JPH0898683A - ７−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】セファロスポリン系抗生物質製造における有用
な中間体であるデアセチルセファロスポラン酸誘導体を
セファロスポラン酸誘導体から製造する際に使用する７
−アミノセファロスポラン酸エステラーゼに関する。 【構成】下記の理化学的性質を有する新規７−アミノセ
ファロスポラン酸エステラーゼ。酵素作用；７−アミ
ノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）または７−アシル
−ＡＣＡのアセチル基を加水分解する反応を触媒する、
基質特異性；酢酸プロピル、酢酸ブチル、セファロス
ポリンＣ、７−ＡＣＡ、７−クロロアセチル−ＡＣＡ、
７−ベンジルオキシカルボニル−ＡＣＡ等に作用する、
分子量；１４１ｋＤａ（ゲル濾過法）、サブユニット
の分子量；８２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、至適ｐ
Ｈ；５．５、安定ｐＨ範囲；５．５〜７．０、至適温
度；３０〜３５℃、安定温度；ｐＨ７．０で１５分処理
では２０℃まで安定。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、セファロスポリン系抗
生物質製造における有用な中間体であるデアセチルセフ
ァロスポラン酸誘導体をセファロスポラン酸誘導体から
製造する際に使用する７−アミノセファロスポラン酸エ
ステラーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術】セファロスポラン酸誘導体から３位のア
セトキシメチル基のアセチル基を脱離させてデアセチル
セファロスポラン酸誘導体を製造する方法としては、化
学的手法よりも酵素法が経済的に有利であることが知ら
れており、種々の方法が知られている（特開昭４９−１
３２２９４、特開昭５９−１０８７９０、特公昭５４−
４３５９８、特公昭５６−４６８３９、特公昭６１−１
１６００、特開昭６１−６７４８９、特公平１−４７１
５８号公報等）。

【０００３】上記酵素法に使用される酵素は、セファロ
スポリンＣデアセチラーゼまたは７−アミノセファロス
ポラン酸エステラーゼ等と呼ばれており、本酵素自体に
ついては，バチルス属由来のセファロスポリンＣデアセ
チラーゼとして、ＷＲＲＬ−Ｂ−５５８・デアセチラー
ゼ；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０（３），４
１３（１９７５）〔文献Ａ〕、ＡＴＣＣ６６３３・デア
セチラーゼ；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，４８５，３６７（１９７７）〔文献Ｂ〕、ＳＨＳ−
０１３３・デアセチラーゼ；Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉ
ｏｅｎｇ．，７７，１７（１９９４）〔文献Ｃ〕が、オ
ーレオバシディウム属由来のセファロスポリンＣデアセ
チラーゼとして、４４６６−Ｉ・アセチルエステラー
ゼ；特公平２−５１５９４号公報〔文献Ｄ〕および４４
６６−ＩＩ・アセチルエステラーゼ；特公平２−５１５
９４号公報〔文献Ｅ〕等が報告されている。

【０００４】また、Ｎ末アミノ酸配列および部分アミノ
酸配列で示されるセファロスポリンＣデアセチラーゼも
報告されている（特開平４−２２８０７９号公報）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来のセファロスポリ
ンＣデアセチラーゼ（Ｃｅｃデアセチラーゼ）または７
−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ（７−ＡＣＡ
エステラーゼ）は、セファロスポラン酸誘導体からデア
セチルセファロスポラン酸誘導体への変換に使用する
と、酵素反応に長時間を要したり、Ｋｍ値が大きいため
に反応収率を１００％とすることが困難であった。従っ
て、ＣｅＣデアセチラーゼとして、比活性（Ｖｍａｘ
値）が高く、Ｋｍ値の低い特性を有する酵素の出現が、
工業化に有利なために求められていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記の問題を解決すべく、種々研究を続けた結果、本発
明者が土壌より分離したロドトルラ属に属する微生物に
より産生される７−ＡＣＡエステラーゼが、一般式
（３）

【０００７】

【化４】 （式中、Ｒ¹ は水素原子、Ｄ−５−アミノ−５−カルボ
キシバレリル、クロロアセチルまたはベンジルオキシカ
ルボニル基を示す）で表される７−アミノセファロスポ
ラン酸誘導体〔以下、単に「７−ＡＣＡ誘導体（３）」
と称する〕を非常に反応収率良く一般式（４）

