JPH01160495A - Ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法 - Google Patents
Ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法Info
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- JPH01160495A JPH01160495A JP62293858A JP29385887A JPH01160495A JP H01160495 A JPH01160495 A JP H01160495A JP 62293858 A JP62293858 A JP 62293858A JP 29385887 A JP29385887 A JP 29385887A JP H01160495 A JPH01160495 A JP H01160495A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンアル
キルエステル（以下ｒＡＰＭＪと略称）の製造方法に関
する。
キルエステル（以下ｒＡＰＭＪと略称）の製造方法に関
する。
（従来の技術および
発明が解決しようとする問題点）
ＡＰＭは近年、甘味剤として注目されているペプチドで
ある。ＡＰＭもしくはＬ−アスパルチル−し−フェニル
アラニン（ＡＰ）の製造方法には化学的合成法と酵素的
合成法か含まれることはよく知られている。
ある。ＡＰＭもしくはＬ−アスパルチル−し−フェニル
アラニン（ＡＰ）の製造方法には化学的合成法と酵素的
合成法か含まれることはよく知られている。
ＡＰＭ製造のための化学的合成法はＮ末端保護されたＬ
−アスパラギン酸無水物とＬ−フェニルアラニンメチル
エステル（ＰＭ）とを縮合してＮ末端保護されたＡＰＭ
を得ることからなる。保護基は後に除去される。酵素的
合成法は蛋白質分解酵素の効力をＮ末端保護されたＬ−
アスパラギン酸およびＰＭに及ぼしてＮ末端保護された
ＡＰＭもしくはＮ末端保護されたＡＰＭのＰＭ付加物を
得、次いで保護基を除去してＡＰＭを形成することから
なる。しかしながら、いずれの方法においても保護基の
導入および除去という複雑な工程が要求（ＧＢ２，０９
２．１６１ Ａ参照）。
−アスパラギン酸無水物とＬ−フェニルアラニンメチル
エステル（ＰＭ）とを縮合してＮ末端保護されたＡＰＭ
を得ることからなる。保護基は後に除去される。酵素的
合成法は蛋白質分解酵素の効力をＮ末端保護されたＬ−
アスパラギン酸およびＰＭに及ぼしてＮ末端保護された
ＡＰＭもしくはＮ末端保護されたＡＰＭのＰＭ付加物を
得、次いで保護基を除去してＡＰＭを形成することから
なる。しかしながら、いずれの方法においても保護基の
導入および除去という複雑な工程が要求（ＧＢ２，０９
２．１６１ Ａ参照）。
プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ） 、トル
ロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ） 、０−ドトルラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ）およびスポロボロミセス（
Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏ＋ｏｙｅｅｓ）の１つを用いた微生
物的合成法である、保護基を用いないＡＰＭの製造方法
（Ｊ Ｐ ８３／１２８，７９６ ）も知られているが
、収率が極めて低いために工業的生産には必ずしも適し
ていない。
ロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ） 、０−ドトルラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ）およびスポロボロミセス（
Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏ＋ｏｙｅｅｓ）の１つを用いた微生
物的合成法である、保護基を用いないＡＰＭの製造方法
（Ｊ Ｐ ８３／１２８，７９６ ）も知られているが
、収率が極めて低いために工業的生産には必ずしも適し
ていない。
微生物もしくはそれに由来する酵素によってＬ−アスパ
ラギン酸およびＰＭから直接ＡＰＭを形成することがで
きる、より直接的な非保護性の経路も用いられている（
特願昭５８−７５５５９号）。しかしながら、保護基を
用いずにＬ−アスパラギン酸を用いてＡＰＭを製造する
際におけるこの方法の問題点はＬ−アスパラギン酸とＰ
ＭからＡＰＭを形成する反応が平衡反応であって、基質
が十分にＡＰＭに変換することが平衡によって妨げられ
、この結果収率が低くなる。後の文献（Ｅ Ｐ １５４
．４７２）ではアルコールのし一フェニルアラニンエス
テル残基を用いることによって収率がいくらか改善され
たが、反応は依然として平衡に依存し、したがって比較
的低い収率が生じる。
ラギン酸およびＰＭから直接ＡＰＭを形成することがで
きる、より直接的な非保護性の経路も用いられている（
