７／　Ｃ
ｙｓ　９９　）及び１６３６３番目９４９４番Ｃｙｓ間
（Ｃｙｓ　１６３／　Ｃｙｓ　１９４　）の２ケ所に存
在しており、　Ｃｙｓの存在しないサチライシンにも相
等する位置に部位特異変異でＣｙｓを入れてジスルフィ
ド結合を導入すれば熱安定性の向上したサチライシンＥ
に改変できると考えた。

そこでアクアライシンＩの２ケ所のジスルフィド結合に
相等する位置のうち、アミノ酸残基間の距離が短く、ジ
スルフィド結合をとり得る可能性のよシ高いアミノ末端
側（Ｃｙｓ　６７／　Ｃｙｓ　９９）に対応するアミノ
酸残基に着目し、サチライシンＥの６１番目のＧｌｙ　
（以下Ｇ］７６１とする）及び９８番目のＳｏｒ　（以
下Ｓｓｒ　９８とする）をそれぞれｃｙｓに置換した変
異型サチライシンＥを構築し、その特性を調べた。

第９図に示すようなＧｌｙ　６１及び／又はＳｅｒ　９
８ｆｃｙｓに変換させるような変異原オリゴヌクレオチ
ドを用いる以外、実施例１と同様の方法で部位特異変異
を行った。

尚、調製した変異体はＤＮＡ塩基配列の結果から野生型
サチライシンＥのＮ末端からのＧｌ）Ｆ　６１　及び／
又はＳｅｒ　９８がそれぞれＣｙｓに変換されていた。

〔実施例６〕 実施例５で調製した各種変異型サチライシンＥの特性に
ついて調べた。即ち、 （１）野生型サチライシンＥのＮ末端から６１番目のＧ
ｌｙ及び９８番目のＳｅｔの両方をＣｙＳで置換した変
異型サチライシンＥ（以下変異型Ｃｙｓ　６１／ＣＦ＋
１９８サチライシンＥと称する）の遺伝子を（ｉｉ）　
　野生型サチライシンＥのＮ末端から６１番目のＧ１７
のみがＣｙｓに変換された変異型サチライシンＥ（以下
、変異型Ｃｙｓ６１サチライシンＥと称する）の遺伝子
を組み込んだグラスミドｐＨＴＣ６１ヲ含有するＥ、　
ｃｏｌｔ　ＪＡ　２２１、仙）野生型サチライシンＥの
Ｎ末端から９８番目のＳｅｔのみがＣｙｓに変換された
変異型サチライシンＥ（以下、変異型Ｃ７１１９８サチ
ライシンＥと称する）の遺伝子を組み込んだグラスミド
ｐＨＴＣ９８を含有するＥ、　ｃｏｌｔ　ＪＡ　２２１
　及びＧＪ　　野生型サチライシンＥの遺伝子を組み込
んだシラスミドｐＨ７２１２ を保有する旦、ｃｏｌｉ　ＪＡ　２２１　　について調
らべたわけである。

さて、上記（１）　、　（ｉｉ）　、　（ｉｉｉ）　、
　（ｉｖｌの微生物をアンビシリフ　５０　ｆｉ９／ｒ
ａｉ　、　１　ｍＭ　ＣａＣｔ２′ｆ：含むＭ９カザミ
ノ酸培地で３７℃２時間振とう培養後、培養温度を２３
℃に下げ、ＩＰＴＧ　ｆ　１　ｍＭとなるよう添加しさ
らに４時間２３℃で振とうした。次いでこの培養液１１
を遠心分離により集菌後、菌体を２０４シー−クロース
、１０ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）　５０Ｍ
に懸濁し、０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨｓ、ｏ）　２
．ｓｍｔを添加後、３０分間水中に放置した。１２００
０　ｒｐｍ、１０分間遠心し、上澄と菌体を分離後、菌
体画分を蒸留水４５ｄに懸濁し３０分間水中に放置後、
５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐ）（８，０）　１０
ｍＭ　ＣａＣｔ２５　ｍｌを添加し、１２０００ｒｐｍ
、１０分間遠心し、上澄と菌体を分離した。次にこれら
の上澄液を合わせて、限外濾過により５０ｒＩＬｔにま
で濃縮後、３８０００ｒｐｍｓ６０分間超遠心した。そ
の上澄を０Ｍ５２カラムにて処理して、ＳＤＳ電気泳動
的に単一になるまで変異型Ｃｙｇ　６１／　Ｃｙｓ　９
８　＊変異型Ｃｙａ６１．変異型Ｃｙａ９８　　および
野生型サチライシンＥを精製した。

