JPH01137973A - アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法およ
び用途に関する。

〔従来の技術〕

光学活性なＮ−アシル−α−アミノカルボン酸（以下Ｎ
ａ−アシルアミノ酸と称する）を対応する光学不活性な
り　Ｌ　−Ｎ−アシルアミノ酸にラセミ化する反応は、
光学活性アミノ酸の製造に利用されている重要な反応で
ある。

光学活性なＮ（１−アシルアミノ酸をラセミ化し、Ｄ　
Ｌ−Ｎ　″−アンルアミノ酸を製造する方法としては、
例えば、酢酸中で当量以下の無水酢酸と加熱する方法〔
ビオヒエミッシェ・ツァイトシュリフト（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ　Ｚ、）、２０３，２８０（１９２９））　。

多量の無水酢酸と室温で処理する方法〔ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ、　Ａｍ
、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）、５４．１６３０（１９３
２））、燐酸トリエステル、低級脂肪酸等の溶媒中で加
熱する方法〔特公昭５１−＋８４０２）、窒素気流下に
光学活性Ｎａ−アシルアミノ酸を約１６０’Ｃにて直接
加熱する方法〔特開昭６１−１２６０５８〕、触媒量の
脱水剤を加え芳香族炭化水素の存在下１３０℃以」二で
加熱する方法〔特開昭６１−１６５３５４　）など、物
理的あるいは化学的ラセミ化法については古くより今日
に至るまで枚挙に暇がない程発表されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

Ｄ−Ｎ　　−アシルアミノ酸のラセミ化法は、光学活性
α−アミノ酸を製造するためにアミノアシラーゼと組み
合わせて使用される。すなわち原料である安価なりＬ−
Ｎａ−アシルアミノ酸にアミノアシラーゼを作用せしめ
、Ｌ−Ｎ“−アシルアミノ酸のみを加水分解してＬ−α
−アミノ酸に変換したのち、物理的性質の違いを利用し
てＬ−α−アミノ酸とＤ−Ｎａ−アシルアミノ酸を相互
に分離し、それぞれを単離する。ついてＤ−Ｎａ−アシ
ルアミノ酸に上記のラセミ化法のいずれかを適用して原
料であるＤＬ−Ｎａ−アシルアミノ酸に変換し、再度ア
ミノアシラーゼを作用させる。

これを繰り返すことにより原料であるＤＬ−Ｎ”−アシ
ルアミノ酸を光学活性なＬ−α−アミノ酸に１００％変
換することができる。しかし、この方法には大きな欠点
がある。それはアミノアノラーゼを作用させた後にＬ−
α−アミノ酸とＮａ−アシルアミノ酸とを相互に分離す
るための分離操作が必要であること、およびＤ−Ｎ“−
アンルアミノ酸についてはこれを固体状に単離したのち
化学的にあるいは物理的に厳しい条件に曝してラセミ化
操作を施さねばならないことである。

もし、このラセミ化反応がアミノアシラーゼの　゛失活
しない条件（常温、常圧、中性付近の水溶液中という条
件）下で、しかもＬ−α−アミノ酸とＤ−Ｎａ−アシル
アミノ酸を分離することなく、光学活性アミノ酸の共存
下に、Ｄ−Ｎ　−アンルアミノ酸についてだけ選択的に
実施することができるならば、この選択的ラセミ化とア
ミノアシラーゼとの共同作業により、原料であるＤＬ−
Ｎａ−アシルアミノ酸を一段階で目的のＬ−α−アミノ
酸に１００％変換することが可能となり、従来技術に不
可欠な分離操作とラセミ化操作を省略することができ、
光学活性アミノ酸の製造プロセスを飛躍的に効率化する
ことが可能となる。

しかし温和な条件下で選択的にラセミ化を行うことは従
来技術では不可能である。この目的を達成するための一
つの手段として考えられるのは、−光学活性なＮ“−ア
ンルアミノ酸に作用してこれをラセミ化するが、しかし
対応する光学活性なα一アミノ酸には作用しないという
選択性をもつ酵素またはラセミ化剤を入手することであ
る。しかしながらこのような触媒作用を示す酵素または
ラセミ化剤は、今日に至るまで全く知られていない。

なおＮ　−アンルアミノ酸には作用しないが光学活性α
−アミノ酸に作用してこれをラセミ化する酵素いわゆる
アミノ酸ラセマーゼの存在することはよく知られている
〔例えばバイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍ、）。

川、３６３（１９６９））。しかし、この目的に使用し
得ないことは明らかである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは鋭意探索研究を続けた結果、光学活性アミ
ノ酸には作用せず、光学活性Ｎ１２−アシルアミノ酸に
作用してこれをラセミ化する酵素が自然界に存在するこ
とを初めて明らかにし、本酵素をアシルアミノ酸ラセマ
ーゼと命名した。さらに、アシルアミノ酸ラセマーゼを
用いてＤＬ−Ｎｏ−アンルアミノ酸から光学活性のα−
アミノ酸を製造する方法を確立した。

すなわち本発明は、 （１）下記性状を有する酵素、アシルアミノ酸ラセマー
ゼ。

１）Ｄ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸を、対応す
るＬ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸に変換する。

１ｉ）Ｌ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸を、対応
するＤ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸に変換する
。

ｉｉｉ）Ｄ−α−アミノ酸を、対応するＬ−α−アミノ
酸に変換しない。

ｉｖ）Ｌ−α−アミノ酸を、対応するＤ−α−アミノ酸
に変換しない。

（２）アシルアミノ酸ラセマーゼ生産能を有する微生物
を培地に培養し、該酵素を培養物中に生成。

蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記アシ
ルアミノ酸ラセマーゼの製造法、および（３）　　ＤＬ
−Ｎ−アシル−α−アシルアミノ酸に、り−またはＬ−
アミノアシラーゼの共存下請求項（１）記載のアシルア
ミノ酸ラセマーゼを作用させることを特徴とする光学活
性のＤ−またはＬ−α−アミノ酸の製造法を提供するも
のである。

