JPH0751075B2

JPH0751075B2 - Ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法

Info

Publication number: JPH0751075B2
Application number: JP62293858A
Authority: JP
Inventors: グラントボストンマシュー; ジェイポーローズエイルーカラム
Original assignee: ジェネンコアインコーポレーテッド
Priority date: 1987-11-20
Filing date: 1987-11-20
Publication date: 1995-06-05
Anticipated expiration: 2010-06-05
Also published as: JPH01160495A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンアル
キルエステル（以下「APM」と略称）の製造方法に関す
る。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点） APMは近年、甘味剤として注目されているペプチドであ
る。APMもしくはＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニン（AP）の製造方法には化学的合成法と酵素的合成法
が含まれることはよく知られている。

APM製造のための化学的合成法はＮ末端保護されたＬ−
アスパラギン酸無水物とＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステル（PM）とを縮合してＮ末端保護されたAPMを得る
ことからなる。保護基は後に除去される。酵素的合成法
は蛋白質分解酵素の効力をＮ末端保護されたＬ−アスパ
ラギン酸およびPMに及ぼしてＮ末端保護されたAPMもし
くはＮ末端保護されたAPMのPM付加物を得、次いで保護
基を除去してAPMを形成することからなる。しかしなが
ら、いずれの方法においても保護基の導入および除去と
いう複雑な工程が要求される（GB2,092,161A参照）。

プソイドモナス（Pseudomonas）、トルロプシス（Torul
opsis）、ロードトルラ（Rhodotorula）およびスポロボ
ロミセス（Sporobolomyces）の１つを用いた微生物的合
成法である、保護基を用いないAPMの製造方法（特開昭5
8−126796号公報）も知られているが、収率が極めて低
いために工業的生産には必ずしも適していない。

微生物もしくはそれに由来する酵素によってＬ−アスパ
ラギン酸およびPMから直接APMを形成することができ
る、より直接的な非保護性の経路も用いられている（特
開昭59−198994号公報）。しかしながら、保護基を用い
ずにＬ−アスパラギン酸を用いてAPMを製造する際にお
けるこの方法の問題点はＬ−アスパラギン酸とPMからAP
Mを形成する反応が平衡反応であって、基質が十分にAPM
に変換することが平衡によって妨げられ、この結果収率
が低くなる。後の文献（EP154,472）ではアルコールの
Ｌ−フェニルアラニンエステル残基を用いることによっ
て収率がいくらか改善されたが、反応は依然として平衡
に依存し、したがって比較的低い収率が生じる。

（問題点を解決するための手段）本発明は非障害経路もしくは誘導体化されないアスパラ
ギン酸を用いる経路における平衡の問題を伴うことな
く、生産物の収率を改善するものである。

すなわち、本発明のＬ−アスパラギン酸αエステル（LA
E）もしくはＬ−アスパラギン酸αアミド（LAA）との縮
合によってＬ−アスパルチン−Ｌ−フェニルアラニンア
ルキルエステル（LPAE）を形成することのできる酵素、
該酵素を含有する微生物、該微生物のフラクションを含
有する該酵素もしくは固体担体上に固定化された該酵素
の存在下で水性溶媒もしくは有機性溶媒もしくはこれら
の混合物からなる溶媒中においてＬ−アスパラギン酸α
エステル（LAE）もしくはＬ−アスパラギン酸αアミド
（LAA）をＬ−フェニルアラニンアルキルエステル（LPA
E）を反応させることからなるＬ−アスパルチル−Ｌ−
フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法に関する
ものである。

