JPH01165383A - ヒト組織因子抑制因子のｄｎａクローン - Google Patents
ヒト組織因子抑制因子のｄｎａクローンInfo
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- JPH01165383A JPH01165383A JP63183423A JP18342388A JPH01165383A JP H01165383 A JPH01165383 A JP H01165383A JP 63183423 A JP63183423 A JP 63183423A JP 18342388 A JP18342388 A JP 18342388A JP H01165383 A JPH01165383 A JP H01165383A
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
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- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、組織因子抑制因子（ＴＦ Ｉ ）あるいはり
ボタンバク質関連凝固抑制因子（ＬＡＣＩ）として知ら
れる凝固抑制因子に関する。更に詳細には、本発明は全
長’Ｉ’ＦＩを本質的に表現しているｃＤＮＡクローン
に関する。
ボタンバク質関連凝固抑制因子（ＬＡＣＩ）として知ら
れる凝固抑制因子に関する。更に詳細には、本発明は全
長’Ｉ’ＦＩを本質的に表現しているｃＤＮＡクローン
に関する。
哺乳動物の血液での凝固カスケードには、２つの異なる
システム、即ち内因性システムと外因性システムとがあ
る。後者の外因性システムは、血液が組織スロンボデラ
ステイン（第厘因子〕（以後、組織因子（ＴＦ）と言う
）にさらされることによって活性化される。この組織因
子は、各種の細胞のプラズマメンブレン中で生じるリポ
タンパク質であり、特に脳及び肺において多く存在する
。
システム、即ち内因性システムと外因性システムとがあ
る。後者の外因性システムは、血液が組織スロンボデラ
ステイン（第厘因子〕（以後、組織因子（ＴＦ）と言う
）にさらされることによって活性化される。この組織因
子は、各種の細胞のプラズマメンブレン中で生じるリポ
タンパク質であり、特に脳及び肺において多く存在する
。
プラズマ第Ｖ「因子あるいはその活性体である第１Ｘａ
因子がＴＦと接触すると、ＴＦとともにカルシウム依存
性複合体を形成し、これがタンパク加水分解作用を発揮
して第Ｘ因子を第Ｘａ因子にまた第１Ｘ因子を第１Ｘａ
因子に活性化する。
因子がＴＦと接触すると、ＴＦとともにカルシウム依存
性複合体を形成し、これがタンパク加水分解作用を発揮
して第Ｘ因子を第Ｘａ因子にまた第１Ｘ因子を第１Ｘａ
因子に活性化する。
ＴＦによシイニジエイトされる凝固系の制御に関するこ
れまでの研究により、ＴＦを血清とともにインキュベー
ション（粗組織スロンボゾラステイン調製物中で）する
と、その活性がｉｎ ｖｉｔｒ。
れまでの研究により、ＴＦを血清とともにインキュベー
ション（粗組織スロンボゾラステイン調製物中で）する
と、その活性がｉｎ ｖｉｔｒ。
で抑制されまたＴＦをマウスに注入した時の致死効果が
阻止されることが明らかにされている。
阻止されることが明らかにされている。
Ｈｊｏｒｔの精力的な研究によって、この分野における
それまでの研究成果が確認され更に研究が進められて、
血清中の抑制成分が第■−ＴＦ複合因子を認識すること
が結論として示された（ ５ｃａｎｄ、 Ｊ。
それまでの研究成果が確認され更に研究が進められて、
血清中の抑制成分が第■−ＴＦ複合因子を認識すること
が結論として示された（ ５ｃａｎｄ、 Ｊ。
Ｃ１１ｎ、 Ｌａｂ、 Ｉｎｖｅｎｔ、、 ９！ ５ｙ
ｐｐＬ ２７ ｗ ７６〜９７（１９５７）］。この
結論は、プラズマ中で生じるＴＦの抑制にはＣａ”＋の
存在が必要であり（第Ｖ１１／■ａ因子がＴＦに結合す
る際にもＣａ２＋の存在が必要）ＴＦの抑制はＥＤＴＡ
による２価のカチオンのキレート化によって阻止され及
び／又は逆転されるという事実と符合している。
ｐｐＬ ２７ ｗ ７６〜９７（１９５７）］。この
結論は、プラズマ中で生じるＴＦの抑制にはＣａ”＋の
存在が必要であり（第Ｖ１１／■ａ因子がＴＦに結合す
る際にもＣａ２＋の存在が必要）ＴＦの抑制はＥＤＴＡ
による２価のカチオンのキレート化によって阻止され及
び／又は逆転されるという事実と符合している。
最近の研究によって、プラズマあるいは血清中でＴＦを
抑制するには第Ｖｌｒａ因子だけではなく触媒的に活性
な第Ｘａ因子と更に他の因子が必要であることが明らか
にされている［ ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅ−ｔｉｃｈ 、
Ｂｌｏｏｄ ６９．１５０〜１５５（１９８７）；５
ａｎｄｅｒａら、Ｉｂ１ｄ、、 ６６ 、２０４〜２１
２（１９８５）：）。この他の因子は組織因子抑制因子
（ＴＦＩ）あるいはりボタンバク質関連凝固抑制因子（
ＬＡＣＩ ）と定義されるものであシ、バリウム吸着プ
ラズマ中に存在している。また血清を遠心して密度１−
２１ ｊ；ｌ ／ｃｍ”とした時の浮遊液中のりボタン
バク質フラクションとともにＴＦＩ活性が分離されるこ
とから、この因子はりボタンバク質と関連しているもの
と考えられる。
抑制するには第Ｖｌｒａ因子だけではなく触媒的に活性
な第Ｘａ因子と更に他の因子が必要であることが明らか
にされている［ ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅ−ｔｉｃｈ 、
Ｂｌｏｏｄ ６９．１５０〜１５５（１９８７）；５
ａｎｄｅｒａら、Ｉｂ１ｄ、、 ６６ 、２０４〜２１
２（１９８５）：）。この他の因子は組織因子抑制因子
（ＴＦＩ）あるいはりボタンバク質関連凝固抑制因子（
ＬＡＣＩ ）と定義されるものであシ、バリウム吸着プ
ラズマ中に存在している。また血清を遠心して密度１−
２１ ｊ；ｌ ／ｃｍ”とした時の浮遊液中のりボタン
バク質フラクションとともにＴＦＩ活性が分離されるこ
とから、この因子はりボタンバク質と関連しているもの
と考えられる。
ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉｃｈ ％Ｂｌｏｏｄ ６９
％ １５０〜１５５（１９８７）及びＰｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８４．１８８６
〜１８９０（１９８７）によればＨθｐＧ２細胞（ヒト
へパトーマセルライン）が、プラズマ中に存在するＴＦ
Ｉと同様の特性を有する抑制成分を分泌することが示さ
れている。
％ １５０〜１５５（１９８７）及びＰｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８４．１８８６
〜１８９０（１９８７）によればＨθｐＧ２細胞（ヒト
へパトーマセルライン）が、プラズマ中に存在するＴＦ
Ｉと同様の特性を有する抑制成分を分泌することが示さ
れている。
米国同時係属出願Ｓｅｒ、 Ａ ７７．３６６号明細書
（出願臼：１９８７年７月２６日）には、Ｈｅｐ Ｇ２
細胞から分泌された精製組織因子抑制因子が記載されて
いる。この組織因子抑制因子には２つの形態、即ちナト
リウムドデシルスルフエートホリアクリルアミドデル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した時に約３７．０
００〜４０，０００ダルトンの位置に現われるＴＦｒｌ
と約２５，０００〜２６，０００ダルトンの位置に現わ
れるＴＦＩ２との２つの形態が存在することが見出され
ている。ＴＦｒのアミノ酸配列のＮ−末端部分が以下の
ように決定されでいる。
（出願臼：１９８７年７月２６日）には、Ｈｅｐ Ｇ２
細胞から分泌された精製組織因子抑制因子が記載されて
いる。この組織因子抑制因子には２つの形態、即ちナト
リウムドデシルスルフエートホリアクリルアミドデル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した時に約３７．０
００〜４０，０００ダルトンの位置に現われるＴＦｒｌ
と約２５，０００〜２６，０００ダルトンの位置に現わ
れるＴＦＩ２との２つの形態が存在することが見出され
ている。ＴＦｒのアミノ酸配列のＮ−末端部分が以下の
ように決定されでいる。
Ｘ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈ
ｉｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｈｉ８−８ｅ
ｒ−Ｐｈｅ−（Ｐｈｅ）−Ａｌａ（Ｘ−Ｘは未決定であ
る） 上記米国出願明細書の記載は本明細書に引用する。
ｉｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｈｉ８−８ｅ
ｒ−Ｐｈｅ−（Ｐｈｅ）−Ａｌａ（Ｘ−Ｘは未決定であ
る） 上記米国出願明細書の記載は本明細書に引用する。
発明の要旨
本発明によれば、本質的に組織因子抑制因子の全長を表
現するｃＤＮＡクローンの完全コード配列が見出された
つ 最初に、ヒト胎盤及び胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡライブ
ラリーを、精製Ｔ１４に対するラビットポリクローナル
血清でスクリーニングした。免疫学的にポジティブなり
ローンについて、更に１２５ニ一第Ｘａ因子結合活性を
スクリーニングした。免疫学的にかつ機能的に活性な７
個のクローンが得られた。
現するｃＤＮＡクローンの完全コード配列が見出された
つ 最初に、ヒト胎盤及び胎児肝λｇｔ１１ｃＤＮＡライブ
ラリーを、精製Ｔ１４に対するラビットポリクローナル
血清でスクリーニングした。免疫学的にポジティブなり
ローンについて、更に１２５ニ一第Ｘａ因子結合活性を
スクリーニングした。免疫学的にかつ機能的に活性な７