上記Ｎ“−アシルアミノ酸およびα−アミノ酸に関し、
α−アミノ酸は天然型、非天然型のいずれでもよい。ま
た中性、塩基性、酸性のいずれのα−アミノ酸でもよい
。

上記Ｎ　−アシルアミノ酸として、例えば一般式 ％式％（１） ［式中、Ｘは置換基を有していてもよいカルボン酸由来
のアシルを、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜
２０のアルキルを示す］で表わされる化合物が挙げられ
る。

Ｎａ−アシルアミノ酸のアシル基（Ｘ）に関し、アルカ
ノイル、ベンゾイル、アリールアルカノイルなどのカル
ホン酸アシルが挙げられ、これらのアンル基は置換基（
例、ハロゲン、Ｃｌ−３アルキル。

Ｃ８−３アルコキシなど）を有していてもよい。上記ア
ルカノイルとして例えばホルミル、アセチル、プロピオ
ニル、クロロアセチルなどＣ１−３のアルカノイルが挙
げられ、ベンゾイルとして例えばベンゾイル、ｐ−クロ
ロベンゾイルなどが、アリールアルカノイルとして例え
ばフェニルアセチル、フェニルプロピオニルなどフェニ
ル−０１−３アルカノイルが挙げられる。

また、Ｒで表わされるアルキルとして、直鎖状または分
枝状のアルキル、ヒドロキシ、Ｃｌ−３アルキルチオ、
チオール、フェニル、ヒドロキシフェニルもしくはイン
ドリルで置換されたＣｌ−３アルキルおよびアミノ、カ
ルボキシ、グアニジルもしくはイミダゾリルなどで置換
されたＣ１−４アルキルなどが挙げられる。

アシルアミノ酸ラセマーゼの生産菌は、例えば次の手順
で見い出すことができる。すなわち、天然界から分離し
た微生物あるいは菌株保存センターから入手し得る微生
物を常法（必要に応じ、培地に該酵素を誘導するあるい
は該酵素の生産を促進する化合物例えば該酵素の基質等
あるいは金属塩等を添加する）にしたがって培養し、得
られた培養物から菌体を集め、必要があれば緩衝液など
で洗浄したのち、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンおよび
硫酸マグネシウムの適当量を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７
）中にこの菌体を懸澗し、３０℃で一夜振盪して反応さ
せる。反応液から菌体を除いたのち、反応上清にＬ−ア
ミノアシラーゼおよび必要があれば塩化コバルトを一定
量添加し、３７°Ｃで数時間反応させたのち、Ｔ　Ｌ　
Ｃ（ｎ−ブタノール、酢酸・水−３・１・１）にかけ、
ニンヒドリン発色によりメチオニンのスポットを与える
反応液を選び、ついでニンヒドリン反応および／または
高速液体クロマトグラフィにより反応液中のメチオニン
量を測定する。メチオニン陽性の反応液についてはさら
にＤ−アミノ酸オキシダーゼ溶液を添加し３０°Ｃで２
０時間反応させてＤ−メチオニンを分解したのち再びニ
ンヒドリン反応、高速液体クロマトグラフィおよび／ま
たはペディオコッカス・アシディラクヂＡＴＣＣ８０４
２を用いるバイオアッセー〔ジャーヤル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
）、上７７．５３３（１９４９））にかけて反応液中の
残存メチオニンすなわちＬ−メチオニンの量を測定する
。こうしてＬ−メチオニン陽性の反応液を与えた菌株は
、Ｎ−アセデル＝Ｄ−メチオニンからＬ−メヂオニンを
生成する能力を有するのであるから、この菌株はアソル
アミノ酸ラセマーゼあるいはアミノ酸ラセマーゼのいず
れかまたは両方を生産するけずである。

そこで次にＬ−メチオニン陽性株を再度同条件で培養し
て菌体懸澗液を調製し、これにＮ−アセデル−Ｄ−メチ
オニンの代りにＬ−メチオニンを添加し、同様に反応さ
せる。除菌後反応液中のＩ）−メチオニンの量をＤ−ア
ミノ酸オギンダーゼ、ペロオキシダーゼ、フェノールお
よび４−アミノアンチピリンを用いる比色法〔クリニカ
ル・ケミストリー（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｍ、）且、４．
７０（１９７４））　。

で定量し、Ｄ−メチオニン陰性の菌株を選択する。

ここに用いたＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンの代りに他
のＩ）−Ｎｃｌ−アシルアミノ酸を用いてもよい。こう
して、アミノ酸ラセマーゼ活性を示さず、Ｄ−Ｎｃｔ−
アシルアミノ酸から対応するＬ−α−アミノ酸を生成す
る株を選択すれば、アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌を
取得することができる。

次にこの方法によって見い出されたＮ−アシルアミノ酸
ラセマーゼ生産菌を表１に示す。

（以下余白） 表Ｉ ＝１２− 表１に例示したアノルアミノ酸ラセマーゼ生産菌はたま
たま放線菌に属しているが、」二記の方法で見出し得る
アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌であれば、それらが放
線菌、細菌、かび、酵母、きのこのいずれに属する微生
物であっても本発明に使用し得る。

次に京都嵐山の土壌から分離したアシルアミノ酸ラセマ
ーゼ生産菌（表１にストレプトミセス・スピーシーズＹ
−５３として表示）の菌学的性質を示すと、下記の通り
である。