特願昭５８−７５５５９号）。しかしながら、保護基を
用いずにＬ−アスパラギン酸を用いてＡＰＭを製造する
際におけるこの方法の問題点はＬ−アスパラギン酸とＰ
ＭからＡＰＭを形成する反応が平衡反応であって、基質
が十分にＡＰＭに変換することが平衡によって妨げられ
、この結果収率が低くなる。後の文献（Ｅ Ｐ １５４
．４７２）ではアルコールのし一フェニルアラニンエス
テル残基を用いることによって収率がいくらか改善され
たが、反応は依然として平衡に依存し、したがって比較
的低い収率が生じる。
（問題点を解決するための手段）
本発明は非障害経路もしくは誘導体化されないアスパラ
ギン酸を用いる経路における平衡の問題を伴うことなく
、生産物の収率を改善するものである。
ギン酸を用いる経路における平衡の問題を伴うことなく
、生産物の収率を改善するものである。
すなわち、本発明のＬ−アスパラギン酸αエステル（Ｌ
ＡＥ）もしくはＬ−アスパラギン酸αアミド（ＬＡＡ）
との縮合によってＬ−アスパルチル−し−フェニルアラ
ニンアルキルエステル（ＬＰＡＥ）を形成することので
きる酵素、該酵素を含有する微生物、該微生物のフラク
ションを含有する該酵素もしくは固体担体上に固定化さ
れた該酵素の存在下で水性溶媒もしくは有機性溶媒もし
くはこれらの混合物からなる溶媒中においてＬ−アスパ
ラギン酸αエステル（ＬＡＥ）もしくはＬ−アスパラギ
ン酸αアミド（ＬＡＡ）をＬ−フェニルアラニンアルキ
ルエステル（ＬＰＡＥ）を反応させることからなるＬ−
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンアルキルエステル
の製造方法に関するものである。
ＡＥ）もしくはＬ−アスパラギン酸αアミド（ＬＡＡ）
との縮合によってＬ−アスパルチル−し−フェニルアラ
ニンアルキルエステル（ＬＰＡＥ）を形成することので
きる酵素、該酵素を含有する微生物、該微生物のフラク
ションを含有する該酵素もしくは固体担体上に固定化さ
れた該酵素の存在下で水性溶媒もしくは有機性溶媒もし
くはこれらの混合物からなる溶媒中においてＬ−アスパ
ラギン酸αエステル（ＬＡＥ）もしくはＬ−アスパラギ
ン酸αアミド（ＬＡＡ）をＬ−フェニルアラニンアルキ
ルエステル（ＬＰＡＥ）を反応させることからなるＬ−
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンアルキルエステル
の製造方法に関するものである。
本発明はＬ−アスパラギン酸αエステルもしくはαアミ
ドとＬ−フェニルアラニンアルキルエステルとを開始物
質とするＡＰＭの製造に関するものである。Ｌ−アスパ
ラギン酸のαエステルは当技術分野において公知であり
、例えばｊ、コヴアックス等ＣＪ、Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ
ａｌ、、 Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、 ２８．１０８４
（１９８１））の方法によって製造することが可能であ
る。好ましいαエステルにはアルコールの残基、置換流
もしくは未置換のフェノール、チオールもしくはアルキ
ルエステルがあるが、他の形態のＬ−アスパラギン酸α
エステルもしくはαアミドを用いることも可能である。
ドとＬ−フェニルアラニンアルキルエステルとを開始物
質とするＡＰＭの製造に関するものである。Ｌ−アスパ
ラギン酸のαエステルは当技術分野において公知であり
、例えばｊ、コヴアックス等ＣＪ、Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ
ａｌ、、 Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、 ２８．１０８４
（１９８１））の方法によって製造することが可能であ
る。好ましいαエステルにはアルコールの残基、置換流
もしくは未置換のフェノール、チオールもしくはアルキ
ルエステルがあるが、他の形態のＬ−アスパラギン酸α
エステルもしくはαアミドを用いることも可能である。
例えば、Ｎ末端保護されたＬＡＥもしくはＬＡＡ、ある
いはＬＡＥも ゛しくはＬＡＡのβエステルもし
くはβアミド等を形成するものを用いることができる。
いはＬＡＥも ゛しくはＬＡＡのβエステルもし
くはβアミド等を形成するものを用いることができる。
他の好ましい形態はＬ−アスパラギン酸シアキルエステ
ルであろう。このような化合物は当技術分野において公
知である。次いで、これらの付加基は当技術分野におい
て公知な方法で除去することができる。
ルであろう。このような化合物は当技術分野において公
知である。次いで、これらの付加基は当技術分野におい
て公知な方法で除去することができる。
αアミドは当技術分野において公知の条件でアスパラギ
ン酸αメチルエステルをメタノール中においてアンモニ
アと反応させることによって製造される。アミドを製造
するためには他の方法も当技術分野において公知であり
、使用可能である。α位のアミド基は例えば、ＮＨ３、
Ｒに芳香族もしくは脂肪族構造が含まれるＲ−ＮＨ２，
