JPH0451893A - ウロキナーゼ様酵素前駆体の回収法 - Google Patents
ウロキナーゼ様酵素前駆体の回収法Info
- Publication number
- JPH0451893A JPH0451893A JP15856890A JP15856890A JPH0451893A JP H0451893 A JPH0451893 A JP H0451893A JP 15856890 A JP15856890 A JP 15856890A JP 15856890 A JP15856890 A JP 15856890A JP H0451893 A JPH0451893 A JP H0451893A
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- Japan
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- urokinase
- precursor
- medium
- enzymic
- escherichia coli
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ウロキナーゼ様酵素前駆体を暗号化する遺伝
子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌について適
用されるものである。本明細書で使用するウロキナーゼ
様酵素前駆体との言葉は、例えば特開昭５９−５１３０
０号等に記載された天然型のウロキナーゼ前駆体以外に
も、例えばそのアミノ酸配列中の一部分が天然のものと
は異なるアミノ酸に置換されているものも包含する（特
開昭６２−１４３８８１３号等）。
子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌について適
用されるものである。本明細書で使用するウロキナーゼ
様酵素前駆体との言葉は、例えば特開昭５９−５１３０
０号等に記載された天然型のウロキナーゼ前駆体以外に
も、例えばそのアミノ酸配列中の一部分が天然のものと
は異なるアミノ酸に置換されているものも包含する（特
開昭６２−１４３８８１３号等）。
本発明でいう培地とは、実際に破砕処理に供される大腸
菌を培養した培地、即ち、培養の最終段階においてウロ
キナーゼ様酵素前駆体を菌体内に蓄積した大腸菌が懸濁
されている培地自体を意味するものである。
菌を培養した培地、即ち、培養の最終段階においてウロ
キナーゼ様酵素前駆体を菌体内に蓄積した大腸菌が懸濁
されている培地自体を意味するものである。
本発明において使用される金属キレート剤としては、例
えばＥＤＴＡ、 ＥＧＴＡ等を使用すれば良い。
えばＥＤＴＡ、 ＥＧＴＡ等を使用すれば良い。
これらは、前記した培地に直接添加すれば良い。
使用する濃度に特別の制限はないが、５−１００ｍＭ程
度の使用により、本発明の効果は十分に達成される。
度の使用により、本発明の効果は十分に達成される。
金属キレート剤を添加した後は、培養液ごと例えばホモ
ジナイザー、超音波破砕器等を用いて培地中で大腸菌を
破砕することが出来る。このとき、培地のｐＨはウロキ
ナーゼ様酵素前駆体が失活しない、ｐＨ７〜１０の範囲
に保つことが好ましい。従って、培地のｐＨを測定し、
必要に応じてトリスヒドロキシルアミノメタン・塩酸、
リン酸塩、グリシン又は苛性ソーダ等を添加してｐＨを
前記範囲に保てば良い。
ジナイザー、超音波破砕器等を用いて培地中で大腸菌を
破砕することが出来る。このとき、培地のｐＨはウロキ
ナーゼ様酵素前駆体が失活しない、ｐＨ７〜１０の範囲
に保つことが好ましい。従って、培地のｐＨを測定し、
必要に応じてトリスヒドロキシルアミノメタン・塩酸、
リン酸塩、グリシン又は苛性ソーダ等を添加してｐＨを
前記範囲に保てば良い。
破砕操作を終了した後に不溶性画分としてウロキナーゼ
様酵素前駆体を回収するが、本発明においてはこの操作
に制限はなく、例えば遠心分離、限外濾過等の方法によ
れば良い。
様酵素前駆体を回収するが、本発明においてはこの操作
に制限はなく、例えば遠心分離、限外濾過等の方法によ
れば良い。
以上の操作により、後に説明するように再活性化操作に
供された場合に、単に培地に懸濁された状態で破砕操作
に供された大腸菌から回収されるウロキナーゼ様酵素前