個のクローンが得られた。
最も長いクローンは胎盤由来λＰ９であって１．４キロ
ベース（ｋｂ）であシ、他の６個のクローンは１、Ｏｋ
ｂであった。部分的ＤＮＡ配列決定により、１、Ｑｋｂ
クローンは１．４ｋｂクローンの１部分と同じ配列を有
することが明らかになった。ヌクレオチド配列分析によ
シ、λＰ９は、１３３ ｂｐの５′非コード領域、９１
’２ｂｐのオープン・リーディング・フレーム、ストッ
プコドン及び３８４ｂｐの３′非コード領域を含む１４
６２塩基対（ｂｐ）のｃ ＤＮＡインサート配列からな
ることが明らかにされた。
ベース（ｋｂ）であシ、他の６個のクローンは１、Ｏｋ
ｂであった。部分的ＤＮＡ配列決定により、１、Ｑｋｂ
クローンは１．４ｋｂクローンの１部分と同じ配列を有
することが明らかになった。ヌクレオチド配列分析によ
シ、λＰ９は、１３３ ｂｐの５′非コード領域、９１
’２ｂｐのオープン・リーディング・フレーム、ストッ
プコドン及び３８４ｂｐの３′非コード領域を含む１４
６２塩基対（ｂｐ）のｃ ＤＮＡインサート配列からな
ることが明らかにされた。
このＣＤＮＡ配列は、１８個のシスティン及び７個のメ
チオニンを含む２７６個のアミノ酸からなる３ １．９
５０ダルトンの蛋白質をコードしている。
チオニンを含む２７６個のアミノ酸からなる３ １．９
５０ダルトンの蛋白質をコードしている。
翻訳されたアミン配列によシ、成熟ＴＦＩ蛋白の先には
約２８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが存在す
ることが明らかにされた。ここで言う一成熟“ＴＦＩと
は、本明細書Ｋｊ、−いて記載するλＰ９クローンのＡ
ＴＧ翻訳コｒンによってＴＦＩとメチオニルＴＦＩとの
両者を含むように定義されるものであり、このことは以
下の記載から理解することができよう。
約２８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが存在す
ることが明らかにされた。ここで言う一成熟“ＴＦＩと
は、本明細書Ｋｊ、−いて記載するλＰ９クローンのＡ
ＴＧ翻訳コｒンによってＴＦＩとメチオニルＴＦＩとの
両者を含むように定義されるものであり、このことは以
下の記載から理解することができよう。
ＴＦＩ蛋白には、Ａｓｎ−Ｘ−８ｅｒ／Ｔｈｒ （Ｘは
普通の２０個のアミノ酸のうちのいずれでもよい）の配
列を有する３個のＮ−結合グリコシル化部位が存在する
。これらの部位は、５′非コード領域の後の最初のメチ
オニンの位置をアミノ酸の位置＋１とした時、ＡＢｎ
１４５、ＡＢｎ ｉ ９５及びＡｆｉｌｎ ２５６の位
置にある。
普通の２０個のアミノ酸のうちのいずれでもよい）の配
列を有する３個のＮ−結合グリコシル化部位が存在する
。これらの部位は、５′非コード領域の後の最初のメチ
オニンの位置をアミノ酸の位置＋１とした時、ＡＢｎ
１４５、ＡＢｎ ｉ ９５及びＡｆｉｌｎ ２５６の位
置にある。
ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列により、該アミノ酸配
列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部分、高度にプ
ラスに荷電したカルボキシ末端部分、及びＫｕｎｉｔｚ
型酵素抑制因子の典型的配列を有する３個の相同ドメイ
ンからなる介在配列部分などのいくつかの識別可能な領
域を有していることが明らかにされた。
列は、高度にマイナスに荷電したＮ末端部分、高度にプ
ラスに荷電したカルボキシ末端部分、及びＫｕｎｉｔｚ
型酵素抑制因子の典型的配列を有する３個の相同ドメイ
ンからなる介在配列部分などのいくつかの識別可能な領
域を有していることが明らかにされた。
相同性についての研究から、ＴＦＩは塩基性グロテアー
ゼ抑制因子遺伝子スーパーファミリーに４するものと考
えられる。
ゼ抑制因子遺伝子スーパーファミリーに４するものと考
えられる。
ｃＤＮＡクローンλＰ９を開発するために用いた蛋白材
料はヒト胎盤組織であシ、この組織は通常の外科的手法
による分娩後に広く入手することができる。本発明にお
いて用いられているλｇｔ１１（１ａｃ５ ｎ１ｎ５
ｃｌ ８５７ ５１００）はよく知られたものであ
って、普通に入手することのできるラムダファージ発現
ベクターである。その構成及び制限酵素地図は、Ｙｏｕ
ｎｇとＤａｖ ｉ日＋ Ｐｒｏｃ。
料はヒト胎盤組織であシ、この組織は通常の外科的手法
による分娩後に広く入手することができる。本発明にお
いて用いられているλｇｔ１１（１ａｃ５ ｎ１ｎ５
ｃｌ ８５７ ５１００）はよく知られたものであ
って、普通に入手することのできるラムダファージ発現
ベクターである。その構成及び制限酵素地図は、Ｙｏｕ
ｎｇとＤａｖ ｉ日＋ Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 ＡＣａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８０ 、
１１９４〜１１９８（１９８３）に記載されている。
１１９４〜１１９８（１９８３）に記載されている。
ノーデン・プロット分析によ勺、肝由来セルライン、即
ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及び５Ｋ−
ＨＥＰ、−１へパトーマは、ＴＦＩ ｃＤＮＡとハイブ
リダイズする２つの主要なｍＲＮＡ （１，４ｋｂと４
．４ ｋｂ）を有していることが明らかにされた。
ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及び５Ｋ−
ＨＥＰ、−１へパトーマは、ＴＦＩ ｃＤＮＡとハイブ
リダイズする２つの主要なｍＲＮＡ （１，４ｋｂと４
．４ ｋｂ）を有していることが明らかにされた。
本明細書に記載した如き、ＴＦＩのためのｃ ＤＮＡの
クローニング及びその全蛋白配列及び構造の解明によシ
、詳細な構造−機能分析が可能となシ、またその生合成
的レギュレーションの研究のための基本的知識が得られ
る。
クローニング及びその全蛋白配列及び構造の解明によシ
、詳細な構造−機能分析が可能となシ、またその生合成
的レギュレーションの研究のための基本的知識が得られ
る。
しかして本発明は、第Ｘａ因子及び第Ｖｌｌａ／ＴＦ酵
素複合因子を抑制することのできる試薬についての血液
凝固カスケード研究にとって重要なものである。
素複合因子を抑制することのできる試薬についての血液
凝固カスケード研究にとって重要なものである。
本明細書においては、特許請求の範囲の記載によって本
発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白に
クレームされているが、以下に記述する図面についての
説明とともに本発明の好ましい態碌についての記載によ
シ本発明がよシよく理解されるものと考える。
発明を形成すると考えられる対象が特に指摘され明白に
クレームされているが、以下に記述する図面についての
説明とともに本発明の好ましい態碌についての記載によ
シ本発明がよシよく理解されるものと考える。
第１図は、１２５■−第Ｘａ因子を用いたλｇｔ１１ク
ローンのスクリーニングを示したものであるっクローン
化ファージの傅解物（Ｑ、１ｒｎｌ ）を、ドツト・プ
ロット装置を用いたサクションによりニトロセルロース
ペーパー上にスポットし、次いでニトロセルロースヘー
バー ヲ”５Ｔ−第Ｘ ａ 因子テデローブし、以後
に記述するようにしてオートラジオグラフィーに付した
つ黒いス蹟ットとして現われているクローンが１２５ニ
ー第Ｘａ因子と結合したポジティブ・クローンである。
ローンのスクリーニングを示したものであるっクローン
化ファージの傅解物（Ｑ、１ｒｎｌ ）を、ドツト・プ
ロット装置を用いたサクションによりニトロセルロース
ペーパー上にスポットし、次いでニトロセルロースヘー
バー ヲ”５Ｔ−第Ｘ ａ 因子テデローブし、以後
に記述するようにしてオートラジオグラフィーに付した
つ黒いス蹟ットとして現われているクローンが１２５ニ
ー第Ｘａ因子と結合したポジティブ・クローンである。
コントロールλｇｔ１１（下の右側のコーナー〕及び他
のクローンは１２５ニー第Ｘａ因子と結合しなかつたつ
第２図は、部分的制限酵素地図及びλＰ９のインサート
配列の目己列決定に用いた技法を示している。下に示し
たスケールはヌクレオチドの位置を示している。太い棒
線はコード領域を示しておシ、細い棒線ば５′及び６′
非コード領域を示している。
のクローンは１２５ニー第Ｘａ因子と結合しなかつたつ
第２図は、部分的制限酵素地図及びλＰ９のインサート
配列の目己列決定に用いた技法を示している。下に示し
たスケールはヌクレオチドの位置を示している。太い棒
線はコード領域を示しておシ、細い棒線ば５′及び６′
非コード領域を示している。
制限酵素部位は消化によシ確認した。矢印はｃＤＮＡの
配列決定に用いたオーバーラッピングＭ１３クローンを
示しているう 第３図は、ヒ） ＴＦＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
及び翻訳されたアミノ酸配列を示している。ヌクレオチ
ドの番号は左側に示されておυ、アミノ酸の番号は右側
に示されている。下線を引いた配列は、精製したＴＦｒ
蛋白と、ｖ８プロテアーゼとトリノシンで消化したベゾ
チドとを用いたアミノ酸配列分析によって独立に確認さ
れた配列であるっ＋１のアミノ酸は、５′非コード領域
のストップコドンの後にある最初のメチオニンである。
配列決定に用いたオーバーラッピングＭ１３クローンを
示しているう 第３図は、ヒ） ＴＦＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
及び翻訳されたアミノ酸配列を示している。ヌクレオチ
ドの番号は左側に示されておυ、アミノ酸の番号は右側
に示されている。下線を引いた配列は、精製したＴＦｒ
蛋白と、ｖ８プロテアーゼとトリノシンで消化したベゾ
チドとを用いたアミノ酸配列分析によって独立に確認さ