（ａ）形態 胞子形成菌糸は単純分枝を示し、その形態はフック状、
ループ状、まれに２−３巻の緩いコイル状（Ｒｅｔｉｎ
ａｃｕｌｕｍ−Ａｐｅｒｔｕｍ（ＲＡ））を呈する。胞
子は１０個以上鎖状に連らなり、円柱状（０，’ｌ−０
．９Ｘ１．ｌ−１．５μｍ）を呈し、その表面は平滑で
ある。胞子の運動性は観察されない。特殊構造体も観察
されない。細胞壁成分のジアミノピメリン酸はＬＬ型で
、糖については特徴的な糖は検出されない。細胞壁組成
はタイプＩに属する。

（ｂ）各種培地における生育状態 Ｙ−５３株の各種培地上の生育状態は表２に示す通りで
ある。括弧内に示す色の記号はコンテナー・コーポレー
シヨン・オブ・アメリカ社製のカラー・ハーモニー・マ
ニュアル第４版に記載のものを用いた。

（以下余白） ＝１６− （Ｃ）生理的性質 ■生育温度範囲、イースト・麦芽寒天培地上。

１４−３７°Ｃ（最適生育温度２０−３０’Ｃ）■ゼラ
チンの液化：陽性 ■スターチの加水分解：陽性 ■脱脂牛乳の凝固：陰性 脱脂牛乳のペプトン化、陽性 ■メラニン様色素の生成、陰性 （ｄ）炭素源の同化性 陽性：クルコース、キノロース、ラムノース擬陽性：フ
ラクトース 陰　性アラビノース、シュクロース、ラフィノース、マ
ンニトール、イノシトール 以上の菌学的性状から、Ｙ−５３株はストレプトミセス
属に属する菌株であるので、本発明者らはＹ−５３株を
ストレプトミセス・スピーシーズＹ−５３と称すること
とした。同Ｙ−５３株は財団法人発酵研究所にＴＰＯ−
１４５９６として寄託され、また昭和６２年８月１３日
に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に受託番
号ＦＥＲＭ−Ｐ９５１８として寄託され、ブタベスト条
約に基づきＦＥＲＭ　　ＢＰ−１８８９として同所に保
管されている。

なお、Ｙ−５３株もしくは表１に例示されたアシルアミ
ノ酸ラセマーゼ生産菌に由来する突然変異株、形質接合
体、あるいはこれらの菌株の遺伝子の一部（アシルアミ
ノ酸ラセマーゼをコードする部分を含む）を適当な宿主
微生物に組み込んで得られる遺伝子組換え体であっても
、アシルアミノ酸ラセマーゼを生産するものはすべて本
発明に使用できる。

前記の微生物の培養に用いられる培地は該菌株が利用し
うる栄養源を含み、アシルアミノ酸ラセマーゼの生成を
促進するようなものならば、液体状でも固体状でもよい
。大量に培養するときは液体培地が便利である。

該培地には、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒
素源、無機塩類などが用いられる。炭素源としては、例
えばグルコース、グリセリン、デキストリン、スターチ
、糖蜜、動植物油などを、また窒素源としては、例えば
大豆粉、コーンスチープリカー、綿実かす、肉エキス、
ペプトン、酵母エキス。

硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。

その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム１カルシウム
、マグネシウム、マンカン、鉄、コバルト。

亜鉛、リン酸などの塩類が用いられることがある。

培養法としては、静置培養でも振盪培養または通気攪拌
培養でもよいが、大量の処理には通気攪拌培養が便利で
ある。培養温度は１５−３７°Ｃの範囲、好ましくは２
０−３７℃程度がよく、培地のｐ）（は５−９程度が望
ましい。培養時間は１８時間−４日間程度で、アシルア
ミノ酸ラセマーゼの蓄積量が最高になったときに培養を
停止する。

培養物からアシルアミノ酸ラセマーゼを採取するには、
まず培養物を遠心分離その他の操作により菌体と培養ろ
液に分け、該酵素が菌体内に存在するときは菌体を溶菌
酵素処理、超音波処理、フレンヂプレス処理、ダイノミ
ル処理などの種々の菌体破砕方法の単独使用または組合
せ使用により菌体を破砕し、該酵素を可溶化する。該酵
素が培養ろ液中に存在するときは培養ろ液をそのまま次
の精製プロセスに付することかできる。

可溶化された該酵素および培養ろ液中の該酵素の精製に
は、公知の酵素精製手段、例えば硫酸アンモニウムなど
による塩析法、ジエチルアミノエチルセルロースなどを
用いる陰イオン交換クロマトグラフィ、カルボキシメチ
ルセルロースなどを用いる陽イオン交換クロマトグラフ
ィ、デキストランゲルなどを用いるゲルろ過、疎水性樹
脂を用いる疎水性クロマトグラフィ、およびアフィニテ
ィクロマトグラフィなどを適宜組み合わせて使用すれば
よく、これにより目的に応じた精製度のアシルアミノ酸
ラセマーゼ標品を得ることができる。

〔作用〕

本発明によって得られるアノルアミノ酸ラセマーゼは以
下に述べる理化学的性質を有する。

■作用 該酵素はＬ　−Ｎ　ａ−アシルアミノ酸に作用して対応
するＩ）−Ｎ“−アンルアミノ酸に変換し、Ｄ＝２０＝ −Ｎａ−アシルアミノ酸に作用して対応するＬ−Ｎ“−
アシルアミノ酸に変換する。すなわち下式に示す可逆反
応を触媒とする。

Ｌ−Ｎｃｌ−アンルアミノ酸＝ Ｄ−Ｎ“−アンルアミノ酸 ■基質特異性 下記表３に示すように、光学活性Ｎ“−アシルアミノ酸
には作用するが、対応する光学活性α−アミノ酸には作
用しない。

