JPH01137974A - 固定化酵素，その製法ならびにフラクトオリゴ糖の製造法 - Google Patents
固定化酵素，その製法ならびにフラクトオリゴ糖の製造法Info
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- JPH01137974A JPH01137974A JP29529987A JP29529987A JPH01137974A JP H01137974 A JPH01137974 A JP H01137974A JP 29529987 A JP29529987 A JP 29529987A JP 29529987 A JP29529987 A JP 29529987A JP H01137974 A JPH01137974 A JP H01137974A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は難う触性甘味料、低カロリー甘味料。
脂質代謝改善効果及び腸内ビフィズス菌の選択増殖効果
のある甘味料等として食品分計などに使用されているフ
ラクトオリゴ環を製造するために用いられる固定化酵素
とその製法ならびに固定化酵素によるフラクトオリゴ糖
の製造法に関する。
のある甘味料等として食品分計などに使用されているフ
ラクトオリゴ環を製造するために用いられる固定化酵素
とその製法ならびに固定化酵素によるフラクトオリゴ糖
の製造法に関する。
［従来の技術］
シュークロースにフラクトース転移作用を有する酵素を
作用させると、フラクトース転移反応の結果、副生じた
グルコース、転移反応によりシュークロースにフラクト
ースが１〜４分子結合ｔ、４３ｓ類（ＧＦ２）、 ４１
１！ＩＪ （ＧＦ３）、 ５１！ｉ類（ＧＦ４）。
作用させると、フラクトース転移反応の結果、副生じた
グルコース、転移反応によりシュークロースにフラクト
ースが１〜４分子結合ｔ、４３ｓ類（ＧＦ２）、 ４１
１！ＩＪ （ＧＦ３）、 ５１！ｉ類（ＧＦ４）。
６糖類 （ＧＦ５）を含むフラクトオリゴ環および未反
応のシュークロースを少量含有する甘味組成物が生成し
、このフラクトオリゴ環はう蝕原因菌であるストレプト
コッカス・ムタンスの生産するデキストランシュークラ
ーゼの基質とはならないので、フラクトース転移作用を
有する酵素をシュークロースに作用させることによりシ
ュークロースから難う触性甘味料を製造できることが知
られている（特開昭５６−１５４９６７）。また、フラ
クトオリゴ環が生体内で消化吸収されない低カロリー甘
味料であること（特開昭５８−４００６５）に加えて、
腸内細菌のビフィズス菌により選択的に資化されること
から、腸内ビフィズス菌の選択的増殖因子ともなり得る
こと（特公昭５９−５３８３４）も知られている。
応のシュークロースを少量含有する甘味組成物が生成し
、このフラクトオリゴ環はう蝕原因菌であるストレプト
コッカス・ムタンスの生産するデキストランシュークラ
ーゼの基質とはならないので、フラクトース転移作用を
有する酵素をシュークロースに作用させることによりシ
ュークロースから難う触性甘味料を製造できることが知
られている（特開昭５６−１５４９６７）。また、フラ
クトオリゴ環が生体内で消化吸収されない低カロリー甘
味料であること（特開昭５８−４００６５）に加えて、
腸内細菌のビフィズス菌により選択的に資化されること
から、腸内ビフィズス菌の選択的増殖因子ともなり得る
こと（特公昭５９−５３８３４）も知られている。
上記のフラクトオリゴ糖製造に用いられるフラクトース
転移作用を有する酵素としては、アスペルギルス（江阻
■月三）属、例えばアスペルギルス・ニガー（八ｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＦＥＲＭ−Ｐ ５８８６
） 。
転移作用を有する酵素としては、アスペルギルス（江阻
■月三）属、例えばアスペルギルス・ニガー（八ｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＦＥＲＭ−Ｐ ５８８６
） 。
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属（ペニシリ
ウム・ニグリカンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｉｇ
ｒｉｃａｎｓ）等）。
ウム・ニグリカンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｉｇ
ｒｉｃａｎｓ）等）。
フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属（フザリウム・リニ
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ １ｉｎｔ ＩＡＭ ５００８）等
）、ダレオスボリウム（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ）属
（ダレオスボリウム・カキ（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ
ｋａｋｉ ＩＡＭ ５０１１）等）、オーレオバシデ
ウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属（オーレオバシ