れた配列であるっ＋１のアミノ酸は、５′非コード領域
のストップコドンの後にある最初のメチオニンである。
Ｎ−結合グリコシル化部位は星印で示されている。
第４図は、 ＴＦＩのアミノ酸配列における電荷分布を
示すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基から１番
目のアミノ酸残基までを計算し７たものであシ、その電
荷の値が１番目の残基に示されている。従って、１番目
の位置の値は、最初のアミノ酸残基から１番目のアミノ
酸残基までの全ての電荷を合計したものであり、１番目
と５番目（Ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の差は、
１番目から５番目までのアミノ酸残基の合計電荷を示す
ものである。
示すグラフである。電荷は最初のアミノ酸残基から１番
目のアミノ酸残基までを計算し７たものであシ、その電
荷の値が１番目の残基に示されている。従って、１番目
の位置の値は、最初のアミノ酸残基から１番目のアミノ
酸残基までの全ての電荷を合計したものであり、１番目
と５番目（Ｊ＞ｉ）のアミノ酸残基における値の差は、
１番目から５番目までのアミノ酸残基の合計電荷を示す
ものである。
第５図は、ＴＦＩの疎水性プロファイルを示すグラフで
あろうアミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ酸残基が蛋
白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的データから
得られる）として定義するコンピュータープログラムに
よって、疎水性プロファイルを分析した（ Ｋｉｘｄｅ
ｒａら、Ｊ、 ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ、４．２３〜５
５（１９８５）］。アミノ酸配列に沿った疎水性プロフ
ァイルは、ＩＭＳＬＬＩｂｒａ−ｒｙのプログラムＩＣ
８ＳＣＵを用いることによって、滑らかになった（ Ｉ
ＭＳＬ Ｌｘｂｒａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎ
ｕａＬ９ｔｈ ａｄ、、 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆ
ｏｒ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄＳｔａｔｉ
θｔｉｃａｌ ５ｕｂｒｏｕｔｉｙｅ Ｌｉｂｒａ
ｒｙ、Ｈｏｕｓｔｏｎ。
あろうアミノ酸残基の疎水性の指数をアミノ酸残基が蛋
白内に埋没された深さ（Ｘ線による結晶学的データから
得られる）として定義するコンピュータープログラムに
よって、疎水性プロファイルを分析した（ Ｋｉｘｄｅ
ｒａら、Ｊ、 ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ、４．２３〜５
５（１９８５）］。アミノ酸配列に沿った疎水性プロフ
ァイルは、ＩＭＳＬＬＩｂｒａ−ｒｙのプログラムＩＣ
８ＳＣＵを用いることによって、滑らかになった（ Ｉ
ＭＳＬ Ｌｘｂｒａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎ
ｕａＬ９ｔｈ ａｄ、、 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｆ
ｏｒ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄＳｔａｔｉ
θｔｉｃａｌ ５ｕｂｒｏｕｔｉｙｅ Ｌｉｂｒａ
ｒｙ、Ｈｏｕｓｔｏｎ。
ＴｅｘａＢ（１９８２）、１゜
第６図は、ＴＦＩの塩基性プロテアーゼ抑制因子ドメイ
ンと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメン
トを示す。ＴＦＩ以外の他の全ての配列は、Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅ日ｅａｒｃｈ Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎの蛋白配列データベース（Ｇｅｏｇ
ｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。
ンと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメン
トを示す。ＴＦＩ以外の他の全ての配列は、Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅ日ｅａｒｃｈ Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎの蛋白配列データベース（Ｇｅｏｇ
ｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。
Ｗａ９ｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｄ、Ｃ，、レリース１３．
Ｊｕｎｅ ｊ ９８７）から得たものである。
Ｊｕｎｅ ｊ ９８７）から得たものである。
１：牛塩基性プロテアーゼ抑制因子前駆体；２：牛初乳
トリプシン抑制因子： ３：牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子；４：食用カタ
ツムリ・イン抑制因子： ５：紅海つミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｃ１〜７
９のアミノ酸のみ）： ６：ウェスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ
抑制因子■； ７：リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子■ ； ８：ケープ・コプラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子■
： ９：ルツセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ： １０：サンド毒ヘビ毎の塩基性プロテアーゼ抑制因子■
： １１ニイースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子■ホモローグ； １２ニブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｂ； １６：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｅ： １４ニブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｉ： １５ニブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子に： １６：β−１−プンガロトギシンＢ鎖（マイナー）：１
７：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジャー）；１８
：β−２−シンガロトキシンＢ鎖：１９：ウマ・インタ
ーα−トリプシン抑制因子〔アミ ） 酸 １ 〜５
７（１１；５８ 〜１２３（２） 〕 ；２０：デ
タ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミノ酸１〜
５７ （１） ； ５８〜１２３ （２）〕；２１：ウ
シ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミノ酸１〜
５７ （１） ； ５８〜１２３ （２）］；２２：ヒ
ト・α−１−マイクログロブリン／インター−α−トリ
プシン抑制因子前駆体〔アミノ酸２２７〜２８３（１）
；２８４〜３５２ （２））；２３： ＴＦＩ Ｃアミ
ノ酸４７〜１１７ （１） ； １１８〜１８８ （２
） ； ２１０〜２８０（６）〕。
トリプシン抑制因子： ３：牛血清塩基性プロテアーゼ抑制因子；４：食用カタ
ツムリ・イン抑制因子： ５：紅海つミガメ塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｃ１〜７
９のアミノ酸のみ）： ６：ウェスタン・サンド毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ
抑制因子■； ７：リンガルス毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子■ ； ８：ケープ・コプラ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子■
： ９：ルツセル毒ヘビ毒の塩基性プロテアーゼ抑制因子Ｉ
Ｉ： １０：サンド毒ヘビ毎の塩基性プロテアーゼ抑制因子■
： １１ニイースタン・グリーン・マーンバ毒の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子■ホモローグ； １２ニブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｂ； １６：ブラック・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｅ： １４ニブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子Ｉ： １５ニブラツク・マーンバ毒の塩基性プロテアーゼ抑制
因子に： １６：β−１−プンガロトギシンＢ鎖（マイナー）：１
７：β−１−ブンガロトキシンＢ鎖（メジャー）；１８
：β−２−シンガロトキシンＢ鎖：１９：ウマ・インタ
ーα−トリプシン抑制因子〔アミ ） 酸 １ 〜５
７（１１；５８ 〜１２３（２） 〕 ；２０：デ
タ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミノ酸１〜
５７ （１） ； ５８〜１２３ （２）〕；２１：ウ