駆体に比較して高い活性を発現し得る状態のウロキナー
ゼ様酵素前駆体を回収することが出来る。
供された場合に、単に培地に懸濁された状態で破砕操作
に供された大腸菌から回収されるウロキナーゼ様酵素前
駆体に比較して高い活性を発現し得る状態のウロキナー
ゼ様酵素前駆体を回収することが出来る。
本発明においては、一方、以上のようにして回収された
ウロキナーゼ様酵素前駆体について、次いで再活性化操
作を実施して活性を発現し得る状態の標品を回収する回
収法を提供するものである。当該再活性化操作について
は、例えば塩酸グアニジン等の強力な蛋白質変性剤溶液
にてウロキナーゼ様酵素前駆体を可溶化し７、後に溶液
を希釈又は透析等して当該変性剤濃度を低下させる方法
（特開昭５９−１６１３２１号を参照）やｐＨ１０−１
３程度のアルカリ性水溶液にてウロキナーゼ様酵素前駆
体を可溶化し、後に酸性物質を添加して当該溶液のｐＨ
を低下させる方法（特開昭１３０−５００８９３号参照
）等によれば良い。
ウロキナーゼ様酵素前駆体について、次いで再活性化操
作を実施して活性を発現し得る状態の標品を回収する回
収法を提供するものである。当該再活性化操作について
は、例えば塩酸グアニジン等の強力な蛋白質変性剤溶液
にてウロキナーゼ様酵素前駆体を可溶化し７、後に溶液
を希釈又は透析等して当該変性剤濃度を低下させる方法
（特開昭５９−１６１３２１号を参照）やｐＨ１０−１
３程度のアルカリ性水溶液にてウロキナーゼ様酵素前駆
体を可溶化し、後に酸性物質を添加して当該溶液のｐＨ
を低下させる方法（特開昭１３０−５００８９３号参照
）等によれば良い。
（発明の効果）
培地から大腸菌を分離することなく、培地中で菌体を破
砕してウロキナーゼ様酵素前駆体を回収し再活性化操作
を実施した場合には、低い活性を有するウロキナーゼ様
酵素前駆体しか回収されないという課題が生じる。この
課題を例えば遠心分離により解決しようとした場合には
、大規模な設備を設置するか又は長い時間をかけて大腸
菌と培地を分離した後に再活性化操作を行うことが必要
であるが、本発明によればそのような大規模な設備や長
い時間がかかる処理を行うことなしに、同様の効果を達
成することができるのである。即ち、本発明は、培地に
金属キレート剤を添加するという極めて簡便な操作によ
り菌体を培地から分離することなく破砕操作を実施し、
続いて活性化操作を実施したとしても、ウロキナーゼ前
駆体様蛋白質の収率が低下することのない回収方法を提
供するものである。詳しくは後の実施例に示されるよう
に、金属キレート剤を培地に添加することで、大腸菌と
培地を分離することなしに後の再活性化操作を実施した
場合にも高い活性を有するウロキナーゼ様酵素前駆体を
得ることを可能とするものである。
砕してウロキナーゼ様酵素前駆体を回収し再活性化操作
を実施した場合には、低い活性を有するウロキナーゼ様
酵素前駆体しか回収されないという課題が生じる。この
課題を例えば遠心分離により解決しようとした場合には
、大規模な設備を設置するか又は長い時間をかけて大腸
菌と培地を分離した後に再活性化操作を行うことが必要
であるが、本発明によればそのような大規模な設備や長
い時間がかかる処理を行うことなしに、同様の効果を達
成することができるのである。即ち、本発明は、培地に
金属キレート剤を添加するという極めて簡便な操作によ
り菌体を培地から分離することなく破砕操作を実施し、
続いて活性化操作を実施したとしても、ウロキナーゼ前
駆体様蛋白質の収率が低下することのない回収方法を提
供するものである。詳しくは後の実施例に示されるよう
に、金属キレート剤を培地に添加することで、大腸菌と
培地を分離することなしに後の再活性化操作を実施した
場合にも高い活性を有するウロキナーゼ様酵素前駆体を
得ることを可能とするものである。
（実施例）
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
なお、ウロキナーゼ様酵素前駆体はそれ自体活性を発現
しない（酵素前駆体であるため）ため、その活性は、プ
ラスミンで処理してウロキナーゼ様酵素に変換して（Ｐ
ｙｒＧｌｙＡｒｇ−ｐＮＡ ；第一化学薬品（株）製）
の加水分解活性を測定し、市販のウロキナーゼ（ミドリ
十字（株）製）と比較した上で決定した（ Ｈａｙａｓ
