JPH01137985A - ピルビン酸の醗酵生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は醗酵、特にＣａｎｄｉｄａタイプの酵母を使用
する醗酵によるピルビン酸の製造方法に関する。

発１男が解決しようとする問題点 ピルビン酸はトリプトファン、チロシン又はアラニンの
ような必須アミノ酸の製造に有利な出発材料である。酸
性フレーバを与える添加物とじて使用する利点も右する
化合物である。

Ｃａｎ（Ｉｔｄａタイプのような酵母の培養は培養培地
にピルビン酸を生産することは既知である。しかし、こ
れらの傑作で生産されるピルビン酸量は少量で、産業的
規模でこの生産の実現を想定することはその低収量のｌ
こめ困難である。

醗酵によるピルビン酸の製造方法についてはフランス特
許ＦＲ−７１−２７７８９０明細書の方法により既知で
ある。この方法はチアミンおよびメヂオーニンを成長に
対し必要とするＣａｎｄｉｄａタイプの突然変異体であ
る特別の酵母を使用することによりピルビン酸の収量を
増加させる。

従って、この方法は特別の酵母分枝の使用を必要とする
欠点を有する。

問題を解決するだめの手段 本発明の主な目的はピルビン酸の製造方法を供すること
であり、この方法は突然変異分校体を必要とせずに一層
高収量で産業的規模で使用することができ、かつアルフ
ァーケトグルタル酸の同時生産を限定することを可能化
する。

本発明に係る醗酵によるピルビン酸の製造方法は： ｉ）−炭素源、窒素源、チアミンおよび無機塩を含むＰ
Ｉ＋４．５〜５．５の培地に好気傑作でＣａｎｄ　ｉ　
ｄａタイプの細胞を培養し、１１）−こうして生産した
細胞を生育培地から分離し、 １ｉｉ１−これらの細胞を炭素源および無機要素を含有
するａｌ１３．５〜４．５のバイオ転換培地に好気傑作
で培養し、そして Ｍ−培養培地から生産したピルビン酸を抽出することか
ら成る。

この方法の第３工程で髪よ、３．５〜４．５、好ましく
は約４のｐｌ＋の選択はアルファーケトグルタル酸に有
害で、ピルビン酸の生産を有利にする。

さらに、このｌｕｌ＋範囲およびチアミンおよび鉄を含
有しないことが好ましいバイオ転換培地の選択はバイオ
マスを増加せずにこの培養に対し生産でき、こうして培
養培地に導入した炭素の大部分をピルビン酸のような有
用な生成物に有利に転換することができる。

好ましくは、そして高収量のピルビン酸を得るためにバ
イオ転換培地の細胞濃度は培養開始時に少なくとも５ｇ
／（でなければならない。

本発明で使用する培養培地はピルビン酸を生産できる通
常の培地である。従って、同化性炭素および無機塩源を
含有する。

炭素源はグルコース、フラクトース、シュクロースおよ
び澱粉加水分解物のようなサツカライドでよい。価格の
理由で澱粉加水分解物を使用することが好ましい。

培養培地に一般に使用する無機塩はＦｅ、Ｋ、Ｎａ、Ｍ
ＣｌＳＭｎ、、Ｎ、ＰおよびＳ塩、すなわちバイオマス
に対し増加することができる酵素の合成に必要なもので
ある。

好ましくは、そしてピルビン酸の生産を有利にし、バイ
オマスの発育を防止するために、バイオ転換培地は［ｅ
イオンもチアミンも含有してはならない。

＝　６− 実際に本発明方法では、ピルビン酸を生産し、Ｃａｎｄ
ｉｄａタイプの細胞が発育しないように行ない、従って
これらの細胞の発育を促進するＦｅイオンおよびチアミ
ンを添加することは必要ではない。

使用できる培養培地の例として、単にグルコース又は澱
粉加水分解物、硝酸アンモニウム、モノリン酸カリ、硫
酸マグネシウムおよび銅イオンを含む水溶液を使用する
ことができる。

