JPH01146885A - リン酸化試薬およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は化学的なリン酸化試薬に関し、特にＤＮＡの合
成や精製に有用な化学的す゛ン酸化試薬に関する。

（発明の背景） ハイブリッドＤＮＡ技術が出現し２種々様々な天然物、
ポリペプチドや核酸を単離し、精製し、そして分析し得
る可能性が急激に増大すると共に。

アミノ酸や核酸のオリゴマーを調製し、そして精製する
迅速かつ有効な方法に対する必要性が増大している。

核酸の場合には、典型的には、リンカ−、アダプター、
合成遺伝子および合成調節配列として使用する配列や、
プローブ、プライマーなどとして使用する配列を合成す
る必要がある。ヌクレオチドのオリゴマーを調製する多
くの方法が開発されている。これらの方法は、大体まず
始めに９選択的に開裂可能な結合により、最初のヌクレ
オチドを固相支持体に結合し９次いで続くヌクレオチド
単位を連続的に付加することにたよっている。各々の付
加には数多くの化学反応が伴う。

当該分野で充分に確立された２つの主要なオリゴヌクレ
オチド合成法は、いわゆる「ホスホトリエステル」法お
よび「ホスホアミダイト」法である（以下の引用文献に
相当詳しく記載されている）。

両方の方法に対する最も一般的な機構では、オリゴヌク
レオチド鎖は、可溶性の５゛位保護化ヌクレオチドブロ
ックにおける活性化された３”−ホスフェートまたは３
′−ホスホアミダイト官能基に対して固定化オリゴマー
の５”位水酸基が求核攻撃することにより成長する。他
の重要な工程には、ホスホトリエステル法における５’
−０−（４，４”−ジメトキシトリチル）基（ＤＭＴｒ
）の酸膜保護化やホスホアミダイト法における亜リン酸
トリエステルのリン酸トリエステルへの酸化がある。

オリゴヌクレオチドを合成する他のよ（知られた方法に
は、β−シアノエチルホスフェート保護基を用いる５゛
位から３゛位への合成法（Ｄｅ　Ｎａｐｏｌｉら。

Ｇａｚｚ、　ＣｈｉＩＩｌ、　Ｉｔａｌ、　　１１４：
６５　（Ｉ９８４）ｓ　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　　２４：１６９
１　（Ｉ９８３）；　ＢｅｌａｇａｊｅおよびＢｒｕｓ
ｈ＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１０
：６２９５（Ｉ９７７））および溶液相による５”から
３゛への合成法（例えば、　ＨａｙａｔｓｕおよびＫｈ
ｏｒａｎａ、　Ｊ、＾ｍｅｒ。

Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　８９：３８８０　（Ｉ９６７）
；　Ｇａ１ｔおよび５ｈｅｐｐａｒｄ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　４　：１１
３５　（Ｉ９７７）：　ＣｒａｍｅｒおよびＫＯ８ｊｅ
ｒ＋　Ａｎ　ｅｗ、　Ｃｈｅ＋＋＋、　Ｉｎｔ、　Ｅｄ
、　ｕｎ　１．　　７：４７３　（Ｉ９６８）；および
Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、　Ｊ、　Ｃｈｅ＋ｗ、　Ｓｏｃ
、　Ｃ＋２４３８　（Ｉ９６７））がある。

オリゴヌクレオチドの合成が完了し、生成物の脱保護化
を行った後、該オリゴヌクレオチドの遊離した５”位水
酸基は、たいていの生物学的工程において使用するため
に、リン酸化または亜リン酸化しなければならない、ま
た、３°位水酸基におけるリン酸化または亜リン酸化は
、典型的には、オリゴヌクレオチドを、精製し得るか、
保存し得るか、および／または商品化し得る形で生成さ
せるのに必要である０例えば、　５ｏｎｖｅａｕｘ、　
７Ｄμｍ、　　１４：２７４．２９４（Ｉ９８６）を参
照されたい０本発明は、３°位水酸基部分および５”位
水酸基部分の両方をリン酸化および亜リン酸化するのに
有用な化合物に関する。

５゛位のリン酸化は、−船釣には、　Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼおよびＡＴＰを用いて実施される。

この反応は、特に信頼性があって、有効であるというわ
けではない、化学的に５゛位のリン酸化を行なういくつ
かの方法も知られており１例えば以下の文献に記載され
ている：　Ｎａｄｅａｕら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ■■２
３：６１５３−６１５９（Ｉ９８４）；　ｖａｎ　ｄｅ
ｒ　Ｍａｒｅｌら、↑ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、
　　２２：１４６３−１４６６　（Ｉ９８１）：旧ｖｗ
ｅｌｓｂａｃｈおよびＰｆｌｅｉｄｅｒｅｒ、　Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２３：４７９３−４７
９６（Ｉ９Ｂ２）ｓ　Ｍａｒｕｇｇら、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：８６３９−８６５１
　（Ｉ９８４）：およびＫｏｎｄｏ　ら、　Ｎｕｃｌｅ
ｌｃ　Ａｃ１ｄｓ勤Ｊ巨匹Ｌ１１凹、ｓｉｕ＋ｗむｊ且
ｓ　　ｌｆｉ：１６１−１６４（Ｉ９８５）。

しかしながら、これらの方法の大部分は、不安定な試薬
を用いることを包含するか、あるいは標準的な脱保護化
手順および精製手順を大幅に改変する必要がある。−官
能性および二官能性の３°位リン酸化試薬について同様
の問題が見い出されている（例えば、　５ｏｎｖｅａｕ
ｘ　（前出）、２９７頁を参照されたい）。