【０００８】

【化５】 （式中、Ｒ¹ は前記と同じ意味を有する）で表されるデ
アセチル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体〔以
下、単に「Ｄ−７−ＡＣＡ誘導体（４）」と称する〕に
変換することを見い出し、本発明を完成したものであ
る。

【０００９】すなわち、本発明は、下記の理化学的性質
を有する７−ＡＣＡエステラーゼ〔以下、単に「本酵
素」と称することがある〕を提供することを目的とする
ものである。 酵素作用 少なくとも、一般式（１）

【化６】 （式中、Ｒは水素原子またはアシル基を示す）で表され
る７−アミノセファロスポラン酸誘導体〔以下、単に
「７−ＡＣＡ誘導体（１）」と称する〕を一般式（２）

【化７】 （式中、Ｒは前記と同じ意味を有する）で表されるデア
セチル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体〔以下、
単に「Ｄ−７−ＡＣＡ誘導体（２）」と称する〕と酢酸
に加水分解する反応を触媒する。

【００１０】 基質特異性 少なくとも、酢酸プロピル、酢酸ブチル等の酢酸低級ア
ルキルエステルおよび７−ＡＣＡ誘導体（３）に作用す
る。特に、セファロスポリンＣ（ＣｅＣ）、７−クロロ
アセチルアミノ−セファロスポラン酸（７−ＣＡＡＣ
Ａ）、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）お
よび酢酸ブチルに強く作用する。

【００１１】 分子量 分子量は１４１ｋＤａである（ゲル濾過法）。サブユニ
ットの分子量は８２ｋＤａである（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）。 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは５．５である。ｐＨ５．５〜７．０が安定ｐ
Ｈ領域である。 至適温度および安定温度 至適温度は３０〜３５℃である。ｐＨ７．０で１５分処
理においては、２０℃まで安定である。

【００１２】 阻害 Ｃｕ²⁺、Ｈｇ²⁺、（ｐ−アミジノフェニル）メタンスル
ホニルフルオライド、硫酸エセリン等で阻害される。 糖含量 ２０％以上の混成型糖鎖を含む。

【００１３】 Ｎ末アミノ酸配列 Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−

【００１４】 部分アミノ酸配列 少なくとも次に示す４種類のアミノ酸配列を含む。 （ａ）Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ （式中、Ｘは未同定アミノ酸を示す） （ｂ）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｐ−Ａｌａ

【００１５】（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ｐｈｅ （ｄ）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ
−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ

【００１６】本発明の７−ＡＣＡエステラーゼ生産菌は
ロドトルラ属に属するが、例えば、本発明者が京都府の
土壌から分離したロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏ
ｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）３８Ｂ１は、本発明
に最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株は
微工研菌寄第１３０３９号として微生物工業技術研究所
に寄託されており，その菌学的性質は特開平６−１２５
７８５号公報に記載されている。

【００１７】本発明においては、先ずロドトルラ属に属
する７−ＡＣＡエステラーゼ生産菌が適当な培地に培養
される。上記の７−ＡＣＡエステラーゼ生産菌として
は、前述のロドトルラ・グルチニス３８Ｂ１が挙げられ
るが、微生物の一般的性状として菌学上の性質は変異し
得るものであるから、自然的にあるいは通常行われる人
工的変異手段により変異し得る人工変異株は勿論、自然
変異株も含め、ロドトルラ属に属し、本酵素を生産する
能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することがで
きる。

【００１８】上記の培養は、酵母の培養に一般に使用さ
れる公知の培養方法に準じて行うことができる。使用す
る培地は、一般酵母の栄養源として公知のものが利用で
き、例えば、グルコース、シュークロース、マルトー
ス、エタノール、酢酸、オレイン酸エチル等の炭素源、
硝酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニ
ア等の窒素源、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉
エキス、ポテト等の有機栄養源、Ｌ−バリン、Ｌ−グル
タミン酸等のアミノ酸、リン酸、マグネシウム、カリウ
ム、鉄、コバルト、マンガン等の無機栄養源を適宜組合
せて使用できる。

【００１９】さらに、本酵素活性を誘導するために各種
脂肪酸エステル化合物、例えばメチルオレートを培地中
に０．０１〜１０％になるように添加してもよい。培地
のｐＨは３〜１０の範囲で選べばよい。