本発明の好ましい態様によれば、醗酵によるピルビン酸
の製造方法は次の連続工程： ａ）少なくとも０．２！？／ｐの細胞、炭素および窒素
源、無機塩および細胞の発育に必要なチアミンを含む４
．５〜５．５のｌ）Ｈの培養培地に、少なくとも５Ｊ／
！の細胞濃度が培養培地に得られるまで好気培養により
Ｃａｎｄｉｄａタイプの細胞を生産し、 ｂ）　工程ａ）で生産した細胞を分離、洗滌し、Ｃ）炭
素源、無機塩を含むが、チアミン又は鉄を含まないバイ
オ転換培地で、ｐｔ（３，５〜４．５で、培養の出発時
に少なくとも５　’ｊ／ｆｌの培養培地の細胞濃度によ
り工程ｂ）で分離した細胞を好気培養し、そして ｄ）ピルビン酸を培養培地から抽出する、を含む。

この好ましい態様では、第１工程はこれらの細胞の発育
を促進する培養培地およびｐＨを使用することによりＣ
ａｎｄｉｄａタイプの細胞を発育させて所望１胞！１度
を得ることから成る。所要細胞濃匪が得られると、後者
は培養培地から分離し、培養培地により洗滌し、これら
は次の工程Ｃ）で使用する。

この工程で培養傑作の選択はピルビン酸の生産を指向す
る。従ってｐＨは３．５〜４゜５、好ましくは４であり
、バイオ転換培地は炭素を含むが、チアミン又は鉄を含
まないものを使用する。この工程中にピルビン酸はバイ
オ転換培地に蓄積し、常法により、例えば先づ第一に限
外濾過により細胞からピルビン酸を分離し、次にイオン
交換体樹脂と接触させることによりアルファーケトグル
タル酸からピルビン酸を抽出する。

一般に、この連続方法は限外濾過室に連結する醗酵容器
を含む装置で使用する。第１相間で細胞が成長した後、
細胞は限外濾過室で培養培地から分離でき、分１ｌｌｌ
Ｉｔａ胞は透析濾過により徐々に培養培地を変えること
により洗滌する。培養はｐＨ３，５〜４．５で生産ピル
ビン酸を連続的に抽出するために醗酵容器と限外濾過室
間を循環する細胞を含有する培養培地により生産する。

培養培地と共に限外濾過室の内側に抽出されたピルビン
酸はイオン交換体樹脂上に分離できる。

本発明のこの好ましい態様では、工程ａ）で使用する培
養培地は炭素および窒素源、および無機塩を含有する。

使用する炭素および窒素源および無機塩は記述したもの
である。窒素源は有機又は無機物質、例えば硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、カルバミド、ペプトン又は
任意の他のペプチド化合物でよい。ピルビン酸基質の同
一バイオ転換収量を生ずる２分校方法間で、窒素源価格
の理由により無機窒素を含有する分校方法を選択する結
果となる。この場合、培養培地は純粋形で、又は同族物
質形で、又はチアミンを含有する任意−つ　　− 物質、例えば酵母抽出物又はトウモロコシ浸軟溶液で導
入できるチアミンを含む。

成る培養培地はビタミン、メチオニンなどのような他の
添加物の添加を必要とするが、これらの添加物の使用は
一層高い価格で得られるピルビン酸を生産する結果にな
る。

本発明方法の工程ａ）およびＣ）では、好気傑作は培養
培地に酸素を注入することにより得られる。

バイオマスの発育を指向する第１工程では、ピルビン酸
を生産する方向を指向する第３ｃ）工程より多い酸素量
を使用する。双方の場合、培養培地は撹拌する。

図面の簡単な説明 本発明の１也の特性および利点は添付図面を引用して次
の記載を読むことにより一層容易に理解されよう。図中
、 第１図は本発明方法を充足する装置を図示する。

第２図は産生ピルビンＩ！！（カーブエ）、産生アルフ
ァーケトグルタル び培養期間に従ってバイオマス濃度の発達（カー・　　
−　１０　− ブ■）の変化、その場合後者は９０時間の終期に５から
４へ培養ｐｔ＋を変化させる例示図である。

