JPH01168276A - 微生物菌体の破砕方法 - Google Patents
微生物菌体の破砕方法Info
- Publication number
- JPH01168276A JPH01168276A JP32737187A JP32737187A JPH01168276A JP H01168276 A JPH01168276 A JP H01168276A JP 32737187 A JP32737187 A JP 32737187A JP 32737187 A JP32737187 A JP 32737187A JP H01168276 A JPH01168276 A JP H01168276A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- organic solvent
- microbial cell
- hydrophilic organic
- disintegration
- microorganism
- Prior art date
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- Pending
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は微生物により生産された不溶性蛋白質を微生物
菌体から効率よく抽出する方法に関するものである。
菌体から効率よく抽出する方法に関するものである。
（従来の技術とその時照点）
微生物菌体内に存在する蛋白質を抽出するには、微生物
を破砕する必要がある。微生物の破砕方法として、超音
波を用いる方法、ガラス、＠鉄などの小球と共に磨砕す
る方法、圧力差を用いる方法等の物理的な方法が知られ
、また微生物が強固な細胞膜あるいは細胞壁を持つ様な
場合は、これらの前処理としてセルラーゼ、リゾチウム
等の酵素処理を行うこともある。
を破砕する必要がある。微生物の破砕方法として、超音
波を用いる方法、ガラス、＠鉄などの小球と共に磨砕す
る方法、圧力差を用いる方法等の物理的な方法が知られ
、また微生物が強固な細胞膜あるいは細胞壁を持つ様な
場合は、これらの前処理としてセルラーゼ、リゾチウム
等の酵素処理を行うこともある。
遺伝子組換技術により、異種（外来性）蛋白質を微生物
で生産できるようになったが、この場合にも生産された
蛋白質はしばしば本来の活性を発現し得ない三次構造に
折り畳まれた不溶性蛋白質として微生物菌体内に畜積さ
れることが知られている。
で生産できるようになったが、この場合にも生産された
蛋白質はしばしば本来の活性を発現し得ない三次構造に
折り畳まれた不溶性蛋白質として微生物菌体内に畜積さ
れることが知られている。
上記の様に、目的とする蛋白質が不溶性の場合には、そ
れらの蛋白質は破砕において用いる緩衝液中に溶出せず
、細胞膜断片や細胞壁断片等とともに不溶性画分に得ら
れるため、菌体をできるだけ小断片に破砕しておく必要
がある。しかし、前記の様な物理的破砕方法を用いて、
その破砕効率を上げようとした場合には、より過激な条
件で長時間の破砕を行うことが必要となるためこのよう
な処理で生じる破砕時の熱、過大な衝敢等により、目的
蛋白質の不可逆的な変性が起こり易い等の間照点がある
。
れらの蛋白質は破砕において用いる緩衝液中に溶出せず
、細胞膜断片や細胞壁断片等とともに不溶性画分に得ら
れるため、菌体をできるだけ小断片に破砕しておく必要
がある。しかし、前記の様な物理的破砕方法を用いて、
その破砕効率を上げようとした場合には、より過激な条
件で長時間の破砕を行うことが必要となるためこのよう
な処理で生じる破砕時の熱、過大な衝敢等により、目的
蛋白質の不可逆的な変性が起こり易い等の間照点がある
。
本発明暑佇、以上の問題点について鋭意検討を行った結
果、菌体を、親水性有機溶媒を含む緩衝液中で破砕する
ことでこれら問題点を解決できることを見い出し、本発
明を完成させた。すなわち本発明は不溶性蛋白質を含む
微生物を親水性有機溶媒を含む緩衝液中で破砕すること
を特徴とする微生物菌体の破砕方法を提供するものであ
り、以下詳細に説明する。
果、菌体を、親水性有機溶媒を含む緩衝液中で破砕する
ことでこれら問題点を解決できることを見い出し、本発
明を完成させた。すなわち本発明は不溶性蛋白質を含む
微生物を親水性有機溶媒を含む緩衝液中で破砕すること
を特徴とする微生物菌体の破砕方法を提供するものであ
り、以下詳細に説明する。
（問題点を解決するための手段）
微生物菌体としては、例えば大腸菌、酵母、糸状菌、担
糸状菌等、どのような微生物でも良い。
糸状菌等、どのような微生物でも良い。
本発明は親水性の有機溶媒を用いて、不溶性蛋白質を可
溶化することな（細胞模等の破壊を行う方法であり、目
的蛋白質としては、微生物が自然状態で生産する蛋白質