【００２０】培養は、通常振盪または通気攪拌培養等の
好気的条件下で行うのがよく、工業的には深部通気攪拌
培養が好ましい。培養温度は本酵素生産菌が発育し、本
酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は１５
℃〜４０℃である。培養時間は培養条件によって異なる
が、本酵素が最高力価に達する時期を見計らって適当な
時期まで培養すればよいが、通常は１日〜１０日の範囲
でよい。

【００２１】このようにして得られた本酵素は、主とし
て菌体内に含有されるので、得られた培養物から濾過ま
たは遠心分離等の手段によって集菌し、この菌体を超音
波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理、凍結破
砕処理等の機械的破壊手段等の種々の公知の菌体処理手
段を適宜組み合わせて破砕し、細胞片等の固形物を遠心
分離によって除き、粗製の７−ＡＣＡエステラーゼ含有
液が得られる。

【００２２】該粗酵素含有液から、公知の蛋白質・酵素
等の単離、精製手段を用いることにより、さらに精製さ
れた本酵素を得ることができる。例えば、超遠心分離分
画、硫安、食塩、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム等を
添加する塩析沈澱、アセトン等を添加する有機溶媒沈澱
等の手段により沈澱物として、本酵素を回収すればよ
い。

【００２３】さらに、この沈澱物は、半透膜を用いる透
析、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ハイドロフォービッグクロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー等等の手段を適宜組み合わせ
て行うことにより精製することができる。

【００２４】このようにして得られた７−ＡＣＡエステ
ラーゼは、次の理化学的性質を有する。 １）酵素作用 少なくとも、７−ＡＣＡ誘導体（１）をＤ−７−ＡＣＡ
誘導体（２）と酢酸に加水分解する反応を触媒する。

【００２５】ここで、前記一般式（１）中の基Ｒにおい
て定義されるアシル基とは、公知のセファロスポリン化
合物のアシル基であって、例えば、アミノ基、カルボニ
ル基またはカルボキシル基の１個ないし数個により置換
されていてもよい炭素数２〜７個の直鎖状または分鎖状
アルカノイル基；ハロゲン原子、シアノ基、低級アルコ
キシ基、置換基を有していてもよいアリールオキシ基、
イミノ基、低級アルキリデン基もしくは複素環式基によ
り置換された炭素数２〜４個のアルカノイル基；置換基
を有していてもよいアリールオキシ基で置換されていて
もよい炭素数２〜５個の直鎖状または分鎖状アルコキシ
カルボニル基；置換基を有していてもよいアリール−低
級アルカノイル基等を意味する。

【００２６】２）基質特異性 本酵素を用いて基質特異性を検討した。酵素活性の測定
は、後記の酵素活性測定法に従った。７−ＡＣＡ誘導体
（１）を基質とする場合には、その中から７−ＡＣＡ誘
導体（３）を選択した。各基質に対する本酵素の基質特
異性について測定した結果は表１の通りである。

【表１】

【００２７】上記の結果から、本酵素は７−ＡＣＡ誘導
体（３）に作用する。特に、ＣｅＣ、７−ＣＡＡＣＡ、
７−ＡＣＡに強く作用する。また、酢酸低級アルキルエ
ステルに作用し、アルコール鎖が長い程活性が強い。一
方、Ｎ−アセチルグルコサミン、キチン等のＮ−アセチ
ル化合物を加水分解しないことより、キチン・デアセチ
ラーゼ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．，９０，２５６４（１９９３）〕とは異なるこ
とを示している。

【００２８】３）分子量 公知の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行い、
標準蛋白質と比較することにより、本酵素のサブユニッ
トの分子量は８２ｋＤａである（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。
また、通常状態での本酵素の分子量を求めるために、Ｓ
ｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅのカラム
を用いて溶出させ、標準蛋白質と比較することにより、
本酵素の分子量は１４１ｋＤａである（ゲル濾過法）。

【００２９】以上の結果より、本酵素は８２ｋＤａのサ
ブユニットが２個会合した酵素であり、このような分子
量およびサブユニットの分子量を有する本酵素は、従来
公知のＣｅＣデアセチラーゼとは異なる。

【００３０】４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 緩衝液以外は後記酵素活性測定法により本酵素の至適ｐ
Ｈを求めた。緩衝液はｐＨ４．０〜６．０のコハク酸−
ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ５．５〜７．８のリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０のトリス−塩酸緩衝液を
用いた。測定結果は図３に示す通りであり、至適ｐＨは
５．５である。一方、ｐＨ５．５〜７．０が安定ｐＨ領
域である。

