JPS5953834B2 - ビフイズス菌増殖促進物質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はビフィズス菌増殖促進物質に関する。

ビフィズス菌は母乳栄養児の腸内細菌の大部分を占める
細菌として良く知られている。

この菌の生理学的意義については多数の報告があり、腸
内腐敗菌による腐敗の抑制作用、独性アミンの産生防止
作用、乳酸や酢酸などの有機酸生成による病原菌の生育
抑制作用等が広く知られている。

ビフィズス菌がこのような作用を有していることから、
成人を含めた人の健康維持、増進を目的として腸内のビ
フイス゛ス菌数を増加させるために種々のビフィズス菌
製剤や醗酵乳製品などが提案されている。

しかしながら、ビフィズス菌をこのようにして体内に摂
取しても、一般的にはビフィズス菌は定着せず、摂取を
中止すればビフィズス菌は糞便中に検出されなくなるこ
とか゛多い。

腸内におけるビフィズス菌の増殖に必要な因子として最
も重要なものは糖類であると考えられ、古くはラクチュ
ロースが有効であるとされていた。

ラクチュロースは難消化性の糖であり、これを摂取した
場合、体内にはほとんど吸収されず大腸に至り、腸内細
菌によって資化される。

しかしながら、腸内にはビフィズス菌のほかに大腸菌、
クロストリディウム等多種多様な腸内細菌が存在してお
り、ラクチュロースはこれら腸内細菌によって非選択的
に資化されるため、ビフィズス菌のみを選択的に増殖さ
せることは困難であった。

本発明者らは、腸内においてビフィズス菌を選択的に増
殖させる糖源について鋭意研究を重ねた結果、シューク
ロースにフラクトースが１〜４分子結合したフラクトオ
リゴ糖が生体内で消化吸収されないことを見出した（特
願昭５６−１３６１３０号〈特開昭５８−４００６５号
〉）。

さらに、これら糖類の腸内細菌による資化性を検討した
ところ、このフラクトオリゴ糖はビフィズス菌により選
択的に資化されることから、腸内でのビフィズス菌の選
択的増殖因子となり得ることを見出し、本発明を完成し
たのである。

すなわち本発明は、シュークロースにフラクトースが１
〜４分子結合したフラクトオリゴ糖を主成分とするビフ
ィズス菌増殖促進物質に関するものである。

本発明で用いるフラクトオリゴ糖は、シュークロースに
フラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得られる
オリゴ糖類、すなわちシュークロースにフラクト−スが
１分子結合した物質（以下ＧＦ２と称する。

）、シュークロースにフラクトースが２分子結合した物
質（以下、ＧＦ３と称する。

）、シュークロースにフラン１ヘースが３分子結合した
物質（以下、ＧＦ４と称する。

）およびシュークロースにフラン１ヘースが４分子結合
した物質（以下ＧＦ５と称する。

）である。これらのオリゴ糖は、シュークロースにフラ
ノ１〜ジルトランスフエラーゼを作用させて得られる転
移糖組成物からたとえは勿−ボンクロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー等の手段により単離精製
することができる。

ここで用いかれるフラクトシルＩ・ランスフェラーゼは
主としてシュークロースに作用してフラクトースとグル
コースとのβ−１，２結合を切断した後、そのフラクト
ースをシュークロースに転移してＧＦ２を生じ、さらに
ＧＦ２にフラクトースを転移してＧＦ３を生成する等の
作用を有している。