なお表３中の相対活性は、基質としてＮ　−アシルアミ
ノ酸を用いた場合は、■に記載した活性測定法に準じて
測定し、実測された各基質に対応するα−アミノ酸の生
成ｍ（ｍＭ）をメチオニンのそれを１００として表わし
たものである。また基質がＬ−Ｎａ−アシルアミノ酸の
場合は、Ｌ−アミノアシラーゼの代りにＹ−５３株が産
生ずるＤ−アミノアシラーゼを使用した。また基質とし
て光学活性アミノ酸を用いた場合はＤ−またはＬ−アミ
ノ酸オキシダーゼ（いずれもシグマ社製）で反応液を処
理した後高速液体クロマトグラフィにかけ、基質の光学
対掌体が生成したか否かを確認しノこ。

表３ 表３　（続き） ＮＤ測測定ず ■酵素活性測定法 アンルアミノ酸ラセマーゼは可逆反応を触媒する。ずな
イつちＤ−Ｎ　　−アンルアミノ酸を基質とした場合、
反応の進行につれて生成蓄積するＬ−Ｎ“−アンルアミ
ノ酸もまた該酵素の基質となるためその作用を受け、Ｄ
−Ｎａ−アシルアミノ酸すなわち基質に変換される。真
の反応速度を求めるためには生成物を直ちに他の化合物
に変換して反応系外に追い出すことが必要である。

本発明者らはこの目的で、該酵素の活性測定用の反応系
に、生成物がＬ−（またはＤ−）Ｎａ−アシルアミノ酸
の場合はＬ−（またはＤ−）アミノアシラーゼを大過剰
に添加して生成物の脱アシル化反応を同時に行わせ、最
終的に蓄積するり、−（またはＤ−）アミノ酸の量を測
定し、この値（μＭ）が１−（またはＤ−）Ｎａ−アシ
ルアミノ酸の生成量に等しいとみなした。

酵素活性の測定は、酵素溶液５０μｇ、基質溶液４０μ
＆、Ｌ−アミノアシラーゼ溶液ＩＯμσおよび５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）４００μρから成る
混合反応系を用いて行う。基質溶液としてはＮ＝アセチ
ル−Ｄ−メチオニン２５０ｍＭおよび塩化コバルト１２
．５ｍＭを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７、５）を、
酵素溶液としてはア−２５＝ シルアミノ酸うセマーセ標品を１〜０．２ユニツト／滅
になるようにトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７５）に溶解し
た溶液を、モしてＬ−アミノアシラーゼ溶液としてはＬ
−アミノアンラーゼ標品（市販品例えばシグマ社製でも
良いが、本発明においてはＹ−５３株から抽出精製した
Ｌ−アミノアシラーゼを使用した）を４０〜８ユニツト
／滅になるようにトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
溶解した溶液をそれぞれ使用する。

以」二の各溶液を、トリス−塩酸緩衝液、基質溶液、Ｌ
−アミノアソラーセ溶液、酵素溶液の順に混合し、酵素
溶液の添加と同時に３０℃で反応を開始する。反応時間
は該酵素溶液の活性が低いときは１２０分、高いときは
１０分行い、１００°Ｃ３分間の熱処理で反応を停止す
る。

酵素活性は、反応系中に生成したメチオニンの量を高速
液体クロマトグラフィで測定し、１分間に１μモルのメ
チオニンを生成する酵素活性を１ユニツトとして表イっ
す。反応時間Ｘ分で、反応系中にｙｍＭ濃度のメチオニ
ンが生成したときは、５０μρ中に含まれる酵素の活性
（αユニット）は、次式で求められる。

一 α−２Ｘ ■至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 上記酵素活性測定法においてトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）の代りに、酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ
４，０，５，０）、第一リン酸カリウム−第ニリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６，０，７，０，８゜０）、第一
リン酸カリウム−ホウ酸ナトリウム（ｐＩ（６，３，７
，８，８，３，９，０）、炭酸ナトリウム−ホウ酸ナト
リウム（ｐＨ９，２，１０，０，１０，９）をそれぞれ
用い、反応は２時間または４時間行い、生成したメチオ
ニンの量比から相対活性を求めた。

図１は、各１）Ｈ溶液中ての２時間反応の場合の相対酵
素活性を示ずが、至適ｐＨは８付近であることがわかる
。

図２は、反応時間が２時間から４時間に延長されたとき
に、メチオニンの生成量がどの程度増加したかを示す。

４時間反応で２時間反応の２倍近くメチオニンが生成し
た条件では該酵素は安定であるといえる。図２からアノ
ルアミノ酸ラセマーゼはｐＨ６〜９付近において安定で
あることかイつかる。

■作用適温の、範囲 標準酵素活性測定法（■に記述）における反応温度（３
０８Ｃ）を２５．３０，３５．４０，５０，６０．また
は７０°Ｃに変えて、Ｎ−アシル−Ｄ−メチオニンから
のＬ−メヂオニンの生成量を測定した。使用酵素量を増
やし反応時間を５分とした。得られた結果を図３に示す
。図３から明らかなように、作用適温の範囲は３０°〜
５０°Ｃ付近である。

■温度による失活の条件 該酵素溶液を３０°、３５°、４０°、５０°。

６０°または７０°Ｃで３０分間加熱処理したのち、残
存する活性を標準活性測定法に従って測定した。

その結果を図４の黒丸曲線で示す。

この曲線から明らかなように、該酵素は４０℃までは安
定であるが、５０’Ｃを超えると失活する　、ようであ
る。なお該酵素溶液に１ｍＭのコバルトイオンを添加し
たうえで、上記と同条件で加熱処理を行い、残存活性を
測定したところ、Ｃｏ　　無添加の場合と異なる結果が
得られた。Ｃｏ　　添加時の結果を図４の白丸曲線で示
す。該酵素はＣＯ″＋共存下では５０°Ｃまで安定で、
６０°Ｃから失活を始めることがわかる。

