JPH01179686A - 乳糖資化性を有する新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、大腸菌のラクトース・オペロンに由来する遺
伝情報を含み、その形質発現に基づいて、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に
対して乳糖資化性を付与することができる組換え体ＤＮ
Ａを保有させた乳糖資化能を有するコリネ型グルタミン
酸生産菌および該微生物を乳糖を含む培地に培養し、培
養物中にアミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から該アミ
ノ酸を採取することを特徴とする乳糖含有原料からの発
酵法によるし一アミノ酸の製造法に関する。従って本発
明はバイオインダストリーの産業分野に関わり、特に医
薬、食品および飼料工業において有用なアミノ酸の製造
分野に関する。

さらに、本発明は、コリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属に属するコリネ型細菌内での遺伝子発現
に必要な機能を有するＤＮＡ断片を含む組換え体プラス
ミドの取得法に関する。その有用性は、コリネ型細菌に
おいて任意の遺伝子の発現を可能にしたり強化したりす
るために必要な機能を有するＤＮＡ断片を取得できる点
にあり、ひいては、コリネ型細菌において、代謝産物の
生産性の改善、新たな機能の付与、有用な酵素や生理活
性蛋白の生産などを可能にすることにある。

従来の技術 ］リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属など
に属するいわゆるコリネ型グルタミン酸生産菌を用いる
アミノ酸の製造法は、該菌種の野生株によるグルタミン
酸の製造法をはじめ、野生株から誘導された突然変異株
による種々のアミノ酸の製造法がよく知られている〔ア
ミノ酸発酵（上）　（下）アミノ酸・核酸集談会編、共
立出版（１９７２）　、アミノ酸発酵　相国、滝波、千
畑、学会出版センター（１９８６）　）。さらに近年、
該菌種のプラスミドベクター（特開昭５７−１３４５０
０　、特開昭５７−１８３７９９　、特開昭５８−１０
５９９９）および形質転換法（特開昭５７−１８６４９
２　、特開昭５７−１８６４８９）が開発されたことに
より、該菌種において、組換えＤＮＡ技術の適用が可能
となり、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種の新たな有効利用が可能になりつつある。

この組換えＤＮＡ技術の開発により、各種アミノ酸生産
菌の生合成経路上で律速となっている生合成系酵素の遺
伝子をクローン化し、それを含む組換え体ＤＮＡを導入
することによって、律速酵素の活性を増幅することが可
能になった。すでに、コリネ型細菌において、コリネ型
細菌由来の遺伝子のみならず大腸菌などの異菌種由来の
遺伝子をクローン化した組換え体ＤＮＡを導入すること
により、アミノ酸の生産性が改善された例が知られてい
る（特開昭５８−１２６７８９　、特開昭５９−１５６
２９２、特開昭５９−１５６２９４　、特開昭６０−２
４１９２、特開昭６０＝３４１９７　、特開昭６０−３
０６９３、特開昭６Ｏ−６６９８９）。

これらのコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種による各種アミノ酸の発酵生産は、遺伝的にこ
れらの菌種がもともと資化能を有するグルコース、フラ
クトース、ショ糖、マルトース、酢酸、エタノール、乳
酸あるいはそれらを含有する澱粉加水分解物、廃糖蜜な
どを主炭素原料として行われている。

これらの原料とは別に乳糖を原料とするコリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属微生物によるアミノ
酸の発酵生産も試みられている。

しかしながら、コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属などに属するコリネ型グルタミン酸生産菌は
乳糖資化能を有していない〔農芸化学会誌　３９．３２
８　（１９６５）］ので、乳糖を主炭素源として用いる
ことはできない。これまでに乳糖原料からアミノ酸を発
酵生産する方法として混合培養法が知られている。例え
ば、乳酸菌などの別の乳糖資化性微生物を共存させ、そ
の代謝能を借りて乳糖から乳酸を生成させ、この乳酸を
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のア
ミノ酸生産性菌株に資化させて、グルタミン酸、リジン
あるいはバリンを生産する方法が開示されている（特開
昭５７−１７４０９５　、特開昭５７−１７０１９４　
、特開昭５７−２０８９９３　）　。

発明が解決しようとする問題点 現在、チーズあるいはカゼインの製造工程で乳業廃液と
して多量に排出されるホエーは、通常、乳糖約５％、蛋
白質的１％を含有するが、一部が食品、飼料添加物、肥
料などに利用されているものの、大部分が廃棄されてお
り資源の有効利用ができないばかりか、環境汚染の原因
ともなっている〔食品工業　−１８，Ｎ［１１２，２０
（１９７５）　）　。ホ”−を発酵原料として使用でき
るならば、資源の有効利用ができると同時に環境汚染を
軽減でき、産業上の意義は大きい。前記の乳酸菌とコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物の
混合培養によるグルタミン酸などの生産は、ホエー中に
含まれる乳糖を原料として活用しようとしたものである
。しかしながら、乳酸菌による乳酸発酵が急速に進行し
すぎると培養液が酸性に移行し、コリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属菌種によるアミノ酸の発酵
阻害がおこるため、コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属するアミノ酸生産菌の乳酸資化性の
強度に応じて、両菌種の接種量や培養条件を工夫する必
要があるなど、操作が繁雑であると同時に培養管理が難
しい。そこで本発明者は、元来乳糖資化能のないコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物に、
組換えＤＮＡ技術を用いて乳糖資化能を付与し、コリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物のみ
を用いるホエーなどの乳糖を原料とする各種アミノ酸の
発酵生産法を開発するために研究を行った。

上記の組換え体ＤＮＡの導入によるアミノ酸生産菌の改
良は、コリネ型細菌内で発現可能な酵素遺伝子の遺伝子
増幅効果に基づいている。しがしながら、これらの遺伝
子の発現は、該遺伝子の供与体となった微生物固有の遺
伝子発現調節部位の支配下に起こるものである。従って
、導入した遺伝子の発現効率が低く、生産性を顕著に改
善できない場合もある。従って、生産性を最大限に向上
させるには、導入する遺伝子の発現を高めることが必要
である。

微生物の遺伝子発現には、構造遺伝子の上流に転写開始
に必要なプロモーター領域と伝令ＲＮＡから蛋白質を合
成する翻訳に必要なりボゾーム結合部位とが存在するこ
とが不可欠であり、発現効率は主にプロモーターの強さ
に依存していると考えられている。さらに、このプロモ
ーター領域とりボゾーム結合部位は、種特異的な塩基配
列を有すると考えられる。従って、任意の構造遺伝子を
宿主微生物由来の強力なプロモーター領域と適正なりボ
ゾーム結合部位の下流に配することにより、該遺伝子を
効率よく発現させることが可能となる。

遺伝子発現機構が詳細に解析されている大腸菌では、こ
のような遺伝子発現系がすでに構築さ−れている〔中村
研三、化学と生物、毅、　４７　（１９８２）　）。

また、同様な遺伝子発現系は、大腸菌についで遺伝解析
の進んでいる枯草菌でも確立されている〔堀之内末治、
蛋白質・核酸・酵素、　２８．１４６８（１９８３）、
Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　Ｄ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、　　ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２９３　、３０９（１９８１）
）。

一方、コリネ型細菌由来のプロモーター領域を取得する
方法として、クロラムフェニコール耐性を発現マーカー
とするプロモーター検出ベクターが報告されている（特
開昭６ｌ−１２４３８７）。このベクターは、大腸菌の
タロラムフェニコール耐性遺伝子中、プロモーター領域
を除いた領域、即ち、該遺伝子由来のりボゾーム結合部
位と構造遺伝子を有しており、この上流にプロモーター
のクローニング部位が存在している。このクローニング
部位に、コリネ型細菌由来のＤＮＡ断片を挿入し、コリ
ネ型細菌に対してクロラムフェニコール耐性形質を付与
する組換え体プラスミドを選択することにより、コリネ
型細菌のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片が取得され
る。この組換え体プラスミドのクロラムフェニコール耐
性遺伝子は、コリネ型細菌由来のプロモーター領域から
転写が開始され、生成した伝令ＲＮＡ上に存在する大腸
菌クロラムフェニコール耐性遺伝子由来のりボゾーム結
合部位の機能により、翻訳が開始されて、発現がおこる
ものと考えられる。しかしながら、前記の遺伝子発現支
配領域における種特異性を鑑みると、コリネ型細菌由来
の強いプロモーターが挿入されたとしても、大腸菌のり
ボゾーム結合部位が、コリネ型細菌での翻訳に必ずしも
適しておらず、翻訳が律速となって効率的な遺伝子発現
ができない可能性がある。従ってコリネ型細菌内で強い
遺伝子発現をもたらす発現支配領域を取得するためには
、転写開始領域のみならず翻訳開始領域の両者を含むＤ
ＮＡ断片をクローン化するのが望ましいと考えられる。

しかし、これまでにこの両者を取得する有効な方法がな
かった。

問題点を解決するだめの手段 大腸菌のラクトース・オペロンに由来する遺伝情報を組
換えＤＮＡ技術を用いてコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物に導入し発現させる
ことにより、コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物が乳糖資化能を獲得することを
見出した。

さらに、コリネ型細菌の遺伝子発現に必要な転写・翻訳
の開始を司るプロモーター領域とりボゾーム結合部位と
を長大な染色体ＤＮＡから取得する方法について鋭意研
究した。その結果、コリネ型細菌内で複製でき、大腸菌
のラクトース・オペロン由来のβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼおよびβ−ガラク
トシドパーミアーゼの構造遺伝子断片を含み、その遺伝
子発現に基づいてコリネ型細菌の遺伝子発現調節に係わ
るＤＮＡ断片をクローン化できるプラスミドベクターを
作成し、本発明を完成するに至った。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明は、大腸菌のラクトース・オペロン由来のβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼとβ−ガラクトシドパーミアーゼの
構造遺伝子の全てまたは一部およびそのコーディング領
域の上流に位置し、コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌種中で外来遺伝子の発現を可能にする
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物由来のＤＮＡ断片を含み、かつコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に
対して乳糖資化性を付与できる組換え体ＤＮＡを保有す
る乳糖資化性を有するコリネ型グルタミン酸生産菌およ
び、該微生物を乳糖を含む培地に培養し、培養物中にア
ミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から該アミノ酸を採取
することを特徴とするアミノ酸の製造法に関する。

その有用性は、チーズあるいはカゼインの製造工程で大
量に生成し廃棄されているホエーに含まれる乳糖を原料
として、各種Ｌ−アミノ酸の発酵生産を可能にすること
にある。遺伝的に乳糖を資化できないコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属などに属するコリネ型
グルタミン酸生産菌に、組換えＤＮＡ技術を用いて乳糖
資化能を付与し、乳糖あるいは乳糖を含むホエーなどを
原料として、各種アミノ酸を直接発酵生産する技術は本
発明によって初めて開発されたものである。

本発明により製造されるアミノ酸としては、グルタミン
酸、グルタミン、リジン、スレオニン、イソロイシン、
バリン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン
、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、シ
トルリン、プロリンなどがあげられる。

さらに、本発明は、コリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属に属する微生物で複製でき、選択可能な
遺伝子マーカーをもつと同時に、大腸菌のラクトース・
オペロン由来のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性発現に
必要な構造遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を有し、その上
流に隣接して制限酵素切断部位を有するプラスミドの該
制限酵素切断部位にコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属する微生物のＤＮＡ断片を挿入して
得られる組換え体プラスミドを用いて、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属微生物を形質転換し
て乳糖分解活性を獲得した形質転換株を得、該形質転換
株から組換え体プラスミドを単離することを特徴とする
該微生物内での遺伝子発現に必要な転写・翻訳の開始を
司るＤＮＡ断片を含む組換え体プラスミドを取得する方
法に関する。

本発明のコリネ型細菌の転写・翻訳の開始を司るＤＮＡ
断片のクローン化に用いるプラスミドは、コリネバクテ
リウム属およびブレビバクテリウム属菌種で複製でき、
選択可能な遺伝子マーカーをもっと同時にラクトース・
オペロン由来のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼあるいはβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼおよびβ−ガラクトシドパーミア
ーゼの構造遺伝子を有し、しかもその上流に隣接して制
限酵素切断部位を有するものであればいかなる工程で作
製されたものでも適用可能である。例えば、大腸菌Ｋ１
２株のラクトース・オペロン中のＩａｃＺ（β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ構造遺伝子）・１ａｃＹ（β−ガラクト
シドパーミアーゼ構造遺伝子）領域を含むＤＮＡ断片を
取得し、それをコリネバクテリウム属あるいはブレビバ
クテリウム属菌種内で複製・選択可能なプラスミドベク
ターに連結するという工程で作製できる。