【００３１】５）至適温度および安定温度 反応温度を変化させる以外は後記酵素活性測定法により
本酵素の至適温度を求めた。測定結果は図２に示す通り
であり、至適温度は３０〜３５℃である。一方、ｐＨ
７．０で１５分処理においては、２０℃まで安定であ
る。

【００３２】６）阻害 後記酵素活性測定法の反応系において、各種金属イオン
または阻害剤の存在下での本酵素活性を測定し、各種金
属イオンまたは阻害剤の影響を求めた。各種添加物はｐ
−クロロマーキュリーベンゾエートを０．１ｍＭ添加し
た以外はすべて１．０ｍＭ添加した。無添加の場合の活
性を１００％としたときの相対活性は表２に示す通りで
ある。

【００３３】

【表２】 以上の結果より、本酵素はＣｕ²⁺、Ｈｇ²⁺、（ｐ−アミ
ジノフェニル）メタンスルホニルフルオライド、硫酸エ
セリン等で阻害される。

【００３４】７）糖含量 本酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ポリビニリデン
ジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写した後、シアル酸
を除くために２５ｍＭ硫酸で８０℃、１時間処理した。
洗浄後、メンブラン上の酵素は各種のパーオキシダーゼ
ーレクチン試薬〔文献；新生化学実験講座，３．糖質，
Ｉ，３１（１９９０）〕と反応させた。次に，パーオキ
シダーゼ染色は４５ｍＭの４−アミノアンチピリン０．
３ｍｌ、６０ｍＭのフェノール０．３ｍｌ、３０％の過
酸化水素２μｌ、１５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）８．４ｍｌからなる反応混合液を用いて行っ
た。

【００３５】その結果、本酵素はコンカナバリンＡ（Ｃ
ｏｎ Ａ）とコムギ胚レクチン（Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ
ｌｅｃｔｉｎ）と反応したが、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙ
ｐｏｇａｅａ レクチン（ＰＮＡ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ
ｃｏｍｍｕｎｉｓ レクチン（ＲＣＡ₁₂₀ ）、Ｐｈａｓ
ｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ レクチン（ＰＨＡ−Ｅ
₄ ）とは反応しなかった。このことは，本酵素がアスパ
ラギン残基に結合した混成型糖鎖を持つことを示してい
る。

【００３６】さらに、この糖の含量を決定するために、
本酵素をＥｎｄｏ Ｈ処理を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
かけたところ、３つの主バンドと２つの副バンドが見ら
れ、分子量は７４０００、７２０００、６９０００、６
７０００、６５０００となった。このことより、本酵素
は２０％以上の混成型糖鎖を含む。

【００３７】８）Ｎ末アミノ酸配列 本酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＰＶＤＦ膜に転
写し、次いでエドマン法によるプロテイン シーケンサ
ーにかけたところ、Ｎ末アミノ酸配列は次の通りであ
る。Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−

【００３８】９）部分アミノ酸配列 本酵素の部分アミノ酸配列を知るために、Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓＶ８プロテアーゼを利
用したクリーブランド法によるペプチドマッピング（遺
伝子クローニングのためのタンパク質構造解析，平野久
書，東京化学同人，８９−９２頁）を行ったところ、本
酵素は少なくとも次に示す４種類のアミノ酸配列を含
む。

【００３９】 （ａ）Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ （式中、Ｘは未同定アミノ酸を示す） （ｂ）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｐ−Ａｌａ

【００４０】（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ｐｈｅ （ｄ）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ
−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ

【００４１】１０）酵素の均一性 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔Ｕ．Ｋ．
Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９
７０）〕を行ったところ、均一な１本のタンパクバンド
が見られ、公知の標準蛋白質との比較より、この蛋白質
の分子量は８２ｋＤａである。

【００４２】１１）酵素活性測定法 〔酵素活性測定法１〕７−ＡＣＡ５μｍｏｌ、コハク酸
−ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）０．１ｍｍｏ
ｌおよび適量の酵素を加え、０．５ｍｌになるように混
合して，３０℃にて３０分反応させた後、５０％のジメ
チルスルホキサイド液２ｍｌを添加して反応を停止させ
た。生成したデアセチル−７−アミノセファロスポラン
酸（Ｄ−７−ＡＣＡ）を次の条件による高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。