次に、この精製標品を用いて各酵素の特性を比較検討し
た。第３表には基質（５ｕｃｅｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａ−
Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈａ−ｐ−ｎｉｔｒｏ
ａｎｉｌｉｄｅ　）濃度と反応速度の逆数ゾ０ット（Ｌ
ｌｎｅｗｅａｖｅｒ　Ｂｕｒｋ　７’＋：１ツト）から
求めた各酵素のＫｍ　、　ｋｃａｔ　、　ｋｃａｔ／　
Ｋｍ値を示した。

ジスルフィド結合を導入した変異型Ｃｙｓ６１／Ｃｙｓ
　９８　　サチライシンＥのみがＫｍ　＋　ｋｃａｔ　
、ｋｃａｔ／脂値について野生型とほとんど変わってお
らず、野生型と同程度の活性を保持していた。

双下企白 第３表　各種変異型サチライシンＥと野生型サチライシ
ンＥの反応速度パラメー ター 第４表には、各温度における各酵素の活性半減期を比較
した結果を示した。いずれの温度においても変異型Ｃｙ
ａ　６１　／　Ｃｙｓ　９８サチライシンＥのみが野生
型の２〜３倍半減期が長くなシ、熱安定性が向上した。

第５表には、各酵素の熱安定性における還元剤ジチオス
レイトールの影響を調べた結果を示した。

ジチオスレイトール存在下では変異型Ｃｙｓ　６１／Ｃ
ｙｓ　９８サチライシンＥは野生型と同じ挙動を示すこ
とから、変異型Ｃｙｓ　６１／Ｃｙｓ　９８サチライシ
ンＥの熱安定性ノ向上はジスルフィド結合によるものと
考えられた。

第４表　各種変異型サチライシンＥと野生型サチライシ
ンＥの熱安定性 第１０図には、１０℃から７５℃までの温度域での５ｕ
ｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−
Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ　　ｆ基質
とする相対活性を比較した結果を示す。両酵素とも至適
温度は５０℃〜５５℃であったが、変異型Ｃｙｓ　６１
／　Ｃｙｓ　９８サチライシンＥは野生型に比べて６０
℃以上でもかな多安定であった。

〔実施例７〕 野生型サチライシンＥとほとんど変わらないが、変異型
Ｃｙ＋＋　６１／　Ｃｙｓ　９８　サチライシンＥの酵
素化学的諸性質を以下に示した。

（、）作用　　：タン・臂り質のポリ被ゾチド類を切断
するプロテアーゼ作用の他にエステ ラーゼ作用も有していた。

（ｂ）基質特異性：かなシ広範囲の被プチド結合に作用
するが、−船釣に芳香族アミノ酸 （Ｔｙｒ　、　Ｐｈｅ）や’Ｌｅｕ　＋　ＡｌａのＣ末
端側を切断する活性が強いことが知られ ている。

（Ｃ）至適ＰＨ：基質によシ若干異なるが弱アルカリ性
である。５ｕｃｃｊｎｙｌ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−
Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−１）−ｎｉｔｒｏａｎｉ　１
ｉｄｓ　　を基質とした場合の至適−は８．５〜９．０
であった。