本発明は、現在用いられているリン酸化手順における制
限を解消する新規なリン酸化試薬に関する。ここで用い
られているように、「リン酸化試薬」という用語は、水
酸基を直接リン酸化し得る化合物と、後に続（酸化工程
と組み合わせた場合に、水酸基部分を間接的に（すなわ
ち、二段階反応により）リン酸化し得る亜リン酸化試薬
とを包含する。ここに開示されたリン酸化試薬は、同一
出願人による特開昭６２−１９０９６号に記載されてい
る方法にも有用である。この公報は、誤った配列を実質
的に含まないオリゴヌクレオチドを合成し。

そして精製する方法に関する。その出願の開示内容は、
特にそのすべてを参照文献としてここに採用する。

本発明の試薬、特に記述されるような亜リン酸化試薬は
、現在利用可能なりＮＡ合成装置に容易に適応するとい
う利点がある。また、ここではＹ、　Ｙ’。

またはＹ”と表されるリン酸保護基は、完成したオリゴ
ヌクレオチドの脱保護化の間に容易に除去され、他の脱
保護化工程を必要としない、最も重要なことは、ここに
開示された試薬がオリゴヌクレオチド合成を迅速にかつ
精度よくオンラインでモニターする方法を提供すること
である。すなわち。

本発明の化合物は、完成したオリゴヌクレオチドの脱保
護化に際して容易に検出し得る脱離基を与える。

（従来の技術） 上で引用した文献に加えて、　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉおよ
びＣａｒｕｔｈｅｒｓ　、　Ｊ　　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、
　Ｓｏｃ、　　１０３：３１８５−３１９１（Ｉ９８１
）には、オリゴヌクレオチドの調製においてホスホアミ
ダイトを使用することが記載されている。　Ｂｅａｕｃ
ａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ　、　Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ堕旦−韮：１８５９−１８６２　（Ｉ９８１）
および米国特許第４．４１５．７３２号には、オリゴヌ
クレオチドの調製においてホスホアミダイトを使用する
ことが記載されている。　Ｓｍ１ｔｈ、　　Ａｌル１５
−２４（Ｉ９８３年１２月）には。

自動化された固相オリゴデオキシリボヌクレオチド合成
が記載されている。また、これら文献に引用された文献
や、　Ｗａｒｎｅｒら、　ＤＮＡ　１４０１−４１１（
Ｉ９８４）（この文献の開示内容は参照文献としてここ
に採用する）を参照されたい。

ＦｉｓｈｅｒおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｎｕｃｌ、　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１（５）：１５８９−１５９
９　（Ｉ９８３）には、デオキシヌクレオチド合成の進
行をモニターする方法が記載されている。

該方法は９合成の間における様々なトリアリールメチル
基の脱離をモニターすることを包含する。

該トリアリールメチル基の各々は、「カラーコード化」
、すなわち酸溶液中において様々に着色されている。

アデノシンのアミダイン保護化は、　ＭｃＢｒｉｄｅお
よびＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　
Ｌｅｔｔ、　　２４：２４５（Ｉ９８３）、そしてＰｒ
ｏｅｈｌｅｒおよびＭａｔｔｅｕｃｃｉ＋　Ｎｕｃｌ。

ム江先ｉｆ競−１１：８０３１（Ｉ９８３）に記載され
ている。

他の保護基は９本出願の優先権の基礎をなす米国特許出
願第０８７．１５８号に対する親出願である同時係属出
願第８９１．７８９号に記載されている。

ＨｏｒｎおよびＵｒｄｅａ＋里　５　（５）：４２１−
４２５（Ｉ９８６）には、ビス（シアノエトキシ）−Ｎ
、Ｎ−ジイソプロピル−アミノホスフィンを用いた。固
相支持体に結合したＤＮＡ断片のリン酸化が記載されて
いる。

（発明の要旨） 本発明のある局面では２本発明は次の式（Ｉ）で表され
る亜リン酸化試薬を包含する：ここで、Ｒ１は、リン酸
化およびヌクレオチドの脱保護化に際しての脱離を９例
えば比色分析によりモニターし得る実質的に任意の基で
あり得るｅ　Ｒ１は、好ましくは式ＲＲ’Ｒ”Ｃ−を有
する化合物であり。

Ｒ，Ｒ’、およびＲ”は、独立して、以下の基からなる
群より選択される： ここで、ｘｌおよびｘ２は、互いにオルト、メタ、また
はパラの位置にあり、典型的には、水素、低級アルキル
、低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロ。

フェニル、スルホネート、あるいは０〜２個の低級アル
キルまたは低級アルコキシ置換基で置換されたアミンで
ある。　ＸＩおよびＸ、はまた、典型的には１〜５個の
環を有する多環芳香族系（例えば。

フェニル、ナフチルなど）の一部であり得る。後者の場
合＋　Ｘ、およびｘ２は、高度に共役した芳香族構造に
おいて互いにパラの位置にある炭素原子である。これら
の環は、非置換であるか、あるいは上述の置換基の１種
またはそれ以上で置換されていてもよいａ　Ｒ１は、低
級アルキルで随意に一置換または二置換されたメチレン
、および低級アルキルまたはニトロで随意に置換された
フェニルからなる群より選択される。Ｙは、０〜２個の
低級アルキル基で置換されたアミノ、ハロゲン、３〜１
２個の炭素原子を有するトリアルキルシリル、および合
計して１〜３個８通常は１個または２個の複素環成分と
１〜３個の環とを典型的に有する複素環式部分からなる
群より選択される。×は１〜５０の範囲の整数である。

Ｄは次の化合物（ｉ）および（Ｉ１）からなる群より選
択される：（ｉ）次の式（ＩＩ）で表される化合物：こ
こで＋ＪｌおよびＪ２は、独立して、水素、および１〜
３個の炭素原子を有するアルキルからなる群より選択さ
れ；ＣはＯまたは１であり；そして口は、水素、１〜９
個の炭素原子を有するアルキル。