Ｒ２ＮＨもしくはＲ３Ｎから誘導することができる。好
ましいアミドはアスパラギン酸アミドである。好ましい
アルキルエステルはメチルエステルである。
ン酸αメチルエステルをメタノール中においてアンモニ
アと反応させることによって製造される。アミドを製造
するためには他の方法も当技術分野において公知であり
、使用可能である。α位のアミド基は例えば、ＮＨ３、
Ｒに芳香族もしくは脂肪族構造が含まれるＲ−ＮＨ２，
Ｒ２ＮＨもしくはＲ３Ｎから誘導することができる。好
ましいアミドはアスパラギン酸アミドである。好ましい
アルキルエステルはメチルエステルである。
Ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルは当技術分野に
おいて公知であり、特に低級（１〜６）のアルキルエス
テルはよく知られている。Ｌ−フェニルアラニンの好ま
しい低級アルキルエステルはメチルエステルである。
おいて公知であり、特に低級（１〜６）のアルキルエス
テルはよく知られている。Ｌ−フェニルアラニンの好ま
しい低級アルキルエステルはメチルエステルである。
本発明の製造方法はＬ−アスパラギン酸のαエステルも
しくはαアミドを縮合して縮合生成物ＡＰＭを形成する
ことのできる酵素の存在下で水性有機性培地中において
Ｌ−アスパラギン酸αエステルもしくはαアミドとＬ−
フェニルアラニンアルキルエステルとを反応させること
によって実施される。反応は適当な温度、好ましくは２
５〜４５℃の範囲の温度において約１〜ＩＯ日間行なわ
れる。
しくはαアミドを縮合して縮合生成物ＡＰＭを形成する
ことのできる酵素の存在下で水性有機性培地中において
Ｌ−アスパラギン酸αエステルもしくはαアミドとＬ−
フェニルアラニンアルキルエステルとを反応させること
によって実施される。反応は適当な温度、好ましくは２
５〜４５℃の範囲の温度において約１〜ＩＯ日間行なわ
れる。
反応はおよそ４〜９のＰＨで行なわれる。好ましいｐＨ
は約８である。開始反応物の実際の量は当然、ＡＰＭを
形成するために反応するおよその化学量に比例するもの
であり、最適の結果を得るためにはどのような相対濃度
においてもこのような量が好ましい。しかしながら、い
ずれかの反応物の量を増減することも可能であり、また
複数のＬ−アスパラギン酸エステルもしくはアミドもし
くは複数のＬ−フェニルアラニンアルキルエステルを選
択することも可能である。選択される酵素は好ましくは
Ｌ−アスパラギン酸のαエステル結合もしくはαアミド
結合に対する特異性を有しており、好ましくはＬ−フェ
ニルアラニンアルキルエステルの（特にエステル）結合
および他のし一アスノ（ラギン酸結合もしくはＡＰＭ生
成物を加水分解しないものである。好ましい酵素はシグ
マケミカル社（Ｓｉｇｍａ ＣｈｅＩＩｌｉｃａｌ Ｃ
ｏ、）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）株Ｖ ８ （Ｇ、Ｒ，Ｄｒａ
ｐｅａｕ、（１９７ｇ） Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５６５３４
−４４ ）の突然変異体および遺伝子変異形から得られ
る細胞外プロテアーゼである。この酵素は以下のＮ末端
アミノ酸配列： Ｖａｌ ｌｉｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ａｓｐ Ａｒｇ ＨｉｓＰｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙ
ｒ Ｉｌｅ Ｇｉｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ ＡｌａＶａｌ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔ
ｈｒ ＡｓｎＨｉｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ ＡｌａＴｈｒ Ａｌａ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅ
ｒ １Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｙ
ｓ Ｈｌｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ １Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ
’Ｇｉｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ｇｌｙ ）Ｉｉｓ Ｔｈｒ ＡｌａＰｒｏ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ ＶａｌＬｙｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｐｒ。
は約８である。開始反応物の実際の量は当然、ＡＰＭを
形成するために反応するおよその化学量に比例するもの
であり、最適の結果を得るためにはどのような相対濃度
においてもこのような量が好ましい。しかしながら、い
