JPH0117676B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、酵素の固定化方法に関するものであ
る。 酵素を工業的に化合物の合成に適用した場合、
その化学反応の特異性のため、立体異性をも含め
て反応に併う副反応がなくて、高収率であること
から、不用な環境破壊性の物質を副生することが
ない。さらに反応が常温常圧という温和な条件で
進むことから、次代の省エネルギーの課題を満足
するプロセスを提供する。 しかるに、この酵素を利用した有用な化合物の
製造法では、上記の利点を有する一方、酵素が水
可溶性であるため、反応終了後酵素を回収し再利
用することおよび連続酵素反応を行うことが非常
に困難であるなどの欠点を有する。酵素がすこぶ
る高価であるために、これらの欠点はすでに記し
た酵素の利点を最大限に活用するためにはどうし
ても改良することが必要な課題である。この様な
酵素の欠点の改良克服のために、当業界では多く
の研究がなされ、いくつかの提案がなされてい
る。すなわち、酵素を水不溶性の担体に何らかの
方法で固定化して、水不溶性とし繰返し利用しよ
うとする試みである。たとえばオスカル・ジヤボ
ルスキー（Oskar Zaborsky）著「インモビライ
ズド・エンザイムズ」シーアールシー・プレス
（1973）や千畑一郎編「固定化酵素」講談社
（1975）に記されているように、アミノアシラー
ゼをイオン交換樹脂に吸着法で固定化した例、デ
キストラナーゼをセルロースに共有結合法で固定
化した例、アスパルターゼをポリアクリルアミド
ゲルに包括法により固定化した例などがあげられ
る。このように酵素の固定化によつて、一般に酵
素の再使用、連続使用は可能になり、酵素の固定
化は今日では世界中で種々の方法を用いて広く行
なわれている。中でも共有結合による固定化法が
生産物の安定性、基質の利用し易さ等からいつて
最もすぐれている。しかし、この方法による固定
化は、酵素表面上の不特定のアミノ基やカルボキ
シル基との反応が起るため、得られた固定化酵素
の活性が低く、再現性に乏しいという欠点があつ
た。 共有結合による酵素の固定化法において、固定
化酵素の活性の低下を防止する試みとして、例え
ば、ヘキサメチレンジアミン等（一般にスペーサ
ーと称されている。）を酵素分子と担体分子との
間に挿入することにより、改良する手法が知られ
ている。このスペーサーには、酵素分子と担体分
子との間の立体的相互作用を緩和する効果がある
と予想され、これ故に、より高活性な固定化酵素
が得られると考えることもできる。しかしなが
ら、このスペーサーの効果は一般に小さく、特に
先に述べた酵素表面上の不特定な官能基との反応
を避けることが出来ないものであつた。 本発明者らは、上記欠点を改良克服し、工業的
に価値のある高活性、再現性の高い、酵素の固定
化方法を提供することを目的として鋭意検討した
結果、特定の水不溶性の担体を用いると、上記の
目的がすべて達成されることを見い出し、本発明
を完成した。 即ち、本発明は酵素を水不溶性担体に固定化す
るに際し、下記一般式（） （ただし、ＸはCONH基またはCOD基、Ｙは二
価の脂肪族基、二価の芳香族基または二価の脂環
族基Ｚは水不溶性の高分子または無機化合物を表
わし、ｎは１ないし3mは０または１である。） で示される水不溶性の担体を用いることを特徴と
する酵素の固定化方法である。 本発明に用いられる水不溶性の高分子または無
機化合物としてはたとえば、セルロース、デキス
トラン、アガロース、デンプンなどの多糖類の誘
導体、ポリ酢酸セルロース、ポリビニルアルコー
ルの誘導体、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポ
リエチレン、ポリビニルクロライド、ポリ（メチ
ルメタクリル酸）エステル、ポリブデン、ポリペ
ンテンヽポリビニリデンクロライド、ポリアクリ
ロニトリル、ポリメタクリル酸、ポリアクリル
酸、ポリアミノスチレン、ポリブタジエン、ポリ
イソプレン、ポリマレイン酸モノエステル、架橋
ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポ
リビニルアミン、ポリ（ジアルキルアミノエチル
メタクリル酸エステル）ポリ（ジアルキルアミノ
メチルスチレン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ
（ビニルピロリドン）、ポリアクリル酸無水物、ポ
リメタクリル酸無水物、ポリマレイン酸無水物、
ポリメタクリロニトリル、ポリ（トリフルオロエ
チレン）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ
（ジビニルベンゼン）、ポリ（ａ−メチルスチレ
ン）、ポリ（Ｎ−ビニルアミン）、ポリ（テトラメ
チレングリコールジビニルエーテル）、ポリビニ
ルスルホン、ポリビニルスルホキシド、ポリアク
ロレイン、ポリメチルビニルケトンなどの不飽和
炭素を含む単量体からなる重合体、ポリフエニレ
ンオキシド、ポリメチレンオキシド、ポリエチレ
ンオキシド、ポリテトラメチレンオキシドなどの
ポリエーテル類、ポリアラニン、ポリフエニルア
ラニンなどのポリペプチド類、ナイロン−３、ナ
イロン−４、ナイロン−５、ナイロン６、ナイロ
ン−７、ナイロン−11ナイロン12、ナイロン６・
６、ナイロン6.10、ポリ（ｍ−フエニレン−イソ
フタラミド、ポリ（ｐ−フエニレン−テレフタラ
ミド）などのポリアミド、テレフタル酸、イソフ
タル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、ト
リメリツト酸などのポリカルボン酸と、エチレン
グリコール、プロピレングリコール、ブチレング
リコール、ペンタエリスリトール、ビスフエノー
ルＡなどのポリオールとから誘導されるポリエス
テル類、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシピバリ
ン酸などから誘導されるポリエステル、ジメチル
ポリシロキサン、メチルフエニルポリシロキサ
ン、メチルビニルポリシロキサン、シアノアルキ
ルメチルポリシロキサン、フルオロアルキルメチ
ルポリシロキサンなどのシリンゴム、トルエンジ
イソシアナート、キシレンジイソシアナート、フ
エニレンジイソシアナート、エチレンジイソシア
ナート、ジフエニルメタンジイソシアナート、ト
ルエントリイソシアナートなどのポリイソシアナ
ートと、ポリエチレングリコール、ポリプロピレ
ングリコール、両末端にOH基を有するポリエス
テルなどのポリオールとから誘導されるポリウレ
タン類、フエノールーホルムアルデヒド樹脂、キ
シレン−ホルムアルデヒド樹脂、尿素−ホルムア
ルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂
などのホルムアルデヒド樹脂、ポリイミド、ポリ
ベンツイミダゾール、ポリチアゾールなどの４員
環を含むポリマー、ポリカーボナート、ポリスル
ホンなどの合成ポリマー類およびガラス、ガラス
ウール、ハイドロキシアパタイト、アルミナ、活
性白土、ステアリン酸バリウム、酸化ニツケル、
スチール、磁粉、シリカ、砂などの無機物の誘導
体およびポリフオスフアゼンのような合成無機ポ
リマーなどがあげられる。さらに、市販のセフア
ロースやセフアデツクスがあげられる。 本発明にいう二価の脂肪族基としては、例えば
エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンタメチレ
ン、ヘキサメチレンなどのアルキレン基、ジエチ
レンオキシド、ジプロピレンオキシド、ジブチレ
ンオキシドなどのジアルキレンオキシド基、ジエ
チレンアミド、ジプロピレンアミドなどのジアル
キレンアミド基があげられ、また二価の芳香族基
としては、例えばフエニレン基、ビフエニレン
基、ビフエニレンオキシド基などがあげられ、さ
らに二価の脂環族基としては、例えばシクロヘキ
シレン基、ジシクロヘキシレン基などがあげられ
る。 本発明に用いられる一般式（）で示される水
不溶性の担体を得るには、例えば次の方法で行え
ばよい。 すなわち、水不溶性の高分子がポリビニルアミ
ンやポリビニルアルコールのようにアミノ基やヒ
ドロキシル基を有する場合には、水不溶性の高分
子とN⁶−カルボキシエチル−アデノシンリン酸
（N⁶−カルボキシエチル−アデノシンモノリン
酸、N⁶−カルボキシエチル−アデノシンジリン
酸、N⁶−カルボキシエチル−アデノシントリリ
ン酸）とを共有結合で結合させ、次いでメタ過ヨ
ウ素酸を用いるマラプラード反応を行えばよい。
またアミノ基あるいはヒドロキシル基を有してい
ない水不溶性の高分子を用いる場合には、まず水
不溶性の高分子をテトフルオロホウ酸トリエチル
オキソニウム塩で処理し、次いでアルキレンジア
ミン作用させる方法でアミノ基を導入し、アミノ
基を導入した水不溶性の高分子とN⁶−カルボキ
シエチル−アデノシンリン酸とを共有結合で結合
させ、次いでメタ過ヨウ素酸を用いるマラプラー
ド反応を行えばよい。このテトラフルオロホウ酸
トリエチルオキソニウム塩を用いる方法は、エー
テル、チオエーテル、ニトリル、ケトン、エステ
ル、アミド結合などの部位にアミノ基を導入する
ことができる方法である〔ヘンリー・イー・バウ
ムガーテイン（Henry E.Baumgarten）編「オ
ルガニツク・シンセシーズ（Organic
Syntheses）」コレクテイブ（Collective）Vol.5、
（1973）、第1081頁参照〕。さらにポリスチレンの
ように炭素と水素だけからなる高分子の場合に
は、上記のテトラフルオロホウ酸トリエチルオキ
ソニウム塩を用いる方法による活性基の導入がで
きないので、この場合には、例えばｐ−アミノス
チレンを共重合させる方法を採用してアミノ基を
導入すればよい。無機化合物であるガラスのアミ
ノ基の導入については、例えば千畑一郎編「固定
化酵素」講談社（1975）第19頁に記載されといる
ようにｒ−アミノプロピルトリエトキシシランを
トルエル中で反応させてアミノアルキル基を導入
する方法を採用することができる。またｐ−ニト
ロベンゾイルクロリドを結合させた後、還元すれ
ば芳香族アミノ基も導入することもできる。さら
には、他の無機化合物であるシリカやアルミナな
どはアミノ化合物を吸着させることにより利用す
ることもできる。 これらの水不溶性の高分子または無機化合物の
アミノ基とN⁶−カルボキシエチル−アデノシン
リン酸のカルボキシル基とのアミド化反応は常法
により行いうるが、例えば１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩あるいは１−シクロエキシル−３−（２−モノ
ホリノエチル）カルボジイミドメト−Ｐ−トルエ
ンスルホン酸のような縮合剤を用いて行うことも
できる。水不溶性の高分子のヒドロキシル基を
N⁶−カルボキシエチル−アデノシンリン酸のカ
ルボキシル基とのエステル化反応も通常の方法で
行いうる。 またN⁶−カルボキシエチル−アデノシンリン
酸を得るには、例えば水に溶解したアデノシンリ
ン酸（アデノシンモノリン酸、アデノシンジリン
酸、アデノシントリリン酸）とハロプロピオン酸
