JPH01157400A - バクテリア診断プローブ - Google Patents

バクテリア診断プローブ

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JPH01157400A
JPH01157400A JP63201060A JP20106088A JPH01157400A JP H01157400 A JPH01157400 A JP H01157400A JP 63201060 A JP63201060 A JP 63201060A JP 20106088 A JP20106088 A JP 20106088A JP H01157400 A JPH01157400 A JP H01157400A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高い特異性のヌクレオチド繰り返し配列に基
づくバクテリアに対する診断プローブに関し、より具体
的には前記目的のための診断試験キットに関する。
〔発明の背景〕
本発明者等は、１９８２年に初めて、あるＤＮＡ配列（
３０〜４０ｂｐ長）が、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ旦）およびサルモネラ・チフ
ィムリウム（Ｓａ１ｍｏｎｅ１１旦　拍用烈償１鮭のゲ
ノム中で高頻度（約、１０００回）に繰り返されている
ことを公表した（Ｉｌｉｇｇｉｎｓ、　Ｃ，Ｆ、、　Ｆ
ｅｒｒｏ−Ｌｕｚｚｉ　Ａｗｅｓ。
Ｇ、、　Ｂａｒｎｅｓ、　Ｗ、Ｍ、＋　Ｃｌｅｍｅｎｔ
、　Ｊ、Ｍ、およびｔｌｏｆｎｕｎｇＭ、（１９８２）
　Ｎａｔｕｒｅ、　２９８，７６０〜７６２　）　、こ
れらの配列は、パリンドローム（回文）単位またはＰＵ
と称されている。これらの−次配列の保存率は８０％で
ある。
その後、エシェリヒア・コリーとサルモネラ・チフィム
リウム間では、ＰＵ共通塩基配列に若干の相違が認めら
れた。この相違は、サルモネラＰＵ配列に追加のグアニ
ン残基が存在することである。このことは、ＰＵ配列が
種特異性を示す前触れであった。今までのところ、バク
テリアでは、はんのわずかな族（ｆａｍｉ　ｌｙ）に高
頻度の反復配列が公表されているにすぎない。ＰＵの如
く、それらは厳密な種特異性を示す。ハイブリット形成
によれば、ナイセリア（Ｎｉｓｓｅｒｉａ）ｓ９Ｇ１．
の２６−　ｂｐ反復配列族（ゲノム当たり少くとも２０
コピーにおいて）は、他のいろいろなダラム陰性バクテ
リアには滉い出されていない（Ｃｏｒｒｅｉａ、　Ｆ、
Ｆ、＋Ｉｎｏｕｙｅ＋Ｓ、およびＩｎｏｕｙｅ＋　Ｍ、
（１９８６）　Ｊ、　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１６７、１００９〜１０１５）。ボルデテラ・パータソ
シス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）
に由来する反復配列族もまた種特異的であることが推察
される（ＭａｃＰｈ−ｅａｔ、　Ｗ、Ｌ、およびＭａｃ
Ｎａｌｌｙ、　Ｔ、（１９Ｂ？）　ＦＥＭＳ　Ｌｅｆｔ
。
４１．３５７〜３６０〕。
最近、プローブとしてエシェリヒア・コリーのＰＵ　Ｄ
ＮＡを用いる実験で、エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔ
ｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に由来するＤＮＡだ
けはＥ、コリーとかなりの効率でハイブリットを形成す
ることが示された。これらの実験結果は、未公表のデー
タであるが、遺伝学の動向を概説するために言及したも
のである。かかる研究により、本発明者は、ＰＵの特異
性がｐｕ配列に相当するＤＮＡプローブを用いるバクテ
リアの検出および同定に使用することができると確信し
た。
エンテロバクテリアセエおよびボルデテラ・パータソシ
スの繰り返し配列に関する前記観察から、種特異性の高
い反復配列の存在は、バクテリア間の一般的な事象であ
るように思われる。従って、本発明は、特異性診断プロ
ーブとして種特異性の高い反復配列の使用に関する。こ
の形式のハタテリアブロープは、低コピー数遺伝子に相
当するプローブを用いるアッセイよりもはるかに感度の
よい診断アッセイを提供できる。
〔発明の１既要〕 本発明の目的は、生物流体または別の起源に由来する試
料中のバクテリアの同定方法を提供するにある。この方
法は、高い特異性のヌクレオチド繰り返し配列を含有す
る標識化ＤＮＡプローブと、ハイブリットを形成し得る
バクテリアに対して適当で、かつ通常の処理法による調
製物を要件とする。かかるハイブリット形成プロトコー
ルについて適当でかつ通常利用される試薬類が、本発明
の使用に供される。特許請求の方法は、一定の必要な期
間前記ＤＮＡプローブにバクテリア試料をさらし、試料
バクテリアに由来するＤＮＡと前記プローブのハイブリ
ットを形成させることを要件とする。
通常用いられそして適当である洗浄剤は、反応容器から
標識化プローブのみを取り除く。最後に、通常のハイブ
リット形成度を分析するための手段は、試料バクテリア
の定性ならびに定量分析を可能にする。
他の態様では、本発明は、高い特異性のバクテリアヌク
レオチド繰り返し配列を含有する標識化ＤＮＡプローブ
、および該プローブと試料バクテリアのハイブリットを
形成させる適当な試薬を利用する、試料中のバクテリア
を同定するための診断試験キットに関する。ハイブリッ
トが生じ得る一般的かつ適当な容器と共に、通常のハイ