ずれかの反応物の量を増減することも可能であり、また
複数のＬ−アスパラギン酸エステルもしくはアミドもし
くは複数のＬ−フェニルアラニンアルキルエステルを選
択することも可能である。選択される酵素は好ましくは
Ｌ−アスパラギン酸のαエステル結合もしくはαアミド
結合に対する特異性を有しており、好ましくはＬ−フェ
ニルアラニンアルキルエステルの（特にエステル）結合
および他のし一アスノ（ラギン酸結合もしくはＡＰＭ生
成物を加水分解しないものである。好ましい酵素はシグ
マケミカル社（Ｓｉｇｍａ ＣｈｅＩＩｌｉｃａｌ Ｃ
ｏ、）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）株Ｖ ８ （Ｇ、Ｒ，Ｄｒａ
ｐｅａｕ、（１９７ｇ） Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５６５３４
−４４ ）の突然変異体および遺伝子変異形から得られ
る細胞外プロテアーゼである。この酵素は以下のＮ末端
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Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ ＡｌａＴｈｒ Ａｌａ Ｇ
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ｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ
’Ｇｉｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ｇｌｙ ）Ｉｉｓ Ｔｈｒ ＡｌａＰｒｏ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ ＶａｌＬｙｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｐｒ。
１１ｅ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｐ
ｒｏ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ＰｈｅＧｌｙ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ ｌｉｅ Ｖａｌ
Ｌｙｓ ｐｈｅ ５ｅｒＧｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙ
ｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｓｎ
ＡｓｎＴｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａ１Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｓｅｒ １１ｉｅ Ｇｌｙ ｌｉｅ ｌ１ｉｓ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒ。
ｒｏ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ＰｈｅＧｌｙ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ ｌｉｅ Ｖａｌ
Ｌｙｓ ｐｈｅ ５ｅｒＧｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙ
ｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｓｎ
ＡｓｎＴｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａ１Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
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Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｎ ＡｓｎＰｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ ＡｓｎＧｌｕ Ｐ
ｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ａｓｎ 。
ｙｓ Ｇｌｎ ＡｓｎＰｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ ＡｓｎＧｌｕ Ｐ
ｒｏ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ａｓｎ 。
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａ
ｌａ ＡｌａＧｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ ＶａｌＡ
ｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓ
ｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎを有している。
ｌａ ＡｌａＧｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ ＶａｌＡ
ｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓ
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また、比活性、反応速度、反応特異性Ｋｃａｔ ％Ｋｍ
、有機溶媒および温度に対する安定性等を変化させるこ
とのできるような、コドン中における部位特異的変化、
すなわち自然発生的もしくはランダンな突然変異もしく
は改変以外の変化を酵素にもたらすことができることも
当技術分野においては公知である。特定コドンにおける
部位特異的変化のためのこのような修飾は当技術分野に
おいて公知であり、酵素を選択する際に本発明の一部を
なすものと意図される。重要な部位特異性変化は、例え
ば酵素の触媒残基の近傍、酵素の面、他のアミノ酸、も
しくはアミノ酸の外側部分等、活性部位もしくはその近
傍で生じる。加えて、酵素を安定化するためにジスルフ
ィド結合を導入することもできる。また、酵素を含有す
る微生物もしくは酵素を含有する微生物のフラクション
を使用することもできる。また、固定化酵素を用いるこ
ともできる。
、有機溶媒および温度に対する安定性等を変化させるこ
とのできるような、コドン中における部位特異的変化、
すなわち自然発生的もしくはランダンな突然変異もしく
は改変以外の変化を酵素にもたらすことができることも
当技術分野においては公知である。特定コドンにおける
部位特異的変化のためのこのような修飾は当技術分野に
おいて公知であり、酵素を選択する際に本発明の一部を
なすものと意図される。重要な部位特異性変化は、例え
ば酵素の触媒残基の近傍、酵素の面、他のアミノ酸、も
しくはアミノ酸の外側部分等、活性部位もしくはその近
傍で生じる。加えて、酵素を安定化するためにジスルフ
ィド結合を導入することもできる。また、酵素を含有す
る微生物もしくは酵素を含有する微生物のフラクション
を使用することもできる。また、固定化酵素を用いるこ
ともできる。
適当な選択された酵素の存在下におけるＬＡＥもしくは
ＬＡＡとＰＡＥの酵素反応によって縮合生成物ＡＰＭが
得られる。
ＬＡＡとＰＡＥの酵素反応によって縮合生成物ＡＰＭが
得られる。
他の態様においても同一の反応および条件が用いられる
が、Ｎ末端保護基あるいはβエステルもしくはβアミド
を有するＬ−アスパラギン酸αエステルもしくはαアミ
ドが使用される。保護基あるいはβエステルもしくはア
ミドはＡＰＭ生成物から除去することができる。
が、Ｎ末端保護基あるいはβエステルもしくはβアミド
を有するＬ−アスパラギン酸αエステルもしくはαアミ
ドが使用される。保護基あるいはβエステルもしくはア
ミドはＡＰＭ生成物から除去することができる。
微生物もしくは微生物のフラクションに由来する酵素を
用いる場合、このような微生物は通常の培地を用いて得
ることができる。さらに、細胞増殖工程の開始時もしく
はその途中で反応物を添加することも可能である。
用いる場合、このような微生物は通常の培地を用いて得
ることができる。さらに、細胞増殖工程の開始時もしく
はその途中で反応物を添加することも可能である。
微生物のために用いる培地は通常の炭素源および窒素源
ならびに無機イオンを含有する普通のものである。さら
に、ビタミンやアミノ酸等の有機栄養物質の微量の添加
もしばしば望ましい結果をもたらす。
ならびに無機イオンを含有する普通のものである。さら
に、ビタミンやアミノ酸等の有機栄養物質の微量の添加
もしばしば望ましい結果をもたらす。
ここで用いるのに適当な炭素源にはグルコースやシュク
ロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、および
アルコールが含まれる。ここで用いるのに適当な窒素源
にはアンモニアガス、アンモニア水およびアンモニウム
塩が含まれる。無機イオンは必要に応じて、例えばマグ
ネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオンおよび
鉄イオンから適当に選択される。
ロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、および
アルコールが含まれる。ここで用いるのに適当な窒素源
にはアンモニアガス、アンモニア水およびアンモニウム
塩が含まれる。無機イオンは必要に応じて、例えばマグ
ネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオンおよび
鉄イオンから適当に選択される。
培養はｐＨ４〜９、好ましくは約ｐＨ８の好気条件下に
おいて２５〜４５℃の範囲内の適当な温度において約１
〜１０日間行なわれる。
おいて２５〜４５℃の範囲内の適当な温度において約１
〜１０日間行なわれる。