シ・インター−α−トリプシン抑制因子〔アミノ酸１〜
５７ （１） ； ５８〜１２３ （２）］；２２：ヒ
ト・α−１−マイクログロブリン／インター−α−トリ
プシン抑制因子前駆体〔アミノ酸２２７〜２８３（１）
；２８４〜３５２ （２））；２３： ＴＦＩ Ｃアミ
ノ酸４７〜１１７ （１） ； １１８〜１８８ （２
） ； ２１０〜２８０（６）〕。
最良のアラインメントを達成するためには１６゜ｊ７．
１８にギャップが含まれていた。
１８にギャップが含まれていた。
アミノ酸を示す標準的１文字コードを用いた。
第７図は、６個の肝由来セルラインから得たＲＮＡのノ
ーデン・プロット分析を示すっル−ン当シ１０μｇのポ
リ（Ａ）”ＲＮＡを用いた。
ーデン・プロット分析を示すっル−ン当シ１０μｇのポ
リ（Ａ）”ＲＮＡを用いた。
レーン１： Ｃｈａｎｇリバー細胞、
レーン２ ： ５Ｋ−ＨＥＰ−１へパトーマ細胞、レー
ン３：ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞。
ン３：ＨｅｐＧ２ヘパトーマ細胞。
本明細書においては、標準的生化学命名法を用いておシ
、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン（Ｔ）
ニゲアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ） トして表わされて
いる。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグアノ
シン−５１−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）である。Ｄ
ＮＡヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖のみで
示されておシ、１本鎖におけるＡはその相補性塩基とし
てＴを内包しておシ、ＧはＣを内包している。アミノ酸
は、以下の表に示すように１文字あるいは６文字で示さ
れている。
、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）；チミン（Ｔ）
ニゲアニン（Ｇ）；シトシン（Ｃ） トして表わされて
いる。対応するヌクレオチドは、例えばデオキシグアノ
シン−５１−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）である。Ｄ
ＮＡヌクレオチド配列は、便宜上慣用的に１本鎖のみで
示されておシ、１本鎖におけるＡはその相補性塩基とし
てＴを内包しておシ、ＧはＣを内包している。アミノ酸
は、以下の表に示すように１文字あるいは６文字で示さ
れている。
略 号 アミノ酸
Ａ Ａｌａ アラニンＣＣ７Ｂ
システィンＤＡ日ｐ
アスパラギン酸Ｅ Ｇｌｕ
グルタミン酸フ Ｆ Ｐｈｅ ／エニルアラニン
Ｇ Ｇ１７ グリシンＨＨｉｅ
ヒスチジンＩ Ｉｌｅ
イソロイシンＫ ＬＹ８
リシンＬ Ｌｅｕ
ロイシンＭ Ｍｅｔ メチオニン
ＮＡ日ｎ アスパラギンＰ Ｐｒｏ
プロリンＱ Ｇｌｎ
グルタミンＲＡｒｇ アル
ヤニン８ Ｓｅｒ セリン Ｔ ’ｒｈｒ スレオニンＶ Ｖ
ａｌ バリン Ｗ Ｔｒｐ トリシトファンＹ
Ｔｙｒ チロシン木切ｉ１書に
おいて記載される普通に入手し得る制限酵素は、以下に
示す制限配列及び開裂パターン（矢印で示した）を有し
ている。
システィンＤＡ日ｐ
アスパラギン酸Ｅ Ｇｌｕ
グルタミン酸フ Ｆ Ｐｈｅ ／エニルアラニン
Ｇ Ｇ１７ グリシンＨＨｉｅ
ヒスチジンＩ Ｉｌｅ
イソロイシンＫ ＬＹ８
リシンＬ Ｌｅｕ
ロイシンＭ Ｍｅｔ メチオニン
ＮＡ日ｎ アスパラギンＰ Ｐｒｏ
プロリンＱ Ｇｌｎ
グルタミンＲＡｒｇ アル
ヤニン８ Ｓｅｒ セリン Ｔ ’ｒｈｒ スレオニンＶ Ｖ
ａｌ バリン Ｗ Ｔｒｐ トリシトファンＹ
Ｔｙｒ チロシン木切ｉ１書に
おいて記載される普通に入手し得る制限酵素は、以下に
示す制限配列及び開裂パターン（矢印で示した）を有し
ている。
↓
ＴＴＡＡＧ
↑
↓
ＴＡＴＡＡ
↑
↓
ＡＧＣＴＡ
↑
↓
ＣＧＡ
↑
↓
↑
本発明の好ましい態様を更に詳細に説明するために、以
下に記述する実、験を実施した。
下に記述する実、験を実施した。
例 １
材 料
ヒト胎盤及び胎児肝ｃ ＤＮＡライブラリーをＣ１ｏｎ
ｅｔｅｃｈから得た。プロトプロット（ｐｒｏｔｏｂｌ
ｏｔ）・イムノスクリーニング・キットはＰｒｏｍｅｇ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。制限酵素はＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。牛腸アル
カリ・ホスファターゼ、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポ
リメラーゼ■（クレノー）、エキソヌクレアーゼＩ及び
Ｓ１ヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍから購入した。 ｄＮＴＰはＰ、Ｌ、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。５’−（ａ −”Ｓ
］−］チオーｄＡＴＰ（６００Ｃｉ／ ｍ ｍｏｌ ）
はＡｍｅ ｒ ｓ ｈａｍから購入した。配列決定用キ
ット（５ｅｑｖｅｎａｓｅ ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａ
ｔｅ８Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌａから購入した。Ｃｈ
ａｎｇリバー細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ １３ ）及びＨｅ
ｐＧ２ヘパトーマ細胞（ＡＴＣＣＨＢ ８０６５ ）は
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから
得り。５Ｋ−ＨＥＰ−ｉヘパトー７細胞は−Ｓｌｏａｎ
−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｆｏｒ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈのＧ、 Ｔｒｅｍｐｅに
よって１９７１年に肝アデノカルシノーマから誘導され
たものであり、現在で広く容易に入手可能である。
ｅｔｅｃｈから得た。プロトプロット（ｐｒｏｔｏｂｌ
ｏｔ）・イムノスクリーニング・キットはＰｒｏｍｅｇ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。制限酵素はＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。牛腸アル
カリ・ホスファターゼ、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポ
リメラーゼ■（クレノー）、エキソヌクレアーゼＩ及び
Ｓ１ヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍから購入した。 ｄＮＴＰはＰ、Ｌ、 Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。５’−（ａ −”Ｓ
］−］チオーｄＡＴＰ（６００Ｃｉ／ ｍ ｍｏｌ ）
はＡｍｅ ｒ ｓ ｈａｍから購入した。配列決定用キ
ット（５ｅｑｖｅｎａｓｅ ）はＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａ
ｔｅ８Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌａから購入した。Ｃｈ
ａｎｇリバー細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ １３ ）及びＨｅ
ｐＧ２ヘパトーマ細胞（ＡＴＣＣＨＢ ８０６５ ）は
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから
得り。５Ｋ−ＨＥＰ−ｉヘパトー７細胞は−Ｓｌｏａｎ
−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｆｏｒ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈのＧ、 Ｔｒｅｍｐｅに
よって１９７１年に肝アデノカルシノーマから誘導され
たものであり、現在で広く容易に入手可能である。
１２５ニー第Ｘａ因子は、ヨード源を用いて放射標械す
ることによシ調製した。この比活性は２０００ｄｐｍ
／ ｎｇであった。放射活性の９７チ以上は１０％トリ
クロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈澱可能であった。ヨード
化蛋白は、５ｅｐｅｃｔ、ｒｏｚｙｍｅＸａ （Ａｍｅ
ｒｉ−Ｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ製）に対してそ
の触媒活性を８０％以上保持していた。
ることによシ調製した。この比活性は２０００ｄｐｍ
／ ｎｇであった。放射活性の９７チ以上は１０％トリ
クロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈澱可能であった。ヨード
化蛋白は、５ｅｐｅｃｔ、ｒｏｚｙｍｅＸａ （Ａｍｅ
ｒｉ−Ｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ製）に対してそ
の触媒活性を８０％以上保持していた。
抗−ＴＦＩ（ｇセファロ−昶４Ｂカラムは以下のように
して調製した。即ち、成熟ＴＦＩのアミノ酸３−２５の
配列に相当する配列を含むペプチド（ＴＦエニープチド
）を、Ｂｉｏ８ｙｅｔｅｍの固相ペプチド合成システム
を用いて合成した。ＴＦＩ−ペプチド（５ｍ９）を、グ