ブリソト形成後の、洗浄剤もまた必要とされる。ハイブ
リット形成度は、この目的に役立つ適当かつ通常の手段
により測定される。
さらに、本発明の目的および効果は、以下の詳細な記載
の欄に示されており、そしておそらくその記載から明ら
かになるか、または本発明の実施の態様から理解され得
るだろう。これらの目的および効果は、請求の範囲に具
体的に記載されている容器および組み合わせにより理解
されかつ達成され得るであろう。
前述の一般的な記載および後述の詳細な記載のいずれも
、単に本発明を例示しそして説明するためのものであり
、特許請求されているところの本発明を限定するもので
ない。
〔好ましい態様の詳細な記載〕
本発明の好ましい態様の詳細で、現に引用されている文
献は、以下の実施例と共に本発明の詳細な説明に供する
ものである。
Ｅ、コリーおよびサルモネラ・チフィムリウムゲノムの
ＤＮＡ配列の解析は、高頻度の繰り返しＤＮＡ配列族〔
パリンドローム単位（Ｐ　Ｕ）族〕の存在を明らかにし
た。この発見は、原核生物のゲノムは一般に小さく、そ
して低コピー数のＤＮＡ配列だけからなると信じられて
いるＣＢｒ１ｔｔｅｎ。
Ｒ，Ｊ、およびＫｏｈｎｅ、　Ｄ、Ｅ、（１９６８）、
　５ｃｉｅｎｃｅ、１６１，５２９〜５６０〕ので、予
期できなかった。Ｅ、コリーＤＮＡにおけるＰＵ配列は
１０３コピーとなり得て、これらはゲノムの１％を占め
、そしてこの割合は、真核生物のゲノム中の反復ＤＮＡ
の主要な族について見い出されている値に相当する。
−旦−Ｕ＞−列迎渦款１Ｕ告およびゲノムの肱パリンド
ローム単位は、２回軸対称を示す一群の反復配列の２０
〜４−ヌクレオチドを構成する。
共通塩基配列は、Ｅ、コリーに１２株におけるＰ　Ｕ配
列の１１８種の相違する起源から確認されている（Ｇｉ
ｌｓｏｎ、　Ｅ、、　Ｃｌｅｍｅｎｔ、　Ｊ、Ｍ、、　
Ｂｒｕｔｌａｇ、　Ｄ、およびＨｏｆｎｕｎｇ、　Ｍ、
（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　３．１４１７〜１４２１
）（第１図参照）。ＰＵが、ＲＮＡまたはＤＮＡの高次
構の安定なステムおよびループに対応し得るとしでも、
かか高次構造の構成を確立するに留まる。この「ステム
」は、ＧＣが豊富でありかつ高い保存性を有し、２．３
箇所に５個の塩基対を有する。２つの部分は、「インタ
ーナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）　Ｊミスマツチ（ｍｉｓｍ
ａｔｃｈ）により分離されている。
「ループ」は、ＡＴが豊富で可変性であり、そしてθ〜
５ヌクレオチド′の鎖長範囲内にある。Ｐ　ｔＪステム
のフランキング領域は、高い保存性を有し、［エクスタ
ーナル（ｅｘｔｅｒｎａｌ）　Ｊミスマツチ（第１図お
よび第２図参照）と称されている。このインターナルお
よびエクスターナルミスマツチは、ＰＵに対して極性を
付与する非対称要素をなす（第１図）。
パリンドローム単位は、Ｅ、コリーおよびＳ、チフィム
リウムの染色体上に、そしてエキストラジェニック（ｅ
ｘｔｒａｇｅｎｉｃ）位置中に少なくとも数百度存在す
る。このことが、ＰＵがときどきＲＥＰ　（反復・エキ
ストラジェニック・パリンドローム）配列と称される理
由であるが、この語ＲＥＰは、単位コピーの複製のため
に必要なプラスミド領域を識別するためにいつも広義に
使用されているので、混乱があるようである。
パリンドローム単位は、同一のオペロン２種の遺伝子（
インターシストロンＰＵ）間か、またはあるオペロンの
最後の遺伝子（ポストシストロンＰＵ）後のいずれにも
見い出されている。これらは、単離された存在としてか
、それ以外にも４個までの要素のクラスターとして存在
することが見い出されている。クラスターの構成は、方
同付けにおいて連続するＰＵの厳密な二者択一性（第１
図参照）の点で非常に興味深いものである。さらに、ス
テムの４つの位置は、類似の頻度で、ＧかまたはＴのい
ずれかか、またさらに他のものであることもできる。こ
のことは、クラスターの世代または選択について非常に
特異的な機構の存在を示唆する。
相同性（共通塩基に対応する塩基数を総塩基数で割った
値）は、非常に高く、平均８０％（第２図参照）である
。ステムの分枝におけるより保存性のある位置の１つの
変化は、しばしば他の分技における対応する位置の同時
変化によって達成され、このためこれらの２つの位置の
間の相補性が維持される。配列における驚くべき保存性
および対称性に対するふされしい理由は、後に検討する
。
第１図は、入手できる１２種の既知Ｓ、チフィムリウム
ＰＵ配列に由来する共通塩基配列を示す［Ｎｅｗｂｕｒ
ｙ、　Ｓ、Ｆ、等（１９８７）　Ｃｅ１ｌ　４８，２９
７〜３１０　）。
この配列は、インターナル・ミスマツチのＣの曲に高い
保存性の追加のＧを除いてはＥ、コリーの共通塩基配列
と類似である。２つの種の共通塩基配列におけるこのわ
ずかな相違の意味は、後の項で検討する。
Ｅ、コリーＰ［Ｉ　ＤＮΔをプローブとして使用した場
合、Ｅ、コリーと密接な関連があるエンテロハクテリア
セエに由来するＤＮＡだけが、適当なハイブリット形成
を示すにすぎない。コンピューター検索では、バチルス
・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｔｌｉｓ
）塩基配列のデータベース中に（いずれかの−次配列の
）パリンドロームを本発明者はは検出できなかった。こ
のために多くの説明が可能である。すなわち、（１）Ｂ
、ズブチリスの塩基配列のデータベースには暇疵が存在