【００４３】分析条件Ａ； カラム；ガードカラム（３０×４．６ｍｍ）のついたワ
コージル−ＩＩ ５Ｃ １８ ＨＧ（２５０×４．６ｍ
ｍ，和光純薬工業社製）のカラム（３５℃保温 ） 移動相；７．７％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル、１ｍＭテ
トラブチルアンモニウム硫酸水素塩および６４ｍＭ酢酸
アンモニウムを含む水溶液 流速；０．８ｍｌ／分 検出；２５４ｎｍの吸光度 １分間に１μｍｏｌのＤ−７−ＡＣＡを生成する酵素を
１単位とした。

【００４４】尚、７−ＡＣＡ誘導体（３）の基質特異性
の測定においては、７−ＡＣＡ以外の基質についても、
上記と同様の反応条件を用いるが、基質として７−ベン
ジルオキシカルボニルアミノ−セファロスポラン酸（７
−ＢＺＡＣＡ）および７−ＣＡＡＣＡを用いた場合のＨ
ＰＬＣ分析条件は、次の通りである。

【００４５】分析条件Ｂ；７−ＢＺＡＣＡよりデアセチ
ル体を生成する場合 カラム；コスモジル ５Ｃ１８−ＡＲ（１５０×４．６
ｍｍ，ナカライテスク（株）製）のカラム（３５℃保
温） 移動相；２７％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルおよび６７ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含む水溶液 流速；１．６ｍｌ／分 検出；２５４ｎｍの吸光度

【００４６】分析条件Ｃ；７−ＣＡＡＣＡよりデアセチ
ル体を生成する場合 カラム；コスモジル ５Ｃ１８−ＡＲ（１５０×４．６
ｍｍ，ナカライテスク社製）のカラム（３５℃保温） 移動相；７．７％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル，１ｍＭテ
トラブチルアンモニウム硫酸水素塩および６４ｍＭ酢酸
アンモニウムを含む水溶液 流速；１．６ｍｌ／分 検出；２５４ｎｍの吸光度

【００４７】〔酵素活性測定法２〕さらに、酢酸低級ア
ルキルエステルを基質とした場合の酵素活性測定は、次
の通りに行った。すなわち、４μｍｏｌの基質、コハク
酸−ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）４０μｍｏ
ｌおよび適量の酵素を加え、０．２ｍｌになるように混
合して３０℃、２０分反応させた後、５０％のジメチル
スルホキサイド液を添加し反応を停止させた。生成した
酢酸は３つの酵素をカップリングさせる方法〔Ｈ．Ｕ．
Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ．Ａ
ｎａｌ．，１，１７２（１９７４）〕に従って測定し
た。

【００４８】１２）反応速度（Ｋｍ値）および比活性
（Ｖｍａｘ値） ７−ＡＣＡ誘導体（３）に対する本酵素のＫｍ値および
Ｖｍａｘ値を求めたところ、７−ＡＣＡに対しては各々
１．４３ｍＭ、４２２μｍｏｌ／分／ｍｇ、ＣｅＣに対
しては各々８．３９ｍＭ、１０００μｍｏｌ／分／ｍｇ
である。

【００４９】以上の理化学的性質を有する本酵素と先行
文献Ａ〜Ｅの公知のＣｅＣデアセチラーゼと比較する
と、本酵素は次の理由により公知のＣｅＣデアセチラー
ゼとは明らかに異なるので、新規酵素であるということ
ができる。

【００５０】（１）分子量１４１ｋＤａおよび８２ｋＤ
ａのサブユニットを有する本酵素は、分子量およびサブ
ユニットの分子量の点で公知のＣｅＣデアセチラーゼと
は異なる。 （２）本酵素の至適ｐＨは５．５であるのに対し、公知
のＣｅＣデアセチラーゼの至適ｐＨは、先行文献Ａ〜Ｃ
のそれは７．０〜８．５で、先行文献Ｄ〜Ｅのそれは４
以下であることより、本酵素は公知のＣｅＣデアセチラ
ーゼとは異なる。

【００５１】（３）本酵素の糖含量は２０％以上である
のに対し、公知のＣｅＣデアセチラーゼに糖が含まれて
いることは知られていない。 （４）本酵素のＮ末アミノ酸配列および部分アミノ酸配
列は、公知のＣｅＣデアセチラーゼのアミノ酸配列とは
異なる。 （５）本酵素は７−ＡＣＡ誘導体（３）に対してＫｍ値
が小さく、Ｖｍａｘ値が公知のＣｅＣデアセチラーゼよ
り遙に大きい。