本発明に使用可能な微生物には、培養終了後に得られる
全培養溶液、培養溶液から分離された微生物もしくは洗
浄された微生物が含まれる。また、使用可能な微生物は
凍結乾燥したり、アセトン乾燥したり、トルエン、表面
活性剤等と接触させたり、超音波にさらしたり、機械的
に粉砕したり、これらの細胞処理物質から得られた、酵
素活性を有する酵素蛋白質フラクションとすることがで
きる。また、これらの微生物の固定化した細胞、処理し
た細胞の不溶化した物質等を用いることもできる。
全培養溶液、培養溶液から分離された微生物もしくは洗
浄された微生物が含まれる。また、使用可能な微生物は
凍結乾燥したり、アセトン乾燥したり、トルエン、表面
活性剤等と接触させたり、超音波にさらしたり、機械的
に粉砕したり、これらの細胞処理物質から得られた、酵
素活性を有する酵素蛋白質フラクションとすることがで
きる。また、これらの微生物の固定化した細胞、処理し
た細胞の不溶化した物質等を用いることもできる。
水性培地としては、水、バッファー、およびエタノール
のような有機溶媒を含有するものを用いることができる
。さらに、微生物の増殖に必要な栄養素、酸化防止剤、
表面活性剤、補酵素、ヒドロキシルアミン、金属イオン
、およびＤＭＳＯ等の有機溶媒も必要に応じて水性培地
に添加することができる。
のような有機溶媒を含有するものを用いることができる
。さらに、微生物の増殖に必要な栄養素、酸化防止剤、
表面活性剤、補酵素、ヒドロキシルアミン、金属イオン
、およびＤＭＳＯ等の有機溶媒も必要に応じて水性培地
に添加することができる。
全培養溶液、培養細胞もしくは上記微生物の処理した細
胞物資が反応物に作用を及ぼすように該反応物に直接接
触させられる場合、水性培地は反応物および培養溶液、
培養細胞もしくは処理した細胞物質を溶解もしくは懸濁
することによって調製され、好ましくは１０〜７０℃の
温度およびｐＨ４〜９に調節され、しばらく静置される
か撹拌される。
胞物資が反応物に作用を及ぼすように該反応物に直接接
触させられる場合、水性培地は反応物および培養溶液、
培養細胞もしくは処理した細胞物質を溶解もしくは懸濁
することによって調製され、好ましくは１０〜７０℃の
温度およびｐＨ４〜９に調節され、しばらく静置される
か撹拌される。
このようにして製造されたＡＰＭは公知の分離法によっ
て分離・精製することができる。得られたＡＰＭはアミ
ノ酸分析器で測定される。
て分離・精製することができる。得られたＡＰＭはアミ
ノ酸分析器で測定される。
以下、実施例によって本発明を説明するが、この実施例
は説明の目的のみのために含まれるものであって、本発
明を限定しようとするものではない。したがって、当業
者は不必要な実験を行なうことなく他の酵素を選択した
り、適当な反応条件を採用することが可能である。
は説明の目的のみのために含まれるものであって、本発
明を限定しようとするものではない。したがって、当業
者は不必要な実験を行なうことなく他の酵素を選択した
り、適当な反応条件を採用することが可能である。
（実 施 例）
実施例Ｉ
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルおよびＬ−アスパ
ラギン酸αメチルエステルのそれぞれの水溶液を製造し
、ｐＨ８，０に調節した。次いで、これらの溶液をジメ
チルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）と混合してＬ−フェニ
ルアラニンメチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸αメチ
ルエステルおよびＤＭＳＯの最終濃度をそれぞれ０．１
Ｍ、 ０．５ Ｍおよび５０％とした。次いで前述の
ｖ８酵素溶液を最終濃度０．５ ＃Ｉｇ／ｒｒｄｌとな
るように添加し、反応混合物は室温で２４時間静置した
。ＡＰＭに転換したＰＭに基づく生成物はＨＰＬＣによ
る分析によれば約３３％であった。
ラギン酸αメチルエステルのそれぞれの水溶液を製造し
、ｐＨ８，０に調節した。次いで、これらの溶液をジメ
チルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）と混合してＬ−フェニ
ルアラニンメチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸αメチ
ルエステルおよびＤＭＳＯの最終濃度をそれぞれ０．１
Ｍ、 ０．５ Ｍおよび５０％とした。次いで前述の
ｖ８酵素溶液を最終濃度０．５ ＃Ｉｇ／ｒｒｄｌとな
るように添加し、反応混合物は室温で２４時間静置した
。ＡＰＭに転換したＰＭに基づく生成物はＨＰＬＣによ
る分析によれば約３３％であった。
Claims (7)
- （１）Ｌ−アスパラギン酸αエステルもしくはＬ−アス
パラギン酸αアミドとＬ−フェニルアラニンアルキルエ
ステルとの縮合によってＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンアルキルエステルを形成することのできる酵
素、該酵素を含有する微生物、微生物のフラクションを
含有する該酵素、もしくは固体担体上に固定化された該