デウム・プルランス・パル・メラニゲナム（独王−ｂａ
ｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ ｖａｒ、
ｍｅｌａｎｉｇｅｎｕｍ７ 八−８゜ＦＥＲＭ−Ｐ
５８８５）等）などの他に、サツカロミセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（サツカロミセス・セレビシェ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）等）、ロドトル（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌｌａ ｇｌｕ
ｔｉｎｉｓ）等）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属（ビヒア
・ミソ（Ｐｉｃｈｉａ ｍ１ｓｏ）等）、ハンゼヌラ（
）Ｉａｎｓｅｎｕｉａ）属（ハンゼヌラ・ミソ（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ１旦）等）、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）属（キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等）などの酵母等の微生物起
源の酵素やアスパラガ 、ス、キクイモ等の植物起源の
酵素を用いることができる（特開昭５６−１５４９６７
、特公昭５９−５３８３４）。
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ １ｉｎｔ ＩＡＭ ５００８）等
）、ダレオスボリウム（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ）属
（ダレオスボリウム・カキ（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ
ｋａｋｉ ＩＡＭ ５０１１）等）、オーレオバシデ
ウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属（オーレオバシ
デウム・プルランス・パル・メラニゲナム（独王−ｂａ
ｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ ｖａｒ、
ｍｅｌａｎｉｇｅｎｕｍ７ 八−８゜ＦＥＲＭ−Ｐ
５８８５）等）などの他に、サツカロミセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（サツカロミセス・セレビシェ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）等）、ロドトル（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌｌａ ｇｌｕ
ｔｉｎｉｓ）等）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属（ビヒア
・ミソ（Ｐｉｃｈｉａ ｍ１ｓｏ）等）、ハンゼヌラ（
）Ｉａｎｓｅｎｕｉａ）属（ハンゼヌラ・ミソ（Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ１旦）等）、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）属（キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等）などの酵母等の微生物起
源の酵素やアスパラガ 、ス、キクイモ等の植物起源の
酵素を用いることができる（特開昭５６−１５４９６７
、特公昭５９−５３８３４）。
上記の酵素を用いたフラクトオリゴ糖の工業的な製法と
しては上記微生物の培養液、菌体、菌体破砕物、抽出・
精製酵素などを用い、適当なシュークロース濃度、 ｐ
）Ｉ、温度条件下でシュークロースと混合し攪拌反応さ
せる回分方式が実施されている（特開昭５６−ｔｓｉ９
ｉ＋７．特開昭６ｌ−２６８１９０）。
しては上記微生物の培養液、菌体、菌体破砕物、抽出・
精製酵素などを用い、適当なシュークロース濃度、 ｐ
）Ｉ、温度条件下でシュークロースと混合し攪拌反応さ
せる回分方式が実施されている（特開昭５６−ｔｓｉ９
ｉ＋７．特開昭６ｌ−２６８１９０）。
さらに、製造コスト面から考えると、回分方式よりは固
定化酵素または固定化菌体を用いる連続法が好ましく、
微生物菌体をアルギン酸塩のゲルに包括固定化する方法
（特開昭５８−１６２２９２）やβ−１，３−１，６グ
ルカンと硫酸アルミニウムなどで菌体を固定化する方法
（特開昭６Ｏ−４１４９７）が提案されている。
定化酵素または固定化菌体を用いる連続法が好ましく、
微生物菌体をアルギン酸塩のゲルに包括固定化する方法
（特開昭５８−１６２２９２）やβ−１，３−１，６グ
ルカンと硫酸アルミニウムなどで菌体を固定化する方法
（特開昭６Ｏ−４１４９７）が提案されている。
固定化酵素または固定化微生物を用いてフラクトオリゴ
環を工業的に連続生産するには、固定化物をカラムに充
填し、高濃度のシュークロース溶液を通すので、固定化
物にかなりの物理的強度が要求される。一般に、ゲル包