本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属し、アミノ酸生産能を有
する微生物は全て用いることができるが、好適には下記
の菌株およびそれらの変異株が用いられる。

コリネバクテリウム・グルタミン酸 ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＾ＴＣＣ１３８６ｇ コリネバクテリウム・リリウム　ＡＴＣＣ１５９９０ブ
レビバクテリウム・デイバリカラム ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム　ＡＴＣＣ１４０６７ブ
レビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０６
８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ グルタミン酸やグルタミンなどの生産には野生株を用い
ることもできるが、−段と生産性の向上した変異株（例
えば、特開昭６０−６６９９０あるいは特開昭５５−１
４８０９４に記載されている変異株など）を用いる方が
好ましい。その他の各種アミノ酸の生産には公知の変異
誘導法または組換えＤＮＡ技術を用いて造成された各種
アミノ酸生産性菌株を用いることができる。

本発明の乳糖資化に関わる遺伝情報は、大腸菌に１２株
の乳糖資化性に関与するラクトース・オペロンを供給源
として得ることができる。ラクトース・オペロンは大腸
菌の遺伝子の中で最も詳細に研究されており、遺伝子構
造、発現様式がほぼ明らかにされている〔ザ・ラクトー
ス・オペロン（Ｔｈｅ　Ｌａｃｔｏｓｅ　０ｐｅｒｏｎ
）、　Ｊ、Ｒ，Ｂ’ｅｃｋｗｉｔｈ、　　コールド　ス
プリング　ハーバ−ラボラトリ−（１９８２）　）。

ラクトース・オペロンには、３つの構造遺伝子１ａｃＺ
、　　ＩａｃＹ、　　１ａｃＡがその順番に配位し、そ
の方向へ一転写単位として転写される。Ｉａｃ　Ｚ　。

１ａｃＹ、　　ＩａｃＡはそれぞれβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、β−ガラクトシドパーミアーゼ、およびガラク
トシドアセチルトランスフェラーゼをコードし、乳糖資
化にはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとβ−ガラクトシドパ
ーミアーゼが必要とされている。

乳糖はβ−ガラクトシドパーミアーゼで細胞膜を透過し
てとり込まれ、とり込まれた乳糖はβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼによりガラクトースとグルコースに加水分解され
、あとは一般代謝経路を経て分解利用される。

本発明におけるコリネバクテリウム属およびブレビバク
テリウム属菌種の乳糖資化性の獲得は、大腸菌のラクト
ース・オペロンのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼおよびβ−
ガラクトシドパーミアーゼ遺伝子が本菌種内で発現する
か否かに係わる。しかし、元来大腸菌に存在する転写・
翻訳シグナルをも含めたラクトース・オペロンそのもの
を含有する組換え体プラスミドを使用した場合、ラクト
ース・オペロンはコリネバクテリウム属およびブレビバ
クテリウム属菌種内で発現はするが、その発現が微弱で
あるため乳糖資化能を与えるまでに至らない。つまり発
現がある強度で起こらないとコリネバクテリウム属およ
びブレビバクテリウム属菌種は乳糖資化能を獲得できな
い。従ってコリネバクテリウム属およびブレビバクテリ
ウム属菌種へ乳糖資化能を付与するためには、大腸菌の
ラクトース・オペロンのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼおよ
びβ−ガラクトシドパーミアーゼ遺伝子が、本菌種内で
十分発現できるような工夫を加えた組換え体プラスミド
を作製する必要がある。

本発明者は、大腸菌のラクトース・オペロンの上流に存
在する転写・翻訳シグナルを取り除き、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属菌種由来の転写・翻
訳シグナルを含むＤＮＡ断片を挿入すれば、コリネバク
テリウム属およびブレビバクテリウム属菌種内で大腸菌
のラクトース・オペロンが乳糖資化能を与え得る強度に
発現できることを見出した。

従って、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種に乳糖資化能を与え得る強度の発現が可能な大
腸菌のラクトース・オペロンを含む組換え体プラスミド
は、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属
菌種内で大腸菌のラクトース・オペロンの発現を可能に
する該属菌種由来のＤＮＡ断片を大腸菌のラクトース・
オペロンの構造遺伝子の上流に挿入することにより作製
できる。このようなプラスミドは、大腸菌に１２株のラ
クトース・オペロン中の１ａｃｅ、　　１ａｃＹｌ造遺
伝子領域を含むＤＮＡ断片を取得し、それをコリネバク
テリウム属およびブレビバクテリウム属菌種内で複製可
能なプラスミドベクターに連結し、しかる後に１ａｃＺ
、　　ＩａｃＹコーディング領域の上流に外来遺伝子の
発現を可能にするコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属微生物由来のＤＮＡ断片を挿入し、コリネ
バクテリウム属およびブレビバクテリウム属微生物に乳
糖資化能を付与する組換え体プラスミドを選択するとい
う手順で構築される。

ラクトース・オペロンの］ａｃＺ、　　ＩａｃＹ構造遺
伝子のコーディング領域の全てまたは一部を含むＤＮＡ
断片は、大腸菌の宿主−ベクター系を用いてミ大腸菌に
１２株の乳糖を資化できない変異株を受容菌とし、乳糖
資化性の回復を指標にして、公知のｉｎ　ｖｉｔｒｏ組
換え技法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、　ＴｏＭａｎｉａｔｉｓ　
ｅｔ　　ａｌ。

コールド　スフリング　ハーバ−ラボラトリ−（１９８
２）　）によりラクトース・オペロンをセルフクローニ
ングし、しかる後にエンドヌクレアーゼおよびエキソヌ
クレアーゼなどでＩａｃＺ、　１ａｃＹ構造遺伝子をサ
ブクローン化することによって、組換え体プラスミドを
取得できる。あるいは既にサブクローニングされている
ＩａｃＺ、　］Ｉａｃの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を
使用することもできる。

例えば、Ｃａ５ａｄａｂａｎ　らによって開発されたｌ
ａｃ　Ｚ構造遺伝子を含むプラスミドｐＭｃ１８７１　
　〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、２５７Ｈ１９８３）　：］が
好適な材料となる。

ｐＭｃ１８７１は大腸菌のプロモーターを検出するため
のベクターであり、ラクトース・オペロンのプロモータ
ー領域からβ−Ｄ−ガラクトシダーゼのＮ末端の８個の
アミノ酸のコーディング部位を欠き、マルチリンカ−に
隣接して９個目のアミノ酸からβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼのＣ末端の直前のＥｃｏ旧切断部位までのβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼコーディング領域を含むプラスミドであ
る。ｐＭｃ１８７１のＩａｃ　Ｚコーディング領域の下
流に別にクローン化した大腸菌のラクトース・オペロン
からサブクローン化した１ａｃＹコーデイング領域を含
むＤＮＡ断片を配するようにｉｎ　ｖｉｔｒｏで組み換
えることにより、大腸菌の転写・翻訳シグナルを含まず
、Ｎ末端に対応する一部のアミノ酸のコーディング領域
を欠いたｌａｃ　Ｚと１ａｃＹ構造遺伝子を含むＤＮＡ
断片が取得できる。

次にこのＩａｃＺ、　　１ａｃＹ構造遺伝子領域を含む
ＤＮＡ断片を、コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属微生物のベクターに連結する。

コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属のベ
クターとしては、菌属微生物で複製できるものであれば
特に限定されないが、例えばｐＣＧ　１（特開昭５７−
１３４５００）、ｐＣＧ２　（特開昭５８−３５１９７
）、ｐＣＧ４、ｐｃＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８
３７９９）、ｐｃＢ５１゜ｐｃＥ５２．　ｐＣＥ５３　
（いずれもモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティクス（Ｌｌｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　）１
９６、１７５　（１９８４）　］あるいは、それらから
誘導されたプラスミドを使用することができる。ベクタ
ープラスミドＤＮＡは特開昭５７−１３４５００あるい
は特開昭５７−１８６４８９に開示した方法でそれらを
保有する菌株の培養菌体から単離精製できる。

大腸菌の宿主〜ベクター系でプラスミド上にクローン化
された１ａｃＺ、　　１ａｃＹ構造遺伝子含有ＤＮＡ断
片は、制限酵素で切断しアガロースゲル電気泳動にかけ
た後抽出分取できる。一方、ベクタープラスミドを連結
可能な切断末端を与える制限酵素で切断する。両者を混
合し、Ｔ４１Ｊガーゼで連結反応した混成物を用いて、
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生
物を、プロトプラストを用いる方法（特開昭５７−１８
６４８９、特開昭５７−１８６４９２　、特開昭５８−
１２６７８９）で形質転換し、ベクターの有する選択マ
ーカーで選択し形質転換株を分離する。形質転換株から
プラスミドを単離し、制限酵素での切断によりプラスミ
ドの構造を調べ、目的の連結プラスミドを取得すること
ができる。次のステップで、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
、β−ガラクトシドパーミアーゼが発現可能なプラスミ
ドを誘導するので、連結プラスミドは１ａｃＺ、　１ａ
ｃＹのコーディング領域のすぐ上流に制限酵素部位を有
する必要がある。本発明の実施例に示したプラスミド９
日’　Ｉａｃｌは、前記のようにして得られるＩａｃ　
Ｚ　−１ａｃ　ＹＤＮＡ断片を、Ｍ１３ｍｐ１９ＲＦＤ
ＮＡ由来のオリゴリンカ−を有するｐｃＧｌｌｌにオリ
ゴリンカ一部位で連結したもので、Ｉａｃ　Ｚ　−Ｉａ
ｃ　Ｙコーディング領域上流に隣接してオリゴリンカ−
由来の複数の制限酵素部位が配されており、目的にかな
った構造を有している。

このようにして作製されたＩａｃＺ’、　　ＩａｃＹ構
造遺伝子を有するプラスミドを用いることにより、その
発現を検出指標にしてコリネ型細菌の転写・翻訳の開始
を司るＤＮＡ断片をクローン化できる。

取得目標とするＤＮＡ断片の供与源およびクローン化す
るための宿主微生物は、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属するコリネ型細菌として知られ
る微生物はいずれでも使用できるが、好適には次の菌株
およびこれらから誘導される変異株が用いられる。

コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ３１８３３ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキユリス ＾ＴＣＣ１３８６８ コリネバクテリウム・リリウム　ＡＴＣＣ１５９９０ブ
レビバクテリウム・デイバリカラム ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム　ＡＴＣＣ１４０６７プ
レビバクテリウム・イマリオフィラム＾ＴＣＣ１４０６
８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ 上記プラスミドを用いてコリネ型細菌の転写・翻訳の開
始を司るＤＮＡ断片のクローン化は以下のように行うこ
とができる。

プラスミドをＩａｃＺ、　１ａｃＹ構造遺伝子のコーデ
ィング領域上流に隣接する制限酵素切断部位で切断する
。一方、発現を可能にするＤＮＡ断片の供与源となるコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物
の染色体ＤＮＡを、同一の制限酵素あるいは同一の付着
末端を与える制限酵素で完全消化あるいは部分消化する
。雨滴化物を混合し、Ｔ４リガーゼで連結反応する。こ
の混成物でコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属微生物のプロトプラストを形質転換し、ベクター
マーカーの薬剤と５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）を含
む再生寒天培地上に塗布する。

コリネ型細菌は、元来、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性
を有さないがｌａｃ　Ｚ構造遺伝子のコードするβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ活性を発現する形質転換コロニーは
この選択培地上で青色を呈する。

呈色した形質転換株の培養菌体から常法に従いプラスミ
ドを単離することにより、Ｉａｃ　Ｚ構造遺伝子の上流
の制限酵素部位にコリネ型細菌の転写・翻訳の開始を司
るＤＮＡ断片を挿入した組換え体プラスミドを取得でき
る。