ｈｊ Ｓ、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、第２２巻、ｐ５７３
−５７８．１９８１年）。
しない（酵素前駆体であるため）ため、その活性は、プ
ラスミンで処理してウロキナーゼ様酵素に変換して（Ｐ
ｙｒＧｌｙＡｒｇ−ｐＮＡ ；第一化学薬品（株）製）
の加水分解活性を測定し、市販のウロキナーゼ（ミドリ
十字（株）製）と比較した上で決定した（ Ｈａｙａｓ
ｈｊ Ｓ、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、第２２巻、ｐ５７３
−５７８．１９８１年）。
実施例 １
特開昭６２−１４３［ｉ８６号公報に記載された、゛Ｎ
末端から数えて１３５位及び１５７位のアミノ酸がそれ
ぞれリジン、フェニルアラニンに置換されたウロキナー
ゼ様酵素前駆体をコードするプラスミドで大腸菌ＫＹ１
４３Ｂ株を形質転換し、グリセリンとカゼインの分解物
を含むＭ９培地にてＩｌｌｌｏｏｎの濁度が５０となる
まで培養した。
末端から数えて１３５位及び１５７位のアミノ酸がそれ
ぞれリジン、フェニルアラニンに置換されたウロキナー
ゼ様酵素前駆体をコードするプラスミドで大腸菌ＫＹ１
４３Ｂ株を形質転換し、グリセリンとカゼインの分解物
を含むＭ９培地にてＩｌｌｌｏｏｎの濁度が５０となる
まで培養した。
以上の培地のうちのｌｆｔについて以下の操作を実施し
た。なお、培地１ｇ中には５０ｇの菌体（湿重量）が含
まれていた。
た。なお、培地１ｇ中には５０ｇの菌体（湿重量）が含
まれていた。
まず、１２．１ｇのトリスヒドロキシアミノメタン（ト
リス）と塩酸を添加して培地のｐＨを約９に調整し、１
Ｉ１１．９ｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を
添加した。次に、この５０ｇの菌体を含む培地をホモジ
ナイザー（ゴーリンホモジナイザー）に供し、８０００
ｐｓにて菌体を破砕し、８０００ ｒｐｍで２０分間遠
心分離を実施して不溶性画分を回収した。続いて回収さ
れた不溶性画分を５００＋ａｌｌのＯ，１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し、５００ａ＋４７の８Ｍ
塩酸グアニジン溶液を添加した後４０℃で２時間放置し
て可溶化した。当該可溶化処理を完了した後、Ｓ ｍＭ
ＥＤＴＡ、 ０．２ ｍＭ還元型グルタチオン、０．０
２ｍＭ酸化型グルタチオンを含む５０ＩＩＩＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）を６ｆＩ添加し、再活性化処理
を実施した。
リス）と塩酸を添加して培地のｐＨを約９に調整し、１
Ｉ１１．９ｇのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を
添加した。次に、この５０ｇの菌体を含む培地をホモジ
ナイザー（ゴーリンホモジナイザー）に供し、８０００
ｐｓにて菌体を破砕し、８０００ ｒｐｍで２０分間遠
心分離を実施して不溶性画分を回収した。続いて回収さ
れた不溶性画分を５００＋ａｌｌのＯ，１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁し、５００ａ＋４７の８Ｍ
塩酸グアニジン溶液を添加した後４０℃で２時間放置し
て可溶化した。当該可溶化処理を完了した後、Ｓ ｍＭ
ＥＤＴＡ、 ０．２ ｍＭ還元型グルタチオン、０．０
２ｍＭ酸化型グルタチオンを含む５０ＩＩＩＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）を６ｆＩ添加し、再活性化処理
を実施した。
得られたウロキナーゼ様酵素前駆体について前述のよう
にプラスミン処理を行ったところ、溶液全体で約１３５
５０００．ＯＩＪの活性が回収された。本実施例では５
０ｇの湿菌体を使用したから、１ｇの湿菌体力たり２７
１０００ Ｕの活性か回収されたことになる。
にプラスミン処理を行ったところ、溶液全体で約１３５
５０００．ＯＩＪの活性が回収された。本実施例では５
０ｇの湿菌体を使用したから、１ｇの湿菌体力たり２７
１０００ Ｕの活性か回収されたことになる。
比較例 １
実施例１で取得された培地のうち １ｇを使用して以下
の比較例を実施した。なお、当該１ｇの培地には、実施
例１と同様に約５００ｇ （湿重量）の菌体が含まれて