ニトロ、アルキルスルホニル（−船釣には、低級アルキ
ルスルホニル）、アリールスルホニル、シアノ、ｐ−ニ
トロフェニル、アルキルチオ（−船釣には、低級アルキ
ルチオ）、アリールチオ、およびトリハロメチルからな
る群より選択される；および （ｉｉ）フェニル、β−ナフチル、９−フルオレニル、
および２−アントラキノニル。

本発明はまた９次の式（ＩＩＩ）で表される亜リン酸化
試薬、および次の式（ＩＶ）で表されるリン酸化試薬を
包含する：　゛ ここで＊　ＲＩ＋　Ｒ２，Ｄ＋およびＸは９式（Ｉ）の
試薬に対する上記の定義のとおりである。

本発明の試薬は、水酸基を含有する化合物を亜リン酸化
して亜リン酸トリエステルを与えるのに用いる（すなわ
ち１式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の試薬を用いる）か、
あるいは水酸基を含有する化合物をリン酸化してリン酸
トリエステルを与えるのに用いる（すなわち９式（ＩＶ
）の試薬を用いる）ことができる。

式（Ｉ）で表されるホスホアミダイトを亜リン酸化剤と
して用いる場合には、典型的には活性化剤が同様に必要
である。適当な活性化剤は１例えばＦｒｏｅｈｌｅｒお
よびＭａｔｔｅｕｃｃｉ＋　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　
Ｌｅｔｔ。

２４：３１７１　（Ｉ９８３）：　そしてＢｅａｕｃａ
ｇｅおよび（：１ｒｇｔｈｅｒｓ（Ｉ９８１）　、　（
前出）に記載されている。亜リン酸化が式（Ｉ［）の試
薬を用いて行われる場合には、あるいはリン酸化が式（
ＩＶ）の試薬を用いて行われる場合には１文献（例えば
、　５ｏｎｖｅａｕｘ＋　（前出）、またはＰｒｏｅｈ
ｌｅｒおよびＭａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ　Ｌｅｔｔ。

（Ｉ９８３）　、　（前出））に記載されているような
縮合剤を用いなければならない０本出願の優先権の基礎
をなす米国特許出願第０８７．１５８号に対する親出願
である米国特許出願第８９１．７８９号に記載されてい
るように、好ましい縮合剤は活性化されたアリールスル
ホン酸化合物（例えば、メシチレンスルホニル−３−ニ
トロ−１，２，３−トリアゾール）、またはメシチレン
スルホニルクロリドおよびＮ−メチルイミダゾールであ
る。

亜リン酸化試薬の場合は、−船釣には、得られた亜リン
酸トリエステルを酸化して、対応するリン酸トリエステ
ルおよびリン酸塩を与えることが望ましい。

別の局面では１本発明は、上述の方法によって。

ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド鎖の５゛位水酸
基をリン酸化する方法を包含する。このような方法は、
続いてオリゴヌクレオチド鎖を合成するのに有用である
ため、完成した配列はさらに使用するために５゛位がリ
ン酸化される。これらの試薬はまた。　　ＤＮＡ合成の
間における水酸基の保護基。

すなわち亜リン酸トリエステルまたはリン酸トリエステ
ルを提供するのに有用である。

（本発明の実施様式） ： 「オリゴヌクレオチド」という用語は、約２〜約１００
個の構成ヌクレオチドモノマーを有するヌクレオチド鎖
を意味する。

ここで用いられているように、「リン酸化条件」または
「亜リン酸化条件」という用語は、それぞれ水酸基を有
する化合物を、記載されているように、実質的に完全に
リン酸化または亜リン酸化するのに適した反応条件を意
味することを意図する。

ここで用いられているように、「リン酸化試薬」という
用語は、＋５の酸化状態にあるリン原子を含有し、水酸
基を有する化合物との反応により。

リン酸トリエステルを与える化合物を意味する。

ここで用いられているように、「亜リン酸化試薬」とい
う用語は、＋３の酸化状態にあるリン原子を含有し、水
酸基を有する化合物との反応により、亜リン酸トリエス
テルを与える化合物を意味する。後に続く酸化工程と組
み合わせた亜リン酸化は二段階のリン酸化と同等である
ので、亜リン酸化試薬をここでは「リン酸化試薬」と呼
ぶ場合がある。

「低級アルキル」および「低級アルコキシ」という用語
は、１〜６個の炭素原子を有する。それぞれアルキル基
およびアルコキシ基を表す。

２、新里星拭果豊盪遺： 本発明の試薬は、上記の式（Ｉ）、　　（ＩＩＩ）、お
よび（ＩＶ）で定義されるリン酸化剤である。

一般に、置換基Ｒ，，Ｒ１，Ｄ、およびＹは上記の定義
のとおりであり、Ｘは典型的には１〜５０の範囲内であ
る。ある好ましい実施態様では：（Ｉ）整数「×」は１
〜８の範囲内である。

（２）ＲＩは４．４゛−ジメトキシトリチルである。

（３）Ｙは式−ＮＴ’？”を有するアミン置換基である
；ここで、Ｔ雪およびＴｔは、同一または相異なり、炭
化水素であるか、もしくはＯ〜５個２通常は０〜４個の
へテロ原子、主としてオキシとして酸素原子を、チオと
してイオウ原子を、あるいはアミノ（特に、第３７ミノ
）、ニトロ、またはシアノとして窒素原子を有し得る。