この酵素はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
属（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）ＡＣＥ−２−１、ＦＥＲＭ −Ｐ５８８
６等）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属（
ペニシリウム・ニグリカンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ
ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）等）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉ
ｕｍ）属（フザリウム・リニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｌｉｎ
ｉ ＩＡＭ５００８ ）等）、ダレオスポリウム（Ｇｌ
ｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ ）属（ダレオスポリウム・カキ
（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋａｋｉ ＩＡＭ５Ｑｌ
ｌ）等）、オーレオバシデウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄ
ｉｕｍ）属（オーレオハシデウム・プルランス・パル・
メラニゲナム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌ
ｕｌａｎｓ ｖａｒ ｍｅｌａｎｉｇｅｎｕｍＡ−８、
ＡＴＣＣ２０６１２）等）などのカビ、サツカロミセス
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（サツカロミセス・
セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｓｉａｅ）等）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕ
ｌｌａ）属（ロドトルラ・グルチｓ−ス（Ｒｈｏｄｏｔ
ｏｒｕｌｌａ ｇｌｕｓｉｎｉｓ）等）、ピヒア（Ｐｉ
ｃｈｉａ）属（ピヒア・ミソ（Ｐｉｃｈｉａｍｉｓｏ）
等）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属（ハンセヌ
ラ・ミソ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｍ１ｓｏ）等）、キャ
ンテ゛イタ゛（Ｃａｎｄｉｄａ）属（キャンテ゛イタ゛
・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉ
ｓ）等）などの酵母等の微生物起源の酵素やアスパラガ
ス、キクイモ等の植物起源の酵素が用いられる。

微生物起源のフラクトシルトランスフェラーゼは適当な
培地、たとえは゛シュークロース５．０％、ペプトン１
．０％、肉エキス０．７％、ＮａＣ１０，３％を含有す
る培地にそれぞれの微生物の至適温度、すなわち２５〜
３０℃で２４〜９６時間培養し、培養終了後、培養液か
ら濾過または遠心分離等の手段で分離して得られる菌体
、または菌体を除去した培養濾液、さらにはこの培養濾
液より限外濾過法、硫安塩析法、溶剤性でん法、ゲル濾
過法、イオン交換クロマト法等の酵素精製に関する常法
によって精製純化した酵素を用いることができる。

また、植物起源の酵素は植物組織を摩砕等の物理的手段
により破壊した後、酵素を抽出し、その抽出液または抽
出液から常法で一精製した酵素を用いることができる。

シュークロースにこれらのフラクトシルトランスフェラ
ーゼを作用させるときの工業的転移反応条件によって種
々検討の結果、以下の条件で実施することが好ましい。

すなわち、転移反応時のシュークロース濃度を５〜７０
％、好ましくは３０〜６０％とする。

また反応世、反応温度は酵素の起源により異なるが、１
ｆ（４，０〜７．０、温度２５〜６５℃、好ましくは５
０〜６０℃とする。

酵素使用量についてはシュークロース１ｇ当り５〜２０
０単位、好ましくは２．０〜８０単位とする。

ここで酵素の単位は、５％シュークロース溶液１．Ｏｍ
Ｌ ＩＨ５，０の緩衝液１． Ｏｍｌに酵素液０．５ｍ
ｌを添加し、４０℃で６０分間反応させたとき、反応液
２．５ｍｌ中に６０分間に１μｍｏｌｅのグルコースを
生成する酵素量を１単位として表示する。

転移反応終了後、加熱した酵素を失活させ、活性炭によ
り脱色し、さらにイオン交換樹脂で脱塩した後、濃縮し
て目的物を得る。

転移組成物の分析は、たとえば゛マイクロホンタ゛パッ
クＣＨカラム（ウォーターズ・リミテッド製）を用い、
アセトニトリル：水（８０： ２０ （Ｖ／Ｖ）の溶剤
系を用いた高速液体クロマトグラフィー法で行なうこと
ができる。

このようにして得られた組成物の組成は、たとえばグル
コース３０％、シュークロース１１％、ＧＦ２２８％、
ＧＦ３２５％、ＧＦ４５％、ＧＦ５１％であるが、それ
ぞれの構成糖の組成は反応条件により種々の値をとり得
る。

本発明に用いるＧＦ２．ＧＦ３．ＧＦ４．ＧＦ５または
これらの混合物は、たとえば上記組成物を活性炭を充填
したカラムに加え、水および水とエタンールの混合溶液
で順次溶出することによって得ることができる。