（ｄ）　ｐＨ安定性ニー１５以下では不可逆的に変性失
活した。

（、）金属イオンの影響：Ｃａ２＋の存在で安定性が向
上した。

（ｆ）阻割剤の影響：インドール、フェノール、ヒドロ
キシケイ皮酸、ジイソノロビルフルオ ＣＩ　！Ｊ　ｙｌ　（ＤＦＰ　）、フェニルメタンスル
ホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、タンノ４り質性のサチ
ライシンインヒビタ ーにより阻害された。

尭キ （ｈ）分子量　：約２７０００　（ダル電気原電による
測定） 尚、念の為に第１１図に変異型Ｃｙｓ　６１／Ｃｙｓ　
９８サチライシンＥのアミノ酸配列を示した。

効果 本発明に係る変異型サチライシンＥ酵素は、従来の野生
型サチライシンＥの特性を更に好ましく改変したもので
ある。

具体的には、野生型サチライシンＥ酵素のＮ末端よシ３
１３１番目１ｅｉＬｅｕに変異させた変異型Ｌｅｕ３１
サチライシンＥ酵素は野生型サチライシンＥに比較して
熱安定性は同等で、しかも比活性が著しく高いという特
性を有する。

また一方、野生型サチライシンＥ酵素のアミノ末端より
６１番目のＧｌｙｓおよび９８番目のＳｅｒをそれぞれ
Ｃｙｓに変異させ、分子内にジスルフィド結合を導入し
た変異型Ｃｙｓ　６１／　Ｃｙｓ　９８　サチライシン
Ｅ酵素は野生型サチライシンＥと同程度の活性を保持し
、しかも熱安定性が著しく向上するという特性を有する
。

本発明に係る技術はサチライシンＥ以外の各種サチライ
シン酵素（ＢＰＮ’　＋　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　。

とが示唆されることから極めて汎用性の高い技術である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は野生型サチライシンのＤＮＡ及びアミノ酸配列
を示す。 第２図は部位特異的変異の概略を示す。 第３図は野生型サチライシンＥのＮ末端から３１番目の
ＩＩｓ　ｆ変異する為に使用した合成オリコ゛ヌクレオ
チド■〜■の構造を示す。 第４図はグラスミドｐＨ１２１２の構造を示す。 第５図は野生型及び変異型Ｌｅｕ　３１サチライシンＥ
反応温度と活性を示す。 第６図は野生型及び変異型ｌｅｕ　３１サチライシンＥ
熱安定性を示す。 第７図は野生型及び変異型Ｌｅｕ　３１サチライシンＥ
のラインライ−パーパークプロットを示す。 第８図は変異型Ｌｅｕ　３１サチライシンＥのアミノ酸
配列を示す。 第９図は野生型サチライシンＥのＮ末端から６１番目の
ＧＩＦ及び／又は９８番目のＳｅｒをＣｙｓに置換する
為に用いた合成オリゴヌクレオチド■〜■の構造を示す
。 第１０図は野生型および変異型Ｃｙｓ　６１／Ｃｙｓ　
９８サチライシンＥの反応温度と相対活性を示す。 第１１図は変異型Ｃｙｓ　６１／Ｃｙｓ　９８サチライ
シンＥのアミノ酸配列を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）野生型枯草菌サチライシンＥ酵素中の１〜２個の
   アミノ酸をそれぞれ野生型とは異なる他のアミノ酸に置
   換したものである変異型枯草菌サチライシンＥ酵素。
2. （２）野生型枯草菌サチライシンＥ酵素のＮ末端より３
   １番目のイソロイシンをロイシンに変換したものである
   請求項（１）記載の変異型サチライシンＥ酵素。
3. （３）野生型枯草菌サチライシンＥ酵素のＮ末端より６
   １番目のグリシン及び９８番目のセリンをそれぞれシス
   テインに変換したものである請求項（１）記載の変異型
   枯草菌サチライシンＥ酵素。