コロニーの青色呈色は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼがＸ
−ＧＡＬを分解することに基づいており、強いβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ活性をもつコロニーはど呈色度が濃く
なる。従って強い遺伝子発現をもたらす転写・翻訳開始
を司るＤＮＡ断片が挿入された組換え体ＤＮＡを保有す
る菌は、濃い青色を呈するコロニーとして容易に検出で
きる。発現度は青色を呈した形質転換株を培養し、その
菌体破砕物中のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定す
ることにより、正確に調べることができる。

以上のようにして取得したコリネ型細菌由来のプロモー
ター・リボゾーム結合部位を含むＤＮＡ断片が挿入され
たプラスミドに、大腸菌内で複製可能なベクターを連結
することによって、大腸菌とコリネ型細菌とのシャトル
プラスミドを作製し、大腸菌内に導入して、該プロモー
ターの大腸菌内での発現強度を調べることができる。大
腸菌内でのコリネ型細菌由来のプロモーター・リボゾー
ム結合部位支配下におこるβ−ガラクトシダーゼの発現
度を後述の実施例の（６）に示した方法で調べた結果、
第２表に示すように、コリネ型細菌内で強い発現を示す
プロモーター・リボゾーム結合部位が、大腸菌内では必
ずしも強い発現を示さず、両者に相関性がみられないこ
とがわかった。このことは、コリネ型細菌の遺伝子転写
・翻訳開始領域が、大腸菌とは質的に異なることを意味
している。

この結果からコリネ型細菌内での遺伝子の強発現のため
には、プロモーターだけでなく転写・翻訳開始領域の両
者がコリネ型細菌由来である必要があることが確認でき
た。

従って、コリネ型細菌由来の転写・翻訳開始領域を同時
に取得できる本発明が、コリネ型細菌の遺伝子発現支配
領域の取得法として有効である。

以上のようにして、プラスミド上にクローン化された遺
伝子発現機能を担うＤＮＡ断片は、プラスミドの制限酵
素地図に基づいて適当な制限酵素で切り出し、アガロー
スゲル電気泳動にかけた後、抽出分取できる。単離され
た強い遺伝子発現をもたらすコリネ型細菌の転写・翻訳
の開始を司るＤＮＡ断片を任意の構造遺伝子の上流に連
結した組換え体ＤＮＡは、公知のＤＮＡ組換え技法によ
り作製でき、これをコリネ型細菌に導入することにより
所望の遺伝子産物をコリネ型細菌で高レベルに合成する
ことができる。従って、アミノ酸などの代謝産物の生合
成に係わる酵素の構造遺伝子の発現を強化した場合には
、代謝産物の生産性を一層改善することができる。また
、異種微生物あるいは真核生物由来の構造遺伝子を発現
させることにより、乳糖資化能のように元来コリネ型細
菌にはない代謝機能を付与したり、真核生物の有用生理
活性蛋白を生産させることが可能となる。

コリネ型細菌の転写・翻訳を司るＤＮＡ断片のクローン
化を可能にするプラスミドｐＥ’１ａｃ１は、コリネバ
クテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３３に導入さ
れ、コリネバクテリウム・グルタミカムＫ　７３　（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−１１７８）として工業技術院微生物工業
技術研究所（微工研）に昭和６１年９月２７日付で寄託
されている。

さらに、１ａｃＺ、　１ａｃＹ構造遺伝子を含むＤＮＡ
断片を有するコリネバクテリウム属およびブレビバクテ
リウム属菌種中で複製できるプラスミドから、コリネバ
クテリウム属およびブレビバクテリウム属微生物に対し
て乳糖資化性を付与できる組換え体ＤＮＡを誘導する。

該プラスミドをＩａｃ　Ｚ。

１ａｃＹ構造遺伝子のコーディング領域上流に隣接する
制限酵素部位で切断する。一方、外来遺伝子の発現を可
能にするＤＮＡ断片を得るために、コリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属微生物の染色体ＤＮＡを
、同一の制限酵素あるいは同一の付着末端を与える制限
酵素で完全消化あるいは部分消化する。雨滴化物を混合
しＴ４１Ｊガーゼで連結反応する。この混成物でコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物のプ
ロトプラストを形質転換し、ベクターマーカーの薬剤と
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を持つクローンの検出を
可能にする薬剤５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）を含む
再生寒天培地ＲＣＧＰ上に塗布する。この選択寒天培地
上で青色を呈するコロニーを選択することにより、乳糖
資化能を獲得した形質転換株を分離できる。このような
形質転換株の中から、乳糖を単一炭素源として生育する
菌株が得られる。これらの形質転換株から単離されるプ
ラスミドで、コリネバクテリウム属右よびブレビバクテ
リウム属微生物を形質転換すると、乳糖を資化するよう
になることから、乳糖資化性は該プラスミドによって付
与されていることがわかる。

このようにしてコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属細菌に対して乳糖資化性を与える組換え体プ
ラスミドが構築できる。このような組換え体プラスミド
としてｐＨ’　Ｉａｃｌから誘導されたプラスミドｐＣ
ＰＬ７はｐＨ’　１ａｃｌのＩａｃ　Ｚ構造遺伝子の上
流に、外来遺伝子の発現を可能にするために、コリネバ
クテリウム属微生物由来の染色体ＤＮＡを制限酵素５ａ
ｕ３Ａにより切断して得られる３、１キロベースのＤＮ
Ａ断片が挿入された構造を有している。

以上のようにして作製した乳糖資化性を付与する組換え
体プラスミドは、前記のプロトプラストを用いる形質転
換法によりコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する各種アミノ酸生産性菌株に導入できる。

この乳糖資化性を付与する組換え体プラスミドを導入す
る微生物としてはコリネ型グルタミン酸生産菌として知
られるコリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバク
テリウム・ノ１−キュリス、ブレビバクテリウム・フラ
バムまたはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
などに属する微生物があげられる。組換え体プラスミド
を導入した微生物の例としては、具体的には実施例に示
すが一例としてコリネバクテリウム・グルタミカムに７
４があげられる。この菌株は、ｐＣＰＬ　７を導入した
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３３
であり、微工研に昭和６１年９月２７日付でコリネバク
テリウム・グルタミカムＫ　７４　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
１１７９）　として寄託されている。

上記のようにして得られた乳糖資化性を有するコリネ型
グルタミン酸生産菌は、乳糖をβ−ガラクトシドパーミ
アーゼにより細胞膜を透過してとり込み、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼによりガラクトースとグルコースに加水分
解して得られるグルコースを利用してアミノ酸を生産す
る。

これらの組換え体プラスミド保有株によるアミノ酸の生
産は、炭素源としてブドウ糖や糖蜜を用いる場合と同様
な培養法により行うことができる。

すなわち該形質転換株を、炭素源としてブドウ糖や糖蜜
を用いる代わりに乳糖含有物を使い、その他に窒素源、
無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する培地で好気
的条件下、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、
培養物中にＬ−アミノ酸を蓄積させることができる。ま
た、一般的にプラスミド保有株の培養においてはプラス
ミドの脱落という問題がおこりやすいが、本発明方法の
場合は、プラスミド脱落株は乳糖を主炭素源とする発酵
培地での生育能を失なうため、結果的にプラスミドが安
定に保持される。

炭素源として用いる乳糖含有物は、乳糖そのものでもよ
いが、チーズ・ホエー、カゼイン・ホエーあるいはこれ
らのホエーから抽出、濃縮、部分精製した乳糖含有物を
用いることもできる。

さらに、通常アミノ酸発酵に用いられるグルコース、ク
リセロール、フラクトース、シュークロース、マルトー
ス、マンノース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの種
々の炭水化物、ポリアルコール、ピルビン酸、フマール
酸、乳酸、酢酸などの各種有機酸も炭素源として使用で
きる。さらに菌の資化性によって、炭化水素、アルコー
ル類なども用いうる。

窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−
アミン、肉エキス。

酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水
分解物、フィツシュミールあるいはその消化物、蝋加水
分解物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能
である。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム。

塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム
、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなど
を使用する。微生物の生育に必要とするビタミン、アミ
ノ酸源などは、前記したような他の培地成分によって培
地に供給されれば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養あるいは通気撹拌培養など好気的条件下
で行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である。

培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培養
期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−アミノ酸が蓄積す
る。培養終了後、菌体を除去して、各々のアミノ酸で確
立された公知の方法で培養液からし一アミノ酸を回収す
る。

ビオチンを高濃度含有している糖蜜を炭素源としてＬ−
グルタミン酸を生産する場合には、従来ペニシリンなど
の抗生物質（特公昭３７−１６９５）、界面活性剤ある
いは飽和脂肪酸（特公昭４０〜８７９８、特公昭４Ｏ−
１４５５９）を添加したり、オレイン酸要求株（特公昭
５Ｏ−１９６３２）　、あるいはグリセロール要求株（
特公昭５ｌ−３３９９７）を用いる方法が開発されてい
る。ホエー中にも一般的に高濃度のピオチンが含まれて
いるので、ホエーを原料として用いる場合にも、糖蜜原
料と同様な培養法でし一グルタミン酸を生産できる。

このように乳糖資化性を付与できる組換え体プラスミド
を保有したコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する各種アミノ酸の生産性菌株を用いること
により、乳糖含有物を原料としてＬ−グルタミン酸、Ｌ
−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソ
ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトフ
ァン。

Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロンン、Ｌ−ヒスチジン
、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリンお
よびＬ−プロリンなどの各種アミノ酸を生産することが
できる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例 （１）大腸菌ラクトース・オペロンのクローニングエツ
ジエリシア・コリに１２株亜株で、ラクトース資化性を
もつＫ　２９４　　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５２６）の培養
菌体から、Ｍａｒｍｕｒらの方法〔ジャーナル・オブ・
モレキユラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏ
ｌ、　）３、２０８　（１９６１））に従って高分子染
色体ＤＮＡを単離した。

クローニングのベクターとして用いたｐＢＲ３２２〔ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）、　　２．９５　（１９７５）　）は
、全酒造社製の市販のものを用いた。

上記で調製した染色体ＤＮＡ２■を含む制限酵素Ｂｇ４
２　ｎ用反応液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（以下トリスと略す）１０ｍＭ。

ＭｇＣｊ？ｚ　　１０ｍＭ、ＮａＣｊ！　　１００ｍＭ
。

ジチオスレイトール１ｍＭ、ｐＨ７，５１］　９０１１
！ｌに４単位のＢｇβ■（全酒造社製）を添加し、３７
℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を
停止させた。一方、ｐＢＲ３２２１μｇを含むＢａｍＨ
ｎ用反応液（トリフ、１０ｍＭ。

ＭｇＣｌ２　１０ｍＭ、ＮａＣｊ！　　１００ｍＭ。

ジチオスレイトール１ｍＭ、ｐＨ７，５）９０ｍに２単
位のＢａｍＨＩ（全酒造社製）を添加し、３７℃で６０
分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止させ
た。

両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ用緩衝
液（トリス６６０ｍＭ、ＭｇＣＬ６６ｍＭ、　　ジチオ
スレイトール１００ｍＭ。

ｐＨ７，６）２０Ａｌｌ、１００ｍＭ　　ＡＴＰ　　２
屑。

Ｔ４１Ｊガーゼ（全酒造社製）３５０単位を加え１２℃
で１６時間連結反応させた。この反応物を、エツジエリ
シア・コリに１２株亜株に７２（Ｌａｒ　、　Ｌｅｕ−
）の形質転換に供した。Ｋ７２株は昭和６１年９月２７
日付で微工研にＦ　Ｅ　ＲＭＢＰ−１１７６として寄託
されている。

形質転換はダジェルトらの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）。

６．２３　　（１９７９））に従って行った。

即ち、Ｌ培地（バクトドリブトン１０ｇ１酵母工キス５
ｇ１ブドウ糖１ｇおよび塩化ナトリウム５ｇを水１１に
含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）５０ｍｌにに７２
株を植菌し、東京光電比色計で６６０ｎｍにあける吸光
度（ＯＤ）（以下特記しないかぎり吸光度は６６０ｎｍ
で測定）が０．５になるまで３７℃で培養した。培養液
を氷水中で１０分間冷却してから遠心した。冷却した０
、１Ｍ塩化カルシウム２０ｍｊ！に菌体を再懸濁し、０
℃に２０分間装いた。菌体を再遠心し、Ｑ、１Ｍ塩化カ
ルシウム０．５＋ｎ１に懸濁し、０℃で１８時間装いた
。塩化カルシウム処理した菌液１５０μβに上記リガー
ゼ反応混合物５０ｔｄｌを添加混合し、０℃に１０分間
装いてから３７℃で５分間加温した。次いでＬ培地２ｍ
１を添加し、３７℃で２時間振盪培養した。