２つのＴは９合計して１〜３個１通常は１個または２個
の複素環成分と１〜３の環とを有する複素単環または複
素多環を形成していてもよい、普通、２つのＴは１合計
して２〜２０個、より普通には２〜１６個の炭素原子を
有する。ここで、これらのＴは、脂肪族（脂環族を含む
）、特に飽和脂肪族の１価の基、あるいは１つになって
いる場合には、置換または非置換の複素環を定める２価
の基であり得る。Ｙで定義されるアミンには１種々様々
な飽和第２アミン（例えば、ジメチルアミン、ジエチル
アミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メチ
ルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシク
ロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルアミン。

メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルア
ミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリン、チオ
モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、２．６−シメチ
ルビペリジン、ピペラジン、および同様の飽和単環式窒
素複素環化合物（米国特許第４．４１５．７３２号））
が含まれる。

−ＮＴ’Ｔ”として用いられる報告された特定の基は以
下のとおりである： メチルアミノ 例示される基には以下のものが含まれる：　　Ｎ’−ピ
ロリジノ、　Ｎ−ピペリジノ、１−メチル−Ｎ−ピペラ
ジノ、　Ｎ−へキサヒドロアジピノ、　Ｎ−オクタヒド
ロアゾニノ、Ｎ−アザシクロトリデカノ。

Ｎ−３−アザビシクロ−（３，２，２，）ノナノ、チオ
モルホリノ、　Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ、　　Ｎ、Ｎ−
ジメチルアミノ、　　Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ、
ピペリジノ、および２．２．６．６−テトラメチル−Ｎ
−ピペリジノ。

Ｙはまた。ハロ、例えばクロロ（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒお
よびＬｕｎ５ｆｏｒｄ、　Ｊ、　Ａｓｈ、　Ｃｈｅ＋＋
、ＳＯＣ，（Ｉ９７６）９８：３６５５；Ｍａｔｔｅｕ
ｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋　（前出））または
アンモニウムオキシ塩、特に３〜１２個の炭素原子を有
するトリアルキルアンモニウムであり得る。

（４）上で示したように概して、Ｄは式（ＩＩ）て表さ
れるか、あるいは（ｉｉ）フェニル、β−ナフチル、９
−フルオレニル、および２−アントラキノニルである。

ここで、ＪＩおよびＪ２は、独立して。

水素、および１〜３個の炭素原子を有するアルキルから
なる群より選択され、Ｃは０または１であり、そしてＱ
は、典型的には、水素、１〜９個の炭素原子を有するア
ルキル、ニトロ、一般的な低゛級アルキルスルホニル、
アルキルスルホニル、アリールスルホニル、シアノ、　
ｐ−ニトロフェニル。

アルキルチオ、一般的な低級アルキルチオ、アリールチ
オ、およびトリハロメチルからなる−より選択される。

口として用いられる報告された特定の基は以下のとおり
である： Ｂａｌｇｏｂｉｎ、　（同上Ｊ ＭｅＣＯＣＨ（Ｍｅ）　−Ｒａｍ　１ｒｅｚら、　Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９：２１５７　（Ｉ９釈ｍ φ５ｃｏ（Ｃ１）　　　　　　　　　Ｖａｓｓｅｕｒ　
ら、　ＴａｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、　　２４：２
Ｔ］丁Ｈ■− χは、水素、あるいは中性または極性であり。

電子供与性または電子吸収性であって、一般的には１〜
ｌＯ個９通常は１〜６個の原子を有し、一般的には０〜
７個の炭素原子を有する任意の安定な非干渉性置換基で
あり得る。そして、χは、脂肪族、脂環族、芳香族、ま
たは複素環式の基であり。

一般的には脂肪族で飽和のハロ炭化水素（例えば。

トリフルオロメチル）、八日、チオエーテル、オキシエ
ーテル、エステル、アミド、ニトロ、シアノ、スルホン
、アミノ、アブなどであり得る。

３、　　Ｉ　ン　　　　　　の　　　：式（Ｉ）で表さ
れる亜リン酸化試薬は、　ＨｏｒｎおよびＵｒｄｅａ＋
　　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　　　釘：（３
９）４７０５−４７０Ｂ（Ｉ９８６）に記載されている
方法に類似した方法で合成することができる。この文献
の開示内容は参照文献としてここに採用する。

次の式（Ｖ）で表される化合物がまず与えられる：Ｒ’ ここで、（Ｉ）第１の好ましい実施態様では　ＩＩはハ
ロゲン、好ましくは塩素であり、Ｒ″は上で定義された
Ｙであり、そしてＲ１は上で定義された一ＯＤである；
（２）第２の実施態様では、Ｒ”およびＲ”は共にＶで
あり、必ずしも同一である必要はなく、そしてＲ”′は
−ＯＤである；および（３）第３の別の実施態様では、
Ｒ”、Ｒ”、および「”は、すべてハロゲン、好ましく
は塩素である。この化合物は９次の式（Ｖｌ）で表され
るアルコール： ＲｒＯ（ＣＨｔ）ｃＲｇ　　　Ｓ　　　ＣＨｘＣＨｇ−
ＯＨ（Ｖｌ）と、不活性雰囲気下で、比較的低温、好ま
しくは約θ℃にて反応に供され、ハロゲン置換基（実施
態様（Ｉ））または「Ｙ」置換基（実施態様（２）およ
び（３））のいずれかが９次の式（■）で表される基で
置換され１式（Ｉ）の亜リン酸化剤を与える構造をもた
らす： Ｒｈｏ　　（ＣＨｔ）「Ｒｔ　　Ｓ　　ＣＨＩＣＨ！　
０　　　　　　（■）（別の実施態様（３）の場合には
　、得られた化合物は、置換基「ＯＤ」に結合し１次い
で当該分野で公知の合成法により、アミン部分「Ｙ」と
の反応に供され９式（Ｉ）の構造を与える。） 式（ＩＩＩ）で表される亜リン酸化試薬は、トシルクロ
リドのような活性化剤の存在下で９式（ＶＩ）のアルコ
ニルをリン酸またはそのアルキル化類似物と縮合させる
ことにより調製される。