■金属イオンの影響 ■に記述した酵素活性測定法において、基質溶液中に添
加された塩化コバルト１２．５ｍＭ（反応液中の最終濃
度１ｍＭ）を除き、その代わりに各種金属塩あるいはＥ
ＤＴＡの１２．５ｍＭまたは１２５ｍＭ（反応液中の最
終濃度はそれぞれ１ｍＭまたはＩＯｍＭ）を加え、無添
加の場合をコントロールとして反応を行い、該酵素活性
に対する金属イオンの影響を調べた。なおこの実験に使
用したＬ−アミノアシラーゼの活性にはこれらの添加物
の影響がないことを確認済みである。その結果を表４に
示す。酵素活性は添加物無添加の場合を１００として相
対活性で示しである。

表４から明らかなように、該酵素は数種の金属イオンの
ある限られた濃度範囲において著しく活性化される。す
なわちコバルトイオンは低濃度（１ｍＭ付近）で活性化
効果が顕著であるが、ｌ０ｍＭでは該酵素をほとんど活
性化しない。亜鉛イオンやニッケルイオンも同様な傾向
をもつ。マグネンウムイオンはＩｍＭよりもｌ０ｍＭで
活性化効果が一層大きくなる。マンガンイオン、二価鉄
イオンも同様な傾向をもつ。阻害効果を顕著に示したの
は、供試金属イオンの中では銅イオンである。アルミニ
ウムイオンやモリブデン酸イオンも１０ｍＭでは阻害を
示ず。ＥＤＴＡはｌｏｍＭで阻害効果が顕著である。

■分子量 約２００，０００（実施例２の表５のステップ５で得ら
れた電気泳動的に単一蛋白となった標品について、デイ
ビス法〔アナルス・オブ・ザ・ニコーヨーク・アカデミ
−・オブ・ザイエンシーズ（Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、１２１，４０４（１９６４）〕
に従って、第−化学薬品株式会社製のグラジェントゲル
（ＰΔＧプレート４７１５）を用い、３０ｍＡ定電流で
２時間電気泳動させ、同時に泳動させたマーカー蛋白質
の移動度との比較から推定した値である）。また同社製
の５ＤＳ−ＰＡＧプレート４／２０を用いて、上と同じ
酵素標品をＳＤＳの共存下に電気泳動を行ったところ、
その分子量は約４０，０００と推定された。

■等電点 ４８（キャリア・アンホライトを用いるアカロース電気
泳動法により測定した。測定にはＬ　Ｋ　Ｂ２１１７型
電気泳動装置とファルマライ１−ｐＨ３〜１０（ファル
マシア製）を用い、定電力（２Ｗ）で２５時間泳動した
）。

本発明のアシルアミノ酸ラセマーゼは、Ｌ−アミノアシ
ラーゼまたはＤ−アミノアンラーゼと共に用いると、安
価なり　Ｌ　−Ｎ“−アシルアミノ酸から一段階で光学
活性Ｌ−α−アミノ酸または光学活性Ｄ−α−アミノ酸
を製造することができる。

Ｌ−アミノアンラーゼは公知の方法で容易に入手し得る
が、市販品を使用することも可能である。

Ｄ＝ニアミノアシラーゼ、ストレプトミセス属菌〔特開
昭６２−１２６９６９および特開昭６２−１２６９７６
）、シュードモナ属菌〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
１７０，８８８（１９５２）、特公昭６Ｏ−３１４７７
）およびアルカリ土類金属菌〔日本農芸化学会、昭和６
２年度大会の講演要旨集６５９頁〕が生産するとされて
いる。

またアシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌として本発明で分
離選択された菌株の多くはアシルアミノ酸ラセマーゼの
ほかにＤ−アミノアシラーゼおよび／またはＬ−アミノ
アシラーゼをも生産する。

したがってＤＬ−Ｎ“−アシルアミノ酸を原料として光
学活性α−アミノ酸を製造する場合には、本発明方法に
よって製造される各種精製度のアシルアミノ酸ラセマー
ゼ標品の中から使用の目的および態様に適した標品を選
び、例えばＬ−α−アミノ酸を製造する場合には、当該
酵素標品と市販のあるいは適当なＬ〜ルアミノアシラー
ゼ産菌から分取したＬ〜ルアミノアシラーゼを同時にま
たは交互にＤＬ−Ｎ“−アシルアミノ酸に作用させ、原
料が実質的に１００％Ｌ−α−アミノ酸に変換したとこ
ろで反応を中止し反応液からＬ−α−アミノ酸を回収す
ればよい。

ここで使用の目的に適した標品とは、使用の目的が１７
−アミノ酸の製造であれば、当該標品中にはＤ−アミノ
アシラーゼが含まれていてはならないという要件を満た
していることを意味し、また使用の態様に適した標品と
は、当該酵素を固定化し５てバイオリアクターとして使
用する場合を例にとれば、包括固定化法では当該酵素を
含む菌体そのものでもあるいは無細胞抽出液でもよいこ
とを意味するのに対し、イオン交換樹脂への吸着法ある
いは不溶性担体への共有結合法では、当該酵素標品の精
製度は若干高めでなければならないことを意味する。

本発明による光学活性アミノ酸の製造法に使用しうるア
シルアミノ酸ラセマーゼ標品としては、当該酵素生産菌
が１７−アミノアシラーゼもＤ−アミノアンラーゼも生
産しない場合は、この生産菌の培養細胞およびその処理
物、その細胞から抽出し各種程度に精製された当該酵素
標品が使用できる。