第３図はバイオ転換培地のｐＨに従って、消費ゲルコー
ス１びにつきピルビン酸くカーブ■）およびアルファー
ケトグルタル酸（カーブＶ）の生産を表わす図表である
。

本発明の具体的構成 第１図に図示するように、本発明方法を実施できる装置
は醗酵に必要な生成物の供給装置３を供した１個の醗酵
容器１および図示しないが温度調整、ｐＨ調整および酸
素入口および撹拌から成ることがわかる。

醗酵容器内の培地はポンプ７を備えた導管５により吸引
し、瀘過壁１０を備えた限外濾過装置９の内側を循環し
、濾過壁から限外濾過液体培地を抽出できる。これは特
に醗酵時に生産したピルビン酸およびアルファーケトグ
ルタル酸を含む。限外濾過装置９を出る細胞の豊富な培
養培地は醗酵容器１の内部に導管１３により再循環する
。

本発明によりピルビン酸の製造方法を実施するために、
次の操作を行なう： 工程ａ）：細胞の生 この第１工程は次の組成を有する培養培地Ｃ１を醗酵容
器の内側に最初に導入することにより実施するニ ゲルコース　　：　　５０ｆｉ／Ｉ ＮＨＮＯ：　　２．５ｇ／ｊ！ ＭｇＳＯ４：　１９／ｊ！ Ｋｌ−Ｉ　　ＰＯ：　　２ｇ／ｊ！ Ｆｅ２’　　　　　：　　２．１０−６９／ＪＩＣ”２
＋　　　　＋　　２．１０−６ｇ／ｊ！肉エキス　　　
：　　０．２ｇ＃！ チアミン　　　：　　１０−６ｇ／ｊ！この培地にＣａ
ｎｄｉｄａ　Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａタイプの細胞を０．
２’ｊ／１添加する。

次に培養を次の傑作で行なう： １１Ｈ：　　５ 温度　　　　　：　３０±３℃ 溶存酸素の分圧：３０℃の溶媒培地の内側の酸素の飽和
圧の８０±１０％ 撹拌＝２５０〜９５０ｒｐｍ　（８５００〜３２０００
のレイノルズ数に対し）。

培養は培養傑作を大喜一定に保持することにより９０時
間継続する。

操作が終ると、培養培地の細胞濃度およびピルビン酸お
よびアルファーケトグルタル酸濃度を測定する。得た結
果は次の通りである： 細　　胞　　　　　　　：　　５〜１５　ｇ／Ａピルビ
ン酸　　＝　１０〜１５ｇ／ｌ アルファーケト グルタル酸　：　５〜８ｇ／ｌ この工程を実施するために、ポンプ７の運転を開始し、
細胞を含有する培養培地を限外濾過装置９の内側を循環
させる。これは酸化ジルコニウム微少多孔性被覆により
被覆した多孔性炭素支持体により構成されたＣａｒｂｏ
ｓｅｐブランドの濾過膜を含む。

培養培地は４±２ｍ／ｓの接線速度で循環させる。限外
濾過装置の内側を通過中に培地は液体を減少する。第１
相では、Ｃａｎｄｉｄａ　Ｌｙｐｏｌｙｔｉｃ　＠胞は
培養培地の最初の容積の１／４に濃縮される。

第２相では、培養培地Ｃ２は導管３により限外濾過装置
に導入し、この培地Ｃ２は次のピルヒン酸生産工程で使
用するもので、次の組成を右するニゲルコース　　：　
　１０（１／ｊ！ ＮＨＮｏ　　　’　　５９／１ ４　３　゛ Ｋ　Ｈ２Ｐ　０４　　　：　　　２　ｇ／　ｊ！ＭＣｌ
５Ｏ：　　１９／１ Ｃｕ”　　　　　：　２．１０−”ｑ／ｊ！このＣ２培
地の導入により培養培地の容積はＶ／４からＶ／２に戻
る。次いでこの添加を中断し、培養培地は再び導管１１
により排水してＶ／２からＶ／４に濃縮する。第２培養
培地Ｃ２のこれらの３回の添加操作でＶ／４からＶ／２
に濃縮するために更新される。最終相では、第２培養培
地Ｃ２は醗酵容器の内側を循環する培養培地容積をＶ／
４から■に戻すために添加する。その場合この培地は５
〜１０ｇ／ｉの細胞を含有し、次に第３Ｔ程Ｃを実施す
る。