式（Ｖｌ）のリン酸化試薬は、出発物質が次式で表され
る化合物であること以外は１式（Ｉ）の試薬に対して上
述した方法と同様の方法で調製される： Ｒ” ここで、（Ｉ）第１の好ましい実施態様では、Ｒ゛はハ
ロゲン、好ましくは塩素であり、Ｒ”は上で定義されｔ
ｉ−ｏｏテあり、そしｒＲ”　は−ｏｔｔ　テある；（
２）第２の実施態様では　９１およびＲ”は共にハロゲ
ン。

好ましくは塩素であり、モしてＲ“は−ＯＤでる；およ
び（３）第３の別の実施態様ではｐＺｌｍｌ、およびＲ
１は、すべてハロゲン、好ましくは塩素である。

実施態様（２）および（３）では、さらに加水分解工程
が必要であるが、実施態様（３）では特に、当該分野で
公知の合成法を用いて「００」置換基を付加するのに、
さらに別の工程が必要である。

生成物の単離はバリウム塩またはトリエチルアミン塩と
して沈殿させることにより行われる。

これらの反応はすべて、均一化を容易にし、溶解度に関
する問題を避けるために、好ましくは希釈せずに実施さ
れる。しかしながら、必要に応じて、任意の適当な不活
性溶媒を使用することができる。ただし、関係するすべ
ての試薬が該溶媒に実質的に溶解しなければならない。

（以下余白） ４、　　　　　　いた　１ン　　％　　菖ン一般に、こ
こに開示された試薬は、遊離水酸基を亜リン酸トリエス
テルおよびリン酸トリエステルに変換する。好適な実施
態様においては、そのように変換される水酸基は、ヌク
レオシドの５°位水酸基またはオリゴヌクレオチド鎖の
５′位水酸基である０反応は９反応式Ｉのように進行す
る：（ＩＸ）　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｘ
）反息犬土 反応式ｌにおいて、Ｙは反応の際に脱離する基である。

置換基ＩＪ　Ｊは、プリンまたはピリミジン塩基であり
２本出願に記載されているアミン保護基により保護され
得る。「Ｅ」は、ハロゲン。

３”末端水酸基の適切な保護基、または連続するオリゴ
ヌクレオチド鎖である。

典型的には１反応式Ｉのリン酸化反応の反応条件は、既
知のＤＮＡ合成法１例えばホスホアミダイト法（Ｂｅａ
ｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ　、Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ切ｔｔ、　（Ｉ９８１）　（前出）参照）に
おけるのと同様である。

ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド鎖の。

式■で示される亜リン酸トリエステルへの変換。

対応するリン酸トリエステル（反応式■の化合物Ｘ）へ
の酸化は、標準的方法を用いて行なわれ得る。標準的方
法には１例えば、適当な有機溶媒（好ましくは、テトラ
ヒドロフラン（ＴＨＦ）のようなやや極性のある有機溶
媒）中でヨード水溶液または過酸化物とともに処理する
方法がある０例えば。

ＨｏｒｎおよびＵｒｄｅａ、　ＤＮＡ　（前出）を参照
されたい。

（以下余白） （ＸＩ） （ＸＩＩ） 反息式Ｉ Ｒ６基の脱離は、目視観察または比色分析により容品に
モニターされ、従って、リン酸化工程全体を簡単かつ精
度よくモニターすることが可能である。

反応代用に示されるように、塩基に不安定なリン酸トリ
エステルは、脱保護化剤（例えば、水酸化アンモニウム
）で処理することにより、リン酸塩（ＸＩ）に変換され
得る。この工程は、固相支持体からのオリゴヌクレオチ
ド饋の脱離と同時に進行し得る。ここで固相支持体への
結合は、塩基に不安定な結合である。

亜リン酸化およびそれに続く酸化、および脱保護化工程
（反応式■）は溶液中で行われ得るが。

オリゴヌクレオチド基質が固相支持体に結合しているこ
とが好ましい、広い範囲の固相支持体が用いられ得る。

それには例えば、シリカ、ボラシルＣ，ポリスチレン、
制御された細孔を有するガラス（ＣＰＧ）　、キーゼル
ゲル、ポリ（ジメチルアクリルアミド）、ポリ（アクリ
ルモルフォリド）、ポリスチレングラフト化ポリ（テト
ラフルオロエチレン）、セルロース、セファデックスＬ
ｉｔ−２０、フラクトシル５００などがある。関連する
文献には次の文献がある：　５ｏｎｖｅａｕｘ＊　　（
前出）　；　ＭｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒ
ｓ＋　（前出）　、　Ｃｈｏｗら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　（Ｉ９８１）ｉ　：　２８０７　
ＨＦｅ１ｄｅｒら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ
ｔ。

（Ｉ９８４）２５　：　３９６７　：　Ｇｏｕｇｈら、
同誌（Ｉ９８１）２２　：　４１７？　。

Ｇａ１ｔら、　　　　”　ｓ　Ｒｅｓ　（Ｉ９８２）　
　１３　：　６２４３　：ＢｅｌａｇａｊｅおよびＢｒ
ｕｓｈ、同誌（Ｉ９８２）　１０　：　６２９５　；　
Ｇａｉ　ｔおよび５ｈｅｐｐａｒｄ、同誌（Ｉ９７７）
４　：　４３９１　；　１ｌｌｙｏｓｈｉおよびＩｔａ
ｋｕｒａ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　（Ｉ
９７Ｂ）３８　：　３６３５　：Ｐｏｔａｐｏｖ　ら、
　　ｕｃｌｅｉｃ　　ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　（Ｉ９７９）
ｆｉ：２０４１；Ｓｃｈｗｙｚｅｒら、　　Ｈｅ１ｖ、
　　Ｃｈｉｎ、　　Ａｃｔａ（Ｉ９８４）５ヱ：　１３
１６　。

