JPH01162144A

JPH01162144A - 電気泳動用媒体膜及び電気泳動方法

Info

Publication number: JPH01162144A
Application number: JP62320708A
Authority: JP
Inventors: Masashi Ogawa; 雅司小川; Yoshihiko Makino; 快彦牧野
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1987-12-18
Filing date: 1987-12-18
Publication date: 1989-06-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の属する技術分野］本発明は電気泳動用媒体及び電気泳動方法に間するもの
で、詳しくは、高分子量の蛋白、巨大ＤＮＡ分子のパル
ス電場印加による電気泳動分離に有用な電気泳動用媒体
及び電気泳動方法に間するものである。

本発明の電気泳動用媒体はパルス電場による巨大ＤＮＡ
の分離分析に有用なアガロース系水性ゲルからなる電気
泳動用媒体である。また１本発明の方法は、パルス電場
による巨大ＤＮＡの分離技術と膜厚勾配を有する（膜厚
グラジェント）アガロース系水性ゲル電気泳動媒体を組
み合わせることにより。

従来公知の方法では不可能であるか又は充分な分離分析
を実施できなかったような巨大ＤＮＡの分離分析を可能
とする電気泳動方法である。

本発明の電気泳動用媒体及び電気泳動方法の適用可能分
野として、染色体ＤＮＡの分離分析、染色体マツピング
、各種生物の遺伝子ライブラリの作成等がある。

［従来の技術］ゲル電気泳動は、遺伝子工学の分野において蛋白質や核
酸のような高分子物質を分離する手段として極めて重要
である。染色体マツピングなど巨大ＤＮＡ分離分析にお
いて、従来の連続電気泳動法では十数にｂｐ（ｂｐはｌ
塩基対を表わし、　Ｋｂｐは１０００塩基対を表わす）
以下の分子量範囲のＤＮＡが分離可能であり、これ以上
の分子量範囲のＤＮＡは分離不可能であった。近年にお
いて遺伝子関連の研究が進むにつれて、　ＤＮＡ塩基配
列決定の操作の迅速化が急務となっている。また口ＮＡ
シークエンス（塩基配列）解析において、数百塩基程度
の分子量差のＤＮＡフラグメントは相互の泳動速度差が
小さく泳動分離バンドの上下間係の判別がしづらいので
、シーフェンス解析において読み取り誤差が大きくなり
大きな支障があった。

１９８２年ＣＡＮＴＯＲらはＰｕ１ｓｅ　Ｇｒａｄｉｅ
ｎｔ　Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅｓｉｓ　（交差する
電界を交互に印加する電気泳動方法）を案出し、特表昭
５９−５０２０３７に開示している。その他の現在まで
に提案された方法として、０ＬＳＯＮらのＮｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｌｉ、５６４７（１９８４
）に記載の０ＰＡＧＥ（Ｏｒｔｈｏ８ｏｎａｌ　Ｆｉｅ
ｌｄ　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ　Ｇｅ１Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ）。

ＦＩＧＥ（Ｆｉｅｌｄ　　Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｇｅｌ
　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｂｏｒｅｓｉｓ）が知られている。

これらの電気泳動方法は、いずれも電界方向を周期的に
変化させることによりＤＮＡの形状を変化させて塩基数
の異なるＤＮＡを相互に分離する方法である。

０ＦＡＧＥ法においては電極を４５度の角度で設置し。

あいだの空間にアガロースの１％ゲルを置き、印加電界
の強度をＩＯＶ／ｃｍ程度に設定し、数十秒の周期で交
互に電界を印加し、約１５時間電気泳動することにより
、約４００ＫｂｐのＤＮＡまで分離することができる。

これら方法による分離の問題点は、電界の方向に角度が
ついていることに起因して、泳動像が歪むので、ＤＮＡ
分子の分子量を決定する際に誤差が大きくなるという欠
点を有していることである。