（ヨードプロピオン酸、ブロモプロピオン酸）ま
たはβ−プロピオラクトンとを反応させて１−カ
ルボキシエチル−アデノシンリン酸を得た後、こ
れをジムロート転位反応させればよい。 本発明において酵素を上記の水不溶性の担体に
固定化するには、酵素を溶解した溶液で水不溶性
の担体を処理すればよい。この時の処理時間は10
分以上、とくに１時間以上が好ましく、処理温度
は４℃ないし70℃、とくに20℃ないし40℃が好ま
しい。上記のようにして得られた固定化酵素はい
わゆるシツフ塩基の形で結合したものであるた
め、さらに安定な共有結合を形成せしめるため
に、好ましくはたとえば水素化ホウ酸ナトリウム
のような還元剤を用いて還元することが望まし
い。 本発明に適用できる好ましい酵素としては、た
とえば、キナーゼ類、脱水素酵素類などをあげる
ことができる。そのような酵素としては、たとえ
ば、酢酸キナーゼ、ホスホリラーゼｂ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン
酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素があげられ
る。とくに、酢酸キナーゼとしては安定性の点か
らバチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus
Stearothermophilus）の産出する酢酸キナーゼ
が工業的にさらに価値あるものとなる。 酢酸キナーゼを固定化する場合には、一般式
（）で示される水不溶性の担体として、水不溶
性の高分子とN⁶−カルボキシエチル−アデノシ
ンジリン酸とを共有結合させついでマラブラード
反応を行つたものを用いることが、高活性、再現
性の点で有利であり、またホスホリラーゼｂおよ
びホスホフルクトキナーゼを固定化する場合に
は、一般式（）で示される水不溶性の担体とし
て、水不溶性の高分子とN⁶−カルボキシエチル
−アデノシンモノリン酸とを共有結合させついで
マラブラード反応を行つたものを用いることが、
高活性、再現性の点で有利である。 本発明により酵素を固定化すれば、高活性で再
現性の極めて優れた固定化酵素が得られ、生体内
で行われているのと同様な化学反応を生体外にお
いて工業的に行うことを可能にし、その効果はは
かりしれないものがある。 次に本発明を実施例によりさらに具体的に説明
する。 実施例１（Ｚ＝多糖類の誘導体、Ｙ＝ヘキサメチ
レン基の例）、比較例１ AH−セフアロース4B（フアルマシア社製、６
−アミノヘキシル基を有するセフアロース4B）
の乾燥粉末５ｇを水で膨潤させ、グラスフイルタ
ー上で0.5M食塩1000mlを用いて洗浄した。つい
で充分に水で洗浄し、最終的にこの膨潤ゲルを水
10mlに懸濁したものとして得た。この懸濁液に、
アデノシンジリン酸（以下ADPと言う。）とβ−
プロピオラクトンとより合成したN⁶−カルボキ
シエチル−ADP200mgを水10mlに溶解した溶液を
加え、PHを4.5に調節した。この混合液を撹拌し
ながら１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下EDCと言
う。）50mgを加えて４時間、さらに50mgを加え８
時間、合計12時間室温にて反応させた。反応液を
グラスフイルター上で濾過、洗浄を繰り返し未反
応のN⁶−カルボキシエチル−ADPとEDCを除去
した。このようにして得られたADPの結合した
セフアロース4B（ADPの結合量は270mmの吸光度
より計算すると1.2μモル／膨潤ゲルmlであつた）
の膨潤ゲルを水50mlに懸濁し、0.5Mメタ過ヨウ
素酸ナトリウム水溶液６mlを加え室温で１時間、
振盪することによりADP部位の2′−、3′−リボー