この菌液をアンピシリン１００■／１Ｔｌｌ、Ｘ−ＧＡ
Ｌ　　４０湖／ｍｌを含むＬ寒天培地（Ｌ培地１１に寒
天１６ｇを加えた培地）に塗布し、３７℃で１日間培養
した。寒天培地上で青色に呈色したコロニーを釣菌し、
性質を調べた結果、ラクトースを炭素源とし、ロイシン
を含む最少培地（ラクトース１０ｇ＋　　Ｋ２　ＨＰＯ
４７ｇ。

ＫＨ２ＰＯ２２ｇ、クエン酸２ナトリウム２水塩０．５
　ｇ、（ＮＨ４）２５０４１　ｇ、　Ｍｇ　ＳＯ４・７
　Ｈ２Ｏ０，１ｇ、サイアミン塩酸塩０．１　ｍｇ。

ロイシン５０ｍｇおよび寒天１６ｇを水１１に含み、ｐ
　Ｈ７，２に調整した培地）に生育し、テトラサイクリ
ン２５■／ｍｌを含むし寒天培地には生育しなかった。

この形質転換株から、アンらの方法〔ジャーナル・オブ
・バタテリオロジ４　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）。

月０　、４００　（１９７９）　）に従って、プラスミ
ドＤＮＡを単離し、制限酵素消化とアガロースゲル電気
泳動で解析した。得られたプラスミドの大きさは、１５
．３キロベース（ｋｂ）であり、ｐＢＲ３２２のＥｌａ
ｍ）ｌ　Ｉ　ｇＪＷｒ点の位置に、エツジエリシア・コ
リに２９４の染色体ＤＮＡ由来の１ｌｋｂのＢｇｌ！ｆ
ｌ挿入断片を有していた。このプラスミドをｐＬａｃ　
１と命名した。

（２）新規ベクターｐｃＧ１１１の作製コリネバクテリ
ウム・グルタミカムにおいて複製可能なベクターｐｃＧ
１１　　（特開昭５７−１８３７９９＞とＭ１３の９１
９１ｉＦＤＮＡ　に含まれるマルチリンカ−とを、以下
に示す方法で連結させｐｃＧｌｌｌを作製した。

ｐｃＧｌｌ　は、これを保有するコリネバクテリウム−
クルタミカムＡＴＣＣ３９０１９（ＡＴＣＣ３１８３３
から誘導したりゾチーム感受性変異を有する菌株）の培
養菌体から次の方法で単離した。

該菌株を４００＋ｎ１ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ１
酵母エキス５ｇを水１βに含みｐＨ７，２に調整した培
地）で３０℃で振盪培養し、ＯＤが約０バになるまで生
育させた。菌体を集菌しＴＢＳ緩衝液１：０．０３Ｍト
リス、０．００５　Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム（ＥＤＴＡ）、０．０５Ｍ　ＮａＣｌ１．ｐＨ８，
０］　で洗浄後、リゾチーム溶液（２５％ショ糖、０．
ＩＭＮａＣｆｌ。

０．０５Ｍ）リス、　　０．８　ｍｇ／ｍｌ　　リゾチ
ーム。

ｐＨ８，０）１０ｍｌに懸濁し、３７℃で２時間反応さ
せた。反応液に５　Ｍ　ＮａＣ１２，４ｍｌ、　０．５
　ＭＢＤＴＡ　（ｐＨ８，５）　０．６ｍｌ、　　４％
ラウリル硫酸ナトリウムと０．７ＭＮａＣｊ！からなる
溶液４．４ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してから氷
水上に１５時間装いた。溶菌物を遠心管に移し、４℃で
６０分間６９．０００　Ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液
を回収した。これに重量百分率１０％相当のポリエチレ
ングリコール（ＰＢＧ）　６，０００　（半井化学薬品
社製）を加え、静かに混和して溶解後、氷水上に置いた
。１０時間後、１．５ＯＯＸｇで１０分間遠心分離して
ペレットを回収した。

ＴＢＳ緩衝緩衝液５奢ｌえてペレットを静かに再溶解し
てから１．５　ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド２．Ｑ
ｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶解
し、密度を１．５８０に合わせた。

この溶液を１０５，０ＯＯＸ　ｇ、　　１．８℃で４８
時間超遠心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心
チューブ下方の密度の高い位置のバンドを遠心チューブ
の側面から注射器で抜きとることによってｐｃＧ１１プ
ラスミドＤＮＡを分離した。この分画液を等容量のイソ
プロピルアルコール液〔容量百分率９０％イソプロピル
アルコール。

１０％Ｔ８Ｓ緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セ
シウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイド
を抽出除去し、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対して透析し
た。

このｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡ　　１■を含む制限酵
素５Ｓｔｌ用反応液（トリス１０　ｍｔＪ、　Ｍ　ｇ　
Ｃβ２１０ｍＭ、　　ジチオスレイトール１ｍＭ、ｐＨ
７，５）９０〃に、１単位の５ｓｔＩ　　（全酒造社製
）を添加し、３７℃で６０分間反応後、さらにＩＭＮａ
（ｌ　　Ｉｏｎと１単位のＰｓｔＩ（全酒造社製）を加
え、３７℃、６０分間反応させ、６５℃。

１０分間の加温により反応を停止させた。

同様にして、Ｍ　１３ｍｐ　１９ＲＦＤＮＡ　（全酒造
社製）１■を５ｓｔｌとＰｓｔｌで消化し、反応を停止
させた。両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４リガーゼ
用援衡液２０ｔ−ｔｌｌ、１００ｍＭＡ’ｒＰ２ｄ、Ｔ
４リガーゼ３５０単位を加え１２℃で１６時間連結反応
させた。この反応物をコリネバクテリウム・グルタミカ
ムＡＴＣＣ３１８３３の形質転換に供した。

形質転換には次のように調製されるプロトプラストを用
いた。ＮＢ培地で増殖させたＡＴＣＣ３１８３３株の種
培養を半合成培地ＳＳＭ（グルコース２０ｇ、　　（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４Ｌｏｇ、尿素３ｇ。

酵母エキスＩｇ、ＫＨｉＰＯ＜　　Ｉｇ、ＭｇＣｊ！２
・６Ｈ２００，４ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｇ。

ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２００，２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ＜　・
７Ｈ２００，９ｍｇ、Ｃｕ５Ｏｎ・５ＨｚＯＯ，４ｍｇ
。

Ｎａ２Ｂ４０．・　１０Ｈ２００，０９ｍｇ。

（ＮＨ＜）ｓＭＯｔｏｚ＜・４Ｈ２００，０４ｍｇ。

ビオチン３０■およびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水１１
に含み、ｐＨ７，２に調整した培地〕に植菌して３０℃
で振盪培養した。ＯＤが０，２になった時点でペニシリ
ンＧを０．５単位／　ｍ　ｌとなるように添加した。培
養を継続し、ＯＤが０．６になるまで生育させた。

培養液から菌体を集菌し、ＲＣＧＰ培地〔グルコース５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ。

Ｋ２ＨＩ）０４３．５ｇ、　　ＫＨ，Ｐｏ、　１．５ｇ
。

ＭｇＣＲ２・６Ｈ２００，４１ｇ＋　　Ｆ　ｅ　５０４
　・７　Ｈ２Ｏ１０ｍｇ、　Ｍｎ　３０４　・４〜６　
Ｈ２Ｏ２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏａ・７Ｈ２００，９ｍｇ。

（ＮＨａ）ｓＭＯｔＯ２４・４　Ｈ２Ｏ０，０４ｍｇ。

ビオチン３０Ａｇ、　　サイアミン塩酸塩２ｍｇ、　　
コハク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン
（分子量１０，０００）　３０　ｇを水ＩＩｌに含む培
地〕に１ｍｇ／ｍｌのりゾチームを含む溶液（ｐＨ７．
６）に約１０９細胞／ｍβとなるように懸濁し、Ｌ型試
験管に移して３０℃で５時間緩やかに振盪反応してプロ
トプラスト化した。

このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり、
２，５００Ｘｇで５分間遠心分離し、Ｔ　Ｓ　ＲＩ　Ｃ
緩衝液（ＭｇＣＬ　　１０ｍＭ、　ＣａＣｊ！ｚ　３０
ｍＭ。

トリス５０ｍＭ、　　ショ糖４００ｍＭ、　ｐＨ７，５
）　　１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、７３ＭＣ緩衝液
０゜ｌ＋ｎｌに再懸濁した。この菌液に２倍高濃度の７
３ＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応液の１対１混合液１０
０パを加えて混和し、次いでＴＳ！ＪＣ緩衝液中に２０
％ＰＥＧ　６，０００を含む液０．８ｍｌを添加して混
合した。

３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）　２ｍｌを添加し
、２．５００Ｘｇで５分間遠心分離にかけて上澄液を除
去した。沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培
地に懸濁し、この菌液ＱＪｍｌをスペクチノマイシン４
００■／＋１１１を含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培
地に１．４％寒天を加えた培地、ｐ！（７，２）に塗布
し、３０℃で１０日間培養した。

ＲＣＧＰ寒天培地上に生育したコロニーを多数釣菌し、
プラスミドＤＮＡの単離を行なった。即ち、各々を３３
Ｍ培地に植菌して３０℃で振盪培養し、ＯＤが０．２と
なった時点でペニシリンＧを０．５単位／ｍ　Ｉとなる
ように添加した後さらに培養を継続し、ＯＤが０．６に
なるまで生育させた。この培養菌体を用いて、アルカリ
法〔モレキュラー〇クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ｐ。

３６８〕に従ってプラスミドＤＮＡを単離した。

制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動の解析の結果、
得られたプラスミドＯＮへのうちの１つが、ｐｃＧｌｌ
のＰｓｔ　Ｉ　−Ｓｓｔ　Ｉ部分消化物とＭｌ　３ｍｐ
　１９　ＲＦＤＮＡのＰｓｔ　Ｉ　−Ｓｓｔ　ｌリンカ
−との連結プラスミドであった（第１図参照）。このプ
ラスミドをｐｃＧｌｌｌと命名した。ｐｃＧｌｌｌは、
Ｍ１３ｍｐ１９マルチリンカ−由来のＫｐｎＩ。

Ｓｍａｌ、ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、Ｓａｄ　Ｉ、Ｐｓｔ
ｌの切断点を含み、これらの酵素によって１ケ所のみ切
断される有用なプラスミドである。

（３）コリネ型細菌の転写・翻訳開始領域のクローニン
グができるベクタープラスミドｐＥ’　　Ｉａｃｌの作
製 （１）でクローン化した大腸菌由来のラクトース・オペ
ロンを含むプラスミドｐＬａｃ　ｌと（２）で作製した
ベクターｐｃＧ１１１．　　さらにｐＭｃ１８７１を材
料として、以下の方法で、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属菌種の転写・翻訳開始領域クロー
ニングベクターｐＥ’　　１ａｃｌを作製した（第２図
参照）。

ｐＭｃ１８７１　はファルマシア社より購入したものを
用いた。ｐＭｃ１８７１プラスミドＯＮ＾　２μｇを含
む制限酵素ＥｃｏＲＩ用反応液（トリス１０ｍＭ。

Ｍｇ　Ｃ１２１０ｍＭ、　　ジチオスレイトール１ｍＭ
。

ＮａＣｊ！　１００ｍＭ、　ｐＨ７，５）　５０μｊ！
に４単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を添加し、３７℃
で６０分間反応させた。この消化ＯＮへのアガロースゲ
ル電気泳動を行ない、Ｇｉｒｖｉｔｚ　らの方法〔モレ
キユラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　（：Ｉ
ｏｎｉｎｇ）ｐ、１６８）に従って３．Ｑｋｂの［１ｃ
ｏＲＩ切断断片約０．４■を分取した。