ルタルアルデヒドによシキーホール（Ｋｅｙｈｏｌｅ
）−リンペット（ユｙｍｐｅｔ） −ヘモシアニン１０
叩に結合させてコンシュデートを調製した５２匹のＮｅ
ｗ Ｚｅａｌａｎｄホワイト・ラビットに、フロイント
・完全・アジュバント１Ｍと、上記コンシュデート１プ
（ＴＦＩ−ペプチド２００μｇ）を含むホモジエネート
を皮肉注射して、それぞれ免疫化した。１チ月後に、フ
ロイント・不完全・アジュバント１１１１ノとコンシュ
デー） ｉ ―（ＴＦ’Ｉ −ペプチｒ１００μｇ）を
含むホモジエネートで、２匹のラビットをそれぞれブー
スターした。３チ月の間、１週間毎に抗血清を採取し、
１チ月毎にブースター注射を行なった。ＴＦＩ−ペプチ
ドに対する特異的抗体を単離するため釦、抗血清をＴＦ
Ｉ−ペプチドセファロース４Ｂカラムを用いたクロマト
グラフィーに付した。カラムを、１０倍量のＰＢＳ （
０，４Ｍ ＮａＣ１−０，１Ｍベンズアミジン−１チ
ト リ ト ン■ Ｘ１００） 及 び ト
リ ト ン ｘ−ｉｏ。
して調製した。即ち、成熟ＴＦＩのアミノ酸３−２５の
配列に相当する配列を含むペプチド（ＴＦエニープチド
）を、Ｂｉｏ８ｙｅｔｅｍの固相ペプチド合成システム
を用いて合成した。ＴＦＩ−ペプチド（５ｍ９）を、グ
ルタルアルデヒドによシキーホール（Ｋｅｙｈｏｌｅ
）−リンペット（ユｙｍｐｅｔ） −ヘモシアニン１０
叩に結合させてコンシュデートを調製した５２匹のＮｅ
ｗ Ｚｅａｌａｎｄホワイト・ラビットに、フロイント
・完全・アジュバント１Ｍと、上記コンシュデート１プ
（ＴＦＩ−ペプチド２００μｇ）を含むホモジエネート
を皮肉注射して、それぞれ免疫化した。１チ月後に、フ
ロイント・不完全・アジュバント１１１１ノとコンシュ
デー） ｉ ―（ＴＦ’Ｉ −ペプチｒ１００μｇ）を
含むホモジエネートで、２匹のラビットをそれぞれブー
スターした。３チ月の間、１週間毎に抗血清を採取し、
１チ月毎にブースター注射を行なった。ＴＦＩ−ペプチ
ドに対する特異的抗体を単離するため釦、抗血清をＴＦ
Ｉ−ペプチドセファロース４Ｂカラムを用いたクロマト
グラフィーに付した。カラムを、１０倍量のＰＢＳ （
０，４Ｍ ＮａＣ１−０，１Ｍベンズアミジン−１チ
ト リ ト ン■ Ｘ１００） 及 び ト
リ ト ン ｘ−ｉｏ。
を含まない同様の溶液で洗った。０．１Ｍグリシン／Ｈ
ＣＪ、、ｐ１４２．２で抗体を溶出させ、直ちにシ、。
ＣＪ、、ｐ１４２．２で抗体を溶出させ、直ちにシ、。
倍量の１Ｍトリス−０Ｔ（を加えて中和し、次いで食°
塩水に対して透析した。単離された抗体を、シアノデン
・ブロマイドで活性化させたセファロース４Ｂに製造業
者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の指針に従って結合させ、こ
れを細胞培善培地からのＴＦＩＯ単離に用いたつ Ｃｈａｎｇリバー細胞を、ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉＣ
ｈ、 Ｐｒｏｃ。
塩水に対して透析した。単離された抗体を、シアノデン
・ブロマイドで活性化させたセファロース４Ｂに製造業
者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の指針に従って結合させ、こ
れを細胞培善培地からのＴＦＩＯ単離に用いたつ Ｃｈａｎｇリバー細胞を、ＢｒｏｚｅとＭｉｌｅｔｉＣ
ｈ、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８４． １
８８６〜１８９０（１９８７）Ｋ記載さ・れた方法に従
って培養した。
８８６〜１８９０（１９８７）Ｋ記載さ・れた方法に従
って培養した。
ならし培地を、抗−ＴＦＩ−Ｉｇセファロース４Ｂカラ
ムを用いたクロマトグラフィーに付した。次いで力′ラ
ムを、１０倍量のＰＢＳ −１％トリトンＸ−１００と
ＰＥＳで洗った。結合したＴＦｒを０．１Ｍグリシン／
ＨＣ１、Ｐ！１２．２で溶出した。イムノ・アフィニテ
ィーによυ単離したＴＦ、■を更に分離用ナトリウム・
ドデシルスルフェート・ポリアクリルアミげケ９ル電気
泳動（５ａｖａｎｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ ）によシ精
製した。最終取得物のアミノ酸を分析した所、米国同時
係属出９ Ｓｅｒ、 ＊ ７７，３６６号明細書（出願
臼： １９８７年７月２６日）に記載されたＨｅｐ Ｇ
２細胞から単離したＴＦＩと同様のＮ末端アミノ酸配
列を有していたつ単離したＣｈａｎｇ ＩＪバーＴＦ工
を用いて、上記したと同じ免疫化プロトコールによシラ
ビットを免疫化した。得られた抗血清は、２重免疫拡散
法テストで約１００μｇ ／ ｍｌの力価を示した。こ
の抗血清を用いてλｇｔ １ｉ ｃＤＮＡライブラリー
のイムノ・スクリーニングを行なった。
ムを用いたクロマトグラフィーに付した。次いで力′ラ
ムを、１０倍量のＰＢＳ −１％トリトンＸ−１００と
ＰＥＳで洗った。結合したＴＦｒを０．１Ｍグリシン／
ＨＣ１、Ｐ！１２．２で溶出した。イムノ・アフィニテ
ィーによυ単離したＴＦ、■を更に分離用ナトリウム・
ドデシルスルフェート・ポリアクリルアミげケ９ル電気
泳動（５ａｖａｎｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ ）によシ精
製した。最終取得物のアミノ酸を分析した所、米国同時
係属出９ Ｓｅｒ、 ＊ ７７，３６６号明細書（出願
臼： １９８７年７月２６日）に記載されたＨｅｐ Ｇ
２細胞から単離したＴＦＩと同様のＮ末端アミノ酸配
列を有していたつ単離したＣｈａｎｇ ＩＪバーＴＦ工
を用いて、上記したと同じ免疫化プロトコールによシラ
ビットを免疫化した。得られた抗血清は、２重免疫拡散
法テストで約１００μｇ ／ ｍｌの力価を示した。こ
の抗血清を用いてλｇｔ １ｉ ｃＤＮＡライブラリー
のイムノ・スクリーニングを行なった。
方法
ｃＤＮＡクローンの単離
抗体を用いた胎盤及び胎児肝ｃＤＮＡのスクリ−ニング
法、プラーク精製法及びλ−ファージ溶解物とＤＮＡの
ｉＵＬＭ法はＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ、 ＦＥＢＳ
ＬＥＴＴ。
法、プラーク精製法及びλ−ファージ溶解物とＤＮＡの
ｉＵＬＭ法はＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ、 ＦＥＢＳ
ＬＥＴＴ。
１．１１〜１６（１９８７）に記載されている。
抗血清にあらかじめＢＮＮ ９７λｇｔ１１溶解物を吸
着させ、ライブラリーのスクリーニング用に１１５００
に希釈した。
着させ、ライブラリーのスクリーニング用に１１５００
に希釈した。
第Ｘａ因子結合活性のスクリーニング
インゾロピル−β−チオガラクトシドによってイムノ・
ポジティブオーファージ溶解物あるいはコントロールλ
ｇｔ １ ’Ｉから誘導される組換え蛋白について、そ
の第Ｘａ因子結合活性をスクリーニングした。λ−ファ
ージ溶解物（Ｑ、１ｍｌ ）は、ドツト−プロット装置
（Ｂｉ、ｏ Ｒａｄ）を用いてニトロセルロースペーパ
ーで濾過したつ次いでニトロセルロースペーパーを、５
■／ ｍｌ牛血清アルブミン及び２．５Ｔｎ９／ｍｌ牛
ガンマグロブリンを含むリンＣ１％衝化食塩水に浸し、
室温で１時間激しく攪拌したつ次いで、Ｑ、１ｒｎｅ）
／ ｒｎｌヘパリンを添加した同様の溶液に更に１２
５１＝第）（ａ因子（１，Ｏｘ １０’ ｃｍｐ／ｄ）
を酵解した＃液で置換し、更に１時間激しく攪拌した。
ポジティブオーファージ溶解物あるいはコントロールλ
ｇｔ １ ’Ｉから誘導される組換え蛋白について、そ
の第Ｘａ因子結合活性をスクリーニングした。λ−ファ
ージ溶解物（Ｑ、１ｍｌ ）は、ドツト−プロット装置
（Ｂｉ、ｏ Ｒａｄ）を用いてニトロセルロースペーパ
ーで濾過したつ次いでニトロセルロースペーパーを、５
■／ ｍｌ牛血清アルブミン及び２．５Ｔｎ９／ｍｌ牛
ガンマグロブリンを含むリンＣ１％衝化食塩水に浸し、
室温で１時間激しく攪拌したつ次いで、Ｑ、１ｒｎｅ）
／ ｒｎｌヘパリンを添加した同様の溶液に更に１２
５１＝第）（ａ因子（１，Ｏｘ １０’ ｃｍｐ／ｄ）
を酵解した＃液で置換し、更に１時間激しく攪拌した。
次いでニトロセルロースペーパーを、０・Ｑ ５ ％
Ｔｗｅｅｎ［Ｆ］２０を含むリン酸緩衝化食塩水で洗っ
た。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換した。
Ｔｗｅｅｎ［Ｆ］２０を含むリン酸緩衝化食塩水で洗っ
た。洗浄緩衝液を５分毎に４回交換した。
次いでニトロセルロースペーパーを空気中で乾燥し、Ｋ
ｏｄａｋ ＸＲ５ｎフイルムを用いてオートラジオグラ
フィー用に調製した。フィルムを一１週間さらした後に
現像した。
ｏｄａｋ ＸＲ５ｎフイルムを用いてオートラジオグラ
フィー用に調製した。フィルムを一１週間さらした後に
現像した。
ポリ■＋ＲＮＡの調製及びノーデン・プロッティング
ＬｉＺａｒｄｉとＥｎｇｅｌｂｅｒｇのナトリウム書バ
ークロレート抽出法（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
９８９ １１６ Ｎ１２２、（１９７９）〕によシ、培
養したＣｈａｎｇリバー細胞、ＨｅｐＧ ２ヘパトーマ
細胞及び５Ｋ−）（ＢＰ−１へパトーマ細胞から全ＲＮ
Ａを調製した。製造業者の指針に従い、オリ−？ （ｄ
Ｔ）−セルロース（Ｐ−Ｉ。
ークロレート抽出法（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
９８９ １１６ Ｎ１２２、（１９７９）〕によシ、培
養したＣｈａｎｇリバー細胞、ＨｅｐＧ ２ヘパトーマ
細胞及び５Ｋ−）（ＢＰ−１へパトーマ細胞から全ＲＮ
Ａを調製した。製造業者の指針に従い、オリ−？ （ｄ
Ｔ）−セルロース（Ｐ−Ｉ。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 、タイ７°７７Ｆ）へのパッ
チ吸着によシボリ（Ａ）”ＲＮＡを単離した。ノーデン