スをジアルデヒド化させることにより水不溶性の
担体を得た。つぎにこの水不溶性の担体を0.1M
リン酸カリウム緩衝液、PH8.5、の50mlに懸濁さ
せ、バチルス・ステアロサーモフイルス
NCA1503から得られた酢酸キナーゼを上記緩衝
液に溶解させた溶液10ml（100000単位）を加えて
１時間ゆつくり振盪しながら室温で反応させた。
反応混合液をグラスフイルター上で上記緩衝液を
用い洗浄し、ついで１％の水素化ホウ素ナトリウ
ムを含む上記緩衝液100mlで洗浄し、さらに0.5M
食塩を含む上記緩衝液で洗浄することにより、固
定化酢酸キナーゼを得た。この固定化酢酸キナー
ゼの活性および各段階の濾液の活性をそれぞれ測
定した。 比較のため活性化CH−セフアロース4B（フア
ルマシア社製、炭素原子６個のスペーサーと、第
１級アミノ基と共有結合する活性化エステルグル
ープを有するセフアロース4B）の乾燥粉末１ｇ
を１ｍＭ塩酸200mlで洗浄し、ついで0.1Mリン酸
カリウム緩衝液、^ｖ８・５、10mlに懸濁させ上記
酢酸キナーゼ溶液２ml（20000単位）を加えて１
時間ゆつくり振盪しながら室温で反応させた。反
応混合液をグラスフイルター上で0.5M食塩を含
む上記緩衝液で充分洗浄して固定化酢酸キナーゼ
を得た。得られた固定化酢酸キナーゼの活性およ
び濾液の活性をそれぞれ測定した。その結果を表
１に示す。

【表】 また、上記操作を繰り返し10回行なつたとこ
ろ、実施例では固定化された活性は45000〜52000
単位の範囲であつたが、比較例では1000〜5000単
位の範囲にばらついた。 実施例２、比較例２ AH−セフアロース4B1ｇを実施例１と同様に
膨潤、洗浄し、得られた懸濁液２mlにアデノシン
モノリン酸（以下AMPと言う。）とβ−プロピオ
ラクトンとより合成したN⁶−カルボキシエチル
−AMP40mgを水２mlに溶かした溶液を加えPHを
4.5に調節した。この混合液を撹拌しながら
EDC50mgを加えて10時間室温にて反応させた。
この反応混合液を実施例１と同様に濾過、洗浄し
た後、メタ過ヨウ素酸処理することにより、水不
溶性の担体が得られた。この水不溶性の担体を
0.05Mリン酸カリウム緩衝液、PH8.0、の10mlに
懸濁させた溶液に、ウサギ骨格筋のホスホフルク
トキナーゼ1000単位を加え、２時間ゆつくりと振
盪しながら室温で反応させた。この懸濁液は実施
例１と同様な方法で洗浄、水素化ホウ素ナトリウ
ム処理を行つた後、固定化ホスホフルクトキナー
ゼの活性および濾液の活性をそれぞれ測定した。 また、比較のためホスホフルクトキナーゼ1000
単位を用いて比較例１と同様にして固定化ホスホ
フルクトキナーゼを得た。得られた固定化ホスホ
フルクトキナーゼの活性および濾液の活性をそれ
ぞれ測定した。 その結果を表２に示す。

【表】 また、上記操作を繰り返し行なつたが、本発明
の方法によれば、実施例１と同様に再現性の良い
結果が得られた。 実施例 ３ 実施例２のホスホフルクトキナーゼの代りにウ
サギ骨格骨のホスホリラーゼb200単位を用いる
以外は実施例２と同様にして固定化ホスホリラー
ゼｂを得た。得られた固定化ホスホリラーゼの活
性は180単位であり、濾液に回収された活性は30
単位であつた。 また、実施例２と同様に繰り返し行なつたが、
本発明の方法によれば、実施例１と同様に再現性
の良い結果が得られた。 実施例４（Ｚ＝ポリアミド、Ｙ＝ヘキサメチレン
基の例） 内径0.2mmのナイロンチユーブの内部を流速0.1
ml／minで温度30℃の10％のテトラフルオロホウ
酸トリエチルオキソニウム塩のジクロルメタン溶
液を２時間循環した。つぎにジクロルメタンで５
分間流速0.2ml／minで洗浄しさらに20％ヘキサ