一方、（１）で得られたラクトース・オペロンクローン
化プラスミドｐＬａｃ１　４μｇを含む制限酵素ＥＣＯ
ＲＩ用反応液５０μｌに、８単位の巳ｃｏＲＩを添加し
、３７℃で６０分間反応させた後、さらにｌ　Ｍ　Ｎａ
１Ｊ　５ｍと、制限酵素Ｓａｊ！Ｉ（宝酒造社製）８単
位を加えて、３７℃、６０分間反応させた。この消化Ｄ
ＮＡから３，２ｋｂのＥｃｏＲｌ−３ａｆｌ切断断片約
０．４μｇを分取した。この断片に、大腸菌のＩａｃＹ
の構造遺伝子が含まれていることは、ラクトース・オペ
ロンの制限酵素地図〔エックスペリメント・ウィズ・ジ
ーン・フユージョンズ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉ
ｔｈ　ＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ）、Ｔ、Ｊ、５ｉｌｈａ
ｖｙ　　ｅｔ　　ａｌ、　　コールド　スプリング　ハ
ーバ−ラボラトリ−（１９８４）　）より明白である。

上記で得られた両断片を各々４５μｌのＴＥＳ緩衝液に
溶解、混合後、１０倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ用緩衝液１
０ｍ、１００ｍＭ　　ＡＴＰ　　ＩＡＴ’。

Ｔ４リガーゼ３５０Ｉｐ−位を加えて１２℃、１６時間
連結反応させた。この反応物に、ＩＭＮａＣＪ　　１０
ｍと、ＢａｍＨＩ　１０単位を添加し、３７℃、６０分
間反応させ、６５℃、１０分間の加温で反応を停止させ
た。

一方、大腸菌とコリネバクテリウム・グルタミカムの両
方で複製可能なシャトルベクターｐＣＥ５３　Ｃモレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティクス（Ｍｏｌ
、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）、　１９６．１７５（１９８
４）　）を、それを保有するエツジエリシア・コＩＪ　
Ｋ　ｌ　２株から、アンらの方法に従って単離した。こ
のｐＣＩＥ５３　プラスミドＤＮＡ　　ＩＪＬｇを含む
ＢａｍＨＩ用反応液６０ｄに、２単位の１３ａｍＨＩを
添加し、３７℃、６０分間反応させた後、さらにＬＭ　
　ＮａＣｊ！６μｊ２と５ａｆ１２単位を加えて、３７
℃、６０分間反応させ、６５℃。

１０分間加温して反応を停止させた。

両反応物を混合後、１０倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ用緩衝
液２　ｏＪｄｌ、　　１００ｍＭ　　ＡＴＰ　　２ＡＩ
２゜Ｔ４リガーゼ３５０単位を加えて１２℃、１６時間
連結反応させた。この反応物を用い、ダジェルトらの方
法に従って、エツジエリシア・コＩＪ　Ｋ　２９４の形
質転換を行った。選択培地として、カナマイシン２０■
／ｍ　ｌを含むし寒天培地を用い、得られたカナマイシ
ン耐性株の中から、テトラサイタリン２５■／ｍ＋を含
むし寒天培地に生育しないものを選んだ。このカナマイ
シン耐性、テトラサイクリン感受性を示す株多数から、
アルカリ法でプラスミドを単離し、制限酵素消化とアガ
ロースゲル電気泳動で解析した結果、得られたプラスミ
ドＤＮＡのうちの１つが、第２図で示すような１６．８
ｋｂの大きさのプラスミドであった。このプラスミドを
ｐ　Ｅ’　ｌａｃ　５３１と命名した。

こうして得られたｐ　Ｅ’　Ｉａｃ５３１１■を用いて
、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１ｇ３
３の形質転換を、（２）と同様にして行った。選択培地
としてカナマイシン２００ｘ／ｎ＋］を含むＲＣＧＰ寒
天培地を用い、得られた形質転換株から、アルカリ法で
プラスミドＤＮＡを単離し、ｐＥ′Ｉａｃ５３１と同一
のプラスミドであることを確認した。この形質転換株よ
り単離したプラスミドｐ　Ｅ　’　Ｉａｃ５３１　１　
μｇと、（２）で作製したｐ、ｃＧ　１１１１Ｊｔｇを
［］ａｍＨＩ用反応液　８０μｌに溶解後、４単位の１
３ａｍ）Ｉ　Ｉを添加し、３７℃、６０分間反応させた
後、さらにＩＭ　　Ｎａ（１１０，！とＳａｊ！Ｉ４単
位を加えて　３７℃、６０分間反応させ、６５℃、１０
分間の加温で反応を停止させた。ここへ、１０倍濃度の
Ｔ４リガーゼ用緩衝液１０膚と１００ｍＭ　　ＡＴＰ　
　１ｍ、Ｔ４リガーゼ３５０単位を添加し、１２℃、１
６時間連結反応させた。この反応物を用い、（２）で示
した方法で、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣ
Ｃ３１８３３の再形質転換を行なった。選択培地には、
スベクチノマイシン４００■／　ｍ　１を含むＲＣＧＰ
寒天培地を用いた。

得られた多数のスペクチノマイシン耐性形質転換株から
、アルカリ法で各々プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵
素消化とアガロースゲル電気泳動による解析を行なった
。その結果、形質転換株の中の１株が、第２図で示すよ
うな１ｌｋｂの大きさのプラスミドを保有していること
が判明した。このプラスミドは、コリネバクテリウム・
グルタミカム由来の複製開始点とスペクチノマイシン耐
性遺伝子、大腸菌のラクトース・オペロンの構造遺伝子
（プロモータ一部位から］ａｃＺｏ）Ｎ末端側の８アミ
ノ酸は欠失）を含有し、その上流に隣接して、ＢａｍＨ
Ｉ　、　Ｓｍａ　Ｉ　。

Ｋｐｎ　Ｉ切断部位を持つプラスミドであり、ｐＥ′ｌ
ａｃ　　１と命名した。

（４）コリネ型細菌の転写・翻訳開始領域を含むＤＮＡ
断片のクローニングおよび乳糖資化性を付与する組換え
体プラスミドの取得 （３）で取得したｐε’Ｉａｃｌを用い、コリネバクテ
リウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮ
Ａより、コリネ型細菌の転写・翻訳開始領域を含むＤＮ
Ａ断片のクローニングを行なった。

コリネバクテリウム・グルタミカム＾ＴＣＣ３１８３３
株の染色体ＤＮＡは以下のようにして調製した。

即ち、ＮＢ培地で増殖させたＡＴＣＣ３１８３３株の種
培養を４００ｍｊ！のＳＳＭ培地に接種して３０℃で振
盪培養した。○Ｄが０．２になった時点で培養液に０．
５単位／ｍ！！、の濃度となるようにベニシリンＧを添
加した。さらに培養を継続し、ＯＤが０．６になるまで
生育させた。

培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、リゾ
チーム溶液ＩＱｍｊ２に懸濁し、３７℃で４時間反応を
行った。集菌した菌体から斉藤−三浦の方法〔バイオキ
ミカ・工・バイオフィジカ・アクタ　（Ｂｉｏｃｈｉｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　７２，６１９（１９６
３）　）に従って、高分子染色体ＤＮＡを単離した。

この染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ　３Ａで部分消化し
た。即ち、染色体ＤＮＡ　２μｇを含む制限酵素Ｓａｕ
　３Ａ用反応液（トリス５０ｍＭ、　ＭｇＣＬ　　１０
ｍＭ。

ジチオスレイトール１ｍＭ、ＮａＣβ　１００ｍＭ。

ｐＨ７，５＞９０ｍに、０．５単位のＳａｕ　３Ａ　（
宝酒造社製）を添加し、３７℃、３０分間反応させ、６
５℃、１０分間の加温で反応を停止させた。

一方、ベクターのｐＢ’　Ｉａｃｌ　　ＩＡｇを含むＢ
ａｍＨＩ用反応液９０μｌに、２単位のＢａｍＨＩを添
加し、３７℃、６０分間で完全消化させ、６５℃、１０
分間の加温で反応を停止させた。両反応物を混合し、１
０倍濃度のＴ４’Ｊガーゼ用ｆｆｔ　新液２０ρ。

１００ｍＭ、　ＡＴＰ　　２ｉＩＪｌ、　　Ｔ　４リガ
一ゼ３５０単位を添加し、１２℃、１６時間連結反応さ
せた。

この反応物を用い、（２）で示した方法に従ってコリネ
バクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３３の形質
転換を行なった。スペクチノマイシン４００ｇ／ｍｌと
Ｘ　−ＧＡＬ　４０ＪＬｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培
地に塗布して、３０℃、７日間培養後、青色に呈色した
コロニー数株を釣菌した。アルカリ法により、プラスミ
ドを単離し、制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で
構造を解析した結果、ｐＥ’１ａｃｌの１３ａｍＨｒ　
切断点の位置に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡ
ＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片が挿
入されていることがわかった。これらのプラスミドをｐ
ＣＰＬ　１〜１５と命名した。そのうちの１つであるｐ
ＣＰＬ　７は、挿入断片が３．ｌｋｂのプラスミドであ
った。ｐＣＰＬ　７を保有するコリネバクテリウム・グ
ルタミカム＾ＴＣＣ３１８３３は、コリネバクテリウム
・グルタミカムＫ　７４　　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１
７９）として寄託されている。

（５）　　クローン化プロモーターの評価（４）で得ら
れたプラスミドｐｃＰＬ１〜１５を保有するコリネバク
テリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３３におけるβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼの発現量を下記のようにして調
べた。スペクチノマイシン１００■／ｍｌを含む４０ｍ
１のＮＯ培地で培養した菌体を集菌し、５３ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、水冷下で２０
分間の超音波破砕を行った。遠心後の上清を菌体内抽出
液とし、これを用いて菌体内β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
活性と菌体内蛋白質中のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ量を
測定した。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性は、０−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を用いる方法〔エ
ックスベリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティク
ス（巳ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｊ、ＨｌＭｉｌｌｅｒ　　ｐ、
４０３（１９７２）　）に従って測定した。菌体抽出液
の蛋白質含量はＢｉｏ−Ｒａｄのアッセイキットを用い
て定量した。

第１表にｐｃＰｌｌ　〜１５およびベクターｐＥ’　１
ａｃｌを保有するコリネバクテリウム・グルタミカム＾
ＴＣＣ３１８３３の菌体内β−Ｄ−ガラクトシダーゼ比
活性を示す。

また、同株の菌体内蛋白質のパターンを菌体抽出液のＳ
ＤＳポリアクリルアミド電気泳動（Ｌａｅｍｍｌ　ｉの
方法：ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）２２７　　。

６８０　（１９８０）　）により調べた。その結果ベク
ターのｐＢ’　Ｉａｃｌ保有株では存在しないバンドが
、ｐｃＰＬ１〜１５保有株において観察され、これらが
β−Ｄ−ガラクトシダーゼの位置とほぼ一致していた。

さらにそのバンドの強弱は第１表で示した菌体内β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ活性の強弱と対応していた。

以上の結果から本発明で開発されたｐＨ’　１ａｃｌを
用いて、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種由来の遺伝子転写・翻訳開始領域を含むＤＮＡ
断片を取得できることが確認できた。

第　　　１　　　表 菌　　　株　　　　　　　比活性（［１／ｍｇ）（６）
　　コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属
菌種由来の遺伝子転写・翻訳開始領域を用いた大腸菌内
での遺伝子の発現 （４）で取得したプラスミドｐＣＰＬ３．１０．１２．
１４およびｐＨ’　ＩａｃｌのＰｓｔ　Ｉ切断部位に、
大腸菌で複製可能でカナマイシン耐性、アンピシリン耐
性のマーカーをもつプラスミドベクターｐＡｃＹｃ１７
７［Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　　ａｌ、　：ジャーナル・オブ
・バタテリオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
　１３４．１１４Ｈ１９７８））を挿入するという方法
で、大腸菌とコリネ型細菌とのシャトルプラスミドを作
製し、これを大腸菌へ導入してβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの発現度を調べた。

まず、プラスミドρＣＰＬ３．１０．１２．１４および
ｐＥ’　１ａｃｌ　ＤＮＡ各々０．５■を含む制限酵素
Ｐｓｔ　Ｉ用反応液（トリス１０ｍＭＳＭｇＣｊｌ！２
１０ｍｌＪＳＮａＣ４２１００ｍＭ　、ジチオスレイト
ール１ｍ１Ｊ、　ｐｌ（７，５）　４ＦＭ！に、各々１
単位のＰｓｔｌ（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６０
分間反応させ、６５℃、１０分間の加温で反応を停止さ
せた。