するかも知れない。
（２）Ｂ、ズブチリスにおけるエンテロバクテリアセエ
のＰＵ群と機能上の同等性は、パリンドローム配列でな
いかも知れない。（３）Ｂ、ズブチリスのＰ　Ｕは、全
く機能上の同等性を有しない可能性がある。Ｅ、コリー
の同様な検索は、このバクテリアにおける単なる高い反
復パリンドロームＤＮＡ配列としてだけのＰＵを明らか
にしている（Ｓａｕ−ｒｉｎ、　ＩＡ、　Ｃａｂｉｏｓ
　３．１２１〜１２７．参照）。ラムダまたはＴ７フア
ージの完全なゲノム中には、ＰＵ配列を見い出せないこ
とが認められるであろう。最終的に、「ハーフ（ｈａｌ
ｆ）−ＰＵＪ　　（すなわち、第２図の１〜１７位と１
８〜３６位）のいずれか１つのＰＵ共通塩基配列も４個
以下の変種のいずれも真核生物の塩基配列データベース
には見い出せなかった。
これらのすべては、ＰＵ配列が一定のエンテロバクテリ
アセエの染色体の特徴を示すことを示唆する。バクテリ
アの殆んどの種に対する塩基配列のデータは、今まだデ
ータベース中に十分に公表されていないので、ＰＵに由
来する相違する配列を有する高頻度の反復パリンドロー
ム要素が、他のバクテリアの種に存在し得る可能性を除
外できなかった。
ＰＵクラスターの局在は、Ｅ、コリーに１２株の種々の
分離株のゲノム間に保存されている。このことは、Ｐｔ
Ｊは安定であるか、または少なくとも非常に不安定なゲ
ノム要素の構成物でないことが明らかである。ＰＵは、
Ｅ、コリーおよびＳ、チフィムリウムのＤＮＡの高い相
同性の配列を必ずしも同し位置に示さない。従って、Ｐ
Ｕの一次配列のように、ＰＵゲノムの局在位置は、バク
テリアの種に特異的である。
Ｐ　ＵおよびｍＲＮＡ 殆んどのＰＵは、転写ターミネータ−として機能しない
。Ｓ、チフィムリウムにおけるヒスチジン輸送に関する
同時転写遺伝子ｈｉｓ　ＪおよびｌＬＱの間に位置する
２つのＰＵは、イン・ビポ（ｉｎν１ｖｏ）で転写終結
を惹起しない（Ｂａｌ　Ｋ融合分析系での転写停止は５
０％以下）。イン・ビボでは、いかなる転写の減衰また
は終結も検出されなかった（Ｓｔｅｒｎ、　Ｊ、Ｍ、等
（１９８４）　Ｃｅ１ｌ　３７．１０１５〜１０２６）
。
Ｅ、コリーにおけるマルトース輸送オペロンの同時転写
遺伝子ｊａｍ　Ｂおよびｍａｌ　Ｍ間に位置する３つの
ｐｕは、下流の遺伝子の転写および翻訳に彫金を及ぼさ
ない（多コピー系のかり−に遺伝子および単コピー系の
ｌａｃ　Ｚ遺伝子）　　（Ｇｉｌｓｏｎ、　Ｅ、、　Ｒ
ｏｕ−ｓｓｅｔ、　Ｊ、Ｐ、　、　Ｃｌｅｍｅｎｔ、　
Ｊ、Ｍ、およびｌｌｏｆｎｕｇ、　Ｍ。
（１９８６）　　八ｎｎ、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（
Ｉｎｓｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ）　　１２７Ｂ、。
２５９〜２７０〕。いくつかのＥ、コリーオペロンでは
、主要なメンセンジャー末端は、典型的な因子に依存し
ない転写終結領域またはＰＵに隣接する位置にマツピン
グされるが、ＰＵとは明らかに異なる（Ｇｉｌｓｏｎ、
　Ｅ、、　ＲｏｕｓｓｅＬ、　Ｊ、Ｐ、、　Ｃｌｅｍｅ
ｎｔ、　Ｊ、Ｍ、およびＩｌｏｆｎｕｎｇ、　Ｍ、　（
１９８６）八ｎｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（ｔｎｓｔ
。
Ｐａ５ｔｅｕｒ）　１２７Ｂ、　２５９〜２７０　］。
しかしながら、いくつかのＰＵは、転写を終結させる。
羊−のボストシストロン（ｐｏｓ　ｔｃ　ｉ　ｓ　ｔｒ
ｏｎ　ｉ　ｃ）ＰＵは、二方向転写ターミネータ−とし
て機能するＬＡ遺伝転子ＷＬＡ　Ｊ転子との間に位置す
る。
かかるＰＵの塩基配列から、本発明者等は、ＰｔＪ”（
第１図参照）と命名したＰＵのザブクラスを定義するこ
とができる。興味深いことには、６種の既知ＰＵ”配列
は、それぞれ２つの収束解放読み取り枠（ｃｏｎｖｅｒ
ｇｅｎｔ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｓ）間
に位置しており、こうしてかかる領域における殆んどの
ＤＮＡを説明することができる。他の明らかな転写ター
ミネータ−配列は、これらの周辺には全く存在せず、そ
れらのすべてが前記Ｗ１能を有する可能性を残している
。
Ｅ、コリーおよびＳ、チフィムリウムの高い相同性があ
る領域（ｕｓｈ　Ａ−ＯＲＦＩ領域）の発現の対比は、
ＰＵ“配列が二方向転写ターミネータ−として機能する
との考えに適合する。２つの遺伝子は、Ｅ。
コリーのｐｕ”配列およびＳ、チフィムリウムの２つの
古典的な（Ｃ１ａｓｓｉｃａｌ）　Ｐ　Ｕのクラスター
により収束的に転溶されそして分離されている（第３図
参照）。０ＲＦＩに対応するタンパクは、２種ともに高
いレベルで発現される。しかしながら、Ｓ、チフィムリ
ウムに由来するｕｓｈ　Ａタンパクは、対応−ｊルＥ、
コリーｕｓｈ　Ａタンパクよりも極端に発現が少ない。
驚くべきことに、０ＲＦ１転写の遺伝子の不活化は、壓
１工Ａ０の発現を増大せしめる（Ｂｕｒｎｓ、Ｄ。
ＨｌおよびＢｅａｃｈａｍ、　１．Ｒ，（１９８６）　
Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１９２゜１６３〜１７５〕。
従って、０ＲＦ１転写は、Ｓ、チフィムリウムのｕｓｈ
　Ａ’の発現を阻害するが、Ｅ、コリーのｕｓｈ　Ａの
発現は、ＰＵｌによる転写停止に帰因するものでない。
ｒｈｏ−依存性であることが推定される終結部位は、Ａ