・プロット分析用に、それぞれのポリ■“ＲＮＡ １［
１μｇをグリオキサールで処理しく Ｔｈｏｍａｓ、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ’Ｅｎｚｙｍｏｌ。
チ吸着によシボリ（Ａ）”ＲＮＡを単離した。ノーデン
・プロット分析用に、それぞれのポリ■“ＲＮＡ １［
１μｇをグリオキサールで処理しく Ｔｈｏｍａｓ、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ’Ｅｎｚｙｍｏｌ。
１ ００、 ２５５〜２６６（１９８３））、 １Ｑｍ
Ｍリン酸ナトリウム、ｐ）１７．０を含む緩衝液でアガ
ロースデル電気泳動に付した。 Ｂｅｔｈｅ８ｄａ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＲＮＡラダー（
ｌａｄｄｅｒ）を分子量マーカーとして用いた。１１（
ＮＡをニトロセルロースペーパー上にプロットし、次い
で８０℃で２時間焼いた。λＰ９クローンのインサート
ＤＮＡを、ニックトランスレーションにより３２Ｐで放
射標識化し、プローブとして用いた（ Ｍａｎｉａｔｉ
θら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｄｅｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ
−＋ （１９８２） ］ ｏ ５０チホルムアミド、
５．Ｘ ＳＳＣ’、 ５０ ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐｉ−１７，０，２５０Ｉｇ／プ変性サケスペルマＤＮ
Ａ及び１Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ溶液を含む溶液５−中のプ
ローブ（５ｘ １０’ ｃｐｍ ）で４２°Ｃで１６時
間ハイブリダイズさせた。フィルターを、０．１％ナト
リウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ） 、２ Ｘ Ｓ
ＳＳで室温で３回、それぞれ５分間洗った。次いでニト
ロセルロースペーパーを空気中で乾燥し、 Ｋｏｄａｋ
ＭＡＲ−５フイルム及び増感板を用いて一７０℃で６日
間オートラジオグラフィーに付した。
Ｍリン酸ナトリウム、ｐ）１７．０を含む緩衝液でアガ
ロースデル電気泳動に付した。 Ｂｅｔｈｅ８ｄａ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＲＮＡラダー（
ｌａｄｄｅｒ）を分子量マーカーとして用いた。１１（
ＮＡをニトロセルロースペーパー上にプロットし、次い
で８０℃で２時間焼いた。λＰ９クローンのインサート
ＤＮＡを、ニックトランスレーションにより３２Ｐで放
射標識化し、プローブとして用いた（ Ｍａｎｉａｔｉ
θら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｄｅｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ
−＋ （１９８２） ］ ｏ ５０チホルムアミド、
５．Ｘ ＳＳＣ’、 ５０ ｍＭリン酸ナトリウム、
ｐｉ−１７，０，２５０Ｉｇ／プ変性サケスペルマＤＮ
Ａ及び１Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄ溶液を含む溶液５−中のプ
ローブ（５ｘ １０’ ｃｐｍ ）で４２°Ｃで１６時
間ハイブリダイズさせた。フィルターを、０．１％ナト
リウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ） 、２ Ｘ Ｓ
ＳＳで室温で３回、それぞれ５分間洗った。次いでニト
ロセルロースペーパーを空気中で乾燥し、 Ｋｏｄａｋ
ＭＡＲ−５フイルム及び増感板を用いて一７０℃で６日
間オートラジオグラフィーに付した。
クローン化λｇｔ １１ ＤＮＡの調製、ｐＵＣ１９プ
ラスミド及びＭ１３ｍｐ１８ベクメーでのサブクローニ
ング、エヤソヌクレアーゼ■を用いた消化による欠失、
及びジブオキ法によるＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇｅｒら
、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ Ｆ３３゜６７７６〜６７８０（１９７７））は、
ＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ、 ＦＥＢＳＬｅｔｔ、 １
＊ １１−１６ （１９８７）に記載された方法に従
って実施した。
ラスミド及びＭ１３ｍｐ１８ベクメーでのサブクローニ
ング、エヤソヌクレアーゼ■を用いた消化による欠失、
及びジブオキ法によるＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇｅｒら
、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ Ｆ３３゜６７７６〜６７８０（１９７７））は、
ＷｕｎとＫｒｅｔｚｍｅｒ、 ＦＥＢＳＬｅｔｔ、 １
＊ １１−１６ （１９８７）に記載された方法に従
って実施した。
ＬｉｐｍａｍとＰｅａｒ８ｏｎによって書かれたプログ
ラムＦＡＳＴＰ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２２７．１４５５
〜１４４１（１９８５）］を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ
ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎ
ｄａｔｉｏｎの配列データバンク（レリース１３，１９
８．７年６月）から相同性を示す蛋白のファミリーを同
定し、該ファミリー内で配列のアラインメントを行なっ
た。
ラムＦＡＳＴＰ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２２７．１４５５
〜１４４１（１９８５）］を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ
ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎ
ｄａｔｉｏｎの配列データバンク（レリース１３，１９
８．７年６月）から相同性を示す蛋白のファミリーを同
定し、該ファミリー内で配列のアラインメントを行なっ
た。
結果
多数のセルラインについて、そのならし培地中にＴＦＩ
が存在するか否かをスクリーニングしたういくつかの肝
由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ ２
ヘパトーマ及び５Ｋ−ＨＥＰ−１へパトーマが培地中に
ＴＦＩを分泌することが見出された。初めに、ＴＦＩに
対する抗血清を用いてヒト胎児肝λｇｔｌ ｌ ｃＤＮ
Ａライブラリー（１０６プラーク・フォーミング・ユニ
ット）をスクリーニングし、１５個の免疫学的にポジテ
ィブなりローンが得られた。
が存在するか否かをスクリーニングしたういくつかの肝
由来セルライン、即ちＣｈａｎｇリバー、ＨｅｐＧ ２
ヘパトーマ及び５Ｋ−ＨＥＰ−１へパトーマが培地中に
ＴＦＩを分泌することが見出された。初めに、ＴＦＩに
対する抗血清を用いてヒト胎児肝λｇｔｌ ｌ ｃＤＮ
Ａライブラリー（１０６プラーク・フォーミング・ユニ
ット）をスクリーニングし、１５個の免疫学的にポジテ
ィブなりローンが得られた。
次いで同様の方法によシ胎盤λｇｔ １１ ＣＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングした。１０６ゾラーク・フ
ォーミング・ユニットのうち１０個の免疫学的にポジテ
ィブなりローンが得られた。これらのクローンをプラー
ク精製し、精製クローンの容解物についてＴＦＩのｆｌ
１ｊ１：活性をテストした。イソプロピルチオガラク
トシドで銹導したファージの醇解物ヲ＝）ロセルロース
ペーパーに吸着せしめ、１２６■〜第Ｘａ因子結合活性
をスクリーニングしたつ上ｔｉ己の免疫学的にポジティ
ブなりローンのいくつかハ、ニトロセルロースペーパー
上の１２５Ｉ −ｊＸ Ｘａ内因子結合する能力を示し
たことが、第１図によシ＃ｌ″明されている。免疫学的
にポジティブな胎児肝クローン１５個のうち６個、及び
免疫学的にポジティブな胎盤クローン１０個のうち４個
のクローンが１２５ニ一第Ｘａ因子結合活性を示した。
イブラリーをスクリーニングした。１０６ゾラーク・フ
ォーミング・ユニットのうち１０個の免疫学的にポジテ
ィブなりローンが得られた。これらのクローンをプラー
ク精製し、精製クローンの容解物についてＴＦＩのｆｌ
１ｊ１：活性をテストした。イソプロピルチオガラク
トシドで銹導したファージの醇解物ヲ＝）ロセルロース
ペーパーに吸着せしめ、１２６■〜第Ｘａ因子結合活性
をスクリーニングしたつ上ｔｉ己の免疫学的にポジティ
ブなりローンのいくつかハ、ニトロセルロースペーパー
上の１２５Ｉ −ｊＸ Ｘａ内因子結合する能力を示し
たことが、第１図によシ＃ｌ″明されている。免疫学的
にポジティブな胎児肝クローン１５個のうち６個、及び
免疫学的にポジティブな胎盤クローン１０個のうち４個
のクローンが１２５ニ一第Ｘａ因子結合活性を示した。
これらの免疫学的に且つ機能的にポジティブなりローン
をＥｃｏＲＩで消化し、インサート配列のサイズをケ９
ル電気泳動により調べた。胎盤ライブラリー（λＰ９）
から得た１つのクローンは約１．４ｋｂのインサート配
列を有して＄−シ、他のすべてのクローンは約１．０ｋ
ｂのインサート配列を有していた。
をＥｃｏＲＩで消化し、インサート配列のサイズをケ９
ル電気泳動により調べた。胎盤ライブラリー（λＰ９）
から得た１つのクローンは約１．４ｋｂのインサート配
列を有して＄−シ、他のすべてのクローンは約１．０ｋ
ｂのインサート配列を有していた。