本発明はＬ−アスパラギン酸αエステルもしくはαアミ
ドとＬ−フェニルアラニンアルキルエステルとを開始物
質とするAPMの製造に関するものである。Ｌ−アスパラ
ギン酸のαエステルは当技術分野において公知であり、
例えばJ.コヴァックス等（J.Kovacs et al.,J.Org.Che
m.26,1084（1961））の方法によって製造することが可
能である。好ましいαエステルにはアルコールの残基、
置換済もしくは未置換のフェノール、チオールもしくは
アルキルリエステルがあるが、他の形態のＬ−アスパラ
ギン酸αエステルもしくはαアミドを用いることも可能
である。例えば、Ｎ末端保護されたLAEもしくはLAA、あ
るいはLAEもしくはLAAのβエステルもしくはβアミド等
を形成するものを用いることができる。他の好ましい形
態はＬ−アスパラギン酸ジアルキルエステルであろう。
このような化合物は当技術分野において公知である。次
いで、これらの付加基は当技術分野において公知な方法
で除去することができる。αアミドは当技術分野におい
て公知の条件でアスパラギン酸αメチルエステルをメタ
ノール中においてアンモニアと反応させることによって
製造される。アミドを製造するためには他の方法も当技
術分野において公知であり、使用可能である。α位のア
ミド基は例えば、NH₃、Ｒに芳香族もしくは脂肪族構造
が含まれるＲ−NH₂,R₂NHもしくはR₃Nから誘導すること
ができる。好ましいアミドはアスパラギン酸アミドであ
る。好ましいアルキルエステルはメチルエステルであ
る。Ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルは当技術分
野において公知であり、特に低級（１〜６）のアルキル
エステルはよく知られている。Ｌ−フェニルアラニンの
好ましい低級アルキルエステルはメチルエステルであ
る。

本発明の製造方法はＬ−アスパラギン酸のαエステルも
しくはαアミドを縮合して縮合生成物APMを形成するこ
とのできる酵素の存在下で水性有機性培地中においてＬ
−アスパラギン酸αエステルもしくはαアミドとＬ−フ
ェニルアラニンアルキルエステルとを反応させることに
よって実施される。反応は適当な温度、好ましくは25〜
45℃の範囲の温度において約１〜10日間行なわれる。反
応はおよそ４〜９のpHで行なわれる。好ましいpHは約８
である。開始反応物の実際の量は当然、APMを形成する
ために反応するおよその化学量に比例するものであり、
最適の結果を得るためにはどのような相対濃度において
もこのような量が好ましい。しかしながら、いずれかの
反応物の量を増減することも可能であり、また複数のＬ
−アスパラギン酸エステルもしくはアミドもしくは複数
のＬ−フェニルアラニンアルキルエステルを選択するこ
とも可能である。選択される酵素は好ましくはＬ−アス
パラギン酸のαエステル結合もしくはαアミド結合に対
する特異性を有しており、好ましくはＬ−フェニルアラ
ニンアルキルエステルの（特にエステル）結合および他
のＬ−アスパラギン酸結合もしくはAPM生成物を加水分
解しないものである。この酵素はシグマケミカル社（Si
gma Chemical Co.）から入手できる黄色ブドウ球菌（St
aphylococcus aureus）株V8（G.R.Drapeau,（1978）Can
adian Journal of Biochemistry56534−44）、その突然
変異体および遺伝子変異形から得られる細胞外プロテア
ーゼである。この酵素は以下のＮ末端アミノ酸配列：を有している。

また、比活性、反応速度、反応特異性Kcat、Km、有機溶
媒および温度に対する安定性等を変化させることのでき
るような、コドン中における部位特異的変化、すなわち
自然発生的もしくはランダムな突然変異もしくは改変以
外の変化を酵素にもたらすことができることも当技術分
野においては公知である。特定コドンにおける部位特異
的変化のためのこのような修飾は当技術分野において公
知であり、酵素を選択する際に本発明の一部をなすもの
と意図される。重要な部位特異性変化は、例えば酵素の
触媒残基の近傍、酵素の面、他のアミノ酸、もしくはア
ミノ酸の外側部分等、活性部位もしくはその近傍で生じ
る。加えて、酵素を安定化するためにジスルフィド結合
を導入することもできる。また、酵素を含有する微生物
もしくは酵素を含有する微生物のフラクションを使用す
ることもできる。また、固定化酵素を用いることもでき
る。

適当な選択された酵素の存在下におけるLAEもしくはLAA
とPAEの酵素反応によって縮合生成物APMが得られる。

他の態様においても同一の反応および条件が用いられる
が、Ｎ末端保護基あるいはβエステルもしくはβアミド
を有するＬ−アスパラギン酸αエステルもしくはαアミ
ドが使用される。保護基あるいはβエステルもしくはア
ミドはAPM生成物から除去することができる。

微生物もしくは微生物のフラクションに由来する酵素を
用いる場合、このような微生物は通常の培地を用いて得
ることができる。さらに、細胞増殖工程の開始時もしく
はその途中で反応物を添加することも可能である。