一方、プラスミドｐＡｃＹｃ１７７２．５Ｍを含むＰｓ
ｔ　Ｉ用反応液２２５ｄにＰｓｔｒ６単位を添加し、同
様に反応を行い、加温により反応を停止させた。

この反応液４５ρずつを上記で調製したｐＣＰＬ３．１
０゜１２．１４とｐε’　ＩａｃｌのＰｓｔ　Ｉ切断反
応液と混合した。これらの混合物に各々ｌＯ倍濃度のＴ
４１Ｊガーゼ用緩衝液１０ＡＩ！、１００ｍＭ　ＡＴＰ
　１　ｔｔＪｌ、　Ｔ　４リガ一ゼ３５０単位を加え、
１２℃で１６時間反応させた。

この反応物を用いて（１）で示した方法でエツジエリシ
ア・コ１ＪＫ１２株亜株に７２の形質転換を行った。た
だし選択培地には、スペクチノマイシン１０ｈｇ／＋ｎ
ｌ、カナマイシン２０　ｕｇ　／ｍ　ｌを含むし寒天培
地を用いた。同寒天培地上で生育したコロニーを釣菌し
、アンらの方法に従ってプラスミドＤＮＡを単離した後
制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析し、ｐＣ
ＰＬ３．１０．１２．１４゜ｐＨ’　１ａｃｌのＰｓｔ
　Ｉ切断部位に３．６ＫｂのｐＡｃＹｃ１７７が挿入さ
れた構造のプラスミドを有していることを確認した。こ
れらのプラスミドをそれぞれｐｃＰＬ１０３．−（１０
，１１２，１１４およびｐＨ’　１ａｃ１０１と命名し
た。これらを用いて、（２）で示した方法で、コリネバ
クテリウム・グルタミカム＾ＴＣＣ３１８３３の形質転
換を行い、スペクチノマイシンおよびカナマイシン耐性
を有する形質転換株を得た。

こうして得られたｐｃＰＬ１０３．　１１０．　１１２
．　１１４およびｐＨ’　Ｉａｃｌｏｌを保有するコリ
ネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３３とエ
ツジエリシア・コＵＫ７２について、（５）で示した方
法で菌体内のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ比活性を測定し
た。

ただしに７２の形質転換株の超音波破砕時間は２分間と
した。結果を第２表に示す。

第　　　２　　　表 第２表で示したようにコリネバクテリウム・グルタミカ
ム由来の遺伝子転写・翻訳開始領域からの発現は、大腸
菌内で弱いだけでなく、コリネバクテリウム属菌種内で
の発現度と相関性がみられなかった。この結果より、コ
リネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属微生物の遺
伝子転写・翻訳開始領域と、大腸菌のプロモーター・リ
ボゾーム結合部位とに差異が存在することがわかった。

（７）ｐＣＰＬ　７導入による、コリネバクテリウム属
およびブレビバクテリウム属微生物への乳糖資化性の付
与 コリネバクテリウム・グルタミン酸ＡＴＣＣ３１８３３
、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７
およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴ
ＣＣ１３８６９を、各々ｐＣＰＬ　７　１　Ａｇを用い
て、（４）で示した方法で形質転換した。得られたスペ
クチノマイシン耐性で、コロニーが青色に呈色した形質
転換株より、プラスミドを単離して、ｐｃｐ＋、　７と
同一であることを確認した。

形質転換株と親株のラクトースを炭素源とする培地にお
ける生育試験は次のように行なった。

形質転換株と親株を、ＮＢ培地で３０℃。

２４時間培養した。ただし、形質転換株の培養には、ス
ベクチノマイシンを１００■／ｍｌになるようＮＢ培地
に添加した。得られた各菌株の種培養Ｑ、５ｍｌを、生
理食塩水で遠心洗浄後、ラクトースを炭素源とする最少
培地〔ラクトース１０ｇ＋　　（ＮＨ４）２Ｓ０４１０
　ｇ＋　　Ｋ１−１２ＰＯ４１ｇ、　　Ｍｇ　Ｓ　Ｏｓ
　・７　Ｈ２Ｏ０，４ｇ、Ｆｅ５０＋・７　Ｈ２０２ｍ
ｇ、　Ｍｎ　Ｓ　０４　・４　Ｈ２０２ｍｇ。

ビオチン６０μｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、尿素３ｇ
、ＮａＣβ　５０ｍｇを水ｌβに含みｐＨ７゜２に調整
した培地〕　１０ｍ１の入ったＬ字型試験管に接種した
。３０℃、１２時間振盪培養後、６６０ｎｍでの濁度を
測定し、第３表に示す結果を得た。

第３表 上記の結果より、ｐＣＰＬ　７を保有する形質転換株は
、ラクトース資化性を獲得していることが確Ｓ忍された
。

（８）　　ラクトース含有原料からのグルタミン酸の生
産 ■（７）で得られたｐｃｐ＋、　７を保有するコリネバ
クテリウム・グルタミカム＾ＴＣＣ３１８３３，コリネ
バクテリウム・ハーキュリスＡＴ［Ｃ１３８６８，ブレ
ビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７およびブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３
８６９と各々の親株のグルタミン酸生産試験を次のよう
に行なった。

グルコース４０ｇ／ｊ！、ポリペプトン２０ｇ／ＣＫＨ
，Ｐｏ、　１．５ｇ／Ｉ！、に２ＨＰ０゜０．５ｇ／Ａ
、Ｍｇ５ｏ、・７Ｈ２００，５ｇ／Ｒ。

ビオチン１０■／１．尿素３　ｇ／ｆｌの組成の種培地
（ｐＨ７，２＞で各菌株を３０℃、２４時間振盪培養し
た。ただし、形質転換株の培養には、スペクチノマイシ
ンを１００■／ｍ　ｌになるように種培地に添加した。

得られた種培養４ｍｌを、ラクトース１００ｇ／ｊ！、
　　（ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１，Ｏ
ｇ／ｊ！、に２ＨＰ０゜０．５ｇ／ｌ、Ｍｇ５Ｏ＜・７
　Ｈ２Ｏ０，５ｇ／　ｆｌ。

サイアミン塩酸塩１ｍｇ／　１　、　　Ｆ　ｅ　Ｓ　０
４　・７　Ｈ２Ｏ２ｍｇ／　ｌ、　　Ｍｎ　３０４　・
４　Ｈ２０１０ｍｇ／　Ｉ！。

Ｃｕ　Ｓ　０４　・５　Ｈｚｏ　　１　ｍｇ／　１　、
尿素５ｇ／ｊｌ！。

フェノールレッド１０ｍｇ／Ｊの組成の生産培地（Ｉ）
Ｈ６，５）　　２０ｍｌを含む３０　Ｑｍｌ容三角フラ
スコに接種して、３０℃で培養した。培養中、培養液を
ｐＨ６，０〜８．０に保つため１２時間目と２０時間目
の２回、１０％尿素液を１ｍｌずつ添加して３０時間振
盪培養した。培養後、培養濾液をペーパークロマトグラ
フィーにかけ、ニンヒドリン発色による比色定量法を用
いてＬ−グルタミン酸生成量を測定した。結果を第４表
に示す。

第４表 ■■で使用した生産培地中、ラクトースの代わりに、ラ
クトースとして１０％になるようにホエーパウダー（ラ
クトース含量７５％）を含む培地を用い、種培養の植菌
と同時にペニシリン０５単位／ｍβを添加して、３０℃
、７２時間振盪培養した。■と同様の定量法で測定した
し一グルタミン酸生成量を第５表に示す。

第５表 （９〕　　ラクトース含有原料からのグルタミンの生産
コリネバクテリウム・グルタミヵム＾ＴＣＣ１３７６１
を（７）と同様の方法で形質転換し、形質転換株がｐｃ
ＰＬ　７を有していることを確認した。

形質転換株と親株のグルタミン生産試験を次のように行
なった。

グル：］　−ス５０　ｇ／　ｊ！、　　（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ’４５ｇ／β、尿素３ｇ／β、コーン・スチーフ・リ
カー　２ｇ／β、肉エキス　２　ｇ／ｊ２゜ＫＨ２ＰＯ
４０，５ｇ／Ｌ　　Ｋ、ＨＰＯ４１，５’ｇ／ｊ！。

Ｍｇ５Ｏ＜　０．５ｇ／１．Ｆｅ５０＊・７Ｈ２００，
０２ｇ／ＣＭｎ５Ｏ＜・７Ｈ２００，０２ｇ／１２゜ビ
オチン２０ｇ／Ｌ　サイアミン塩酸塩１’ｍｇ／ｊ！の
組成の種培地（ｐ１４７．２　）で各菌株を２８℃。

２４時間振盪培養した。ただし、形質転換株の培養には
、スペクチノマイシンを１００　ＪＬｇ／ｍＩになるよ
うに種培地に添加した。得られた種培養１ｍｌを、ラク
トース１２０ｇ／ｊ！、　　（ＮＨ，）２３０゜４０　
ｇ／ｊ！、尿素５　ｇ／ｆｌ、　ＫＨ，ＰＯ４０，５ｇ
／Ｉｔ。

Ｋ２ＨＰ　０４０．５　ｇ／　Ｒ，Ｍｇ　Ｓ　０４・７
Ｈ２００，５ｇ／（１，Ｆｅ５０．・７Ｈ２００，０２
ｇ＃。

Ｍｎ　Ｓ　Ｏ＝　・７８２０　０．０１　ｇ／　ｆｌ、
　　ビオチン３．５μｇ／ｌ’、サイアミン塩酸塩１ｍ
ｇ／ＣＣａ　Ｃ０３２０ｇ／　Ｉｌの組成の生産培地（
ｐｆ１６．８）２０ｍｌを含む３００ｍｌｍｌ用フラス
コに接種して、３０℃、７２時間振盪培養した。培養後
、培養濾液をペーパークロマトグラフィーにかけ、ニン
ヒドリン発色による比色定量法を用いてＬ−グルタミン
生成量を測定した。結果を第６表に示す。

第６表 αＱ　ラクトース含有原料からのリジンの生産■コリネ
バクテリウム・グルタミカムＲＨ６（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
７０４）　（ホモセリン要求性）、ブレビバクテリウム
・フラバムＡＴＣＣ２１５２８（チアリジン耐性）およ
びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ
２１０８６（スレオニン、イソロイシン・バリン要求性
）を用い、（７）と同様の方法で形質転換し、形質転換
株がｐＣＰＬ　７を有していることを確Ｓ忍した。

形質転換株と各々の親株のリジン生産試験を次のように
行なった。

各菌株をＮＢ培地で、３０℃、１６時間培養した。ただ
し、形質転換株の培養には、ＮＢ培地にスベクチノマイ
シンを１００■／ｍ　Ｉになるように添加した。得られ
た種培養Ｑ、５ｍｌをラクトース１００ｇ／Ｌ　　（Ｎ
Ｈ４）２３０．３０ｇ７ｐ、ＫＨ，ＰＯ，０，５ｇ／Ｃ
Ｋ、ＨＰ○４０、５　ｇ／　ｊ２．　Ｍｇ　Ｓ　０４・
７　Ｈ２Ｏ１ｇ／Ｉ！。

Ｆｅ５ｏ４・７Ｈ２０１０ｍｇ／ｊ！、Ｍｎ５Ｏ＜　・
７　Ｈ２Ｏ１０ｍｇ／　１　、　　ビオチン１００μｇ
／ｊ２゜ＣａＣＯ３３０ｇ／βの組成の生産培地（ｐＨ
７，２）５ｍｌを含む試験管に接種し、３０℃で７２時
間振盪培養した。ただし、ＲＨ６とその形質転換株には
ホモセリン１００■／ｍ　１を、ＡＴＣＣ２１０８６と
その形質転換株にはスレオニン１　イソロインン、バリ
ンを各々１００ｘ／ｍｌｆつ培地に添加した。培養後、
培養濾液中のＬ　　ＩＪリジン成量を酸性鋼ニンヒドリ
ン法（Ｃｈｉｎａｒｄ、　　ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
）、　１９９　９１　（１９５２）Ｅにより比色定量し
た。結果を第７表に示す。