Ｃｈｏｌｌｅｔ　ら、同誌（Ｉ９８４）６７　：　１３
５６　；　Ｉｔｏ　ら、　ＮｕｃｌｅｌｃＡｃｉｄｓ　
Ｒｅｓ、　（Ｉ９Ｂ２）１０　：　１７５５　Ｈｔ！ｆ
ｉ＋ｓｏｖら、同誌（Ｉ９８３）１１　：　８３６９　
：　ＣｒｅａおよびＨｏｒｎ、同誌（Ｉ９８０）ｆｉ　
：　２３３１゜Ｈｏｒｎら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｓ　ｍ、　Ｓｅｔ、　（Ｉ９８０）ヱ
：　２２５　　：　Ｔｒａｇｅｉｎ　ら９Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　　（Ｉ９８３）２４　：　１
６９１　；　Ｋｏｓｔｅｒら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ、（Ｉ９８４）　４０　：１０３　；　Ｇｏｕｇｈ　
ら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌａｔｔ、　（Ｉ９８
３）　２４　：５３２１　：　Ｋｏｓｔｅｒら、同誌（
Ｉ９７２）１６　：　１５２７　：　Ｋｏ５ｔｅｒおよ
びＨｅｙｎｓ　、同誌（Ｉ９７２）　１６　：　１５３
１　；　Ｄｅｓｂｅｋら、ＬＳｅｔｌｏ−およびＨｏ１
ｌａｅｎｄｅｒ　編、Ｖｏｌ、４．１９８２．　ｐｐ、
１−１２゜Ｐｌｅｎｕｓ　　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎ、Ｙ。

式■の試薬を用いる亜リン酸化は、同様の方法により進
行しくＦｒｏｅｈｌｅｒおよびＭｅｔｔｅｕｃｃｉ　　
（前出）参照）１次の化合物を生じる： （ＸＩＩＩ） この化合物は１次に、上述のように酸化され脱保護化さ
れる。

弐■の試薬を用いたリン酸化は反応式■に従って進行し
、上述のように脱保護化されてリン酸エステルとなり得
る。

（ＸＩＶ） （ＸＶＩ） 反鷹ｉ（ｌ 支持体の性質に依存して９種々の官能基がアンカーとし
て用いられる。シリカおよびガラスのようなケイ素含有
支持体には、置換アルキルまたはアリールシリル化合物
が採用され、シロキサンまたはシロキシム結合が形成さ
れる。有機ポリマーについては９例えば、エーテル、エ
ステル、アミン、アミド、スルフィド、スルホン、リン
酸エステルが用いられ得る。ポリスチレンのようなアリ
ール基については、ハロメチル化による官能基化が行な
われ得る。ここで、ハロ基は、オキシ、チオ（これはス
ルホンに酸化され得る）、アミノ。

ホスホ（ホスフィン、ホスファイトまたはホスフェート
）、シリルなどにより置換され得る。ポリアクリル酸誘
導体との処理により珪藻土（例えば。

キーゼルゲル）の活性化が起こり、そしてアミノ基との
反応によりアミン結合が生成する。多糖類は無機エステ
ル（例えば、リン酸エステル）により官能化し、ここで
、他の酸素は、鎖を連結する働きをする。ポリアクリル
酸誘導体について言えば、カルボキシルまたは側鎖官能
基（例えば、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド）は
、従来法においては、連結基を結合するのに用いられる
。

結合基または結合鎖は、その長さ、官能基の種類および
第１のヌクレオチドを結合する方法について、広い範囲
のものが用いられる。ｉＩを延長させるための官能基に
は、シリル基、エーテル基。

アミノ基、アミド官能基などが包含される。二官能性の
試薬が採用され得、それには、ジアミン。

二塩基性酸、アミノ酸、糖類、シラン類などがある。

文献記載の多くの支持体および結合基を次の表に示す。

（以下余白） ５、積ｌぶ］弓し１支里 簡単に述べれば、前出の特開昭６２−１９０９６号に記
載の方法が、誤った配列の混入を最小とするようなオリ
ゴヌクレオチド鎖の合成方法を包含する。

オリゴマー化は、成長している鎖が不溶性支持体に結合
しているときに起こる。各工程終了後において、誤まっ
た配列はキャップされ、配列が完成するまで次のモノマ
ーが加えられる。各モノマーの保護基、末端ブロック基
、キャップ基および支持体への結合基は２選択的開裂が
行なわれ得るように選択される。ブロック基は、末端ブ
ロック基を欠く配列の酵素分解により妨害されないよう
に選択される。完成したら、キャップ基を除去し。

酵素分解を妨害するブロック基を除去し、そして。

末端ブロック基を欠く不完全な配列を酵素的に分解する
。オリゴマーは、支持体上に保持され得。

あるいは、不完全な配列の分解に先立って除去される。

誤まりのある配列を実質的に持たない完成した正しい配
列は１次に、単離される。

このように１本法は、誤まりのあるあるいは不完全なオ
リゴヌクレオチドを２選択的に、酵素的に除去する方法
を提供する。これは、エキソヒドロラーゼが完全な配列
に働くのを妨害する末端ブロッキング官能基により達成
され、他方、エキソヒドロラーゼは、ブロックされてい
ない不完全な配列を加水分解する能力を有する０本法に
おいてはまた。キャップ官能基が採用される。このキャ
ップ官能基は、引き続いて行なわれる添加により次の工
程が行なわれない配列を終結させ、キャッピングに先立
って９反応性を有する遊離の末端（５゛位水酸基）官能
基を保持する。つまり、誤まった配列は、誤まった時点
において終結し、続いて反応しない。