さらにＤＮＡシークエンス決定操作においては泳動像の
歪によりバンドの上下間係が判別しにくくなるという重
大な欠点も有している。

ＦＩＧＥ法は電界の方向を１８０度で（正反対向きに）
反転させる方法である。この方法は電場方向が正確に一
定方向に向かっているため分離像が歪むといった問題点
はない。しかし、この方法においては分離するＤＮＡの
分子量の大きさに対応させてパルスの条件を選択設定す
るのではあるが、ゲル膜全体にわたって逆方向と順方向
に一定の電界を印加するので、目的のＤＮＡ分離領域の
分子量の形状を効率良く変形させるには不充分である。

このためＤＮＡの分画可能分子量範囲が狭いという問題
点がある。かかる問題点を解決することは、ＤＮＡシー
クエンス解析及び遺伝子解析のスピードを上げるために
切望されていることである。

［発明の目的］本発明の目的はパルスフィールド電気泳動法に有用な改
良されたアガロース系水性ゲルからなる電気泳動用媒体
を提供することである。

本発明の他の目的は巨大ＤＮＡ分子を分離するための電
気泳動法におけろ分画可能分子量範囲を広げたパルスフ
ィールド電気泳動方法に有用なアガロース系水性ゲルか
らなる電気泳動用媒体を提供することである。

本発明の他の目的は巨大ＤＮＡ分子の分子量に適した電
気泳動条件を容易に設定することがてき。

かつ短時間の泳動操作で高い分画性能が達成されるパル
スフィールド電気泳動方法に有用なアガロース系水性ゲ
ルからなるを提供することである。

本発明の目的はアガロース系水性ゲルからなる電気泳動
用媒体を用いる改良されたパルスフィールド電気泳動法
を提供することである。

本発明の他の目的は巨大ＤＮＡ分子を分離するための電
気泳動法における分画可能分子量範囲を広げたパルスフ
ィールド電気泳動方法を提供することである。

本発明の池の目的は巨大ＤＮＡ分子の分子量に適した電
気泳動条件を容易に設定することができ。

かつ短時間の泳動操作で高い分画性能が達成されるパル
スフィールド電気泳動方法を提供することである。

［発明の構成］本発明は。

■厚さ勾配を有するアガロース系水性ゲルからなる電気
泳動用媒体膜、及び。

■厚さ勾配を有するアガロース系水性ゲルからなる電気
泳動用媒体膜を用いることを特徴とするパルスフィール
ド電気泳動方法。

である。

［発明の構成の詳細な説明］本発明の厚さ勾配を有するアガロース系水性ゲルからな
る電気泳動用媒体膜に用いられるアガロースとしては、
巨大分子量のＤＮＡ分離又は塩基解析に通常用いられる
７ガロースを用いることができる。アガロースとしては
、低電気浸透性、中電気浸透性、高電気浸透性アガロー
スのいずれをも用いることができる。用いることのでき
るアガロースの例として、特開昭５５−５７３０．特開
昭５５−１１０９４６、特表昭５７−５０２０９８等の
各公報に記載のアガロース等がある。水性ゲルには公知
の添加剤９例えば界面活性剤（例、ノニオン性界面活性
剤、アニオン性界面活性剤）、ｐ）ｌバッファー組成物
、変性剤、ポリオール化合物（例、グリセロール）、変
性剤等を公知の含有量範囲で含有させろことができる。

水性ゲルの濃度としては約０．４％〜約４．０％の範囲
内で目的又はＤＮＡ試料の分子量範囲等に応じて選択さ
れた実質的に一定の適宜な濃度値で用いられる。水性ゲ
ル膜の厚さを変化させる範囲は、特に制限はないが、約
１００Ｌｆｆｒ１〜約ｌ０ＩＩＩＩＨの範囲であり、実
用的に好ましい範囲としては約１００ｕ＋ｎ〜約５ＩＩ
Ｒ１である。水性ゲル膜の厚さ勾配は直線９指数関数、
対数、階段状関数又は前記関数の任意の組み合わせで表
わされる直線、折れ線又は曲線から適宜に選択して用い
られろ。水性ゲル膜の厚さ変化は、試料注入側（陰極側
）のゲル膜厚が反対側の側（陽極側）のゲル膜厚より大
きいように通常設定されるが、目的又はＤＮＡ試料の分
子量範囲等に応じて逆の膜厚変化を採用することもでき
る。