第７表 ■生産培地のラクトースの代わりに、ホ二一パウダー（
ラクトース換算）１００ｇ／ｆを用いる以外は■と同様
に実施し、第８表に示す結果を得た。

第８表 ０υ　ラクトース含有原料からのスレオニンの生産■コ
リネバクテリウム・グルタミカム＾ＴＣＣ２１６６０（
メチオニン要求性、チアリジン耐性、α−アミノ−β−
ヒドロキシ吉草酸耐性）を（７）と同様の方法で形質転
換し、形質転換株がｐＣＰＬ　７を有していることを確
認した。

形質転換株と親株のスレオニン生産試験を次のように行
なった。

各菌株をＮＢ培地で、３０℃、２４時間振盪培養した。

ただし、形質転換株の培養には、ＮＢ培地にスペクチノ
マインンを１００μｇ　７ｍ　１になるように添加した
。得られた種培養Ｑ、５ｍｌを５ｍｌの生産培地〔ラク
トース１００ｇ／β。

（ＮＨ，）２ＳＯ４２０ｇ／１２．ＫＨ２Ｐ０゜０．５
ｇ／β、　Ｋ２Ｈｐ　０４０．５　ｇ／β、Ｍｇ５ｏ。

・７　Ｈ２Ｏ１ｇ／　ｊ！、　　Ｆ　ｅ　Ｓ○、・７Ｈ
２０１０ｍｇ／ｊ！、Ｍｎ５ｏ＜　・７８２０　１０ｍ
ｇ／β。

ビオチン１００μｇ／ｊ！、ＣａＣＯ３２０ｇ／Ａメチ
オニン５０ｍｇ／　Ｒ（ｐＨ７，２）　）の入った試験
管に植菌し、３０℃で８２時間振盪培養した。

培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定量してＬ−スレオニン生
成量を測定した。結果を第９表に示す。

第９表 ■生産培地のラクトースの代わりにホエーパウダー（ラ
クトース換算）ｌｏｎｇ／βを用いる以外は■と同様に
実施し、第１０表に示す結果を得た。

第１０表 ０の　ラクトース含有原料からのイソロイシンの生産コ
リネバクテリウム・グルタミカムＮ−２２２（ＫＹ　１
１０５８９）（ＦＩＥＲＰ−２８４３）　（リジン要求
性、チアイソロイシン耐性）を（７）と同様の方法で形
質転換し、形質転換株がｐｃｐ＋、　７を有しているこ
とを確言忍した。

形質転換株と親株のイソロイシン生産試験を次のように
行なった。

各菌株をグルコース２０ピ／β、ペフトン１０ｇ／Ｃ酵
母エキス１０ｇ／ＣＮａＣｊ！２．５ｇ／ｆｌの組成の
種培地（ｐＨ７，４）で、３０℃、２４時間振盪培養し
た。ただし、形質転換株の培養には、種培地にスベクチ
ノマイシンを１００■／ｍ　１になるように添加した。

得られた種培養２ｍｌを、ホエーパウダー（ラクトース
換算）１００ｇ／β、　　（ＮＨ４）２ＳＯａ　５０ｇ
／β。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１ｇ／Ｌ　　ＫＨ２ＰＯ４０，５
ｇ／Ｊ！、に２ＨＰＯ４０，５ｇ／ｊ’、ＦｅＳ○４・
７Ｈ２００，０１ｇ／ｊ！、Ｍｎ５Ｏ，・４Ｈ，００，
０１ｇ／ｊ！、ビオチン１００■／Ｌ　　リジン塩酸塩
１００ｍｇ／　ｊ！、　ＣａＣＯ３２０ｇ／　ｆｌの組
成の生産培地（ｐ）１７．４　）　　２０ｍｌを含む３
００ｍ１容三角フラスコに接種して、３０℃、９６時間
振盪培養した。培養後、培養濾液をペーパークロマトグ
ラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量してＬ
−イソロイシン生成量を測定した。結果を第１１表に示
す。

第１１表 αＪ　ラクトース含有原料からのバリンの生産ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムＫＹ　１０６１４　
（ＦＥＲＭ　Ｐ−２９２５）、　（チアリジン耐性）を
（７）と同様の方法で形質転換し、形質転換株がｐＣＰ
Ｌ　７を有していることを確認した。

形質転換株と親株のバリン生産試験を次のように行なっ
た。

各菌株をグルコース５０　ｇ／Ｉ！、ペプトン１０ｇ／
Ｉｔ、酵母エキス１０ｇ／Ｊ、ＮａＣｊ！　　２．５ｇ
／β、尿素３ｇ／Ｃビオチン５０■／β。

コーン・スチーブ・リカー　５ｇ／ｊ！の組成の種培地
（ｐ）１７．２　）で、２８℃、２４時間培養した。た
だし、形質転換株の培養には、種培地にスペクチノマイ
シンを１００７４ｇ／ｍｌになるように添加した。得ら
れた種培養２ｍｌを、ホエーパウダー（ラクトース換算
）１００ｇ／ＣＫＨ，Ｐｏ、２ｇ／ｌ、Ｍｎ５Ｏ，・４
Ｈ２００，０１ｇ／Ｒ，Ｍｇ５ｏ４・７　Ｈ２Ｏ０，５
ｇ／Ｌ　　Ｆｅ５Ｏｎ・７Ｈ，０，０，０１ｇ／Ｌ（Ｎ
Ｈ４）２３０．２０　ｇ／Ｉ！、　　ビオチン５０■／
１１、ＣａＣＯ３３０ｇ／ｊｌ！の組成の生産培地（ｐ
Ｈ６，８）　２０ｍｌを含む３０３ｍｌ容三角フラスコ
に接種し、２８℃、７２時間振盪培養した。

培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定量してＬ−バリン生成量
を測定した。結果を第１２表に示す。

第１２表 αリ　ラクトース含有原料からのロイシンの生産ブレビ
バクテリウム・ラクトフアーメンクムＡＴＣＣ２１８８
ｇ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３７，チアリジン耐性）を（７
）と同様の方法で形質転換し、形質転換株がｐＣＰＬ　
７を有していることを確言忍した。

形質転換株と親株のロイシン生産試験を、側のバリン生
産試験と同様の条件で行ない、第１３表に示す結果を得
た。

第１３表 αω　ラクトース含有原料からのトリプトファンの生産 ■コリネバクテリウム・グルタミカムに−５５（ＦＩＥ
ＲＭ　ＢＰ−８６４）　　（フェニルアラニン要求性。

チロシン要求性、５−メチルトリプトファン耐性、トリ
プトファンハイドロキサメート耐性。

６−フルオロトリプトファン耐性、４−メチルトリプト
ファン耐性、パラ−フルオロフェニルアラニン耐性、パ
ラ−アミノフェニルアラニン耐性、チロシンハイドロキ
サメート耐性、フェニルアラニンハイドロキサメート耐
性）を（７）と同様の方法で形質転換し、形質転換株が
ｐＣＰＬ　７を有していることを確認した。

形質転換株と親株のトリプトファン生産試験を次のよう
に行なった。

各菌株をＮＢ培地で、３０℃、１６時間振盪培養した。

ただし、形質転換株の培養には、ＮＢ培地にスペクチノ
マイシンを１００■／ｍｌになるように添加した。得ら
れた種培養Ｑ、５ｍｌをラクトース１００　ｇ／Ｉ１．
（ＮＨ，）２ＳＯ。

２０ｇ／１．ＫＨ２Ｆ０．０．５ｇ／ｌ、に２ＨＰ０゜
０．５ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０，２５ｇ／１
２゜ＮＺ−７ミン２．５　ｇ／　Ｉｔ、　ＣａＣ０＊　
　２０　ｇ／βの組成の生産培地（ｐＨ７，２）５ｍｌ
の入った試験管に接種し、３０℃で８４時間振盪培養し
た。培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフィーに
かけ、ニンヒドリン発色後、比色定量してＬ−）ＩＪブ
トファンの生成量を測定した。

結果を第１４表に示す。

第１４表 ■生産培地のラクトースの代わりにホエーパウダー（ラ
クトース換算）１００ｇ／βを用いる以外は■と同様に
実施し、第１５表に示す結果を得た。

第１５表 ００　　ラクトース含有原料からのフェニルアラニンの
生産 コリネバクテリウム・グルタミカムに３８（ＦＥＲＮ　
ＢＰ−４５４）　　（パラ−フルオロフェニルアラニン
耐性、パラ−アミノフェニルアラニン耐性）を（７）と
同様の方法で形質転換し、形質転換株がｐｃＰＬ　７を
有していることを確認した。

形質転換株と親株のフェニルアラニン生産試験をαωの
■と同様の条件で行い、第１６表に示す結果を得た。

第１６表 面　ラクトース含有原料からのチロシンの生産コリネバ
クテリウム・グルタミカムに４３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４
５７）　　（３−アミノチロシン耐性、パラ−アミノフ
ェニルアラニン耐性、パラ−フルオロフェニルアラニン
耐性、チロシンハイドロキサメート耐性）を（７）と同
様の方法で形質転換し、形質転換株がｐＣＰＬ　７を有
していることを確８忍した。

形質転換株と親株のチロシン生産試験を、０９の■と同
様の条件で行い、第１７表に示す結果を得た。

第１７表 α印　ラクトース含有原料からのヒスチジンの生産 コリネバクテリウム・グルタミカムＨ−ｄ（Ｆ巳ＲＭ　
Ｐ−８１８５）　（２−チアゾールアラニン耐性、６−
メルカブトグアニン耐性、８−アザグアニン耐性、６−
アザウラシル耐性、６−メチルプリン耐性、５−メチル
トリプトファン耐性゛、ストレプトマイシン耐性、グラ
ミシジン耐性、Ｐ−クマール酸耐性）を（７）と同様の
方法で形質転換し、形質転換株がｐＣＰＬ　７を有して
いることを確δ忍した。

形質転換株と親株のヒスチジン生産試験を次のように行
なった。

各菌株をグルコース４ロ ０、　５　ｇ　／　ｊ！　、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ．Ｏ　
Ｏ．　５　ｇ／Ｌ　　ビオチン５０μｇ　／１，酵母エ
キス５　ｇ／ｉ，尿素３ｇ／ｊ！，サイアミン塩酸塩１
０ｍｇ／ｊ’の組成の種培地（ｐＨ　７．　２　）で３
０℃、２４時間振盪培養した。ただし、形質転換株の培
養には、種培地にスペクチノマイシンを１００■／ｍｌ
になるように添加した。得られた種培養１ｍｌを、ホエ
ーパウダー（ラクトース換算）７０ｇ／Ａ。

肉エキス５　ｇ／ｆ１．　（ＮＨ４）２ＳＯ４　　４　
０　ｇ／β。

ＫＨ２Ｐ０．　　１．　５　ｇ／ｌ，　Ｋ２ＨＰＯ４０
．　５　ｇ／βＪ１ｇＳＯ１・７８２０　０、　５　ｇ
／ｆｌ，尿素３ｇ／β，　ＮａＣβ２．５ｇ／β。

Ｆｅ５０＜　・７Ｈ２０　　１　０ｍｇ／ｊ！，　Ｍｎ
ＳＯ４・４Ｈ２０　　１　０ｍｇ／ｆｌ，　ＣｕＳＯ４
２ｍｇ＃！，　ＺＩＩＳＯ４　　１ｍｇ＃！，　　ビオ
チン１００μｇ／ｊ！，サイアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ａ
’。

β−アラニン１　０ｍｇ／ｆｌ，　ニコチン酸１０ｍｇ
／Ｃパントテン酸カルシウム１　０ｍｇＩｎ，　ＣａＣ
Ｏ５　　３　０ｇ／βの組成の生産培地（ρ８７．４＞
　　２０ｍ１の入った３　０　０ｍｊ！容三角フラスコ
に接種して、３０℃，８４時間振盪培養した。培養後、
培養濾液をペーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒ
ドリン発色後、ポーリー試薬を用いる比色定量法〔アグ
リカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ，　　Ｃｈｅｍ，）丑，１８
９　（１９７４）　）に従って、Ｌ−ヒスチジン生成量
を測定した。結果を第１８表に示す。

第１８表 αつ　ラクトース含有原料からのアルギニンの生産コリ
ネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３３にｐ
ＣＰＬ　７と、アルギニン合成系遺伝子群クローン化プ
ラスミドｐＥａｒｇ　５を共存させ、ラクトース含有原
料からのアルギニンの生産を行った。