当該酵素生産菌がＬ−アミノアシラーゼまたはＤ−アミ
ノアシラーゼを同時に生産する場合には、Ｌ−α−アミ
ノ酸またはＤ−α−アミノ酸の製造にそれぞれ上記の菌
と全く同様に使用できる。

この場合、併産する■７−アミツアノラーゼまたはＤ−
アミノアノラーゼの活性が当該酵素の活性よりもはるか
に強いときは、Ｌ−またはＤ−アミノアンラーゼを別途
追加する必要がない。

当該酵素生産菌がＬ−アミノアシラーゼとＤ−アミノア
ンラーゼとを同時に生産するときは、常法に従って、Ｄ
−アミノアシラーゼまたはＬ−アミノアシラーゼの欠損
株を変異誘導したうえで、それぞそれＬ−アミノ酸また
はＤ−アミノ酸の製造に使用することができる。培養細
胞から酵素標品まで各種精製段階のものも適宜使用しう
る。

なお培養細胞あるいは無細胞抽出液のレベルでは目的物
であるアミノ酸を分解する酵素が含まれていることもあ
るので、このようなときはアミノ酸分解活性を欠落させ
るかあるいは除去することが必要である。アミノアノラ
ーゼの欠損株でないときは、細胞のレベルで光学活性α
−アミノ酸の製造に直接使用することは困難であるが、
熱処理あるいは阻害剤等の添加により、当該酵素に影響
を与えずにアミノアシラーゼの一方または両方を失活さ
せて使用することができる。また、■、−およびＤ−ア
ミノアシラーゼを併産する菌株から当該酵素標品を調製
する場合は、培養細胞から当該酵素を抽出した後、目的
のアミノ酸の製造に障害となるアミノアシラーゼをまず
分離除去し、しかる後必要があればさらに適当な精製操
作を加えて当該酵素標品を調製する。

当該酵素並びにＩ７−またはＤ−アミノアノラーゼを用
いてＬ−またはＤ−α−アミノ酸を製造する場合、当該
酵素標品と１７−またはＤ−アミノアシラーゼを、原料
であるＤ　Ｌ　−Ｎ“−アシルアミノ酸とＣｏ　　また
はその他の金属イオンの適当量を含むｐＨ６〜９付近の
緩衝液中に溶解し、適当な温度で静置して反応を完結さ
せる方法、当該酵素標品とＬ−またはＤ−アミノアシラ
ーゼを公知の方法で同時にまたは別々に固定化した後反
応容器に一段または多段に充填してバイオリアクターを
調製し、このリアクターにＤ　Ｌ−Ｎ　　−アンルアミ
ノ酸とＣＯまたはその他の適当な金属イオンを含むｐ１
１６〜９付近の緩衝液を通して反応させる方法、あるい
は半透膜で仕切られた反応容器の一方に両酵素を溶解し
、原料溶液を注入して反応を行わせ、半透膜を通過した
生成物を回収する方法などが通常用いられる。いずれの
場合も反応液は滅菌し、可能な限り無菌的に操作するこ
とが望ましい。

こうして得られた反応終了液中には、目的の光学活性ア
ミノ酸とアシル基の加水分解によって生成した有機酸が
含まれるだけであるので、目的のアミノ酸は常法によっ
て容易に回収することができる。

〔実施例〕

実施例Ｉ ＢＢＬトリプチケース・ソイ・ブロス（ベクトン・ディ
キンソン社販売）とＮ−アセチル−Ｄ−メチオニン０１
％とを含む培地（１）Ｈ７，０）を２００旋容三角フラ
スコに２０滅ずっ分注し、１２０℃で２０分間滅菌処理
した。一方、ストレプトミセス・スピーシーズＹ−５３
株を予め液体培養した後凍結保存（−８０℃）しておき
、必要に応じ溶解して接種用種菌として使用した。

」二記の培地３０本に、溶解した凍結保存菌０゜７旋ず
つを無菌的に接種し、２８℃で２日間振とう培養して種
培養を得た。ついで同じ培地５００本に種培養をＩ滅ず
つ移植し、２８℃で４２時間振盪培養した。フラスコの
内容物を集め、遠心分ＭＣ４°Ｃ，１０，０００ｒｐｍ
、１５分間）により菌体を集め、生理的食塩水で洗浄し
た後２１６ｇの湿菌体を得た。以下の操作はすべて４°
Ｃ以下の低温で行った。

湿菌体２１６ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ−Ｉ７．
０）のＩＱに懸濁し、ダイノミル（ウィリー・ニー・バ
クホーフェン社製細胞破砕機）によって細胞を破砕した
。使用したガラスピーズは直径０゜１〜０　、２　ｍｍ
、流速は６０成／分であった。処理液を４８Ｃ，１０，
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、無細胞抽出液１７
００滅を得た。この液のアシルアミノ酸ラセマーゼ活性
は４９ユニツト、比活性は０５２ミリユニット／ｍｇ蛋
白であった。総蛋白質量は、バイオラッド・プロティン
・アッセイ法で測定した。

実施例２ 実施例１で得た無細胞抽出液＋　７００成に３００ｇの
硫酸アンモニウムを冷却攪拌しながらゆっくりと添加し
た。全量添加後、さらに３０分間攪拌を続け、４°Ｃ，
１０，００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離して澄明な上清
１６６０ｄを得た。

予め５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，３０％飽和硫
酸アンモニウムを含む）で平衡化させた　２ＴＳＫＨＷ
６５　Ｃ（東ソー（株）社製）カラム（４，８ｃｍＸ　
３０　ｃｍ）に上清１６６０旋を吸着させ、１０００戚
の上記リン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモニウムを
含まないリン酸緩衝液で蛋白成分を溶出し、溶出液中の
当該酵素活性の認められる両分を集めた。こうして得ら
れた活性画分３３０旋に硫酸アンモニウム１２８ｇを冷
却攪拌しながらゆっくりと加えた。生じた沈澱は１０゜
００　Ｏｒｐｍで３０分間冷却遠心分離することにより
分取した。この沈殿を５０滅の５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）に溶解し、セファデックスＧ２５（ファル
マシア製）カラムを通して脱塩した。