ここで述べる試薬は、上記方法に組みあわせて用いられ
る。上記方法は、完全なオリゴヌクレオチド配列に５°
−リン酸トリエステルブロッキング基を提供するように
記載されている。５°−０−ブロッキング基としてリン
酸トリエステルを使用すると、完全なオリゴマーがエキ
ソヌクレアーゼにより分解するのが回避される。５°−
リン酸トリエステルが本性では特に有用である。なぜな
ら、それは、キャップ基を除去する間およびエキソヌク
レアーゼを使用する間は保持され、そして、オリゴマー
を分解させることな（除去可能であるためである。

このように、新規試薬がオリゴヌクレオチド鎖の末端５
”位水酸基の官能化を提供し、鎖の保護を提供する。そ
して、これは、核酸配列の自動合成工程に適する。さら
に、脱保護反応、そしてオリゴヌクレオチド合成の完成
のモニターは、実際に。

簡単な比色反応、つまり上記「Ｒ１」部分の脱離。

によってなされる。

本発明は、好適な特定の実施態様をもって記載されてい
るが、前述の記載内容および次の実施例は本発明を例示
するものであり、限定するものではない０本発明は、添
付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の他の局
面、利点および改変は当業者に明らかであり、それは本
発明に包含される。

（実施例） 以下に本発明を実施例について説明する。

皇施■土 試薬である２−（シアノエトキシ）　−２−（２”−４
，４−ジメトキシトリチルオキシエチルスルホニル）エ
トキシ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン（式
Ｉ参照）を次のように合成した。

市販のスルホニルジェタノール（６５％−／Ｖ　Ｈ，０
中）を、乾燥アセトニトリルと共エバポレートを繰り返
すことにより乾燥し、粘稠なオイルを得た。

このオイルは放置すると固化した。ピリジン（Ｉ５０ｄ
）中のスルホニルジェタノール１０．６ｇ　　（６８，
６ミリモル）に４．４゛−ジメトキシトリチルクロリド
１６．９５ｇ（５０ミリモル）を加え、混合物を暗所で
１８時間撹拌した０反応液を次に、減圧下で濃縮した。

残渣を酢酸エチル５００　ｍに溶解させ、５％ＮａＨＣ
Ｏｓ水溶液および８０％飽和ＮａＣ１水溶液で抽出し、
有機相を無水Ｎａ１ＳＯ，上で乾燥した。溶媒を除去し
た後、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで
精製し、純粋な２−４．４’−ジメトキシトリチルオキ
シエチルスルホニルエタノール（Ｉ）（ＴＬＣ，シリカ
、　ＣＨｇＣｂ中：Ｒｆ−０，０１５）　　１０．０ｇ
を得た。上記（Ｉ）（４，６ミリモル）およびＮ、Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰ！Ａ）　４．６ミ
リモルのメチレンクロリド（Ｉ０ｄ）溶液を撹拌しつつ
、これに０℃。

アルゴン雰囲気下で、クロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル
アミノ−２−シアノエトキシ−ホスフィン（２）（４，
６ミリモル）を速やかに添加した。この溶液を室温にま
で加温し、酢酸エチル５０Ｉ１１で希釈し。

そして８０％飽和食塩水２０１ｄで２回洗浄した。有機
相を無水ＮａｇＳＯ，で乾燥し、ロータリーエバポレー
ターで濃縮した。油杖の生成物（３）をアセトニトリル
に溶解し２次に、膜で密封された１、５ｄのＷｈｅａ　
ｔｏｎバイアルに、それぞれ１００マイクロモルの試薬
が入るように１分注した。溶媒をエバポレートシて除去
し、生成物をアルゴン雰囲気下、−２０℃で貯蔵した。

この粗製の生成物は、さらに精製することなく使用され
た。

この乾燥した物質をテトラゾール（アセトニトリル中）
で活性化し、固相支持体に結合したオリゴヌクレオチド
に結合させた。引き続き、この合成りＮＡを標準条件下
で、水性Ｉオにより酸化し、　６０℃にてＮＨ４ＯＨを
用いて脱保護化した。これにより。

５°位がリン酸化された目的の断片を定量的に得た。

結合の度合は、　ＮＯ，ＯＨによる脱保護化に先立ち。

橙色の溶液（オリゴマーをジクロロ酢酸のメチレンクロ
リド溶液（５χＶ／Ｖ）と処理することにより生じる）
の４９８ｎ腸における吸光度を測定することにより決定
された。

１旌■ｌ 溶液中のオリゴヌクレオチドの酵素的精製：　ＣＰＧ支
持体（Ｗａｒｎｅｒら、　ＤＮＡ３．４０１（Ｉ９８４
）　）上で９次の断片５’−ＴＡＴＣＡＡＴＴＣＣＡＡ
ＴＡＡＡＣＴＴＴＡＣＴＣＣＡＡＡＣＣ−３’および５
’　−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＧ
ＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣ−ＡＴＧＧＡＡＡＣ−３’を合成
した。この断片を次に、実施例１と同様の方法で、５”
位をリン酸化した。生じたオリゴマーを、室温で、支持
体からＮＨ４ＯＨにより除去し、６０℃で一夜かけて脱
保護化した。この溶液を、スピード真空濃縮器中でエバ
ポレート・乾固した。