【００５２】

【発明の効果】上記の通り、本発明の７−ＡＣＡエステ
ラーゼは７−ＡＣＡ誘導体（１）をＤ−７−ＡＣＡ誘導
体（２）に変換する上で、常温常圧下において加水分解
を行い、しかも基質に対してＫｍ値が小さく、Ｖｍａｘ
が公知のＣｅＣデアセチラーゼより遙に大きいため、少
量の酵素量で反応収率を１００％にすることができるの
で、工業的に非常に有用な酵素を提供することができ、
本酵素を使用することにより、７−ＡＣＡ誘導体（１）
からＤ−７−ＡＣＡ誘導体（２）を工業的に有利に製造
することができる。

【００５３】

【実施例】次に、実施例により本発明をより詳細に説明
する。これにより本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】 ７−ＡＣＡエステラーゼ含有菌体の培養 麦芽エキス２％、ペプトン０．５％を含み、ｐＨを６．
０に調整した殺菌培地１５０ｍｌ（２Ｌ容三角フラスコ
使用）に、予め上記と同一組成の培地で２８℃、１日試
験管培養（７ｍｌ）したロドトルラ・グルチニス３８Ｂ
１を移植、，２８℃で１日間培養した。この培養液を麦
芽エキス２％、ペプトン０．５％、オレイン酸メチル
０．５％を含み、ｐＨを６．０に調整した１０Ｌの殺菌
培地を仕込んだ１５Ｌ容ジャーファーメンターに移植
し、５Ｌ／分の通気条件、４００ｒｐｍの攪拌条件にて
３３時間培養した。得られた培養物を遠心分離により菌
体を集菌し、０．８５％食塩水にて洗浄して菌体を得
た。７−ＡＣＡの加水分解活性をみると、１．７単位／
ｍｌ（培養液）であった。

【００５４】

【実施例２】 ７−ＡＣＡエステラーゼの精製 実施例１で得た菌体を２ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し，−２０℃
に凍結した。融解した菌体液をガラスビーズを用いたダ
イノーミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ Ｍａ
ｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）により
菌体破砕を行った。これを７０００Ｇで６０分間遠心分
離により沈澱を除き、無細胞抽出液を得た。これに硫酸
ストレプトマイシンを１％になるように添加し、遠心分
離により核酸を沈澱として除去した。これに硫酸アンモ
ニウムが６５％飽和となるように添加した後、遠心分離
により上清液を取得した。これに硫酸アンモニウムをさ
らに８０％飽和となるようにさらに添加し、遠心分離に
より活性画分を沈澱として採取した。

【００５５】この沈澱を２ｍＭのＤＴＴを含むコハク酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、同一緩衝液
にて透析を２回行った。透析された酵素液はＹＭ３０メ
ンブラン（アミコン社製）を用いる限外濾過により濃縮
した。得られた酵素液を上記と同一の緩衝液で平衡化し
たＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ ｐｒｅ−ｐａ
ｃｋｅｄ カラム（２０×２．２ｃｍ ｉ．ｄ．）にチ
ャージした。分画は５ｍｌとして、同一緩衝液で先ず３
０分，次に食塩濃度を０〜０．２Ｍ含む同一緩衝液でグ
ラジエント溶出（０−０．１Ｍ、３０−５５分；０．１
−０．２Ｍ、５５−９０分）した。活性画分を集めた
後、ＹＭ３０メンブランフィルターおよびセントリコン
３０コンセントレイターにて濃縮した。

【００５６】得られた濃縮液を２ｍＭＤＴＴおよび０．
１ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００
ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ カラム（６０×１．６ｃｍ
ｉ．ｄ．）にチャージした。１ｍｌ／分の流速で上記と
同一緩衝液で溶出した。得られた活性区分のみを集め、
凍結乾燥して精製酵素７−ＡＣＡエステラーゼを得た。
上記の精製過程を表３に示す。

【表３】

【００５７】

【実施例３】 ７−ＡＣＡからのＤ−７−ＡＣＡの生成 コハク酸−ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１ｍ
ｍｏｌ、７−ＡＣＡ０．０５ｍｍｏｌ、実施例２で得た
精製酵素８単位を含む反応液５ｍｌを３０℃にて攪拌し
ながら反応させた。７−ＡＣＡ、Ｄ−７−ＡＣＡおよび
酢酸を定量した。その結果は図１に示す通りであり，基
質の７−ＡＣＡの減少に伴い、Ｄ−７−ＡＣＡと酢酸が
等モルずつ生成されることより，明らかに精製酵素が７
−ＡＣＡエステラーゼであることを示していた。