こうして得られた粗酵素溶液を、予め５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で平衡化させたＤＥＡＥトヨパール
６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラム（４１，８ｃｍＸ　
３０　ｃｍ）に吸着させ、１０００滅の同緩衝液で洗浄
し、ついで０．２Ｍ　ＮａＣρを含む同緩衝液で溶出し
て、活性画分３４０滅を得た。この活性画分に硫酸アン
モニウム１３３ｇを常法に従って添加し、生じた沈殿を
遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ、３０分）で集め
たのち、３０滅の同緩衝液に溶解し、セファデックスＧ
５のカラムを通して脱＝３９− 塩した後、５９滅の粗酵素溶液を得た。この粗酵素溶液
を、予め同緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−５ＰＷカラ
ム（東ソー（株）製、径２．１５ｃｍｘ１５ｃｍ）に吸
着させ、ＨＬＣ８３７型分取用高速液体クロマトグラフ
（東ソー（株）製）にかけ、ＮａＣＱ濃度を０−０．５
Ｍまで直線的に増加させて溶出を行った。溶出速度は毎
分４旋であった。３２分から３６分までの溶出画分を回
収して、活性画分＋６ｄを得た。ここに含まれるアシル
アミノ酸ラセマーゼの活性は、約７．２ユニツトで、比
活性は約６３ミリユニツト／ｍｇ蛋白となり、比活性は
無細胞抽出液から約１２２倍に上昇した。

さらに、この活性画分を、予め５０ｍＭリン酸緩衝液で
平衡化させたＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー（
株）製、径５．５ｃｍＸ　６０ｃｍ）を装着したＨＣＬ
８３７型分取用クロマトグラフにかけ、毎分１滅の流速
でゲルろ過を行い、活性画分を分取した。この両分はポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動で１本のバンドを示し
たので、アシルアミノ酸ラセマーゼはほぼ精製されたと
判断した。この画分にはアシルアミノ酸ラセマーゼ活性
が１゜２ユニツト含まれており、比活性は２８ユニット
／ｍｇ蛋白であった。

上記の各採取工程におけるアシルアミノ酸ラセマーゼの
全活性、全蛋白量および比活性を各標品の容量とともに
表５に示す。

実施例３ 実施例１と同様にして、ストレプトミセス・スピーンー
ズＹ−５３株を１０Ｑ、培養し、４２時間培養の菌体を
遠心分離により集め、０．８％ＮａＣρ溶液で一度洗浄
し、湿菌体３００ｇを取得した。

この湿菌体を実施例１と同様にダイノミル細胞破砕機で
破砕し、遠心分離（毎分１万回転、２０分）を行い、上
澄液１６８０ｄを得た。この上澄液にはアシルアミノ酸
ラセマーゼが２１ユニツト、Ｌ−アミノアシラーゼが３
１５ユニツト、Ｄ−アミノアシラーゼが７５ユニツト含
まれていた。この上澄液に３０％飽和になるように硫酸
アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心除去した。遠
心上清画分にはさらに硫酸アンモニウムを加えて６０％
飽和とし、生じた沈殿を遠心分離により回収した。得ら
れた沈殿は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７０）に溶解
し、同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ２５を用い
てゲルろ過による脱塩を行い、得られた溶液をイオン交
換クロマトグラフィにかけた。

５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤ
ＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（樹脂量７００ｄ）に
」二記脱塩処理液（４９０ｄ）をチャージし、２Ｑの同
リン酸緩衝液で洗浄して非吸着成分を洗い流した。この
洗浄液からＤ−アミノアンラーゼ１１４ユニツトが回収
された。このＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラムには、
アシルアミノ酸ラセマーゼ（約２０ユニツト）とＬ−ア
ミノアンラーゼ（約９００ユニツト）が比較的強く結合
しており、０．２モル以上の含塩溶液を流さない限り溶
出されてこない。

上のカラムを３０℃に保ち、これに０．５％のＮ−アセ
チル−ＤＬ−メチオニンとＩｍＭの塩化コバルトを含む
２０ｍＭリン酸緩衝液を毎時間３０轍の流速で流した。

流出液３ρを集め、ｌＲ１２０のカヂオン交換樹脂を通
したのち、減圧濃縮乾固した。得られた残留物を冷無水
アルコール１０ｙｄで２回洗ったのち、熱水約１００ｒ
ｎ１に溶解し、冷時析出する結晶をろ取した。さらにろ
液にアルコールを滴下し、−夜放置後析出した結晶をろ
取した。得られた結晶を乾燥し、９．６ｇのし−メチオ
ニンを取得した。融点２．８Ｆ１２８１°。

水晶は高速液体クロマトグラフィおよび薄層クロマトグ
ラフィでＬ−メチオニンの標準品と全く同じ挙動を示し
た。また水晶と標準品とを混融したが融点降下を示さな
かった。

実施例４ 実施例１と同様にして調製したストレプトミセス・スピ
シーズＹ−５３株の凍結保存菌の溶解液０７轍を２００
旋三角フラスコに２０轍分注滅菌した種培地（グリセリ
ン１．５％、ポリペプトン１．０％、酵母エキス１．０
％９食塩０．５％、第ニリン酸カリウム０．２５％、硫
酸マグネンウム０．２５％、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチ
オニン００５％。