遺伝子の後に位置する２つのＰＵ間にマツピングされて
いるＣ３ｐｅｎｃｅｒ、　Ｍ、ｌＥ、およびＧｕｅｓｔ
、　Ｊ、Ｒ。
（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２
００．　１４５〜１５４　”Ｊ　、　　これらの２つの
ＰＵ間に位置する（：ＡＡ−一配列が、いくつかのｒｈ
ｏ−依存性ターミネータ−（Ｐｒ、　ＰＩ。
ｔＲＮＡ”’およびｔｒｐｔ　’　）の近傍かまたは末
端にも見い出されることは意味があるかも知れない（Ｍ
ｏｒｇａｎ、　Ｗ、Ｐ、、　Ｂｅａｒ＋　Ｄ、Ｇ、、　
Ｌｉｔｃｈａｍ、　Ｂ、Ｌ、およびｖｏｎ　ｔｌｉｐｐ
ｅｌ、　Ｐ、Ｈ，（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅｓ。
１３、３７３９〜３７５４）。
一定のＰＵは、ｍＲＮＡの３′−末端の安定化を介して
、遺伝子の発現に対して限定された効果を有する。ｈｉ
ｓ　Ｊおよびｈｉｓｑ間の２つのインターシストロン（
ｉｎｔｅｒｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）　Ｐ　Ｕの欠失は、オ
ペロンの遠位部分に影否を及ぼさないが、上流の遺伝子
（ｈｉｓ　Ｊ）の発現について２倍の減少をもたらす。
ＬＬＩＡオペロンのポストシストロンＰＵについて、同
様な観察がＰｌａｍａｎｎ等によってなされている（翻
訳停止コドンと最初のｐｕ間に位置するμファージ挿入
物は、上流の区１１遺伝子の発現を３倍減少させる原因
となる）　　（Ｐｌａｍａｎｎ、　Ｍ、Ｄ、および５ｔ
ａｕｆｆｅｒ、　Ｇ、Ｖ、（１９８５）　Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、　１６１゜６５０〜６５４〕。最近にな
って、このような上流遺伝子の発現の上昇は、上流のｍ
ＲＮＡ類の累積化に由来することが、２例示された。こ
の観察結果は、３′−〜５′エキソヌクレアーゼ分解か
ら転写を保護するｐｕ配列の作用により説明された。
今や、ＲＮＡの二次構造を形成し得る多数の塩基配列が
、３’−−５’エキソヌクレアーゼ消化に対する障壁と
して作用し得ることは十分証明されている。従って、ｍ
ＲＮＡレベルで安定ステムおよびループ構造を形成する
可能性のあるｐｕ配列が、前記のような活性を示す可能
性を有することは驚くに値しない。
臣しＬ　−二Ｂ領域のあるＰＵは、ＲＮａｓｅ　ｍプロ
セッシング部位を含む。このＰＵの塩基配列は定型でな
い（ステムおよびループの上部は欠失している）。興味
深いことに、い（つかの厳密でない相同性が、ステムの
低部とファージＴ７の既知のＲＮＡａｓｅ　ｍ部位との
間に存在するＣＧ１１ｓｏｎ、　Ｅ、。
Ｃｌｅｍｅｎｔ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｂｒｕｔｌａｇ、　Ｄ
、およびＩｌｏｆｎｕｇ、　Ｍ。
（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　３．１４１７〜１４２１
〕、　　Ｐ　ＵとＲＮａｓｃ　ＩＩＩプロセッシングと
の関連性が存在するとの他の証拠はない。ことに、ｈｉ
ｓ　Ｊ−Ｈｉｓ口領域の２つの代表的なＰＵは、イン・
ビトロでＲＮａｓｅ　■によって切断されない。ＰＵ共
通塩基配列に由来するわずかな配列の変性またはＰＵ配
列周辺の変性は、特定のオペロンの転写に対して多様な
効果を与えることができる。ＰＵのこれらの機能的な変
性により細胞に付与される選択性の利点は、ＰＵ配列間
の差異を高めがちであろう。しかしながら、これらの構
成物のずべてが今まだＰＵとして認められているので、
一定の種におけるＰＵ配列の間では相同性維持のための
何等かの機構が存在することが予想される。
Ｕ股λでｊ鵠裏忰ｌは戊 前記のように多数の相同性配列の存在およびｊ］伝壬子
間局在は、それらが染色体再配列〔遺伝子のシャフリン
グ（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）　）により取り込まれ得るこ
とを示唆する。ＰＵ−次配列およびその２回軸対称（制
限酵素部位思い出してほしい）の著しい保存性は、ＰＵ
　ＤＮＡが構造タンパクのバインディング部位であり得
ることを暗示する。
ＰＵは、次の２つの理由で高頻度Ｍｉ換えについての主
要部位でないようである。すなわち、（１）約３　ｋｂ
ｐによって分離されているＰＵの２種のクラスターは、
Ｅ、コリーのｍａｌ　Ｂ領域で見つけられているが、ど
のような卸ゴ欠失変異株もｍａｌ　Ｂ　Ｐ　Ｕ領域の終
点（ｅｎｄ−ｐａｉｎｔ）を有するものは見い出されて
おらず、そして（２）Ｓ、チフィムリウムにおける自然
発生的な縦列の複製の殆んどは、ｒｒｎオペロン間の均
一でない組換えによって生じる。
しかしながら、いずれかの繰り返し配列により促進され
るようなＰｔＪ仲介性の低頻度の組換え活性は、非常に
よく生じ得る。かかる条件下でさえも、ｐｕは染色体の
再配列およびゲノムの進化の調節においである役割を果
すことができる。この考えを支持するものとしては、１
の配列が、Ｓ、チフィムリウムにおける１のＰＵおよび
ａＬＬＢを含むｈｉｓ　Ｇ−ｈｉｓ　Ｄ遺伝子開領域の
間で検出されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｐ、および
Ｒｏｔｈ、　Ｊ、（１９７８）　Ｊ、　Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　１１９．１４７〜１６６　）　、さらに、