メチレンジアミン水溶液を流速0.1ml／minで温
度30℃で１時間循環した。ついで水で充分洗浄
後、１％N⁶−カルボキシエチル−ADPと0.5％
EDCを含む水溶液を流速0.1ml／minで温度30℃
で６時間循環した。ひきつづき水で充分洗浄後、
10ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を流速
0.5ml／minで温度30℃で１時間循環させて水不
溶性の担体であるチユーブを得た。 このチユーブを水で洗浄した後、バチルス・ス
テアロサーモフイルスNCA1503から得られた酢
酸キナーゼ5000単位を含む50ｍＭホウ酸緩衝液PH
8.3を30℃で循環した。２時間循環したのち、チ
ユーブを上記緩衝液で洗浄した。以上の様にして
回収された活性は2300単位であり、チユーブに固
定化された全活性は2600単位であつた。 実施例５（Ｚ＝ガラス、Ｙ＝プロピレン基の例） アミノプロピル−CPG（Electro−Nucleonics、
Ins.社製、アミノプロピル基を有する多孔質ガラ
スビーズ）２ｇを水10mlに懸濁させ、この懸濁液
に、N⁶−カルボキシエチル−ADP100mgを水10
mlに溶解した溶液を加え、PHを4.5に調節した。
この混合液を撹拌しながらEDC50mgを加えて10
時間室温で反応させた。この反応混合液を実施例
１と同様に濾過、洗浄した後、メタ過ヨウ素酸処
理することにより、水不溶性の担体が得られた。 この水不溶性の担体を0.05Mリン酸カリウム緩
衝液（PH8.0）20mlに懸濁させ、バチルス・ステ
アロサーモフイルスNCA1503から得られた酢酸
キナーゼを上記緩衝液に溶解させた溶液５ml
（50000単位）を加えて２時間ゆつくり振盪しなが
ら室温で反応させた。 この反応液を実施例１と同様な方法で洗浄、水
素化ホウ素ナトリウム処理を行つた後、固定化酢
酸キナーゼの活性および濾液の活性をそれぞれ測
定したところ、固定化された活性は23000単位で
あり、濾液の活性は25000単位であつた。 実施例６（Ｚ＝ポリエステル、Ｙ＝フエニレン基
の例） 12mlのキシレンと18mlのヘプタンとからなる溶
液に３ｇのテトラフルオロホウ酸トリエチルオキ
ソニウム塩を溶解し、この溶液中に直径約１mmの
ポリカーボネートビーズ２ｇを懸濁させ、温度30
℃で２時間反応させた。次にキシレンとヘプタン
の混合溶媒で充分洗浄した後、20％ｍ−フエニレ
ンジアミン水溶液30mlを加えて温度30℃で１時間
反応させた。そして水で充分洗浄した後、１％
N⁶−カルボキシエチル−ADPと0.5％EDCを含む
水溶液50mlを加え、温度30℃で４時間反応させ
た。引き続き水で充分洗浄した後、10ｍＭのメタ
過ヨウ素酸ナトリウム水溶液50mlを加え、温度30
℃で１時間反応させて水不溶性の担体（ビーズ）
を得た。 このビーズをガラスカラムに詰め、バチルス・
ステアロサーモフイルスNCA1503から得られた
酢酸キナーゼ5000単位を含む50ｍＭホウ酸緩衝液
（PH8.3）を30℃で循環した。２時間の循環の後、
カラム内のビーズを上記緩衝液で洗浄した。 以上のようにして回収された活性は2900単位で
あり、ビーズに固定化された活性は2000単位であ
つた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素を水不溶性の担体に固定化するに際し、
   下記一般式（） （ただし、ＸはCONH基またはCOO基、Ｙは二
   価の脂肪族基、二価の芳香族基または二価の脂環
   族基、Ｚは水不溶性の高分子または無機化合物を
   表わし、ｎは１ないし３、ｍは０または１であ
   る。）で示される水不溶性の担体を用いることを
   特徴とする酵素の固定化方法。