部分的ＤＮＡ配列決定により、ｉ、Ｑｋｂクローンはよ
υ長い１．４ｋｂＪ１ｍ盤クローンの１部分の配列と同
じ配列を有していることが判った。従って、完全なりＮ
Ａ配列決定を行なうためにλＰ９を選択した。
υ長い１．４ｋｂＪ１ｍ盤クローンの１部分の配列と同
じ配列を有していることが判った。従って、完全なりＮ
Ａ配列決定を行なうためにλＰ９を選択した。
白配列
λＰ９クローンについて、制限酵素地図の作成、Ｍ１３
サブクローニング及び第２因に示した技法を用いた配列
決定を実施した。エキソヌクレアーゼ遥欠失法ＣＨｅｎ
１ｋｏｆｆ、 ａＯＱｅ ２８＋ ３５１〜６５９（
１９８４））によシ、２本のストランドの両者について
全配列を決定し、１４６２個の塩基からなることが見出
された。その配列は第３図に示した通シである。該配列
には、１３３塩基の５′非コード領域、９１２ヌクレオ
チドのオープン・リーディング・フレーム及び６８７ヌ
クレオチドの６′非コード領域が含まれている。最初の
ＡＴＧはＴＡＧＡＴＧＡ配列中のヌクレオチド１３４に
ちゃ、その直ぐ後のＡＣＡＡＴＧＡ配列中のヌクレオチ
ド１４６に第２のＡＴＧがある。真核細胞のりボデーム
によってイニシエートされるためのコンセンサス配列と
して提案された配列、ＡＣＣＡＴＧＧ （Ｋｏｚａｋ、
Ｃｅ１ｌ。
サブクローニング及び第２因に示した技法を用いた配列
決定を実施した。エキソヌクレアーゼ遥欠失法ＣＨｅｎ
１ｋｏｆｆ、 ａＯＱｅ ２８＋ ３５１〜６５９（
１９８４））によシ、２本のストランドの両者について
全配列を決定し、１４６２個の塩基からなることが見出
された。その配列は第３図に示した通シである。該配列
には、１３３塩基の５′非コード領域、９１２ヌクレオ
チドのオープン・リーディング・フレーム及び６８７ヌ
クレオチドの６′非コード領域が含まれている。最初の
ＡＴＧはＴＡＧＡＴＧＡ配列中のヌクレオチド１３４に
ちゃ、その直ぐ後のＡＣＡＡＴＧＡ配列中のヌクレオチ
ド１４６に第２のＡＴＧがある。真核細胞のりボデーム
によってイニシエートされるためのコンセンサス配列と
して提案された配列、ＡＣＣＡＴＧＧ （Ｋｏｚａｋ、
Ｃｅ１ｌ。
４４．２８３〜２９２（１９８２）］とは、上記の配列
は異なるが、これらはイニシェーション配列と考えられ
る。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に２８個のア
ミノ酸配列がある。これら２８個のアミノ酸からなる疎
水性セグメントの組成及び長さは、シグナルペプチドに
典型的なものであるＣ Ｖｏｎ Ｈｅ１ｊｎｅ、 Ｅｕ
ｒ、 Ｊ、 ＢｉｏＣｈｅｍ、 １３３ 。
は異なるが、これらはイニシェーション配列と考えられ
る。成熟蛋白のＮ末端に相当する配列の前に２８個のア
ミノ酸配列がある。これら２８個のアミノ酸からなる疎
水性セグメントの組成及び長さは、シグナルペプチドに
典型的なものであるＣ Ｖｏｎ Ｈｅ１ｊｎｅ、 Ｅｕ
ｒ、 Ｊ、 ＢｉｏＣｈｅｍ、 １３３ 。
１７〜２１ （１９８３） ；ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、
１８４゜９９〜１０５（１９８５））。シグナルペプ
チドはＡ１ａ２Ｂ −Ａ１３ｐ２９で開裂し、成熟蛋白
を与えると考えられる。成熟ＴＦＩとして予想されるア
ミノ酸配列Ｕ、ＩＥｈ＋ｍのシスティン残基及び７個の
メチオニンを含む２７６個のアミノ酸からなる。成熟Ｔ
ＦＩの推定蛋白配列に基いて計算される分子量３）．９
５０ダルトンは、単離して得た蛋白についてナトリウム
ドデシルスルフエートポリアクリルアミタデル電気泳動
で調べた分子量３７〜４０ｋＤａよりもいく分車さい。
１８４゜９９〜１０５（１９８５））。シグナルペプ
チドはＡ１ａ２Ｂ −Ａ１３ｐ２９で開裂し、成熟蛋白
を与えると考えられる。成熟ＴＦＩとして予想されるア
ミノ酸配列Ｕ、ＩＥｈ＋ｍのシスティン残基及び７個の
メチオニンを含む２７６個のアミノ酸からなる。成熟Ｔ
ＦＩの推定蛋白配列に基いて計算される分子量３）．９
５０ダルトンは、単離して得た蛋白についてナトリウム
ドデシルスルフエートポリアクリルアミタデル電気泳動
で調べた分子量３７〜４０ｋＤａよりもいく分車さい。
この分子量の相違は、天然蛋白でのグリコシル化の移動
性を反映したものと考えられる。成熟蛋白に相当する推
定蛋白配列は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの構成を有
する３ケのＮ−結合グリコシル化部位（アミノ酸の位置
１４５゜１９５及び２５６）を有している。、精製した
全長ＴＦＩ及び加水分解された２つの単離体のアミノ酸
分析の１πη果は、ｃＤＮＡ配列から推定される蛋白配
列（第６図の下線を引いた部分）と正確にマツチする。
性を反映したものと考えられる。成熟蛋白に相当する推
定蛋白配列は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの構成を有
する３ケのＮ−結合グリコシル化部位（アミノ酸の位置
１４５゜１９５及び２５６）を有している。、精製した
全長ＴＦＩ及び加水分解された２つの単離体のアミノ酸
分析の１πη果は、ｃＤＮＡ配列から推定される蛋白配
列（第６図の下線を引いた部分）と正確にマツチする。
このことは、単離したｃ ＤＮＡクローンはＴＦＩをコ
ードしていることを示している。６／非コード領域はＡ
＋Ｔを豊富に含んでいる（７０％Ａ＋Ｔ ）。
ードしていることを示している。６／非コード領域はＡ
＋Ｔを豊富に含んでいる（７０％Ａ＋Ｔ ）。
このクローンには、コンセンサス・ホリアデニル化シグ
ナル、ＡＡＴん！ＬＡ 〔ＰｒｏｕｄｆｏｏｔとＢ ｒ
ＯＷｎ Ｉ Ｅ３ ｅ ｔＮａｔｕｒｅ、 ２５２
、５５９〜３６２（１９８１）”］も、ポリＡテイルも
見出されなかった。これは、ライブラリー構築の間に６
／末端部分の１部分が失なわれたためと考えられるう ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列には、２７リシン、１
７アルギニン、１１アスパラギン酸及び２５グルタミン
酸が含まれている。蛋白てそった電荷分布は第４図に示
したようにかなシ高低のあるものである。シグナルペプ
チド領域には、２６個の中性残基とともに２個のプラス
に荷電したりシンが含まれていた。成熟蛋白のアミン末
端領域には、高度にマイナスに荷電した配列が含まれて
いたつ最初の７個の残基のうち６個はアスパラゼン酸め
るいはグルタミン酸であシ、この後例更に高度にマイナ
スに荷電した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり
、その後にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部
分は一般的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端
には高度にプラスに荷電したセグメントがある。、ＴＦ
Ｉのアミノ酸２６５〜２９６には、６−共役アルギニン
＋リシン残基を含むプラスに荷電した１４個のアミノ酸
がおる。
ナル、ＡＡＴん！ＬＡ 〔ＰｒｏｕｄｆｏｏｔとＢ ｒ
ＯＷｎ Ｉ Ｅ３ ｅ ｔＮａｔｕｒｅ、 ２５２
、５５９〜３６２（１９８１）”］も、ポリＡテイルも
見出されなかった。これは、ライブラリー構築の間に６
／末端部分の１部分が失なわれたためと考えられるう ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列には、２７リシン、１
７アルギニン、１１アスパラギン酸及び２５グルタミン
酸が含まれている。蛋白てそった電荷分布は第４図に示
したようにかなシ高低のあるものである。シグナルペプ
チド領域には、２６個の中性残基とともに２個のプラス
に荷電したりシンが含まれていた。成熟蛋白のアミン末
端領域には、高度にマイナスに荷電した配列が含まれて
いたつ最初の７個の残基のうち６個はアスパラゼン酸め
るいはグルタミン酸であシ、この後例更に高度にマイナ
スに荷電した２個のアミノ酸のダウンストリームがあり
、その後にプラスに荷電したリシン残基がある。中心部
分は一般的にマイナスに荷電している。カルボキシ末端
には高度にプラスに荷電したセグメントがある。、ＴＦ
Ｉのアミノ酸２６５〜２９６には、６−共役アルギニン
＋リシン残基を含むプラスに荷電した１４個のアミノ酸
がおる。
ＴＦＩ蛋白の予想疎水性／Ｒ水性プロファイルは第５図
に示した通）であろうシグナルペゾチドには、予想され
たように高度に疎水性の領域が含まれている。残りの部
分はむしろ親水性である。
に示した通）であろうシグナルペゾチドには、予想され
たように高度に疎水性の領域が含まれている。残りの部
分はむしろ親水性である。
ＴＦＩの翻訳されたアミノ酸配列には、いくつかの区別
し得るドメインが含まれている。高度にマイナスに荷電
したＮ末端ドメイン及び高度にグラスに荷電したＣ末端
ドメインに加えて、Ｋｕｎｉｔｚ型抑制因子の典型的配
列（下記参照）を有する３個の相同ドメインからなる中
心部分がある。
し得るドメインが含まれている。高度にマイナスに荷電
したＮ末端ドメイン及び高度にグラスに荷電したＣ末端
ドメインに加えて、Ｋｕｎｉｔｚ型抑制因子の典型的配
列（下記参照）を有する３個の相同ドメインからなる中
心部分がある。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅ
５ｅａｒＣｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの配列データベ
ースを調べた所、ＴＦＩのＮ末端ドメインとＣ末端ドメ
インとは、他の公知蛋白と有意な相同性を有していない
ことが見出された。しかしながら、３個の内部相同ドメ
インは、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプロチ
ニン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター−α