括法によって得られた固定化物は、゛物理的強度が比較
的小さく、高濃度糖液を基質とする工業的規模の生産で
は、ゲルの圧密か起こり通液性が低下しやすい。
環を工業的に連続生産するには、固定化物をカラムに充
填し、高濃度のシュークロース溶液を通すので、固定化
物にかなりの物理的強度が要求される。一般に、ゲル包
括法によって得られた固定化物は、゛物理的強度が比較
的小さく、高濃度糖液を基質とする工業的規模の生産で
は、ゲルの圧密か起こり通液性が低下しやすい。
この面の欠点を解決する目的で微生物菌体を包括固定し
た物理的強度の良好な固定化菌体（特開昭６２−４０２
８９）や固定化酵素（特願昭６ｌ−１１９３３８）が提
案されてきている。
た物理的強度の良好な固定化菌体（特開昭６２−４０２
８９）や固定化酵素（特願昭６ｌ−１１９３３８）が提
案されてきている。
［発明が解決しようとする問題点］
しかしながら、これらの固定化物は工業的な通液条件、
例えば５０℃、シュークロース５０％でカラム通液を行
なった場合、活性半減期が約２０日程度と短かく、可能
な生産量が大きく変化する、固定化物の抜出しと再充填
を頻繁に行なうなと実用上大きな問題点がある。
例えば５０℃、シュークロース５０％でカラム通液を行
なった場合、活性半減期が約２０日程度と短かく、可能
な生産量が大きく変化する、固定化物の抜出しと再充填
を頻繁に行なうなと実用上大きな問題点がある。
そこで本発明者らは、そのような問題点を解決すべく、
鋭意研究を重ねた結果、１級ないし４級アミンを有する
キトサン誘導体や陰イオン交換樹脂などの粒状担体にフ
ラクトース転移作用を有する酵素を一定量吸着固定化さ
せた固定化酵素を用いると、高いフラクトオリゴ糖収率
が得られると共に、上記工業的通液条件においても、従
来の知見に比べ活性半減期が飛躍的に延長される事実を
見出し、本発明を完成したのである。
鋭意研究を重ねた結果、１級ないし４級アミンを有する
キトサン誘導体や陰イオン交換樹脂などの粒状担体にフ
ラクトース転移作用を有する酵素を一定量吸着固定化さ
せた固定化酵素を用いると、高いフラクトオリゴ糖収率
が得られると共に、上記工業的通液条件においても、従
来の知見に比べ活性半減期が飛躍的に延長される事実を
見出し、本発明を完成したのである。
本発明は、フラクトース転移作用を有する酵素を１級な
いし４級アミンを有する粒状の担体に固定化した固定化
酵素、フラクトース転移作用を有する酵素の溶液を１級
ないし４級アミンを有する粒状の担体に固定化すること
を特徴とする固定化酵素の製造法ならびにフラクトース
転移作用を有する酵素を１級ないし４級アミンを有する
粒状の担体に固定化した固定化酵素をシュークロースに
作用させることを特徴とするフラクトオリゴ糖の製造法
を提供するものである。
いし４級アミンを有する粒状の担体に固定化した固定化
酵素、フラクトース転移作用を有する酵素の溶液を１級
ないし４級アミンを有する粒状の担体に固定化すること
を特徴とする固定化酵素の製造法ならびにフラクトース
転移作用を有する酵素を１級ないし４級アミンを有する
粒状の担体に固定化した固定化酵素をシュークロースに
作用させることを特徴とするフラクトオリゴ糖の製造法
を提供するものである。
酵素は微生物を適当な培地、たとえばシュークロース
５．０％、ペプトン １．０％、肉エキス０．７％１食
塩０．３％を含有する培地にそれぞれの微生物の至適生
育温度２５〜３０℃で２４〜９６時間培養して酵素を生
産させた培養液を用いる。
５．０％、ペプトン １．０％、肉エキス０．７％１食
塩０．３％を含有する培地にそれぞれの微生物の至適生
育温度２５〜３０℃で２４〜９６時間培養して酵素を生
産させた培養液を用いる。
酵素の調製手順としては、菌体外酵素として培養液から
、菌体を遠心分離、濾過などにより除去したもの、また
は菌体酵素として菌体から超音波処理、磨砕、高圧破砕
、界面活性剤処理、自己消化などの方法により、菌体か
ら酵素を遊離させ、菌体外画分を除去したものをそのま
ま用いるか、これら酵素液を限外濾過、硫安塩析、溶剤
沈澱。
、菌体を遠心分離、濾過などにより除去したもの、また
は菌体酵素として菌体から超音波処理、磨砕、高圧破砕
、界面活性剤処理、自己消化などの方法により、菌体か
ら酵素を遊離させ、菌体外画分を除去したものをそのま
ま用いるか、これら酵素液を限外濾過、硫安塩析、溶剤
沈澱。
ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィなどの酵素精製
法によって分画精製した、より高純度の酵素を用いるこ
とができる。
法によって分画精製した、より高純度の酵素を用いるこ
とができる。
本発明に使用できる担体は、粒状に成形されたキトサン
誘導体、陰イオン交換樹脂などであるが、固定化に関わ
る官能基として１級〜４級アミンを含んでいることが必
要である。陽イオン交換樹脂、吸着樹脂、活性炭などは
不適当である。担体の母体としてはキトサンなどの多糖
体やスチレン系、エポキシ系、ビニル系、フェノール系
のポリマーが良好であり、アクリル酸系のポリマーは不
適当である。
誘導体、陰イオン交換樹脂などであるが、固定化に関わ
る官能基として１級〜４級アミンを含んでいることが必
要である。陽イオン交換樹脂、吸着樹脂、活性炭などは
不適当である。担体の母体としてはキトサンなどの多糖