酵素の存在下で溶媒培地中においてＬ−アスパラギン酸
αエステルもしくはＬ−アスパラギン酸αアミドをＬ−
フェニルアラニンアルキルエステルと反応させることか
らなるＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンアルキ
ルエステルの製造方法。 - （２）前記酵素がアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります。】 のＮ末端を有するものであることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の製造方法。 - （３）Ｌ−アスパラギン酸メチルエステルを用いること
を特徴とする特許請求の範囲第Ｌ項記載の製造方法。 - （４）Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを用いるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 - （５）前記Ｌ−アスパラギン酸αエステルもしくはＬ−
アスパラギン酸αアミドがＮ末端保護されており、その
保護基は生成物から除去することを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の製造方法。 - （６）前記Ｌ−アスパラギン酸αエステルもしくはαア
ミドがβエステルもしくはβアミドでもあり、Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルを産
出するために該βエステルもしくはβアミドを除去する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造方法
。 - （７）前記酵素がＬ−フェニルアラニンアルキルエステ
ルよりも前記Ｌ−アスパラギン酸αエステルもしくはα
アミドに対して大きな特異性を有していることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62293858A JPH0751075B2 (ja) | 1987-11-20 | 1987-11-20 | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62293858A JPH0751075B2 (ja) | 1987-11-20 | 1987-11-20 | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01160495A true JPH01160495A (ja) | 1989-06-23 |
| JPH0751075B2 JPH0751075B2 (ja) | 1995-06-05 |
Family
ID=17800066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62293858A Expired - Lifetime JPH0751075B2 (ja) | 1987-11-20 | 1987-11-20 | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0751075B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005058212A (ja) * | 2003-01-24 | 2005-03-10 | Ajinomoto Co Inc | α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法およびα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012087153A1 (en) | 2010-12-23 | 2012-06-28 | Marine Bioproducts As | Enrichment of marine oils with omega-3 polyunsaturated fatty acids by lipase-catalysed hydrolysis |
-
1987
- 1987-11-20 JP JP62293858A patent/JPH0751075B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005058212A (ja) * | 2003-01-24 | 2005-03-10 | Ajinomoto Co Inc | α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルの製造方法およびα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステルの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0751075B2 (ja) | 1995-06-05 |
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