ｐＨ７，０）３０本に接種し、２８℃で１８時間、回転
振盪機（２０Ｏｒｐｍ）上で培養した。

この種培養ｌ鍾を２００滅三角フラスコに２０轍分注滅
菌した生産培地（グリセリン０．５％、ポリペプトン１
．０％９食塩０．５％、第ニリン酸カリウム０．２５％
、Ｎ−アセデル−ＤＬ−メチオニン０゜０５％、ｐＨ７
，０）２５０本に移植し、２８℃で１８時間９回転振盪
機上で培養した。得られた培養液から遠心分離（４°Ｃ
，１０，００Ｏｒｐｍ、１５分間）により菌体を集め生
理的食塩水で２回洗浄し、３８５ｇの洗浄湿菌体を得た
。以後の操作はすべて４°Ｃ以下で行った。湿菌体３８
５ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、０）の１ρに懸
濁し、ダイノミル（ウィリー・ニー・バクホーフェン社
製、細胞破砕機）を用いて以下の条件で細胞を破砕した
。

破砕条件、ガラスピーズ　直径０．１〜０．２ｍｍ流速
６０ｔｄ）、７分 回転数　３，０００ｒｐｍ 得られた破砕液をＩ　０．００　（ｌｒｌ）ｍで２０分
間遠心分離し、無細胞抽出液１２８０社を得た。この抽
出液のアシルアミノ酸ラセマーゼの全活性は、７５ユニ
ツト、Ｌ−アミノアノラーゼのそれは１５００ユニツト
であった。得られた抽出液１２８０７Ｊに５００ｇの硫
酸アンモニウムを冷却攪拌しながら、ゆっくりと添加し
た。添加後さらに２時間攪拌を続けた後、生じた沈澱物
を遠心分Ｍ（］　０．０００ｒｐｍ、３０分）で集めた
。集めた沈澱物を４℃の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
、０’）６００威に溶解し、同緩衝液で１８時間透析、
脱塩を行った。得られた酵素液を、あらかじめ５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化されたＤＥＡＥト
ヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）カラム（３ｃｍＸ
　３０　ｃｍ）に吸着させ、１０００滅の同緩衝液で洗
浄後、さらに、１ｍＭ塩化コバルトを含む２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＩ−ｒ　７　、５　）１０００滅で
洗浄した。このカラム中には、アシルアミノ酸ラセマー
ゼ４３ユニツト、Ｌ−アミノアシラーゼ８００ユニツト
が吸着していた。

このカラムを２８℃に保ちながら、０，５％　Ｎ−クロ
ロアセデル−Ｄ−バリン、１ｍＭ塩化コバルトおよび１
ｇｇ／ｄ硫酸ジヒドロストレプトマイシンを含む２０ｍ
Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）２０００滅を１時
間当り６０滅の流速で流した。

反応液を流し終えた後、さらに２０ｍＭ）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）５００＋ｎｌで洗浄した。溶出液を
集め、高速液体クロマトグラフィーに付したところ、Ｎ
−クロロアセチル−Ｄ−バリンは全く検出されなかった
。溶出液を減圧下で濃縮後、エタノールを添加すると沈
澱物が析出した。これをろ取し、エタノールで洗浄後、
少量の水に溶解し、これにエタノールを加え４°Ｃに放
置すると、無色の薄片状結晶が析出した。これをろ取し
乾燥させたところ４．５ｇの結晶が得られた。融点３１
５°Ｃ（分解）。

また本結晶を高速液体クロマトグラフィーおよび薄層ク
ロマトグラフィーに付したところ、標品の１、−バリン
と全く同じ挙動を示した。

〔発明の効果〕

本発明のアシルアミノ酸ラセマーゼは、常温常圧下、中
性付近のｐＨにおいて、光学活性アミノ酸の共存下に、
光学活性Ｎ“−アシルアミノ酸のみをラセミ化し、Ｄ−
またはＬ−アミノアシラーゼと共に用いることにより、
効率よ＜　Ｄ　Ｌ　−Ｎ“−アシルアミノ酸から光学活
性Ｄ−またはＬ−α＝４７＝ 一アミノ酸を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

図１はアシルアミノ酸ラセマーゼのＩ）Ｈ依存性を示す
。 図２は各種１）Ｉ−（におけるアシルアミノ酸ラセマー
ゼによるメチオニンの生成量を、２時間反応の生成量（
二二二）を１としたときの４時間反応の生成量（［）を
相対値として示子。 図３はアシルアミノ酸ラセマーゼの反応温度と酵素活性
との関係を示す。 図４はアシルアミノ酸ラセマーゼの熱安定性を示す。 代理人　　弁理士　　岩　１）　　弘 −４８＝ ％’／ｈ粕ｆ墨＋％ｍ　（’；　） スＬ＋＋Ｉ昼偏−町■）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記性状を有する酵素、アシルアミノ酸ラセマー
   ゼ： ｉ）Ｄ−Ｎアシル−α−アミノカルボン酸を、対応する
   Ｌ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸に変換する。 ｉｉ）Ｌ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸を、対応
   するＤ−Ｎ−アシル−α−アミノカルボン酸に変換する
   。 ｉｉｉ）Ｄ−α−アミノ酸を、対応するＬ−α−アミノ
   酸に変換しない。 ｉｖ）Ｌ−α−アミノ酸を、対応するＤ−α−アミノ酸
   に変換しない。
2. （２）アシルアミノ酸ラセマーゼ生産能を有する微生物
   を培地に培養し、該酵素を培養物中に生成、蓄積せしめ
   、これを採取することを特徴とする請求項（１）記載の
   アシルアミノ酸ラセマーゼの製造法。
3. （３）ＤＬ−Ｎ−アシル−α−アシルアミノ酸に、Ｄ−
   またはＬ−アミノアシラーゼの共存下請求項（１）記載
   のアシルアミノ酸ラセマーゼを作用させることを特徴と
   する光学活性のＤ−またはＬ−α−アミノ酸の製造法。