−トリノシン抑制因子（第６図）などの他の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示した。こ
れらすべての抑制因子にはジスルフィド結合構造が高度
に保持されておシ、これは注目すべき事実である。これ
らの相同性から明らかなように、ＴＦＩは塩基性プロテ
アーゼ抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属する。
５ｅａｒＣｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの配列データベ
ースを調べた所、ＴＦＩのＮ末端ドメインとＣ末端ドメ
インとは、他の公知蛋白と有意な相同性を有していない
ことが見出された。しかしながら、３個の内部相同ドメ
インは、牛膵臓塩基性プロテアーゼ抑制因子（アプロチ
ニン）、毒塩基性プロテアーゼ抑制因子、インター−α
−トリノシン抑制因子（第６図）などの他の塩基性プロ
テアーゼ抑制因子の配列とそれぞれ相同性を示した。こ
れらすべての抑制因子にはジスルフィド結合構造が高度
に保持されておシ、これは注目すべき事実である。これ
らの相同性から明らかなように、ＴＦＩは塩基性プロテ
アーゼ抑制因子遺伝子スーパーファミリーに属する。
ノーデン・プロツテング
’ｆｆｒ産生肝産生上由来セルラインＣｈａｎｇリバー
、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及び５Ｋ−ＨＥＰ−ｉ ヘパト
ーマ細胞からポリ（Ａ）”ＲＮＡを精製した。変性アガ
ロースデル電気泳動によシポリ（Ａ）”ＲＮＡを溶解し
、ニトロセルロースペーパー上にプロットし、３２Ｐ−
標識化’ｒＦｒ ＣＤＮＡ （λＰ９）をプローブとし
て用いて調べた。第７図に示したように、２つの主要な
ハイブリダイゼーションバンドが観察された。これらは
テストした６つの全てのセルラインに見られる１、４ｋ
ｂｍＲＮＡ及び４．４ ｋｂｍＲＮＡに対応するもので
ある。検出し得る厳のＴＦＩを産生しない他のセルライ
ンについてテストしたが、プローブとのハイブリダイゼ
ーションは観察されなかった（データを示していない）
。
、ＨｅｐＧ２ヘパトーマ及び５Ｋ−ＨＥＰ−ｉ ヘパト
ーマ細胞からポリ（Ａ）”ＲＮＡを精製した。変性アガ
ロースデル電気泳動によシポリ（Ａ）”ＲＮＡを溶解し
、ニトロセルロースペーパー上にプロットし、３２Ｐ−
標識化’ｒＦｒ ＣＤＮＡ （λＰ９）をプローブとし
て用いて調べた。第７図に示したように、２つの主要な
ハイブリダイゼーションバンドが観察された。これらは
テストした６つの全てのセルラインに見られる１、４ｋ
ｂｍＲＮＡ及び４．４ ｋｂｍＲＮＡに対応するもので
ある。検出し得る厳のＴＦＩを産生しない他のセルライ
ンについてテストしたが、プローブとのハイブリダイゼ
ーションは観察されなかった（データを示していない）
。
本明細書の記載から、当業者にとっては本発明の思想及
び範囲内にある他の各種の例が自明であろう。これらの
例の全ては本明細書のクレームのａ曲内のものである。
び範囲内にある他の各種の例が自明であろう。これらの
例の全ては本明細書のクレームのａ曲内のものである。
ｖＪ１図は、１２５Ｔ−第）（ａ因子を用イア’（λｇ
ｔ１１クローンのスクリーニングを示した写真である。 ＠２図は、部分的制限酵素地図及びλＰ９のインサート
配列の配列決定に用いた技法を示している。 第３図は、ヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及
び翻訳されたアミノ酸配列を示している。 第４図は、ＴＦＩのアミノ酸配列における准荷分布を示
すグラフである。 第５図は、ＴＦＩの疎水性プロファイルを示すグラフで
ある。 第６図は、ＴＦＩの塩基性プロテアーゼ抑制因子ドメイ
ンと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメン
トを示すっ 第７図は、６個の肝由来セルラインから得たＲＮＡの７
−デン・プロット分析を示す写真である。
ｔ１１クローンのスクリーニングを示した写真である。 ＠２図は、部分的制限酵素地図及びλＰ９のインサート
配列の配列決定に用いた技法を示している。 第３図は、ヒトＴＦＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及
び翻訳されたアミノ酸配列を示している。 第４図は、ＴＦＩのアミノ酸配列における准荷分布を示
すグラフである。 第５図は、ＴＦＩの疎水性プロファイルを示すグラフで
ある。 第６図は、ＴＦＩの塩基性プロテアーゼ抑制因子ドメイ
ンと他の塩基性プロテアーゼ抑制因子とのアラインメン
トを示すっ 第７図は、６個の肝由来セルラインから得たＲＮＡの７
−デン・プロット分析を示す写真である。
Claims (6)
- （１）第２図の制限酵素地図で示されるヒト組織因子抑
制因子のｃＤＮＡクローンλＰ９。 - （２）第３図で示されるヌクレオチド配列を有するヒト
組織因子抑制因子のｃＤＮＡ。 - （３）第３図で示されるアミノ酸配列を有するヒト組織
因子抑制因子。 - （４）グリコシル化されていない請求項３記載のヒト組
織因子抑制因子。 - （５）グリコシル化されている請求項３記載のヒト組織
因子抑制因子、 - （６）ヒト組織因子抑制因子をコードする配列からなる
ＤＮＡ配列。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/123,753 US4966852A (en) | 1987-07-23 | 1987-11-23 | DNA clone of human tissue factor inhibitor |
| US123753 | 1987-11-23 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18131998A Division JP3565714B2 (ja) | 1987-11-23 | 1998-05-25 | ヒト組織因子抑制因子 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01165383A true JPH01165383A (ja) | 1989-06-29 |
| JP2836823B2 JP2836823B2 (ja) | 1998-12-14 |
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ID=22410671
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|---|---|---|---|
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| JP18131998A Expired - Lifetime JP3565714B2 (ja) | 1987-11-23 | 1998-05-25 | ヒト組織因子抑制因子 |
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| JP2005124415A Withdrawn JP2005306875A (ja) | 1987-11-23 | 2005-04-22 | 組織因子抑制因子に対する抗体 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18131998A Expired - Lifetime JP3565714B2 (ja) | 1987-11-23 | 1998-05-25 | ヒト組織因子抑制因子 |
| JP2001226122A Expired - Lifetime JP4025035B2 (ja) | 1987-11-23 | 2001-07-26 | 組織因子抑制因子に対する抗体 |
| JP2004120081A Pending JP2004201696A (ja) | 1987-11-23 | 2004-04-15 | ヒト組織因子抑制因子 |
| JP2005124415A Withdrawn JP2005306875A (ja) | 1987-11-23 | 2005-04-22 | 組織因子抑制因子に対する抗体 |
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|---|---|
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| AT (1) | ATE111518T1 (ja) |
| AU (1) | AU604139B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341223C (ja) |
| DE (1) | DE3851511T2 (ja) |
| DK (1) | DK173536B1 (ja) |
| ES (1) | ES2063769T3 (ja) |
| FI (1) | FI93365C (ja) |
| IE (1) | IE65393B1 (ja) |
| IL (1) | IL87171A (ja) |
| NO (2) | NO310466B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ225535A (ja) |
| PT (1) | PT88076B (ja) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5378614A (en) * | 1989-08-18 | 1995-01-03 | Novo Nordisk A/S | Vector and method for making tissue factor pathway inhibitor (TFPI) analogues in yeast |
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