【００５８】

【実施例４】 ７−ＡＣＡ誘導体（３）に対するＫｍおよびＶｍａｘ値 ７−ＡＣＡ誘導体（３）に対するＫｍ値およびＶｍａｘ
値を求めるために、実施例２で得た精製７−ＡＣＡエス
テラーゼを用いて、前記の酵素活性測定法において、基
質およびその濃度を変化させて活性を測定し、逆数プロ
ット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔｓ）
にてＫｍおよびＶｍａｘを求めた。

【００５９】基質としては７−ＡＣＡ、ＣｅＣ、７−Ｃ
ＡＡＣＡおよび７−ＢＺＡＣＡを用いた。これらに対す
るＫｍ値は各々１．４３、８．３９、２．０３および
１．１１ｍＭであった。また、Ｖｍａｘ値は各々４２
２、１０００、５６２および３９１単位／ｍｇであっ
た。

【配列表】

【００６０】配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Asn Pro Asn Glu Pro Pro Pro Val Val Asp Leu Gly Tyr Ala 1 5 10 15

【００６１】配列番号：２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００６２】配列番号：３ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００６３】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Val Asp Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val Leu Asn Ser Ala 1 5 10 15 Ala Phe

【００６４】配列番号：５ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Ser Ser Leu Thr Asp Phe Gly Thr Ser Gln Ile Thr Ile Ile Asp 1 5 10 15 Phe Trp Arg Gly Gly Ile 20

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の７−アミノセファロスポラン酸エステ
ラーゼを用いた、７−アミノセファロスポラン酸（７−
ＡＣＡ）からのデアセチル−７−アミノセファロスポラ
ン酸（Ｄ−７−ＡＣＡ）の生成経過の結果を示す曲線で
ある。

【図２】本発明の７−アミノセファロスポラン酸エステ
ラーゼの至適温度を示す曲線である。

【図３】本発明の７−アミノセファロスポラン酸エステ
ラーゼの至適ｐＨを示す曲線である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する７−アミノ
   セファロスポラン酸エステラーゼ。 酵素作用 少なくとも、一般式（１） 【化１】 （式中、Ｒは水素原子またはアシル基を示す）で表され
   る７−アミノセファロスポラン酸誘導体を一般式（２） 【化２】 （式中、Ｒは前記と同じ意味を有する）で表されるデア
   セチル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体と酢酸に
   加水分解する反応を触媒する。 基質特異性 少なくとも、酢酸プロピル、酢酸ブチル等の酢酸低級ア
   ルキルエステルおよび一般式（３） 【化３】 （式中、Ｒ¹ は水素原子、Ｄ−５−アミノ−５−カルボ
   キシバレリル、クロロアセチルまたはベンジルオキシカ
   ルボニル基を示す）で表される７−アミノセファロスポ
   ラン酸誘導体に作用する。特に、セファロスポリンＣ、
   ７−クロロアセチルアミノ−セファロスポラン酸、７−
   アミノセファロスポラン酸および酢酸ブチルに強く作用
   する。 分子量 分子量は１４１ｋＤａである（ゲル濾過法）。サブユニ
   ットの分子量は８２ｋＤａである（ＳＤＳ−ＰＡＧ
   Ｅ）。 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは５．５である。ｐＨ５．５〜７．０が安定ｐ
   Ｈ領域である。 至適温度および安定温度 至適温度は３０〜３５℃である。ｐＨ７．０で１５分処
   理においては、２０℃まで安定である。 阻害 Ｃｕ²⁺、Ｈｇ²⁺、（ｐ−アミジノフェニル）メタンスル
   ホニルフルオライド、硫酸エセリン等で阻害される。 糖含量 ２０％以上の混成型糖鎖を含む。 Ｎ末アミノ酸配列 Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐ
   ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
   ｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ− 部分アミノ酸配列 少なくとも次に示す４種類のアミノ酸配列を含む。 （ａ）Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ （式中、Ｘは未同定アミノ酸を示す） （ｂ）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓ
   ｐ−Ａｌａ （ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
   ａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
   −Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ （ｄ）Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓ
   ｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ
   −Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−
   Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