１のＰＵは、Ｅ、コリーおよびＳ、チフィムリウム間の
れＬＡの相同性と非相同性領域間の境界に存在しく第３
図）、そしてＰＵ配列は、ＭＩＲＮＡｉｉ伝子の後に位
転子る直線的な繰り返し配列およびｔＲＮＡ”。遺伝子
の後に位置する直線的な操り返し配列の境界に必ず存在
する（Ｒｅｅｄ、　Ｒ，ＥおよびＡｌｔ−ｍａｎ、Ｓ、
（１９８３）　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ　’　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０
．５３５９〜５３６３．Ｋｕｃｈｉｎｏ。
’ｌ−＋　Ｍａｒ＋　＋　Ｆ、およびＮｉｓ−Ｎ１５−
ｈｉ、Ｓ、（１９８５）　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　
Ｒｅｓ、１３．３２１３〜３２２０）　、証拠が間接的
であるにもかかわらず、これらの観察結果は、ＰＵ部位
と密接な組換え現象の発生と整合する。
核様体を取り込んだタンパクを含む抽出物の存在で、Ｐ
Ｕ配列は、εｘｏｌ１１消化に対して強い障壁を構成す
る（Ｇｉｌｓｏｎ、　Ｅ、等（１９８６）　ＦＥＢＳ　
Ｌｅｔｔ、２０６゜３２３〜３２８〕。いずれの配向性
においても単一のＰＵは、分解を停止するのに十分であ
る。これらの発見は、１つのまたはいくつかの核様体を
取り込んだタンパクが認識でき、そしてＰＵ配列に結合
できるとの考えに調和する。
この相互作用の生物学的な意義は、知られていない。こ
のことは、ヌクレオチドの構造としてのＰＵの複雑さに
整合する。真核性クロマチン構造に対する最近の研究は
、特異なりＮＡ配列を用いる相互作用によって、ループ
ドメイン中のＤＮＡの構成によるトポイソメラーゼ■タ
ンパクに関係がある。電子顕微鏡による研究およびイン
・ビボでの高次コイルの分布係数の測定に基づき、Ｅ、
コリーの核様体は、高次コイル状のループドメイン中に
保持されていることが明らかになった。このことは、特
異的なタンパクによる２つのＰＵクラスターのクランピ
ング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）が、各ループの首部を構成し
、そして／または安定化することを可能にすることであ
る。
バクテリアの　に・するＰＵおよびその＼ｐｕ配列の高
コピー数は、拡散に対する効率的な機構を包含している
ことを示唆する。
真核性生物における数種の機構は、始原繰り返し配列に
由来する逆向の位置（すなわち、ＲＮＡ、ときにはｔＲ
ＮＡの逆転写）、遺伝子転換、不均一な組換え、ずれ（
ｓｌｉｐｐａｇｅ）複製、転位および増幅を含んでいる
（Ｄｏｖｅｒ、　Ｇ、八、（１９８６）　Ｔｒｅｎｄｓ
　　Ｇｅｎｅｔ。
２、１５９．１６５　）。これらの機構のいずれもここ
では除外することはできない。しかしながら、ＰＵは、
あるトランスポゾンと同じように、それらの逆になった
繰り返し構造（Ｉｓを暗示する）、およびＰＵステム共
通塩基配列とトランスボゾンの末端との間の部分的な相
同性を含有する特徴を有する。
ＰＵの高度な相同性は、少なくとも次の２つの仮説によ
って説明することができる。（１）それらが最近生しそ
して（例えば、転位によって）急速に拡散した９そして
（２）それらは、より８典的な起源のものであり、そこ
には、相同性を維持する特異的な機構が存在する、とす
るものである。
Ｅ、コリーとＳ、チフィムリウムのいずれもあるときは
、ＰＣＩを有しており、そしてそれらは同し遺伝子的な
局在（例えば、ｕｓｈ　Ａ領域）にあるので、ＰＵの形
成は、２つの種が分岐する以前に生じたものであると思
える。このことは、第１の仮説に対立する。それらの共
通塩基配列のわずかな相違は、一方の種におけるＰＵ配
列の相同性が、２つの相違する種間よりも高く、相同性
の維持に対する種特異的機構を含むことを示唆する。あ
る配列族内のかかる変異のパターンは、協奏的進化と称
されており、既に多くの真核生物類の、例えばｒＤＮＡ
、核内低分子（ＳＦ））　ＲＮＡまたは長鎖散在的（ｉ
　ｎ　ｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ）反復ＤＮＡ配列（ＬＩＮ
Ｅ）において観察されている。ＰＵ配列にパインデング
するタンパクの存在（前述参照）は、ＰＵ配列と関連の
あるタンパクの遺伝子間のゆっくりした相互変換をもた
らし得る可能性がある。このことは、ある種内のＰＵ［
の相同化をもたらすようである。
ＰＵに類する、バクテリアにおける反復ＤＮＡ配列の他
の既知の３種類は、厳密な種特異性を示す。ナイセリア
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ｓｐｐ、の２６−　ｂｐ反復配
列類（ゲノム当たり少なくとも２０コピ一以上の）がハ
イプツトを形成するいかなる配列も、多様な他のダラム
陰性バクテリアには見い出されていない（Ｃｏｒｒｅｉ
ａ＋　Ｆ、Ｆ、、　Ｉｎｏｕｙｅ、　Ｓ、および１ｎｏ
ｕｙｅ。
Ｍ、（１９８６）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６
７、１００９〜１０１５）　、リゾビウム・トリフォリ
イ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　　ｔｒｉｆｏｌｉｉ）の共生
プラスミド上で３〜６度繰り返されているｎ１ｆ−ｔｌ
ＤＫプロモーター配列は、試験された他のすべての共生