の他、遺伝子組換技術により得られる、例えば大腸菌に
生産されたヒト成長ホルモン、ヒトウロキナーゼ前駆体
蛋白質（ヒトプロウロキナーゼ）、ヒト組織プラスミノ
ーゲンアクティベータ、ウシ成長ホルモン等、不溶性蛋
白質として微生物菌体内に蓄積されるものであれば、何
ら制限はない。
溶化することな（細胞模等の破壊を行う方法であり、目
的蛋白質としては、微生物が自然状態で生産する蛋白質
の他、遺伝子組換技術により得られる、例えば大腸菌に
生産されたヒト成長ホルモン、ヒトウロキナーゼ前駆体
蛋白質（ヒトプロウロキナーゼ）、ヒト組織プラスミノ
ーゲンアクティベータ、ウシ成長ホルモン等、不溶性蛋
白質として微生物菌体内に蓄積されるものであれば、何
ら制限はない。
微生物菌体の破砕に使用する破砕溶液としては使用する
菌体、抽出しようとする目的蛋白質に対し適切なｐＨ等
を有する緩衝液等を用いれば良く、例えば大腸菌からウ
ロキナーゼ前駆体蛋白質を抽出する場合ではｐＨ６〜９
の緩衝液が好ましい。
菌体、抽出しようとする目的蛋白質に対し適切なｐＨ等
を有する緩衝液等を用いれば良く、例えば大腸菌からウ
ロキナーゼ前駆体蛋白質を抽出する場合ではｐＨ６〜９
の緩衝液が好ましい。
添加する有機溶媒は親水性を有するものであればどのよ
うなものでも良（、炭素数等に制限はない。
うなものでも良（、炭素数等に制限はない。
添加する濃度については菌体、目的蛋白質の性質等を考
慮して適宜決定すれば良く、例えば大腸菌からウロキナ
ーゼ前駆体蛋白質をエタノール、イソプロパツール、メ
タノール、アセトン等を用いて抽出する場合には、４〜
５チ（重量７重りが好ましい。
慮して適宜決定すれば良く、例えば大腸菌からウロキナ
ーゼ前駆体蛋白質をエタノール、イソプロパツール、メ
タノール、アセトン等を用いて抽出する場合には、４〜
５チ（重量７重りが好ましい。
本発明は薬品を用いて菌体を破壊する化学的破砕方法と
併用すると、親水性有機溶媒と使用する薬品の相剰的な
作用により、目的蛋白質が不可逆的に変性する等の悪影
響が生じる場合があり、物理的な破砕方法において用い
ることが好ましい。
併用すると、親水性有機溶媒と使用する薬品の相剰的な
作用により、目的蛋白質が不可逆的に変性する等の悪影
響が生じる場合があり、物理的な破砕方法において用い
ることが好ましい。
（発明の効果）
本発明によれば、微生物菌体中に蓄積された不溶性蛋白
質を効率良く抽出することができる。
質を効率良く抽出することができる。
以下本発明をさらに詳細に説明するため実施例を示すが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例）
実施例１
ヒトプロウロキナーゼ遺伝子を組み込んだ大腸菌を参考
例の培養条件で培養しヒトプロウロキナーゼを菌体内に
蓄積した大腸菌を１３０００ ｘｔ）１５分間遠心分離
し湿菌体を得た。湿菌体１ｇを３チ（重量／重量）のエ
タノールを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨａＯ）緩衝液
１０ゴに懸濁し、４℃にて超音波破砕法（２００Ｗ ５
ｍｉｎ ）で破砕し、１５０００ｘ（ｘ １５分間
遠心分離し不溶性画分を得た。この沈殿物を４Ｍグアニ
ジン塩酸を含む、５０ ｍＭ ） ’）ス塩酸ｐＨＩＩ
Ｌ Ｏ緩衝液２０ゴに再悪濁し、４℃１０時間放置して
変性可溶化した後、５０ｍＭトリス塩酸、、ｐＨａＯ、
５ｍＭ ＩＤＤＴＡ 、 １．２５ ｍＭ 還元型グル
タチオン、Ｑ、２５ｍＭ酸化型グルタチオン溶液６０Ｗ
ｔを加え２４℃で２４時間放置して活性化（再折り畳み
）した。
例の培養条件で培養しヒトプロウロキナーゼを菌体内に
蓄積した大腸菌を１３０００ ｘｔ）１５分間遠心分離
し湿菌体を得た。湿菌体１ｇを３チ（重量／重量）のエ
タノールを含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨａＯ）緩衝液
１０ゴに懸濁し、４℃にて超音波破砕法（２００Ｗ ５
ｍｉｎ ）で破砕し、１５０００ｘ（ｘ １５分間
遠心分離し不溶性画分を得た。この沈殿物を４Ｍグアニ
ジン塩酸を含む、５０ ｍＭ ） ’）ス塩酸ｐＨＩＩ
Ｌ Ｏ緩衝液２０ゴに再悪濁し、４℃１０時間放置して
変性可溶化した後、５０ｍＭトリス塩酸、、ｐＨａＯ、
５ｍＭ ＩＤＤＴＡ 、 １．２５ ｍＭ 還元型グル
タチオン、Ｑ、２５ｍＭ酸化型グルタチオン溶液６０Ｗ
ｔを加え２４℃で２４時間放置して活性化（再折り畳み
）した。
大腸菌からのプロウロキナーゼの抽出率は活性化により
得られたプロウロキナーゼを酵素で処理して得られたウ
ロキナーゼの、合成基質Ｓ −２４４４（第一化学薬品
社製）分解活性をＨａｙａｓｈｉらの方法（Ｔｈｒｏｍ
ｂ、 Ｒｅｓ、２２巻５７３〜５７８頁１９８１年）に
従って測定することで決定した。
得られたプロウロキナーゼを酵素で処理して得られたウ