微生物のために用いる培地は通常の炭素源および窒素源
ならびに無機イオンを含有する普通のものである。さら
に、ビタミンやアミノ酸等の有機栄養物質の微量の添加
もしばしば望ましい結果をもたらす。

ここで用いるのに適当な炭素源にはグルコースやシュク
ロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、および
アルコールが含まれる。ここで用いるのに適当な窒素源
にはアンモニアガス、アンモニア水およびアンモニウム
塩が含まれる。無機イオンは必要に応じて、例えばマグ
ネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオンおよび
鉄イオンから適当に選択される。

培養はpH4〜９、好ましくは約pH8の好気条件下において
25〜45℃の範囲内の適当な温度において約１〜10日間行
なわれる。

本発明に使用可能な微生物には、培養終了後に得られる
全培養溶液、培養溶液から分離された微生物もしくは洗
浄された微生物が含まれる。また、使用可能な微生物は
凍結乾燥したり、アセトン乾燥したり、トルエン、表面
活性剤等と接触させたり、超音波にさらしたり、機械的
に粉砕したり、これらの細胞処理物質から得られた、酵
素活性を有する酵素蛋白質フラクションとすることがで
きる。また、これらの微生物の固定化した細胞、処理し
た細胞の不溶化した物質等を用いることもできる。

水性培地としては、水、バッファー、およびエタノール
のような有機溶媒を含有するものを用いることができ
る。さらに、微生物の増殖に必要な栄養素、酸化防止
剤、表面活性剤、補酵素、ヒドロキシルアミン、金属イ
オン、およびDMSO等の有機溶媒も必要に応じて水性培地
に添加することができる。

全培養溶液、培養細胞もしくは上記微生物の処理した細
胞物資が反応物に作用を及ぼすように該反応物に直接接
触させられる場合、水性培地は反応物および培養溶液、
培養細胞もしくは処理した細胞物質を溶解もしくは懸濁
することによって調製され、好ましくは10〜70℃の温度
およびpH4〜９に調節され、しばらく静置されるか攪拌
される。

このようにして製造されたAPMは公知の分離法によって
分離・精製することができる。得られたAPMはアミノ酸
分析器で測定される。

以下、実施例によって本発明を説明するが、この実施例
は説明の目的のみのために含まれるものであって、本発
明を限定しようとするものではない。したがって、当業
者は不必要な実験を行なうことなく他の酵素を選択した
り、適当な反応条件を採用することが可能である。

（実施例）実施例１Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルおよびＬ−アスパ
ラギン酸αメチルエステルのそれぞれの水溶液を製造
し、pH8.0に調節した。次いで、これらの溶液をジメチ
ルスルフォキシド（DMSO）と混合してＬ−フェニルアラ
ニンメチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸αメチルエス
テルおよびDMSOの最終濃度をそれぞれ0.1M、0.5Mおよび
50％とした。次いで前述のV8酵素溶液を最終濃度0.5mg/
mlとなるように添加し、反応混合物は室温で24時間静置
した。APMに転換したPMに基づく生成物はHPLCによる分
析によれば約33％であった。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】黄色ブドウ球菌株V8由来の細胞外プロテア
ーゼからなる酵素の存在下で溶媒培地中においてＬ−ア
スパラギン酸αエステルもしくはＬ−アスパラギン酸α
アミドをＬ−フェニルアラニンアルキルエステルと反応
させることからなるＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンアルキルエステルの製造方法。
【請求項２】前記酵素がアミノ酸配列：のＮ末端を有するものであることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の製造方法。
【請求項３】Ｌ−アスパラギン酸メチルエステルを用い
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造方
法。
【請求項４】Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを用
いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造
方法。
【請求項５】前記Ｌ−アスパラギン酸αエステルもしく
はＬ−アスパラギン酸αアミドがＮ末端保護されてお
り、その保護基は生成物から除去することを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
【請求項６】前記Ｌ−アスパラギン酸αエステルもしく
はαアミドがβエステルもしくはβアミドでもあり、Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンアルキルエステ
ルを産出するために該βエステルもしくはβアミドを除
去することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製
造方法。
【請求項７】前記酵素がＬ−フェニルアラニンアルキル
エステルよりも前記Ｌ−アスパラギン酸αエステルもし
くはαアミドに対して大きな特異性を有していることを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造方法。