プラスミドを含有するりゾビウム種のＤＮＡとハイブリ
ットを形成しない（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ。
ｊ、および５ｈｏｆｉｅｌｄ、　Ｐ、Ｒ，（１９８５）
　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。
１９９、２７９〜２８９〕。ヘモフィリス刊膓ｌ■ｌ封
りの１ｉ−ｂｐ繰り返し配列（ゲノム当たり１０３コピ
ー）は、コンピテント細胞により処理されたヘモフィリ
スＤＮＡの特異的認識をする（Ｄａｎｎｅｒ、　Ｄ。
Ｂ、　Ｄｅｉｃｈ、　Ｒ，Δ、ｌ　５ｉｓｃｏ、　Ｋ、
Ｌ、、およびＳｍ１ｔｈ、　１１．０゜（１９８０）　
Ｇｅｎｅ　ＩＬ３１１〜３１８　〕、さらに、繰り返し
ＤＮＡ配列族が、最近ボルデテラ・バータソシス（Ｂｏ
ｒｄｅｔｅｌｌａ　　ｐμ」卦１醇において見い出され
た。
さらに、この配列も種特異性であるようである（Ｍａｃ
Ｐｈｅａｔ、−ル、およびＭａｃＮａｌｌｙ、　Ｔ、（
１９８７）ＦＥＭＳＬｅｔｔ、　４１．３５７〜３６０
および八、　Ｕｌｌｍａｎ、個人的な情報〕。
バクテリアの反復配列の発見の刺激的な点は、真核生物
におけるこれらの構成物の発明に由来する多くの刺激的
な仮説や推測が、今やＥ、コリーのような遺伝子的によ
く特徴がわかっている生物体の実験的で手が届く範囲に
あることである。かかる配列の起源および機能が、近い
将来わかってくるであろう。
本発明の技術の具体的な課題または情況への適用は、本
明細書に含まれる教示に照らして、当業者が有し得る範
囲内のものと理解される。本発明の調製物およびそれら
を単離し、そして調製するための代表的な実施例（例）
は、以下の例に明らかにされる。
〔実施例〕
例−」− その他の点では相同性のあるバクテリアＤＮＡ配列間の
ＰＵにおける相違の根拠。
（Ｎｅｗｂｕｒｒｙ等、　１９８６　：　Ｇ１１ｓｏｎ
等）。
社虹Ａの停止コドンと転写ターミネータ−間の領域は、
エシェリヒア・コリーにおいて３つのＰＵを含み、そし
てサルモネラ・チフィムリウムおよびクレブシェラ・ニ
ューモニエ（Ｋ　１ｅｂｓ　ｉｅ　ｌ　ｌａｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ）の等価な領域には一つも含まない（Ｍａｃ
ＦａｒｌｅｎｅおよびＭｅｒｒｉｃｋ、　１９８５）。
２つのＰＵは、エシェリヒア・コリーのｍｅｔＪ遺伝子
の停止コドン後の２０ｂｐに位置する。サルモネラ・チ
フィムリウムの等価な領域は、まった＜ＰＵを含まない
が、特異的なファクター非依存性終結部位を含む（Ｓａ
ｉｎｔ−Ｇｉｒｏｎｓ等、　１９８４）　（Ｕｒｂａｎ
−ｏｗｓｋｉおよび５ｔａｕｆｆｅｒ、　１９８５）　
ｏ入手し得るデータでは、エシェリヒア・コリーにおけ
るＰＵを含有する挿入部の正確な境界を限定することが
できない。
単一のＰＵは、サルモネラ・チフィムリウムの１！ＩＬ
Ｄ遺伝子末端と機能性ファクター領域間に位置しており
、このＰＵの位置だけが示されている（Ｅｒｉｃｋｓｏ
ｎ等、　１９８５）。
種々の研究室で、相違するエシェリヒア・コリー源に由
来するｍａｌ　Ｅ−匹ａｌ　Ｆ遺伝子開領域（Ｄｕｐｌ
ａｙ等、　１９８４およびＤｕｐｌｙａ、個人的な情９
１）　、ｕｖｒ　Ｄの３′フランキング領域（Ｆｉｎｃ
ｈおよびＥｍｍｅｒｓｏｎ。
１９８４）　（Ｙａｍａｍｏｔｏ等、　１９８６）が、
クローン化されそして配列が決定されている。この３つ
の場合には、前記領域が同一のＰＵ配列を含む。
従って、ＰＵの局在は、エシェリヒア・コリーとサルモ
ネラ・チフィムリウム間では保存されていないにもかか
わらず、エシェリヒア・コリーの相違する種間では保存
されていることが明らかである。
入手し得る９種の既知サルモネラ・チフィムリウムＰＵ
配列は、すべてＣ−Ｔ　ｒミスマツチ（ｍｉｓ−ｍａｔ
ｃｈ）　ＪのＣの前に追加のＧを含む（第４図）。
本発明者等の研究所で確認された１０３種のエシェリヒ
ア・コリーＰＵ配列間では、１種のみ（区Ａ、ＰＵａ）
が、追加のＧを含むので、本発明者等は、このＰＵ共通
塩基配列は、エシェリヒア。
コリーおよびサルモネラ・チフィムリウム（変性サルモ
ネラ・チフィムリウムＰＵ共通塩基配列は、第４図に示
した）におけるわずかな相違の可能性があることを提案
する。これらの２つが、これらのＰＬＪ配列のこのわず
かな相違を示ずエンテロバクテリアセエに関連すること
は、ＰＵの一次配列がバクテリアの種の１つまたは１群
のものの特異性であることができる。さらに、ＰＵ配列
は、ラムダまたはＴ７フアージの完全なゲノム中に存在
しないことを思い出してほしい（Ｇｉｌｓｏｎ等、１９
８４）。
ＴＧＶプログラム（ＳａｕｒｉｎおよびＭａｒｌｉｅｒ
ｅ。
１９８７）を使用して、バチルス・ズブチリスの塩基配
列データベースを調査した（シーンバンクから取り出し
た３８種から抽出される３３種の配列についての２９４
１７ｂ、ｐ、　、　１９８５年１１月）。このプログラ
ムは、反復ＤＮＡパターンの一次配列にかかわりなく、
それらを検索することができる。必要とされるパラメー
ターは、反復ＤＮＡパターン連続塩基、Ｗａｔｓｏｎ−
Ｃｒｉｃｋ則および相補則を用いて対を形成（すなわち
、Ａ−Ｔまたは（、−Ｃのベアリング）している全塩基
である。この検索は、バチルス・ズブチリスの塩基配列
データベースにおいては、反復パリンドローム配列のい
かなる類縁のものも示さなかった。ここに、本発明者等
は、ただ１つの配列のみが２以上の発生源を有すること