電気泳動用媒体膜を支える支持体として通常カラス、セ
ラミックス、電気絶縁性有機ポリマーからなる平滑表面
の板又は薄板（シート）を用いることができる。有機ポ
リマーからなる板又はシートの例として、ポリアクリル
故エステル（例、ポリメチルアクリレート）ポリマーシ
ート、ポリ塩化ビニルシート、ポリエステル（例、ビス
フェノールＡのポリカルボネート、ポリエチレンテレフ
タレート）等がある。好ましい有機ポリマー支持体とし
てポリメチル７クリレート、ポリエチレンテレフタレー
トがある。有機ポリマー支持体の表面は公知の物理化学
的表面処理（例、紫外線照射処理、グロー放電処理）及
びｌ又は下塗層設置（例、セルロースアセテート下塗層
、ゼラチン下塗層）をすることが好ましい。支持体はゲ
ル媒体膜の片側のみに配置してもよく、または９両側か
らゲルを支持してもよい。ゲル膜の作成方法としては、
２枚のガラス板又はポリマー板をスペーサーを両端部に
介して薄い厚さでかつ所望の厚さの変化を有する空間を
作成し、その内部空間に７ガロースの水溶液を注入して
ゲルを形成させるモウルド法、又は支持体の上に７ガロ
ースの水溶液を塗布して乾燥させる方法によって厚さを
変化させてゲル膜を作成することができる。モウルド法
の場合には一方の支持体の厚さを変化させる。あるいは
所望の厚さ変化を有するスペーサーを用いて２枚の支持
体の間隔を適宜に変化させるで、所望のゲル膜厚グラジ
ェントを得ることができる。

本発明の電気泳動方法の特徴をなす電界の印加方法につ
いて説明する。従来の一定の方向に直流電圧をかける電
気泳動法と異なり９本発明のパルスフィールド（パルス
電界）電気泳動法では周期的に電場の向きを１８０度（
正反対の方向に〉反転させながら電気泳動を実施する。

電場はパルス状に印加する。印加電圧はゲル膜４０ｃｍ
当り（以下同じ）約−５０００Ｖから約＋５０００〜′
の間の任意の電圧１直で、かつ約ｏ、ｏｏｔ秒〜約１０
００秒の任意の時間で、電位を同期的に変化させる。巨
大ＤｌｊＡ（数十Ｋｂｐから数千にｈｐ）の分離のため
には約−１０００Ｖから約＋１００ＯＶの電圧が用いら
れ、　ＤＮＡシークエンス解析のための分子量範囲のＤ
ＮＡ（約３００ｂｐから約１０００ｂｐ）の分離のため
には約−５ｏｏｏｖから約＋５０００Ｖの範囲の電圧が
用いられる。電界印加の方法としては特に制限はないが
、例えば順方向の電圧を大きく逆方向の電圧を小さくし
てもよい、また逆に順方向の電圧を逆方向の電圧よりも
小さくしてもよい。実質的に順方向の泳動速度が逆方向
の泳動速度より大きくなるように電圧の印加時間を選ぶ
ことが原則である。パルスの印加時間としては特に制限
はないが分画する分子量の大きさにより選択されるもの
であるが、好ましい印加時間は約１ミリ秒から約１００
０秒、特に巨大ＤＮＡの分離においては約１秒から約１
０００秒の範囲が好ましく、ＤＮＡシークエンス解析に
おいては約１３１７秒から約１秒の範囲が好ましく用い
られる。作用させるパルス電場の波形は９例えば、矩形
波、鋸歯波、正弦波等のいかなる波形でもよく、制限は
ない。