たとえばＧＦ２は水で溶出した後、５％（Ｖ／Ｖ）エタ
ノール水溶液で溶出することによりまたＧＦ３は次いで
１０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液で溶出することによ
り、ＧＦ４．ＧＦ５は２０％（■／Ｖ）エタノール水溶
液で溶出することにより得られ、ＧＦ２．ＧＦ３．ＧＦ
４．ＧＦ５の混合物はグルコース、シュークロース、フ
ラクトオリゴ糖を含む上記組成物を活性炭カラムに添加
した後、水を通液することによりグルコースとシューク
ロースを除去しさらに２０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶
液で溶出することによって得られる。

フラクトオリゴ糖のＧＦ２としては０−β−Ｄ−フラク
トフラノシル−（２→１）−〇−β−フラクトフラノシ
ル−（２→１）−α−Ｄグルコピラノシド、Ｏ−β−Ｄ
−フラクトフラノシル−（２→６）−〇−βグルコピラ
ノシル−（１→２）−β−Ｄ−フラクトフラノシド、０
−β−Ｄ−フラクトフラノシル−（２→６） −〇−β
−フラクトフラノシル−（２→１）−α−Ｄ−グルコピ
ラノシド等があり、ＧＦ３としては〇−β−Ｄ−フラク
トフラノシルー（２→〔１−Ｏ−β−Ｄ−フラクトフラ
ノシルー２〕２→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド、Ｏ
−β−Ｄ−フラクトフラノシル−（２→６）−〇−β−
Ｄ−フラクトフラノシルー（２→２）） −〇−α−Ｄ
−グルコピラノシルー（１→２）−β−Ｄ−フラクトフ
ラノシド等があり、ＧＦ４としては〇−β−Ｄ−フラク
Ｉ・フラノシル−（２→〔１−０−β−Ｄ−フラクトフ
ラノシルー２〕３→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド等
があり、ＧＦ５としては０−β−Ｄ−フラクトフラノシ
ル−（２→〔１−０−β−Ｄ−フラクトフラノシルー２
〕４→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド等がある。

なお、ＧＦ２のうちの〇−β−Ｄ−フラクトフラノシル
ー（２→１） −０−β−フラクトフラノシル−（２→
１）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以下、１−ゲスドー
スと称する。

）、ＧＦ３のうちの〇−β−Ｄ−フラクトフラノシルー
（２→〔１−０−β〜Ｄ−フラクトフラノシルー２〕２
→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ニス１〜−
スと称する。

）、ＧＦ４の０−β−Ｄ−フラクトフラノシル−（２→
〔１−〇−β−Ｄ−フラクトフラノシルー２〕３→１）
−α−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ＩＦ−フラクトフ
ラノシル−ニスドースと称する。

）およびＧＦ５の〇−β−Ｄ−フラクトフラノシルー（
２→〔１−０−β−Ｄ−フラク）・フラノシル−２〕４
→１）−α−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ＩＦ−（フ
ラクトフラノシル）２−ニスドースと称する。

）は後記実施例１に示すように腸内細菌による資化性を
検討した結果、ビフィズス菌によって選択的に資化され
るので、特に好ましいものである。

） このようにシュークロースにフラクトシルトランス
フェラーゼを作用させて得られるフラクトオリゴ糖は、
腸内におけるビフィズス菌増殖促進物質として有効であ
り、この物質は目的に応じて液状、粉抹状など所望の形
態にすることができ、こｉれらの形態のものをそのま・
本発明の目的に用いることもできるし、また一般の飲食
品類に希望する量を添加して用いることができる。

さらにまたビフィズス菌を含有する錠菓、醗酵乳、散剤
、錠剤等に添加して用いることができる。

１ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例 １ オーレオバシデイウム・プルランス・パール・メラノゲ
ナムＡ−８株（ＦＥＲＭ−Ｐ５８８５）を三角フラスコ
中のブイヨン２％、シュークロース５％１を含む培地３
００ｍ１に植菌し、２８℃で２４時間培養し、これを種
培養液とした。