体やスチレン系、エポキシ系、ビニル系、フェノール系
のポリマーが良好であり、アクリル酸系のポリマーは不
適当である。
市販品を例示すると、ダイヤイオン（三菱化成工業■製
）Ｗ八−２１，Ｗ八−３０，８ＰＡ−２５，セパビーズ
（三菱化成工業■製） ＦＰ−）１八、 Ｆｌ’−ｆｌ
八へトヨパール（東ソー■製）ＤＥＡＥＩ−ヨバール；
デュオライト（ダイヤモンドシャムロツタ社製）Δ−３
８５，Ａ−７゜八−３６８，Ａ−３７８，Ａ−１５１，
Ａ−５６１、ダウエ・ンクス（ダウケミカル社製） ６
６、 ＭＳ八−１，ＷＧＲ−２、アンバーライト （オ
ルガノ■製）ＩＲＡ−４５，ＩＲＡ−９３，ＩＲＡ−９
４゜ＩＲＡ−９９，ＴＲＡ−４０１，ＩＲＡ−４１１，
ＩＲＡ−９０４，；キトパール（富士紡績■製） ＢＣ
Ｗ−２５００，ＢＣＷ−２６００，ＢＣＷ−３０００、
ＢＣＷ−３５００，ＢＣＷ−４０００などがある。
）Ｗ八−２１，Ｗ八−３０，８ＰＡ−２５，セパビーズ
（三菱化成工業■製） ＦＰ−）１八、 Ｆｌ’−ｆｌ
八へトヨパール（東ソー■製）ＤＥＡＥＩ−ヨバール；
デュオライト（ダイヤモンドシャムロツタ社製）Δ−３
８５，Ａ−７゜八−３６８，Ａ−３７８，Ａ−１５１，
Ａ−５６１、ダウエ・ンクス（ダウケミカル社製） ６
６、 ＭＳ八−１，ＷＧＲ−２、アンバーライト （オ
ルガノ■製）ＩＲＡ−４５，ＩＲＡ−９３，ＩＲＡ−９
４゜ＩＲＡ−９９，ＴＲＡ−４０１，ＩＲＡ−４１１，
ＩＲＡ−９０４，；キトパール（富士紡績■製） ＢＣ
Ｗ−２５００，ＢＣＷ−２６００，ＢＣＷ−３０００、
ＢＣＷ−３５００，ＢＣＷ−４０００などがある。
次に固定化酵素を製造する際の手順について記す。酵素
と担体の量比は極めて広い範囲で変えることができるが
、好ましい範囲としては担体１ｇに対し２５単位〜５０
００単位、さらに好ましくは５０単位〜３０００単位の
範囲である。本発明におけるフラクトース転）多作用を
有する酵素の活性測定法および酵素活性の表示法は下記
の通りである。
と担体の量比は極めて広い範囲で変えることができるが
、好ましい範囲としては担体１ｇに対し２５単位〜５０
００単位、さらに好ましくは５０単位〜３０００単位の
範囲である。本発明におけるフラクトース転）多作用を
有する酵素の活性測定法および酵素活性の表示法は下記
の通りである。
マクルベイン（Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ５，
０）２．０ｍρに酵素液１ｍｐを混合し、固定化酵素の
場合には緩衝液３ｍρに固定化酵素の適量を添加し、２
５％（ｗ／ｖ、） シュークロース溶液２．Ｏｍρを
加えて、４０℃で１時間反応させる。反応の停止は、１
０分間の煮沸処理によって行なう。反応液中に生成した
ＧＦ２を高速液体クロマトグラフ法で定量し、反応液中
に１分間で１マイクロモルのフラクトース転移作用を有
する酵素量を１単位とする。
０）２．０ｍρに酵素液１ｍｐを混合し、固定化酵素の
場合には緩衝液３ｍρに固定化酵素の適量を添加し、２
５％（ｗ／ｖ、） シュークロース溶液２．Ｏｍρを
加えて、４０℃で１時間反応させる。反応の停止は、１
０分間の煮沸処理によって行なう。反応液中に生成した
ＧＦ２を高速液体クロマトグラフ法で定量し、反応液中
に１分間で１マイクロモルのフラクトース転移作用を有
する酵素量を１単位とする。
酵素量が５０００単位／ｇ担体以上の使用では、固定化
酵素の固定化率が著しく低下し、かつフラクトオリゴ糖
の生成率が低下する。また、２５単位／ｇ担体以下では
、経済的に実用性がない。
酵素の固定化率が著しく低下し、かつフラクトオリゴ糖
の生成率が低下する。また、２５単位／ｇ担体以下では
、経済的に実用性がない。
固定化時のｐＨは酵素の安定性と担体への吸着性から決
定されるが、ｐＨ３〜１０、好ましくは４〜９の水性媒
体中に溶解している酵素を用い、固定化担体と混合、攪
拌する。攪拌は手動または機械を用いて行なうことがで
き、攪拌時間は構成成分の使用量、温度、 ｐＨ等によ
り変化するが、通常は０．５〜５時間の攪拌で良好な固
定化酵素が得られる。固定化担体は湿潤したものの方が
短時間で固定化できるが、乾燥した担体な用いても良い
。
定されるが、ｐＨ３〜１０、好ましくは４〜９の水性媒
体中に溶解している酵素を用い、固定化担体と混合、攪
拌する。攪拌は手動または機械を用いて行なうことがで
き、攪拌時間は構成成分の使用量、温度、 ｐＨ等によ
り変化するが、通常は０．５〜５時間の攪拌で良好な固
定化酵素が得られる。固定化担体は湿潤したものの方が
短時間で固定化できるが、乾燥した担体な用いても良い
。
固定化時の温度は通常、酵素の安定性が十分確保される
０〜５０℃の範囲で行なわれ、引き続き通常０〜５０℃
の水で洗浄して不純物を除去することも可能である。さ
らに乾燥する場合は、６０℃以下で通風または真空乾燥
することができる。また、このようにして固定化した後
、グルタルアルデヒドなどの水溶性多官能性架橋剤を用
いてさらに強固に固定化することも可能である。
０〜５０℃の範囲で行なわれ、引き続き通常０〜５０℃
の水で洗浄して不純物を除去することも可能である。さ
らに乾燥する場合は、６０℃以下で通風または真空乾燥
することができる。また、このようにして固定化した後
、グルタルアルデヒドなどの水溶性多官能性架橋剤を用
いてさらに強固に固定化することも可能である。