電気泳動操作様式としては垂直式電気泳動法。

水平式電気泳動法等公知のいずれの様式を用いてもよい
。

巨大ＤＮＡのような二重鎖ＤＮＡの検出には、電気泳動
後エチジウムプロミドのような蛍光剤を用いて発色させ
て可視化させた後写真を撮り分離状況を解析する。　Ｄ
ＮＡ塩基配列解析においては９通常ＤＮＡを放射性化合
物でラベルし、一定時間の電気泳動を行った後、ゲル膜
を支持体からはずし、薄いポリマーフィルムで覆った状
態にてオートラジオグラフィー処理、又はイメージング
プレートを有するコンピユーテッドラジオグラフィー装
置による処理を行って９分離パターンを可視化する。色
素又は蛍光色素でラベルした核酸フラグメントを含む試
料を用いて電気泳動分離する場合には９分離パターンを
光−電気変換素子を含む装置により分離パターンを可視
化することができる。

■工歪亘実施例１［膜厚グラジェントアガロースゲル膜の調製１２０ｃｍ
角の平滑表面のガラス板を用いてゲル濃度１．５％の７
ガロース水性ゲル膜を下記組成のＴＯＥバッファー水溶
液ににアガロースを溶解したゲル形成液（アガロース水
溶液）を塗布した後、低温度に保ちゲル化させてゲル膜
厚を２．Ｏｎ＋ｍから５．０ｍａ＋　（ゲル膜ｌ）及び
０．５ｍｍから５．０ＩＩＩｍ（ゲル膜２）に直線状に
変化させた膜厚勾配の異なる２種類のアガロース水性ゲ
ル膜を作成した。

■ＴＢＥバッファーの組成Ｔｒｉｓ（）リス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン
の慣用名）　　　　　　　　　　　１０３ｇ硼酸　　　
　　　　　　　　　　　　　　５５ｇＥＤＴＡφ２Ｎａ
塩　　　　　　　　　　　　　　　９．３ｇ水を加えて
　　　　　　　　　　１０．ＯＬにする■アガロース水
溶液の組成アガロース　　　　　　　　　　　　　　１５０ｇ上記
Ｔ上記式ッファー　　　　　　　　　　　１０Ｌついて
得られたアガロース水性ゲル膜の膜厚の大きい側の端部
近傍にサイズ１０ｍｍ　Ｘ　１５ｓ＋ｍのウェル型のコ
ームを用いて常法によりサンプル用ウェルを作成した。

［膜厚グラジェントアガロースゲル膜の性能評価実験］ＤＮＡ試料として、ＴｄＣＤＮＡ（１６６にｂ）、λＤ
ＮＡ　（４８にｂ）。

λＤＮＡの旧ｎｄ　ｍによる分解物を用いた。各ＤＮＡ
試料の０．０２μｇを、１０％グリセロール、０．００
１５％プロむフェノールブルーを含む上記と同じ成分濃
度のＴＯＥバッファー水溶液５μＬに溶解して用いた。

試料はピペットの先端をカットしたＧ１１ｓｏｎ　Ｐｉ
ｐｅｔｍａｎを用いてウェルに充填した。ついで、パル
スを印加する前に一方向の直流電界下で１５分かけて試
料をアガロースゲル膜中に導入した。

電気泳動操作は膜厚の大きい側の端部を陰極側に接続し
、温度を１４．０℃に維持してパルス・インバージョン
法に従って電気泳動を行った。電気泳動条件は第１表に
示したとおりであった。

泳動終了後に、　ＴＢＥバッファー１ｍＬ当たり０．５
μｇの臭化エチジウムを含有する染色液にゲルを浸漬し
てＤＮＡの泳動像を可視化した。ついて可視泳動像をフ
ジインスタント白黒フィルム（商品名ＦＰ−３０００Ｂ
）を用い短波紫外光照射下で写真撮影した。