ロキナーゼの、合成基質Ｓ −２４４４（第一化学薬品
社製）分解活性をＨａｙａｓｈｉらの方法（Ｔｈｒｏｍ
ｂ、 Ｒｅｓ、２２巻５７３〜５７８頁１９８１年）に
従って測定することで決定した。
結果を表１に示す。
実施例２
破砕溶液として５％インプロパツール、１チプチルアル
コール、３％メタノール、２チアセトン（％は重量／重
量）のうちの１８を及び５０ ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
ａＯ）緩衝液１０ｍ１を用いた以外は実施例１と同様に
して行った。結果を表１に示す。
コール、３％メタノール、２チアセトン（％は重量／重
量）のうちの１８を及び５０ ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
ａＯ）緩衝液１０ｍ１を用いた以外は実施例１と同様に
して行った。結果を表１に示す。
比較例
破砕溶液として５０ ｍＭ ）リス塩酸（ｐＨａＯ）を
用いた以外は実施例１と同様に行った。結果を表１に示
す。
用いた以外は実施例１と同様に行った。結果を表１に示
す。
参考例
以上の実施例、比較例で用いた大腸菌は、以下の方法で
培養した。
培養した。
ヒトグロウロキナーゼ遺伝子を組み込んだプラスミド（
このプラスミドは工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託され、寄託番号８３４１号を付与されている）で形質
転換した組換大腸菌をアンピシリンが最終濃度で［ＬＯ
５％となるように加えたＬＢ培地（バクトドリプトン１
０％、酵母エキス５ ％、ＮａＣｔ１０％）で３０℃１
２時間培養を行った。この培養液１００−をＭ９培地（
Ｎａ、ＨＰｏ。
このプラスミドは工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託され、寄託番号８３４１号を付与されている）で形質
転換した組換大腸菌をアンピシリンが最終濃度で［ＬＯ
５％となるように加えたＬＢ培地（バクトドリプトン１
０％、酵母エキス５ ％、ＮａＣｔ１０％）で３０℃１
２時間培養を行った。この培養液１００−をＭ９培地（
Ｎａ、ＨＰｏ。
７％、 ＮＨ，Ｐｏ、３％、 ＮＨ，Ｃｊｔ １％、
Ｎａｃｔｏ、 ５ Ｈ）に酵母エキス、グリセロール、
アンピシリン。
Ｎａｃｔｏ、 ５ Ｈ）に酵母エキス、グリセロール、
アンピシリン。
Ｍｇ５Ｏ，、ＣａＣ４をそれぞれ最終濃度が２チ、１％
。
。
α０５％、３０ｍＭ、３ｍＭとなるように加えて調整し
た培地１０ｔに接種し、ｐＨ７３０℃で１５時間培養後
、イングロビルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加
えさらに１時間培養を行った。
た培地１０ｔに接種し、ｐＨ７３０℃で１５時間培養後
、イングロビルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加
えさらに１時間培養を行った。
表１
Claims (1)
- （１）不溶性蛋白質を含む微生物を親水性有機溶媒を含
む緩衝液中で破砕することを特徴とする微生物菌体の破
砕方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32737187A JPH01168276A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 微生物菌体の破砕方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32737187A JPH01168276A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 微生物菌体の破砕方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01168276A true JPH01168276A (ja) | 1989-07-03 |
Family
ID=18198394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32737187A Pending JPH01168276A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 微生物菌体の破砕方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01168276A (ja) |
-
1987
- 1987-12-25 JP JP32737187A patent/JPH01168276A/ja active Pending
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