いた。
の比較例を実施した。なお、当該１ｇの培地には、実施
例１と同様に約５００ｇ （湿重量）の菌体が含まれて
いた。
１２゜１ｇのトリスヒドロキシアミノメタン（トリス）
と塩酸を添加して培地のｐＨを約９に調整した後、この
５０ｇの菌体を含む培地をホモジナイザ（ゴーリンホモ
ジナイザー）に供して８０００ｐｓにて菌体を破砕し、
８０００ ｒｐｆｆｌで２０分間遠心分離を実施して不
溶性画分を回収した。続いて回収された不溶性画分を５
００ｍ１１の０．１１４ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）に懸濁し、５００−の８Ｍ塩酸グアニジン溶液を添
加した後４０℃で２時間放置して可溶化した。当該可溶
化処理を完了した後、５ ｍＭＥＤＴＡ。
と塩酸を添加して培地のｐＨを約９に調整した後、この
５０ｇの菌体を含む培地をホモジナイザ（ゴーリンホモ
ジナイザー）に供して８０００ｐｓにて菌体を破砕し、
８０００ ｒｐｆｆｌで２０分間遠心分離を実施して不
溶性画分を回収した。続いて回収された不溶性画分を５
００ｍ１１の０．１１４ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）に懸濁し、５００−の８Ｍ塩酸グアニジン溶液を添
加した後４０℃で２時間放置して可溶化した。当該可溶
化処理を完了した後、５ ｍＭＥＤＴＡ。
０．２ ａＭ還元型グルタチオン、０．０２ｍＭ酸化型
グルタチオンを含む５０１１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）を６ｇ添加し、再活性化処理を実施した。
グルタチオンを含む５０１１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）を６ｇ添加し、再活性化処理を実施した。
得られたウロキナーゼ様酵素前駆体について前述のよう
にプラスミン処理を行ったところ、溶液全体で約８５５
００００ ｔｌの活性が回収された。本比較例では５０
ｇの湿菌体を使用したから、１ｇの湿菌体力たり１７
１０００ Ｕの活性、即ち実施例１の６７％の活性しか
回収さなかった。
にプラスミン処理を行ったところ、溶液全体で約８５５
００００ ｔｌの活性が回収された。本比較例では５０
ｇの湿菌体を使用したから、１ｇの湿菌体力たり１７
１０００ Ｕの活性、即ち実施例１の６７％の活性しか
回収さなかった。
比較例 ２
実施例１で取得された培地のうち１１）を使用して以下
の比較例を実施した。なお、当該１ｆ！の培地には、実
施例１と同様に約５００ｇ （湿重量）の菌体が含まれ
ていた。
の比較例を実施した。なお、当該１ｆ！の培地には、実
施例１と同様に約５００ｇ （湿重量）の菌体が含まれ
ていた。
まずこの菌体を含む培地について８０００ ｒｐｍで２
０分間の遠心分離を実施して５０ｇの個体を回収した。
０分間の遠心分離を実施して５０ｇの個体を回収した。
この菌体を５００Ｊのトリス塩酸緩衝液（１）Ｈ８，０
）に懸濁し、ホモジナイザー（ゴーリンホモジナイザー
）に供して８０００ｐｓにて菌体を破砕し、８０００
ｒｐｍで２０分間遠心分離を実施して不溶性画分を回収
した。続いて回収された不溶性画分を５０ｔｎｌの０１
Ｍトリス塩酸緩衝液（１）Ｉ（８，０）に懸濁し、５０
０ＩＩＩＩＩの８Ｍ塩酸グアニジン溶液を添加した後４
０°Ｃで２時間放置して可溶化した。当該可溶化処理を
完了した後、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．２ｍＭ還元型グ
ルタチオン、０．０２ｍＭ酸化型グルタチオンを含む５
０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を６ｇ添加し
、再活性化処理を実施した。
）に懸濁し、ホモジナイザー（ゴーリンホモジナイザー
）に供して８０００ｐｓにて菌体を破砕し、８０００
ｒｐｍで２０分間遠心分離を実施して不溶性画分を回収
した。続いて回収された不溶性画分を５０ｔｎｌの０１
Ｍトリス塩酸緩衝液（１）Ｉ（８，０）に懸濁し、５０
０ＩＩＩＩＩの８Ｍ塩酸グアニジン溶液を添加した後４
０°Ｃで２時間放置して可溶化した。当該可溶化処理を
完了した後、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．２ｍＭ還元型グ