３０１ジャーファーメンタ−にシュークロース１．０冗
ペプトン１．０％、肉エキス０．７％、ＮａＣ１０，３
％、ＣｏＣ１□・６Ｈ２００，１％を含む培地（ＩＨ６
，５） ２０１を□入れ、１２０℃で３０分殺菌した後
、上記糖培養液３００ｍ１を無菌的に植菌し、２８℃で
２４時間培養した。

なお、通気攪拌条件は２４０ｒｐｍ、５ＱＶＶｍである
。

培養液を遠心分離し、フラクトシルトランスフェラーゼ
を含有する粗酵素菌体４００ｇを得た。

この粗酵素は１２０００単位／ｇの活性を有していた。

シュークロース１５０ｋｇに水１００１を加えてシュー
クロースを溶解したのち坦を６．０とし、上記フラクト
シル１〜ランスフエラーゼの粗酵素菌体３７５ｇを添加
して６０℃で４８時間反応させた。

次いで、′１００℃で１０分間加熱して酵素反応を停止
させ、これを濾過することによって菌体を除いた。

しかる後、炉液を常法により活性炭で脱色し、さらにイ
オン交換樹脂で脱塩した。

このようにして得た組成物の固形分当りの糖組成は次の
通りであった。

フラノＩ・−ス１％、グルコース３６％、シュークロー
ス１０％、■−ケスドース２３％、ニスドース２４％、
ＩＦ−フラクトフラノシルーニスト−４％、１Ｆ−（フ
ック１〜フラノシル）２−ニス１〜−ス２％。

上記組成物１．２ｋｇを４０１の活性炭カラムに充填し
、５Ｖ＝１で８００１の水を通液後、２８０１の５％エ
タノール、次いで２８０１の１０％エタノール、さらに
２０１の２０％エタノールで゛溶出し、ＧＦ２Ｂ。

ＧＦ３．ＧＦ４のみを含む両分を得、濃縮したのち凍。

結乾燥を行なってＧＦ２，５０ｇ、ＧＦ３４０ｇ、ＧＦ
４１０ｇ 、 ＧＦｓｌｇを得た。

これらの物質の化学構造についてグルコースとフラクト
ースの構成比率、ガスクロマド質量分析等の手段により
検討した結果、ＧＦ２は１−ケスドース、ＧＦ３はニス
ドース、。

ＧＦ４はＩＦ−フラクトフラノシル−ニスド−ス、ＧＦ
５はＩＦ−（フラクトフラノシル）２−ニス１ヘースで
゛あることが明らかとなった。

次に、腸内細菌によるこれらの物質の資化性を検討した
。

なお、検討の際にはそれぞれのフラノ。トオリゴ糖類０
．５％を含む培地に腸内細菌を植菌して３７℃で７２時
間培養し、菌数の増加を６００ｎｍにおける吸光度を測
定することにより求め、グルコースを糖源とした場合の
吸光度を１００としたときの比較値で菌の増殖の程度を
示した。

また、資化１性検討用培地としては大腸菌（Ｅ、 ｃｏ
ｌｌ）の場合は下記培地Ａを、他の腸内細菌については
培地Ｂを使用した。

結果を第１表に示す。表から明らかなように、ＧＦ２．
ＧＦ３．ＧＦ４゜ＧＦ５はラクチュロースに比較してビ
フィズス菌に対する資化選択性が高い。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シュークロースにフラクトースが１〜４分子結合し
   たフラクトオリゴ糖を主成分とするビフィズス菌増殖促
   進物質。 ２ フラクトオリゴ糖がシュークロースにフラクトシル
   トランスフェラーゼを作用させて得られるものである特
   許請求の範囲第１項記載の物質。 ３ フラクトオリゴ糖が１−ケスドース、ニスド−ス、
   １Ｆ−フラノＩ・フラノシル−ニスドースおよびＩＦ−
   （フラクトフラノシル）２−ニスドースのいずれかであ
   る特許請求の範囲第１項記載の物質。