を見い出した。この配列（ＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧ
ＧＴＧＧ　）は、３種の相違する遺伝子領域〔旦皿Ｂ　
（ＷａｗｒｏｕｓｅｋおよびＨａｎｓｅｎ、　１９Ｂ３
）、ｔｒｒｎ　Ｄ（Ｗａｗｒｏｕｓｅｋ等、　１９８４
）およびｔｒｒｎ　Ｅ（ＧｒｅｅｎおよびＶｏｌｄ＋　
１９８３　；　Ｗａｉｖｒｏｕｓｅｋ等。
１９８４）　）にコードされているアンチコドンステム
およびｃｔｙ　−ｔＲＮＡのループに対応する。バチル
ス・ズブチリスの塩基配列データベースが、エシェリヒ
ア・コリーのものより１０倍少ない配列を含むにもかか
わらず、ｒＰＵ株」の配列が両種間において同じ頻度で
存在するとすれば、１つは、バチルス・ズブチリスの約
１０個の発生源から発見されることが期待できるだろう
。エシェリヒア・コリーの同じ検索が、このバクテリア
におけるただ高い反復パリンドローム配列としてだけＰ
Ｕを示すことが認められるであろう（Ｓａｕｒｉｎ、　
１９８７）。
（４）分−閉 前述の３つの指摘のすべては、ＰＵがバクテリアの種の
分化に寄与することを示唆する。直接的または間接的な
作用に対する多様性が想像され得る。本発明者等が考慮
したい１つの仮説は、ｐｕはバクテリアの染色体構造中
である役割を果たすであろうというものである。このこ
とは、ＰＵを含有しない異種染色体の大きな断片の挿入
の安定化または生存可能性を妨げることができる。予備
的な結果は、クロモイド（ｃｈ　ｒｏｍｏ　ｉｄ）関連
性のタンパクがＰＵ　ＤＤＮＡと特異的に相互作用する
ことを示す（Ｇｉｌｓｏｎ等、　１９８６ａ）。このこ
とは、ｐｕ配列が染色体の構造中に含まれ得るとの考え
と整合する。
±−Ｉ Ｅ、コリーの標識プローブを利用するハイプツト形成分
析。
相違するバクテリア種の１００のＤＮＡについて、３つ
のＰＵ配列を含有する２００ｂｐ　ＤＮＡプローブを用
いるドツト・プロット（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）またはサザ
ーン・プロット（ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）により
試験した。
ハイプツト形成試験は、次のような改良を加えた標準的
な方法を用いて実施した（ｂｓｓｃにおける０、１％の
ＳＤＳで５８℃にて１２時間ハイブリットを形成する段
階および０．２ＳＳＣにおける０、１％ＳＯＳで４５゛
Ｃにて１時間洗浄）。プローブはアルファー３２ｐヌク
レオチドを用いるニックトランスレーションにより調製
した。１００のバクテリア種は、−組の代表的なエンテ
ロバクテリア（８５の相違する種）および３つの相違す
る種からなる他のバクテリアの一組、および３つの相違
するキセノルハブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）種、
アシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ボ
ルデテラ・ブロンキセプチ力（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　
　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔｉｃａ）、シューウドモナス
・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　憇匹し
凱且）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）　、アク
チッパシラス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）　、パ
スツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ビブリオ・コレ
レ（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｃｈｏｌｅｒａｅ）　、ビブリオ
・ミニカス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｍ１ｎ−ｉｃｕｓ）　、
レジオネラ。
ニューモフイラ＜７旦ａ　　ｎｅｕｍｏ　ｈｉｌａ）、
バチルス・ズブチリス（Ｂａｃ−ｉｌｌｕｓ　　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ）、カロスリックス（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ）
およびメタノコツカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）
の他のバクテリアの構成物を包含する。
前述の分析による結果は、単にＥ、コリーおよびサルモ
ネラ群だけが、前述のハイプツト形成条件下でかかるプ
ローブとハイプツトを形成することを示した。
尉−主 ボルデテラ配列のハイブリット形成の特異性。
例１の一般的な方法に従い、ボルデララ・パータソシス
（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ　　ｐ−ｅｒｔｕｓｓｉｓ□γか
ら抽出した２４０ｂｐ配列単位物を用いてハイブリット
形成試験を行った。通常のハイブリット形成プロトコー
ル段階の変法は、５０％のホルムアミドを用い、４２°
Ｃで１２時間インキュベートシ、次いで６５℃にで０．
ｌ５ＳＣおよび０．１％のＳＤＳを用いて洗浄した。さ