写真の泳動像で各ＤＮＡの移動距離を調べたところ。

第１表に記載の結果が得られた。

比較例１ゲル膜厚２．Ｏｍｍで一定である他は実施例１と同様の
アガロース水性ゲル膜（ゲル膜３）を作成した。

ついで実施例１と同様にして性能評価実験を実施したと
ころ、第１表に記載の結果が得られた。

第１表の結果から９本発明の膜厚グラジェントを有する
アガロースゲル膜を用いたパルスフィールド電気泳動方
法ににおいては、　ＤＮＡ試料の移動距離は比較例の厚
さ−様なゲル膜を用いた方法に比べて顕著に広くなって
おり２本発明のゲル媒体及び泳動方法の効果は明らかで
ある。

実施例２実施例１と同様にしてアガロースゲル形成液を調製し、
厚さ２５０μｍの無色ポリエチレンテレフタレートフィ
ルムの上に第１表と同様の水性ゲル膜を作成した。この
アガロースゲル膜を用いて実施例１と同様にして電気泳
動を行ったところ、実施例１と同様な結果が得られた。

この性能評価実験により、支持体としてポリエチレンテ
レフタレートフィルムを用いたアガロースゲル膜におい
てもガラス板を支持体として用いた場合と同様のＤＮＡ
分画性能を有することが明らかになった。

実施例３厚さ２５０μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレート
フィルムの上にアガロース水溶液を塗布した後、低温度
に保ちゲル化させてゲル膜厚を２．０ｍｍから５．０關
（ゲル膜４）及び０．５開から５．０ｍｍ（ゲル膜６）
に指数関数曲線状に変化させた膜厚勾配の異なる２種類
のアガロース水性ゲル膜（いずれも膜の一方側の膜表面
は直線状で、膜厚変化曲線は直線状の表面に向かって凸
状）を作成した。ゲルの厚さの厚い端部近傍の一部を鋭
いカッターナイフを用いて切取り試料注入用のウェルを
作成した。

上記の７ガロースゲル膜を用いて実施例１と同様にして
電気泳動を行ったところ、第２表に示すとおり、このゲ
ル膜も分画可能なりＮＡ分子量範囲が広く、解像度が高
いことが明らかになった。

圓工至亘第　　１　　表第　　２　　表特許出願人　富士写真フィルム株式会社手続補正書く自
発）昭和６２年１２月２８日ｌ　事件の表示　　昭和６２年１２月１８日付特許願（
Ｈ）２　発明の名称　　電気泳動用媒体膜及び電気泳動
方法３　補正をする者事件との関係　　特許出願人住　所　　　神奈川県南足柄市中沼２１０番地富士写真
フィルム株式会社東京本社電話（０３）４０６−２５３７４　　補正により増加する発明の数　なし　　　−一、
−１，。

６　補正の内容（１）明細書第４頁第９〜１４行のｊまた・・・支障が
あった。Ｊを「染色体や巨大ＤＮＡから目的のＤＮＡ領
域を効率よく分離することに時間がかかり、ＤＮＡ塩基
配列決定の効率を悪くしている。１に訂正する。

（２）明細書第５頁第１５〜１７行のｒさらに・・・欠
点も有している。」を削除する。

（３）明細書第６頁第６〜７行のＦ　ＤＮＡシークエン
ス解析及び遺伝子解析１を「遺伝子解析及びＤＮＡシー
クエンス解析ｊに訂正する。

（４）明細書１０頁第５行の「乾燥１をｒゲル化」に訂
正する。

（５）明細書第１０頁第１３行の「説明する。ｊと「従
来の１の間にｒ電界の印加方法としてはＣＡＮＴｏＲら
の方法、０ＦＡＧＥ法等の公知の方法を適用することが
でき、制限はない。」を挿入する。

（６）明細書第１０頁第１８〜２０行の「印加電圧は・
・・任意の時間で１を「泳動方向の長さ約５０ｍｍから
約５０ｃｍの範囲のゲル膜について９両端（陽極と陰極
）に印加する電圧（電位差）は約＋ＩＯＶから約＋５０
００Ｘ・又は約−１０ｖカら約−５０００Ｖ、好ましく
は約＋３０ｖカら約＋２０００Ｖ又は約−３０Ｖから約
−２０００−゛の範囲内で適宜に選択された電圧値で、
かつ約１ミリ秒から約ｌ０００秒、好ましくは約１００
ミｌＪ秒から約１０００秒の範囲内で適宜に選択された
時間で１に訂正する。