ルタチオン、０．０２ｍＭ酸化型グルタチオンを含む５
０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を６ｇ添加し
、再活性化処理を実施した。
得られたウロキナーゼ様酵素前駆体について前述のよう
にプラスミン処理を行ったところ、溶液全体で約１２６
５００００ Ｕの活性が回収された。本比較例では５０
ｇの湿菌体を使用したから、１ｇの湿菌体力たり２５３
０００ Ｕの活性、即ち、実施例１の９４％の活性が回
収されたことになる。
にプラスミン処理を行ったところ、溶液全体で約１２６
５００００ Ｕの活性が回収された。本比較例では５０
ｇの湿菌体を使用したから、１ｇの湿菌体力たり２５３
０００ Ｕの活性、即ち、実施例１の９４％の活性が回
収されたことになる。
Claims (2)
- （１）ウロキナーゼ様酵素前駆体を暗号化する遺伝子を
含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を培地中に
て培養した後、該大腸菌を培地から分離することなしに
金属キレート剤の存在下で破砕操作に供し、不溶性画分
を回収するウロキナーゼ様酵素前駆体の回収法。 - （２）ウロキナーゼ様酵素前駆体を暗号化する遺伝子を
含むプラスミドにより形質転換された大腸菌を培地中に
て培養した後、該大腸菌を培地から分離することなしに
金属キレート剤の存在下で破砕操作に供して不溶性画分
を回収し、続いて再活性化操作を行うウロキナーゼ様酵
素前駆体の回収法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15856890A JPH0451893A (ja) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | ウロキナーゼ様酵素前駆体の回収法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15856890A JPH0451893A (ja) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | ウロキナーゼ様酵素前駆体の回収法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0451893A true JPH0451893A (ja) | 1992-02-20 |
Family
ID=15674539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15856890A Pending JPH0451893A (ja) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | ウロキナーゼ様酵素前駆体の回収法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0451893A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004011734A1 (ja) | 2002-07-31 | 2004-02-05 | Japan Science And Technology Agency | 煉瓦壁の施工計画方法 |
| KR100419448B1 (ko) * | 2001-03-09 | 2004-02-19 | 주)녹십자 | 고정화 유로키나아제 칼럼의 재생방법 |
-
1990
- 1990-06-19 JP JP15856890A patent/JPH0451893A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100419448B1 (ko) * | 2001-03-09 | 2004-02-19 | 주)녹십자 | 고정화 유로키나아제 칼럼의 재생방법 |
| WO2004011734A1 (ja) | 2002-07-31 | 2004-02-05 | Japan Science And Technology Agency | 煉瓦壁の施工計画方法 |
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