本発明によって得られる固定化酵素をシュークロースに
作用させてフラクトオリゴ環を製造するには、固定化酵
素なカラムに充填し、シュークロース溶液を通液する方
法が最も実用的である。
作用させてフラクトオリゴ環を製造するには、固定化酵
素なカラムに充填し、シュークロース溶液を通液する方
法が最も実用的である。
しかし、回分式あるいは流動層による方式でも十分にそ
の目的を達することができる。固定化酵素カラムで製造
する場合には、シュークロース溶液として２０〜７０％
（Ｗ／ｗ）濃度のものを用い、ｐＨ５〜８、温度３０〜
６０℃の条件で通液することが好ましい。この反応条件
で得られるフラクトオリゴ糖の収率１組成は、固定化酵
素の活性、使用量とシュークロース基質溶液の反応器通
過速度を調整することにより、フラクトオリゴ糖の収率
を最高約６２％（Ｗ／Ｗ）までの範囲で所望のものを得
ることができる。
の目的を達することができる。固定化酵素カラムで製造
する場合には、シュークロース溶液として２０〜７０％
（Ｗ／ｗ）濃度のものを用い、ｐＨ５〜８、温度３０〜
６０℃の条件で通液することが好ましい。この反応条件
で得られるフラクトオリゴ糖の収率１組成は、固定化酵
素の活性、使用量とシュークロース基質溶液の反応器通
過速度を調整することにより、フラクトオリゴ糖の収率
を最高約６２％（Ｗ／Ｗ）までの範囲で所望のものを得
ることができる。
さらに、使用して活性が低下した固定化酵素の担体は、
希アルカリを用いて酵素蛋白を溶離させる常法で再生可
能であり、再生後再び酵素と固定化させて繰返し使用が
できる。
希アルカリを用いて酵素蛋白を溶離させる常法で再生可
能であり、再生後再び酵素と固定化させて繰返し使用が
できる。
［実施例］
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１．比較例
（１）酵素の調製
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｇｅｒ）ＦＥＲＭ−Ｐ ５８８６をブイヨン２％、シ
ュークロース５％の組成を有する３００ｍｊ＋の培地に
植菌し、２８℃で２４時間培養したものを種母培養液と
した。３０℃ジャーファーメンタ−にシュークロース１
５％、酵母エキス３．６％を含む培地１５ｊ２を入れ、
１２０℃で３０分間殺菌後、上記種母培養液１０＋ｎＪ
を植菌し、２８℃で９６時間培養した。通気攪拌条件は
、４００ｒｐｍ 、 １．Ｏｖｖｍであった。培養終了
後、培養液を濾過して菌体を除き、フラクトース転移作
用を有する培養炉液を得た。この培養炉液を、限外濾過
膜（分画分子量１００００ ）で精製濃縮して酵素液を
得た。酵素活性は２５００単位／ｍＲであった。
ｉｇｅｒ）ＦＥＲＭ−Ｐ ５８８６をブイヨン２％、シ
ュークロース５％の組成を有する３００ｍｊ＋の培地に
植菌し、２８℃で２４時間培養したものを種母培養液と
した。３０℃ジャーファーメンタ−にシュークロース１
５％、酵母エキス３．６％を含む培地１５ｊ２を入れ、
１２０℃で３０分間殺菌後、上記種母培養液１０＋ｎＪ
を植菌し、２８℃で９６時間培養した。通気攪拌条件は
、４００ｒｐｍ 、 １．Ｏｖｖｍであった。培養終了
後、培養液を濾過して菌体を除き、フラクトース転移作
用を有する培養炉液を得た。この培養炉液を、限外濾過
膜（分画分子量１００００ ）で精製濃縮して酵素液を
得た。酵素活性は２５００単位／ｍＲであった。
（２）固定化酵素の調製
表−１に記した市販の１８種類の異なる固定化担体を用
い、上記（１）で得られた酵素液を担体１ｇ当り７００
単位、ｐ）１５〜８．室温で１時間攪拌吸着させた。脱
イオン水で洗浄後、活性測定を行なった。非吸着側の液
の酵素活性を測定し、用いた酵素活性との差を求め、用
いた酵素活性で除して固定化率（％）とした。また、固
定化酵素の活性も測定し、見掛は活性とした。
い、上記（１）で得られた酵素液を担体１ｇ当り７００
単位、ｐ）１５〜８．室温で１時間攪拌吸着させた。脱
イオン水で洗浄後、活性測定を行なった。非吸着側の液
の酵素活性を測定し、用いた酵素活性との差を求め、用
いた酵素活性で除して固定化率（％）とした。また、固
定化酵素の活性も測定し、見掛は活性とした。
活性の認められた固定化酵素はバッチ反応でフラクトオ
リゴ糖生成能を試験した。試験条件はシュークロース６
０％（ｗ／ｗ）、 ｐＨ６，０，６０’Ｃテシェークロ
ース１ｇ当り２．５車位（見掛は活性）の固定化酵素を
２０時間反応させた後、高速液体クロマトグラフ法でフ
ラクトオリゴ糖収率（固型分当り）を分析した。
リゴ糖生成能を試験した。試験条件はシュークロース６
０％（ｗ／ｗ）、 ｐＨ６，０，６０’Ｃテシェークロ
ース１ｇ当り２．５車位（見掛は活性）の固定化酵素を
２０時間反応させた後、高速液体クロマトグラフ法でフ
ラクトオリゴ糖収率（固型分当り）を分析した。
ここでフラクトオリゴ糖の生成が十分みられた固定化酵
素についてカラムに充填し、カラム法で試験を実施した
。内径２２ｍｍのカラムに固定化酵素を高さ１０ｃｍ
（３８ｍｌ）充填し、５０％（ｗ／ｗ）シュークロース
液をｐＨ８，０，５０℃でフラクトオリゴ糖収率が最大
となるような速度で通液した。カラム通過液の糖組成を
高速液体クロマトグラフで分析し、固定化酵素の活性を
適時測定し、活性半減期を求めた。その結果を表−１に
まとめた。
素についてカラムに充填し、カラム法で試験を実施した