らに、ハイブリット形成を、２５ＣＣおよび０．１％の
ＳＤＳを有するわずかに低いストリンジェント条件下で
実施した。Ｂ、バータソシスの配列は、Ｂ、Ｂ、バラパ
ータソシス、Ｂ、アビアムまたはＢ、ブロンキセブチ力
のどれともハイブリットを形成しなかった。
尉−↓ 他の一般的な標識化物の利用。
例１および例２のようなハイブリット形成試験を、標識
化プローブを用いて実施した。一般的な放射線活性、酵
素抗体法、蛍光抗体法を含む通常の標識化技術を利用し
た。利用したプローブ配列と標的バクテリアのハイブリ
ット形成の存否について、例１および例２と同様な結果
が確認できた。
本発明の方法や調製物について多様な改良や変形がなし
得ることは、当業者にとって明らかとなるであろう。従
って、本発明はそれらによって提供される本発明の改良
や変形をも特許請求の範囲内に含めることを意図してい
る。
例−」− 生物流体または他の起源に由来する試料中のバクテリア
のイン・ビトロにおける同定のための診断試験キ７）は
、固定されるバクテリアを含む適当に処理された既知量
の試料を添加してもよい通常のハイプツト形成容器から
なる。分離剤として標識化プローブＤＮＡを添加しても
よく、また別に、適当な手段により固定したものとして
存在させてもよい。
適当なインキュベーション期間が経過した後、バイブリ
ソ１〜形成を試料容器から標識化されていないプローブ
物質を洗浄することによって停止した。ハイプツト形成
の存在および存在量は、試料バクテリアのＤＮＡに結合
したプローブの量を測定することにより決定した。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｅ、コリーおよびＳ、チフィムリウムに由来
するパリンドローム単位の共通塩基配列を示し、第２図
は、Ｅ、コリーおよびＳ、チフィムリウムｐｕ配列の一
次構造の保存を示し、第３図は、クレブシェラ・ニュー
モニエ、Ｓ、チフィムリウムおよびＥ、コリーにおける
１し＾遺伝子ならびにＳ、チフィムリウムおよびＥ、〜
１リーにおけるｕｓｈ　Ａ遺伝子の３′フランキング領
域の構造の比較を示すものであり、そして第４図は、Ｅ
、コリーとＳ、チフィムリウム間のＰＵ共通塩基配列を
示すものであり、第５図は、ボルデテラ・パータソシス
配列情報を示すものである。 リＯａａ 侶 バ ４・＝ ；ニ ー″ゴ ヘ ト　　　　　　　　　　　　　　− く ＦＩＧ、　３ｂ Ｅ、コリＰＬＩ共通塩基配列 ＡＮＴ　　ぶコ鄭に霞ＣＧＰＣＧＣ［０，５３Ｓ、チフ
イムリウムＰＵ共通塩基配列 ＧＣＣＭＧＡＴＧＧ　ＣΩ巴３皿　　　　（０，５Ｊｈ
ｉｓＪａχ；匹に国Ｇ　　　ＣＧＣｔｇｔ　　　、１ｈ
ｉ　ｓＪｂ　　ぶコニＡニ巡Ｃ匹　　　　　ｔｇｔｈｉ
ｓＧｂＧＣＣＧＧＡＴＧＧ　　　ＣＧＣｔａｒａＡａ　
９Ｘ≧旦９匹３ＣＡＣｔ ａｒａＡｂ　ＧＣＣＧＧＡＴＧＧ　ＣＧＭ、　　　　　
　　ａｔａａｔａｒａＡｃ　ＧＣＣＧＧＡＴＧＧ　Ｃ（
Ａ　　　　　　　　　ｔｔａｉｒａＧＣＣＧＧｇＴＧＧ
　Ｃｇ、ｔｔｕｓｈＡ’ａ　ＧＣＣＴＧＡＴＧＧ　ＣＧ
Ｃ，ＱＣａａｕｓｈＡ’ｂ匡以褒酬６ＣＧＧＣＧＣｔｔ
ｔＣｇｄｈＡａＧＣＣＴＧＡＴＧＧ　ＣＧＣｔａｑ　Ｔ
　ＴＡＴＣＥＧＧＣＣＴＡＣＰ ＧＣＧＹＣτＴＡＴＣＥＧＧＣＣＴＡＣＰＧＣＧ　　　
　　τｇＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＧＧＣＣ工τｇｃＣＣＧ
ＧＣＣＴＡＣＧ ＧＣＧＣｉ込二≧ぶ遺ＣＴＡＣＧ ＧＣＧＴ　　　　　ＴＴＡｃＣｇＧＧＣＣτＡＣＧＣΩ
ｇ　　ｚ巴二込匡てＣＴＡユ１

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、試料中のバクテリアに高い特異性のヌクレオチド繰
    り返し配列を含有する標識化ＤＮＡプローブ、該プロー
    ブと同定される試料のバクテリアに由来するＤＮＡがハ
    イブリットを形成するのに適する試薬、該プローブと該
    試料のバクテリアとの間のハイブリットが生じ得るハイ
    ブリット形成容器、ハイブリット形成処理後にハイブリ
    ットを形成していないプローブを除去するために適する
    洗浄剤およびハイブリット形成度を分析するための手段
    を含んでなる試料中のバクテリアを同定するためのイン
    ・ヒドロ（￥ｉｎ￥　￥ｖｉｔｒｏ￥）診断試験キット
    。 ２、前記標識化プローブが、酵素抗体法、ラジオアイソ
    トープ法および蛍光抗体法からなる群から選ばれる方法
    により標識化されたものである請求項１記載の試験キッ
    ト。 ３、前記ヌクレオチド配列が、第５図の高い特異性のヌ
    クレオチド繰り返し配列を含む請求項２記載の方法。 ４、前記プローブと同定される試料バクテリアに由来す
    るＤＮＡがハイブリットを形成するのに適する試薬の存
    在下で、前記バクテリアに高い特異性のヌクレオチド繰
    り返し配列を含有する標識化ＤＮＡプローブに試料バク
    テリアをさらす段階、試料からハイブリットを形成して
    いない標識化プローブを洗浄する段階および得られたハ
    イブリット形成度を分析する段階を含んでなる試料中の
    バクテリアの同定方法。 ５、前記標識化プローブが、酵素抗体法、ラジオアイソ
    トープ法および蛍光抗体法からなる群から選ばれる方法
    により標識化されたものである請求項４記載の方法。
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