（７）明細書第１０頁第２０行の　「約０．００１秒〜
約１０００秒」を「約１ミリ秒から約１０００秒、好ま
しくは約１００ミリ秒から約１０００秒１に訂正する。

（８）明細書第１０頁最下行の　「約−１０００Ｖから
約十１０００ＶＪを「約＋５０Ｖから約＋１００ＯＶ又
は約−５０Ｖから約−１０００Ｖ　Ｊに訂正する。

（９）明細書第１１頁第１〜４行のＦ、ＤＮＡシークエ
ンス・・・電圧が用いられ１を削除する。

（ｌＯ）明細書第１１頁第１２行の　「約１ミリ秒から
約１０００秒ｊの次にｒ、好ましくは約１００ミリ秒か
ら約１０００秒ｊを挿入する。

（！ｌ）明細書１０頁第第１４行のｒ好ましく」をｒ好
ましい。」に訂正する。

（１２）明細書第１１頁第１４〜１５行のＦ　、ＤＮＡ
シークエンス・・・好ましく用いられる。ｊを削除する
。

（１３）明細書１２頁第３〜６行のｒ　ＤＮＡ塩基配列
解析・・・状態にて１を「別法として、ニトロセルロー
ス微多孔性膜のようなメンプラン膜にＤＮＡをトランス
ファー（ＳＯＵＴＨＥＲＮプロッティング法）させ、つ
いて放射性同位元素でラベルしたＤＮＡプローブでハイ
ブリダイゼーションさせた後、Ｊに訂正する。

以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）厚さ勾配を有するアガロース系水性ゲルからなる
電気泳動用媒体膜。
（２）試料注入側（陰極側）のゲル膜厚が反対側（陽極
側）のゲル膜厚より大きい特許請求の範囲第１項に記載
の電気泳動用媒体膜。
（３）ゲル膜厚勾配が直線、指数関数、対数、階段状関
数又は前記関数の任意の組み合わせで表わされる直線、
折れ線又は曲線である特許請求範囲第１項に記載の電気
泳動用媒体膜。
（４）前記ゲル膜が有機ポリマーシートに支持されてい
る特許の請求範囲第１項に記載の電気泳動用媒体膜。
（５）前記ポリマーシートがポリエチレンテレフタレー
ト、ポリメチルメタアクリレートからなるシートである
特許請求の範囲第４項に記載の電気泳動用媒体膜。
（６）前記ゲル膜が試料注入のための注入孔を有するも
のである特許請求の範囲第１項に記載の電気泳動用媒体
膜。
（７）厚さ勾配を有するアガロース系水性ゲルからなる
電気泳動用媒体膜を用いることを特徴とするパルスフィ
ールド電気泳動方法。
（８）試料注入側（陰極側）のゲル膜厚が反対側（陽極
側）のゲル膜厚より大きい特許請求の範囲第７項に記載
のパルスフィールド電気泳動方法。
（９）ゲル膜厚勾配が直線、指数関数、対数、階段状関
数又は前記関数の任意の組み合わせで表わされる直線、
折れ線又は曲線である特許請求範囲第７項に記載のパル
スフィールド電気泳動方法。
（１０）前記ゲル膜が有機ポリマーシートに支持されて
いる特許の請求範囲第７項に記載のパルスフィールド電
気泳動方法。
（１１）前記ポリマーシートがポリエチレンテレフタレ
ート、ポリメチルメタアクリレートからなるシートであ
る特許請求の範囲第１０項に記載のパルスフィールド電
気泳動方法。
（１２）前記ゲル膜が試料注入のための注入孔を有する
ものである特許請求の範囲第７項に記載のパルスフィー
ルド電気泳動方法。