。内径２２ｍｍのカラムに固定化酵素を高さ１０ｃｍ
（３８ｍｌ）充填し、５０％（ｗ／ｗ）シュークロース
液をｐＨ８，０，５０℃でフラクトオリゴ糖収率が最大
となるような速度で通液した。カラム通過液の糖組成を
高速液体クロマトグラフで分析し、固定化酵素の活性を
適時測定し、活性半減期を求めた。その結果を表−１に
まとめた。
実施例２
オーレオバシディウム・プルランス・バラエティ・メラ
ニゲナム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌ
ａｎｓｖａｒ、 ｍｅｌａｎｉｇｅｎｕｍ７ Ａ−８株
（ＦＥＢＭ Ｐ−５８８５）を三角フラスコ中のブイヨ
ン２％、シュークロース５％を含む培地４０ｍ１＋に植
菌し、２８℃で２４時間培養し、これを種母培養液とし
た。３λジャーファーメンタ−にシュークロース１５％
、ペプトン１％、肉エキス０．７％、 ＮａＣＲ０，３
％、 ＣｏＣ＃２・６Ｈ２００，１％を含む培地１．５
ｊｌｔを入れ、１２０℃で３０分間殺菌した後、上記
種母培養液４０ｍＲを植菌し、２８℃で２４時間培養し
た。通気攪拌条件は２４０ｒｐｍ、 １．Ｏｖｖ＋＋＋
であった。培養終了後、培養液を遠心分離しフラクトー
ス転移作用を有する粗酵素菌体３Ｑｇを得た。
ニゲナム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌ
ａｎｓｖａｒ、 ｍｅｌａｎｉｇｅｎｕｍ７ Ａ−８株
（ＦＥＢＭ Ｐ−５８８５）を三角フラスコ中のブイヨ
ン２％、シュークロース５％を含む培地４０ｍ１＋に植
菌し、２８℃で２４時間培養し、これを種母培養液とし
た。３λジャーファーメンタ−にシュークロース１５％
、ペプトン１％、肉エキス０．７％、 ＮａＣＲ０，３
％、 ＣｏＣ＃２・６Ｈ２００，１％を含む培地１．５
ｊｌｔを入れ、１２０℃で３０分間殺菌した後、上記
種母培養液４０ｍＲを植菌し、２８℃で２４時間培養し
た。通気攪拌条件は２４０ｒｐｍ、 １．Ｏｖｖ＋＋＋
であった。培養終了後、培養液を遠心分離しフラクトー
ス転移作用を有する粗酵素菌体３Ｑｇを得た。
この菌体を超音波処理で破砕した後、遠心分離で菌体画
分を除き、その後硫安塩析で分画後、透析濃縮して粗酵
素液５０ｍｎを得た（活性１２０単位７ｍＲ）。
分を除き、その後硫安塩析で分画後、透析濃縮して粗酵
素液５０ｍｎを得た（活性１２０単位７ｍＲ）。
担体としてアンバーライトＩＲＡ−９４（ポリスチレン
系弱塩基性イオン交換樹脂、３級アミン、オルガノ社製
）５０ｇを用い、ｐ）Ｉ ４．２、室温条件下で３０分
攪拌吸着させた。その後、固液分離を行ない酵素活性を
測定したところ、固定化率はほぼ１００％、見掛は活性
は９５単位／ｇであった。この固定化陰素を内径２．２
ｃｍのカラムに充填してシュークロース７０％液をｐ）
Ｉ ７．０、温度６０℃で通液したところ、空塔速度０
．５でフラクトオリゴ糖収率は最大となり、固型分９約
５４％であった。また、５０℃での活性半減期は６７日
であった。
系弱塩基性イオン交換樹脂、３級アミン、オルガノ社製
）５０ｇを用い、ｐ）Ｉ ４．２、室温条件下で３０分
攪拌吸着させた。その後、固液分離を行ない酵素活性を
測定したところ、固定化率はほぼ１００％、見掛は活性
は９５単位／ｇであった。この固定化陰素を内径２．２
ｃｍのカラムに充填してシュークロース７０％液をｐ）
Ｉ ７．０、温度６０℃で通液したところ、空塔速度０
．５でフラクトオリゴ糖収率は最大となり、固型分９約
５４％であった。また、５０℃での活性半減期は６７日
であった。
実施例３
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｇｅｒ）ＦＥＲＭ−Ｐ５８８６をブイヨン２％、シュ
ークロース５％の組成を有する１０１１１７！の培地に
１白金耳植菌し、２８℃で２４時間培養したものを種母
培養液とした。
ｉｇｅｒ）ＦＥＲＭ−Ｐ５８８６をブイヨン２％、シュ
ークロース５％の組成を有する１０１１１７！の培地に
１白金耳植菌し、２８℃で２４時間培養したものを種母
培養液とした。
３Ｊ２ジャーファーメンタ−にシュークロース１５％、
酵母エキス３．６％を含む培地１．５Ｊｌを入れ、１２
０℃で３０分間殺菌後、上記種母培養液１０ｍＡ＋を植
菌し、２８℃で９６時間培養した。通気攪拌条件は２４
Ｏｒｐｍ’、 ０．５ｖｖｍであった。培養終了後、菌
体１８０ｇと培養炉液１．２ ｆｔに分別した。培養炉
液は活性が１００ ｉ位／１であった。この培養炉液５
０ｍ１＋を２倍に希釈し、ダイヤイオンＦｌ’−（ＩＡ
（ポリビニール系弱塩基性樹脂、ＤＥＡＥ型３級ア
ミン；三菱化成工業■製）１００ ｇとｐＨ８，７，４
５℃で５時間攪拌混合して固定化させた。固定化物を水
洗後、活性を測定したところ、固定化率９３％、見掛は
活性１６単位であった。この固定化酵素を実施例１と同
条件下（ただし温度５０℃）でバッチ反応を行なったと
ころ、フラクトオリゴ糖収率は固型分あたり５８％であ
り、固定化酵素の失活はなかった。
酵母エキス３．６％を含む培地１．５Ｊｌを入れ、１２
０℃で３０分間殺菌後、上記種母培養液１０ｍＡ＋を植
菌し、２８℃で９６時間培養した。通気攪拌条件は２４
Ｏｒｐｍ’、 ０．５ｖｖｍであった。培養終了後、菌
体１８０ｇと培養炉液１．２ ｆｔに分別した。培養炉