工程Ｃ）：ビルビン酸の生産 細胞の培養は次の傑作で行なう： ＦＩＨ：　　４ 温　　度　　　　　：　　３０±３℃ 酸素分圧　　：　５０％ 撹　拌　　　：　　７００ｒｐｍ（レイノルズ数５００
に対し）、 そして全培養期間中、培養傑作および培養培地の組成は
大暑一定に保持する。

このピルビン酸生産中、培養培地は限外濾過装置を通過
し、導管１１により、ピルビン酸、アルファーケトグル
タル酸および他の生成物を含有する液体は連続的に抽出
される。この液体に存在する酸はＤｕｏｌｉｔｅ　Ａ　
１６２樹脂のような第４級アンモニウムタイプのイオン
交換体樹脂と接触させることにより回復する。液体およ
び細胞は導管１３により醗酵容器１に再循環する。

９０時間の培養後、培養培地の細胞、ピルビン酸および
アルファーケトグルタル酸の濃度を測定する。例として
、得た結果の１つは次の通りである： ピルビン酸　　：　　４０．６：Ｉｌｌ／Ｊ！アルファ
ーケト グルタル酸　：　　５．９０ｇ／Ａ 細　　胞　　　　　　　：　　　６．０９／ｊ！この工
程Ｃ）でｐＨ５の代りに０１１４およびチアミン、Ｆｅ
２＋イオンおよび肉エキスを含有しない培養培地を使用
することにより、アルファーケトグルタル酸の生産を減
少させることによりピルビン酸の生産を増加し、培養培
地の細胞量を実際に一定値に保持することができること
が認められるであろう。

第２図は９０時間の終りに培地およびｐＨが変化した上
記傑作で行なった培養期間（時間で）による培養培地の
ピルビン酸（カーブ■）アルファーケトグルタル酸（カ
ーブ■）および細胞（カーブ■）の濃度変化（ｇ／Ｊｌ
）を示す。

この図面はピルビン酸およびアルファーケトグルタル酸
生産は培養の出発時、すなわち１）８５の工程ａ）にお
いて大暑同じであり、その時点からｐＨおよび培地は変
化し、すなわち工程Ｃ）ではｐ１１４で、ピルビン酸の
生産はアルファーケトグルタル酸の生産より一層有意に
増加する。Ｃａｎｄｉｄａタイプの細胞の生産はｐＨお
よび培地が変化するまで工程ａ）で増加し、この培地の
変化によりほとんど一定になる。

従って、本発明方法はアルファーケトグルタル酸の生産
に関しピルビン酸の生産を増加させることができる。こ
れは産業的規模における利用に対しきわめて有利である
。

数表は細胞の生産中（工程ａ）およびピルビン酸の生産
中（工程Ｃ）の炭素の結果を示す。

Ｃの結果（１ 工程ａ）　　　工程Ｃ） グル］−ス　　　　　＋２０　　　　＋４０細胞　　　
　　　　　　　３０ ピルビン酸　　　　　　　６．２　　１６．４アルフア
ーケト　　　　　２．６　　２グルタル酸 これらの結果に照して、工程Ｃ）において炭素は２倍に
なるが、アルファーケトグルタル酸の生産は工程ａ）に
おけるより少ないことが分る。他方、ピルビン酸のバイ
オ転換収量は工程ａ）におけるより工程Ｃ）において明
らかに一層有意である。