２１ｇの支持体から得られた粗製の生成物を２０μｌの
Ｈ２Ｏに懸濁させ、これに、肺臓由来のホスホジェステ
ラーゼ０．３ユニツトを含むリン酸ナトリウム緩衝液５
０μｌを加えた。この溶液をポルテックスにかけた後、
３７℃にて１時間放置した。

ポリアクリルアミドゲルによる分析により次のことが明
らかになった。つまり、一部を欠いた誤まりのある配列
は実質的に分解されるが、リン酸化された目的の断片は
加水分解から保護されることが明らかになった。

１旌■工 弐■のリン酸化剤を次のようにして調製した。

２−４．４°−ジメトキシトリチルオキシエチルスルホ
ニルエタノールの精製により実施例１の方法に準じた０
次に、記載されているように、　ＤＩＰＢＡ溶液にＮ、
Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフ
ィンオキシド（４，６ミリモル）を加えた。生成物をバ
リウム塩として沈澱させることにより分離し、実施例１
に記載したように、さらに精製することなく完全なオリ
ゴヌクレオチド配列をリン酸化するのに使用した。

裏施■土 式■の亜リン酸化試薬を、　　２−４．４’−ジメトキ
シトリチルオキシエチルスルホニルエタノール（４，６
ミリモル）と亜リン酸（４，６ミリモル）とをピリジン
巾約０℃で反応させることにより調製する０反応は、活
性化剤としてのトシルクロリドの存在下で進行する。生
成物、　　２−４．４’−ジメトキシトリチルオキシエ
チルスルホニルホスフェートを２例えば沈澱法により分
離し、活性化剤として（ＣＨｓ）　３ＣＯＣ１を使用す
る実施例１に記載されたのと同様の方法で合成りＮＡに
結合させる。リン酸化ＤＮＡは■２で酸化し、　ＮＨ４
０４で脱保護化し、５１Ｊン酸エステルを得る。結合反
応は、実施例１に記載された方法によりモニターされる
。

１施■ｌ 化学的リン酸化との比較：固相支持体に結合したホスホ
アミダイトケミストリー（Ｉ２）を使用した自動装置（
Ｇｅｎｏ−０−Ｍａｔｉｃ）により、パリンドロームＢ
ａｇ耐リンカー配列ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣを合成し
た。

支持体の１７２を試薬（３）でリン酸化し、脱トリチル
化して結合効率を調べ、そして完全に脱保護化した。生
成物を次に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精
製した。残りの１７２を脱保護化し、５゛位に水酸基を
有する形として精製し１次に。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを用いて５
゛位をリン酸化した。化学的および酵素的にリン酸化さ
れた断片を用いた↑４ＤＮＡリガーゼ反応のＰＡＧＥ分
析により１両者の配列ともほぼ完全にリン酸化されたこ
とが示された。これは、連結化の後に原料物質が残留し
ていないことにより証明された。

（以下余白） （発明の要約） 本発明によれば、　　ＤＮＡの合成や精製方法に有用で
ある新規なリン酸化試薬が提供される。該試薬は、ヌク
レオシドや、固相支持体に結合したオリゴヌクレオチド
の５゛位水酸基をリン酸化するのに特に有用なホスフィ
ンの代わりに使用される。これら試薬を用いたリン酸化
は容易に行なうことができ、また比色分析によって精度
よ（モニターし得る。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の式（ I ）、式（III）、および式（IV）で表さ
   れる化合物からなる群より選択されるリン酸化試薬： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） ここで、（ａ）Ｒ＿１は、トリチルオキシアセチル、置
   換または非置換のフェノキシアセチル、あるいは式ＲＲ
   ’Ｒ”Ｃ−を有する化合物であり；ここで、Ｒ、Ｒ’、
   およびＲ”は、独立して、以下の基からなる群より選択
   される： ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学
   式、表等があります▼； ここで、Ｘ＿１およびＸ＿２は、水素、低級アルキル、
   低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、フェニル、スルホ
   ネート、０〜２個の低級アルキルまたは低級アルコキシ
   置換基で置換されたアミノ、および１〜５個の環を有す
   る多環芳香族系の一部を表す炭素原子からなる群より選
   択される； （ｂ）Ｒ＿２は、低級アルキルで随意に一置換または二
   置換されたメチレン、および低級アルキルまたはニトロ
   で随意に置換されたフェニルからなる群より選択される
   ； （ｃ）Ｙは、１〜６個の炭素原子を有する０〜２個のア
   ルキル基で置換されたアミノ、ハロゲン、および３〜１
   ２個の炭素原子を有するトリアルキルシリルからなる群
   より選択される； （ｄ）ｘは１〜５０の範囲の整数である；および（ｅ）
   Ｄは次の化合物（ｉ）および（ｉｉ）からなる群より選
   択される； （ｉ）次の式（II）で表される化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ここで、Ｊ＿１およびＪ＿２は、独立して、水素、およ
   び１〜３個の炭素原子を有するアルキルからなる群より
   選択され；ｃは０または１であり；そしてＱは、水素、
   １〜９個の炭素原子を有するアルキル、ニトロ、低級ア
   ルキルスルホニル、シアノ、ｐ−ニトロフェニル、低級
   アルキルチオ、アリールチオ、およびトリハロメチルか
   らなる群より選択される；および （ｉｉ）フェニル、β−ナフチル、９−フルオレニル、
   および２−アントラキノニル。 ２、水酸基部分を有する化合物をリン酸化する方法であ
   って、 該化合物の水酸基部分をリン酸化条件下で特許請求の範
   囲第１項に記載の化合物と反応させる工程、 を包含する方法。