液は活性が１００ ｉ位／１であった。この培養炉液５
０ｍ１＋を２倍に希釈し、ダイヤイオンＦｌ’−（ＩＡ
（ポリビニール系弱塩基性樹脂、ＤＥＡＥ型３級ア
ミン；三菱化成工業■製）１００ ｇとｐＨ８，７，４
５℃で５時間攪拌混合して固定化させた。固定化物を水
洗後、活性を測定したところ、固定化率９３％、見掛は
活性１６単位であった。この固定化酵素を実施例１と同
条件下（ただし温度５０℃）でバッチ反応を行なったと
ころ、フラクトオリゴ糖収率は固型分あたり５８％であ
り、固定化酵素の失活はなかった。
実施例４
実施例２で得られた菌体を凍結融解、超音波破砕、自己
消化により処理し、酵素を抽出後、遠心分離によって粗
酵素液を得た。さらに、硫安塩析、イオン交換カラム、
ゲル濾過カラム、限外濾過、透析により精製後、濃縮し
て高純度酵素（２０００単位／ｍｇ蛋白）を約２９，０
００単位得た。
消化により処理し、酵素を抽出後、遠心分離によって粗
酵素液を得た。さらに、硫安塩析、イオン交換カラム、
ゲル濾過カラム、限外濾過、透析により精製後、濃縮し
て高純度酵素（２０００単位／ｍｇ蛋白）を約２９，０
００単位得た。
担体としてキトパールＢＣＷ３５００ （キトサン誘
導体、１，２級芳香族アミン；富士紡績■製）１０ｇを
用い、ｐＨ５，５、温度３℃で５時間攪拌混合し固定化
酵素を得た。水洗後の活性測定結果、固定化率６３％、
見掛は活性５６０４位／ｇであった。この固定化酵素を
内径ＩＣ［１１のカラムに充填し、シュークロース４０
％、 ｐｌ（５，０，４０℃で１５日間通を夜したとこ
ろ、活性低下はみられなかった。さらに、５０℃で通液
したところ、活性半減期は約８０日であった。
導体、１，２級芳香族アミン；富士紡績■製）１０ｇを
用い、ｐＨ５，５、温度３℃で５時間攪拌混合し固定化
酵素を得た。水洗後の活性測定結果、固定化率６３％、
見掛は活性５６０４位／ｇであった。この固定化酵素を
内径ＩＣ［１１のカラムに充填し、シュークロース４０
％、 ｐｌ（５，０，４０℃で１５日間通を夜したとこ
ろ、活性低下はみられなかった。さらに、５０℃で通液
したところ、活性半減期は約８０日であった。
［発明の効果］
本発明によるフラクトース転移作用を有する酵素の固定
化は、その固定化操作が担体と酵素溶液を混合、攪拌す
るだけであり、従来法に比較して最も簡便、かつ低コス
トな方法である。また、固定化酵素による反応生成物も
非固定化酵素の回分法によるものとほぼ同等のフラクト
オリゴ糖収率を有し、さらに収率９組成を自在に変化さ
せることができる。また、固定化酵素カラム通液によっ
て得られる反応生成物は短時間の反応ですむため、製品
に仕上げるまでに必要な脱色、脱塩の操作を軽減でき、
これらの点でも本発明は産業上有利である。最も有利な
点は、本発明の固定化法により、固定化酵素の活性半減
期が従来法に比べ２倍以上に延長可能であることである
。した力くって、工業上極めて有利にフラクトオリゴ糖
を製造できる。因みに回分法に比較して単位酵素量あた
りの生産性は２０倍以上となる。また、固定化担体は希
アルカリなどにより再生し、再使用可能な点も従来法に
ない大きな利点である。
化は、その固定化操作が担体と酵素溶液を混合、攪拌す
るだけであり、従来法に比較して最も簡便、かつ低コス
トな方法である。また、固定化酵素による反応生成物も
非固定化酵素の回分法によるものとほぼ同等のフラクト
オリゴ糖収率を有し、さらに収率９組成を自在に変化さ
せることができる。また、固定化酵素カラム通液によっ
て得られる反応生成物は短時間の反応ですむため、製品
に仕上げるまでに必要な脱色、脱塩の操作を軽減でき、
これらの点でも本発明は産業上有利である。最も有利な
点は、本発明の固定化法により、固定化酵素の活性半減
期が従来法に比べ２倍以上に延長可能であることである
。した力くって、工業上極めて有利にフラクトオリゴ糖
を製造できる。因みに回分法に比較して単位酵素量あた
りの生産性は２０倍以上となる。また、固定化担体は希
アルカリなどにより再生し、再使用可能な点も従来法に
ない大きな利点である。
Claims (8)
- （１）フラクトース転移作用を有する酵素を１級ないし
４級アミンを有する粒状の担体に固定化した固定化酵素
。 - （２）フラクトース転移作用を有する酵素がアスベルギ
ルス・ニガー（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￥ ￥ｎｉｇ
ｅｒ￥）ＦＥＲＭ−Ｐ５８８６由来のものである特許請
求の範囲第１項記載の固定化酵素。 - （３）フラクトース転移作用を有する酵素がオーレオバ
シディウム・プルランス・バラエティ・メラニゲナム（
￥Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ￥ ￥ｐｕｌｌｕｌａｎ
ｓ￥ ｖａｒ．￥ｍｅｌａｎｉｇｅｎｕｍ￥）由来のも
のである特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。 - （４）固定化担体が１級ないし４級アミンを有するスチ
レン系ポリマー、エポキシ系ポリマー、フェノール系ポ
リマー、ビニル系ポリマーおよびキトサン誘導体のいず
れかである特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素。 - （５）フラクトース転移作用を有する酵素の溶液を１級