試験の別のシリーズでは、工程Ｃの培養培地を使用し、
バイオ転換は工程Ｃ）に関しては９０時間の上記と同じ
傑作で行なったが、Ｉ）Ｈは３〜９の範囲を使用した。

操作の終了時に、それぞれの場合について培養培地のア
ルファーケトグルタル酸およびピルビン酸濃度を測定し
た。

第３図は得た結果を図示する。この数字はピルビン酸生
産量（導入グルコースのｇ当りの３で）およびアルファ
ーケトグルタル酸生産量（導入グルコースのｇ当りの９
で）を縦座標に示す。カーブＩＶはピルビン酸に関し、
カーブ■はアルファーケトグルタル酸に関する。

この図面はピルビン酸の生産はｐ］１４で最高を示す。

他方、アルファーケトグルタル酸の生産に関するカーブ
Ｖはｐ１１５で明らかに最高を示し、ｐｔ１４で最低を
示す。

ピルビン酸の生産に対し本発明において４に等しいＤＨ
の使用はアルファーケトグルタル酸の生産を限定できる
。他方、本発明方法の工程ａ）に相当する細胞のバイオ
マスの生産に対する場合には約５のｐＨを使用すること
が好ましい。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法を実施するｗｇ装置図である。 第２図はピルビン酸、アルファーケトグルタル酸、バイ
オマス濃度をｐＨ４および５で経時的に示す。 第３図はピルビン酸およびアルファーケトグルタル酸の
導入グルコース１ｇ当りのｐＨの変化による生産量を示
す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）醗酵によるピルビン酸の生産方法において、（ｉ
   ）Ｃａｎｄｉｄａタイプの細胞を炭素源、窒素源、チア
   ミンおよび無機塩を含む培地に４．５〜５．５のｐＨで
   、好気條件下培養し、 （ｉｉ）生成された細胞を生育培地から分離し、（ｉｉ
   ｉ）炭素源および無機要素を含有するバイオ転換配置に
   ３．５〜４．５のｐＨで好気條件下この細胞を培養し、
   そして （ｉｖ）産生ピルビン酸を培養培地から抽出する、こと
   を特徴とする、上記醗酵によるピルビン酸の生産方法。
2. （２）バイオ転換培地はチアミン又は鉄を含まない、請
   求項１記載の方法。
3. （３）バイオ転換は約４のｐＨで実施する、請求項１ま
   たは２記載の方法。
4. （４）バイオ転換培地の細胞濃度は培養の開始時に少な
   くとも５ｇ／ｌである、請求項１又は２記載の方法。
5. （５）醗酵によるピルビン酸の生産方法において、次の
   連続工程： （ａ）開始時に少なくとも０．２ｇ／ｌの細胞、炭素お
   よび窒素源、無機塩および細胞の発育に必要なチアミン
   を含む培地に、４．５〜５．５のｐＨで少なくとも５ｇ
   ／ｌの培養培地の細胞濃度を得るまで好気培養によりＣ
   ａｎｄｉｄａタイプの細胞を生産し、 （ｂ）工程ａ）中に生産した細胞を分離し、洗滌し、（
   ｃ）炭素源および無機塩を含むが、チアミンも鉄も含有
   しない培地に、３．５〜４．５のｐＨで培養の開始時に
   少なくとも５ｇ／ｌのバイオ転換培地の細胞濃度により
   工程ｂ）中に分離した細胞を好気培養し、そして （ｄ）ピルビン酸を培養培地から抽出することを特徴と
   する、上記醗酵によるピルビン酸の生産方法。
6. （６）工程ａ）におけるｐＨは約５である、請求項５記
   載の方法。
7. （７）工程ｃ）におけるｐＨは約４である、請求項５又
   は６記載の方法。
8. （８）工程ｃ）で生産した細胞の分離および洗滌は限外
   濾過および透析濾過により行なう、請求項５記載の方法
   。
9. （９）洗滌培地は工程ｃ）で使用した培養培地である、
   請求項８記載の方法。
10. （１０）ピルビン酸は限外濾過により細胞から分離し、
    次いでアルファーケトグルタル酸はイオン交換体樹脂と
    接触させることにより分離する、請求項５記載の方法。