ないし４級アミンを有する粒状の担体に固定化すること
を特徴とする固定化酵素の製造法。 - （６）固定化担体に対するフラクトース転移作用を有す
る酵素の量比が５０〜３０００単位／ｇ担体である特許
請求の範囲第５項記載の固定化酵素の製造法。 - （７）フラクトース転移作用を有する酵素を１級ないし
４級アミンを有する粒状の担体に固定化した固定化酵素
によりシュークロースを変換させることを特徴とするフ
ラクトオリゴ糖の製造法。 - （８）固定化酵素をカラムに充填し、２０〜７０％（ｗ
／ｗ）濃度のシユークロース溶液をｐＨ５〜８、温度３
０〜６０℃で通液する特許請求の範囲第７項記載のフラ
クトオリゴ糖の製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29529987A JPH01137974A (ja) | 1987-11-25 | 1987-11-25 | 固定化酵素，その製法ならびにフラクトオリゴ糖の製造法 |
| US07/885,001 US5314810A (en) | 1987-11-25 | 1992-05-19 | Fructose transferring enzyme absorbed on a granular carrier for production of fructooligosaccharides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29529987A JPH01137974A (ja) | 1987-11-25 | 1987-11-25 | 固定化酵素，その製法ならびにフラクトオリゴ糖の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01137974A true JPH01137974A (ja) | 1989-05-30 |
Family
ID=17818809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29529987A Pending JPH01137974A (ja) | 1987-11-25 | 1987-11-25 | 固定化酵素，その製法ならびにフラクトオリゴ糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01137974A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102558524B1 (ko) * | 2022-10-31 | 2023-07-21 | 씨제이제일제당 주식회사 | 올리고당의 고효율 생산을 위한 신규 아우레오바시디움 플루란스 균주 및 이의 용도 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56154967A (en) * | 1980-03-31 | 1981-11-30 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Sweetening agent and its preparation |
| JPS5831990A (ja) * | 1981-08-21 | 1983-02-24 | Toray Ind Inc | 生理活性物質固定化用担体及びその固定化方法 |
| JPS61257184A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-14 | Tokuyama Soda Co Ltd | 固定化酵素用担体 |
-
1987
- 1987-11-25 JP JP29529987A patent/JPH01137974A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56154967A (en) * | 1980-03-31 | 1981-11-30 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Sweetening agent and its preparation |
| JPS5831990A (ja) * | 1981-08-21 | 1983-02-24 | Toray Ind Inc | 生理活性物質固定化用担体及びその固定化方法 |
| JPS61257184A (ja) * | 1985-05-10 | 1986-11-14 | Tokuyama Soda Co Ltd | 固定化酵素用担体 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102558524B1 (ko) * | 2022-10-31 | 2023-07-21 | 씨제이제일제당 주식회사 | 올리고당의 고효율 생산을 위한 신규 아우레오바시디움 플루란스 균주 및 이의 용도 |
| WO2024096511A1 (ko) * | 2022-10-31 | 2024-05-10 | 씨제이제일제당 (주) | 올리고당의 고효율 생산을 위한 신규 아우레오바시디움 플루란스 균주 및 이의 용도 |
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