ｐＥａｒｇ　５は大腸菌のアルギニン合成系遺伝子群ａ
ｒｇｌＥｃＢｆｌをクローン化したプラスミドｐ［Ｅａ
ｒｇ　１　　（特開昭６Ｏ−６６９８９）を材料として
作製した。ｐＥａｒｇ　　ｌプラスミドＤＮＡは、コリ
ネバクテリウム・グルタミカムＫ　４　６　（ＦＢＲＭ
ＯＰ−３５６）から単離した。即ち、該株を３３Ｍ培地
に植菌して３０℃で振盪培養した。ＯＤが０、２となっ
た時点でペニシリンＧを０．５単位／ｍβとなるように
添加した後、さらに培養を継続し、ＯＤが０．６になる
まで生育させた。

この菌体から、（２）でｐｃＧｌｌを単離したのと同様
な方法でプラスミドＤＮＡを単離した。

こうして得られたｐＥａｒｇ　１プラスミドＤＮＡ２μ
ｇを５ａｉｌ用反応液（トリスｌＱｍｌＪ。

ＭｇＣｊ！２１　０ｍＭ５ＮａＣ４２　　１　５　０ｍ
！Ｊ，　　ジチオスレイトール１ｍＭ，　ｐＨ７．５）
　　２　０１Ｎ＝溶解し、ＰｓｔＴ，ＳａβＩ各々６単
位を添加して、３７℃。

６０分間反応させた。この反応物のアガロースゲル電気
泳動を行いＧｉｒｖｉｔｚ　らの方法により、ａｒｇｌ
］ＣＤの遺伝子を含む４．ＱｋｂのＳａｎ　Ｉ、　　Ｐ
ｓｔｌ切断断片を分取し、約０．３μｇを得た。

一方、コリネバクテリウム属菌種と大腸菌の両方で複製
可能なプラスミドｐｃｌＥ５４　（特開昭５８−１０５
９９９）をそれを保有するエツジエリシア・コ’ＪＫＩ
　２株からアンらの方法に従って単離した。このｐＣε
５４プラスミドＤＮＡ　５μｇを含むＳａβ■用反応液
２０μβにＳａβ■を６単位添加し、３７℃、６０分間
反応させた後、Ｐｓｔｌを２単位添加し、３７℃、３０
分間反応させた。この反応物からＧｉｒｖｉｔｚ　らの
方法に従って、１０．６ｋｂのＤＮＡ断片約１μｇを単
離した。

こうして得られた両ＤＮＡ断片を、Ｔ８Ｓ　ｉ％液１８
０μｌに溶解し、１０倍濃度のＴ４リガーゼ用緩衝液２
０．ｕｊ’、　　１００ｍＭ　ＡＴＰ２μｆ、Ｔ４リガ
ーゼ３５０単位を添加し、１２℃、１６時間連結反応さ
せた。この反応物を用い、エツジエリシア・コリに２９
４の形質転換を、ダジェルトらの方法に従って行った。

選択培地にはカナマイシン２０μｇ　／ｍβを含むＬ寒
天培地を用いた。得られた形質転換株のうちクロラムフ
ェニコール２５μｇ／ｍβを含むし寒天培地上で生育し
ないものから、アルカリ法に従ってプラスミドＤＮＡを
単離した。このプラスミドＤＮＡは、制限酵素消化とア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＥａｒｇｌに
由来する４、ＱｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＣＥ５４に由来
し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１０．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片がＰｓｔ　Ｉ、　　Ｓａｌ　Ｉ両粘着末端で連結
した構造を有していた。このプラスミドをｐＥａｒｇ　
５と命名した。

得られたｐＥａｒｇ　５を用いてコリネバクテリウム・
グルタミン酸ＡＴＣＣ３１８３３の形質転換を行い、ア
ルギニンの生産性を調べた。形質転換は、（２）で示し
たプロトプラスト法に従い、選択培地にはカナマイシン
２００μｇ　／ｍβを含むＲＣＧＰ寒天培地を用いた。

得られた形質転換株を、カナマイシン２０μｇ　／ｍβ
ヲ含むＮＢ培地で３０℃、１６時間振盪培養し、この培
養液０．５ｍｌを廃糖蜜（グルコース換算＞８０ｇ／β
、　（ＮＨ４）２ｓＯ，ｎ　　４０　ｇ／ＩＩ。

Ｋ１１２Ｐ０．０．５　ｇ／　Ｒ，Ｋ２）ＩＰＯ４０，
５ｇ／β。

ＣａＣＬ　２０　ｇ／　ｊ！の組成の生産培地（ｐＨ７
、０）５ｍｌの入った試験管に接種し、３０℃。

７２時間振盪培養した。培養後、培養濾液をペーパーク
ロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定
量した。その結果Ｌ−アルギニン生成量は、１．５ｇ／
ｆであり、ｐＥａｒｇ　５がコリネ型グルタミン酸生産
菌にアルギニン生産能を与えることを確認した。

このようにして得られたｐＥａｒｇ　５を保有するＡＴ
ＣＣ３１８３３をさらにｐＣＰＬ　７を用いて形質転換
した。（２）で示したプロトプラスト法に従い、選択培
地にカナマイシン２００μｇ／ｎ＋ｊ！、スベクチノマ
イシン４００μｇ　／ｍβを加えたＲＣＧＰ寒天培地を
用いて形質転換し、形質転換株がｐＥａｒｇ　５とｐｃ
ＰＬ　７の両方を有していることを確認した。

ｐＥａｒｇ　５保有株と、ｐｔＥａｒｇ　５およびｐＣ
ＰＬ　？保有株のアルギニン生産試験を次のように行っ
た。種培地にはＮＢ培地を用い、ｐｌＥａｒｇ　５保有
株にはカナマイシン２０μｇ　／ｍ！。

ｐＥａｒｇ　５およびｐＣＰＬ　？　ｆ！有株にはカナ
マイシン２０μｇ／ｍ１．スペクチノマイシン１００μ
ｇ／ｍｆｌを添加した。３０℃、１６時間振盪培養し、
各々の種培養０．５ｍｌを、ホエーパウダー（ラクトー
ス換算）８０ｇ／ｊ！。

（Ｎ）１．）２３０．　４０　ｇ／Ｌ　ＫＨ２Ｐ０．０
．５　ｇ／β。

Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ／ｌ、　ＣａＣＯ３２０ｇ／Ｒの
組成の生産培地（ｐＨ７，０）　５ｍｌの入った試験管
に接種し、上記のアルギニン生産試験と同様にしてＬ−
アルギニン生成量を測定し、第１９表に示す結果を得た
。

第１９表 （イ）　ラクトース含有原料からのオルニチンの生産 コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３２３２
（アルギニン要求性）を、（７）と同様にして形質転換
し、形質転換株がｐＣＰＬ　７を有していることを確認
した。

形質転換株と親株のオルニチン生産試験は次のように行
なった。

各菌株をＮＢ培地で３０℃、１６時間振盪培養した。た
だし、形質転換株の培養には、ＮＢ培地にスペクチノマ
イシンを１００　鴻／ｍＩになるように添加した。得ら
れた種培養０．５ｍｆｌを、ラクトース８０　ｇ／ｊ！
、　（ＮＨ，）、５ｏ４４０　ｇ／ｊ２．　ＫＨ２ＰＯ
４０，５ｇ／Ｌ　Ｋ、ＨＰＯ４０，５ｇ／ｊ！、Ｌ−ア
ルギニン１００ｍｇ／　Ｉ！。

ＣａＣ０＊　　２０　ｇ／　ｊ！の組成の生産培地（ｐ
Ｈ７，０）５ｍｌの入った試験管に接種し、３０℃、７
２時間振盪培養した。培養後、培養濾液をペーパークロ
マトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量
してＬ−オルニチン生成量を測定した。結果を第２０表
に示す。

第２０表 （２１）　　ラクトース含有原料からのシトルリンの生
産 コリネバクテリウム・グルタミカムに６１（ＦＥＲＭ　
ＢＰ−１１１１）　　（アルギニン要求性）を、（７）
と同様にして形質転換し、形質転換株がｐｃｐシフを有
していることを確認した。

形質転換株と親株のシトルリン生産試験は、（イ）のオ
ルニチン生産試験と同様の条件で行なった。結果を第２
１表に示す。

第２１表 （２２）ラクトース含有原料からのプロリンの生産コリ
ネバクテリウム・グルタミカムＨ−３３３４（ＦＥＲＭ
　Ｐ−６８２３）　（６−メルカプトグアノシン耐性）
を（７）と同様の方法で形質転換し、形質転換株がｐｃ
ｐ＋、　７を有していることを確認した。

形質転換株と親株のプロリン生産試験は、次のように行
なった。

各菌株をグルコース　１０ｇ／β、肉エキス５ｇ／ｌ、
ペプトン１０　ｇ／Ｃ酵母エキス３　ｇ／　Ｒ，ＮａＣ
ｊ！　　３　ｇ／　１２の組成を有する種培地（ｐＨ７
，２）で３０℃、２４時間振盪培養した。ただし、形質
転換株の培養には、種培地にスペクチノマイシンを１０
０■／ｍｌになるように添加した。得られた種培養２１
′ｌＩｌを、ホエーパウダー（ラクトース換算）１００
ｇ／β、　ＫＬＰＯ＜　３　ｇ／β、　Ｍｇ５Ｏ＜　　
・７Ｈ２００、５ｇ／Ｌ　（ＮＨ，）、５０４１０　ｇ
／Ｒ，ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０１０ｍｇ／ｊ！、　二：］
チン酸１０ｍｇ／Ｌプサイミン塩酸塩１００μｇ／Ｌ　
ビオチン１００μｇ／β、コーン・スチープ・リカ−２
ロ ２　０　ｇ／　４１’，　ＣａＣＯ５　　３　０　ｇ／
　ｊｉ！の組成の生産培地（ｐＨ７．　４　）　２　０
ｍｆの入った３００ｍ　１２容三角フラスコに接種し、
３２℃，９６時間振盪培養した。培養後、（ｈｉｎａｒ
ｄの方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリイ（Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，）　１９９．９１（
１９５２）］に従って、培養濾液のＬ−プロリン生成量
を測定した。

結果を第２２表に示す。

第２２表 発明の効果 本発明によれば、大腸菌のラクトース・オペロン中、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼとβ−ガラクトシドパーミアー
ゼの構造遺伝子の全であるいは一部を含み、そのコーデ
ィング領域の上流に外来遺伝子の発現を可能にするコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物由
来のＤＮＡ断片を挿入することにより、コリネバクテリ
ウム属およびブレビバクテリウム属微生物に対して、乳
糖資化性を付与できる組換え体ＯＮ八を得ることができ
、この組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属およびブ
レビバクテリウム属に属するアミノ酸生産性微生物に保
有させることにより、乳糖資化性を有するコリネ型グル
タミン酸生産菌を得ることができる。さらに、該微生物
を乳糖を含む培地に培養することにより、培養物中に生
成蓄積したし一アミノ酸を採取することができる。

本発明によれば、コリネバクテリウム属およびブレビバ
クテリウム属に属する微生物で複製でき、選択可能な遺
伝子マーカーをもつと同時に大腸菌のラクトース・オペ
ロン由来のβ−り一ガラクトシダーゼの活性発現に必要
な構造遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を有しその上流に隣
接して制限酵素の切断部位を有するプラスミドを用い、
該制限酵素切断部位にコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物のＤＮＡ断片を挿入し
、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微
生物を形質転換して、乳糖分解活性を獲得した形質転換
株を検出することにより、該菌種内での遺伝子発現に必
要な転写・翻訳の開始を司るＤＮＡ断片を含む組換え体
プラスミドを取得することができる。

さらに、該ＤＮＡ断片を任意の遺伝子の構造遺伝子領域
の上流に配することにより、コリネ型細菌において、該
遺伝子の発現を強化できるので代謝産物の生産性の改善
、新たな機能の付与、有用な酵素あるいは生理活性蛋白
質の生産が可能になる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｃＧｌｌｌの作製工程を示す。 第２図はｐＥ’　Ｊａｃｌの作製工程を示す。太線の部
分は、大腸菌のラクトース・オペロン由来のＤＮＡ断片
である。 第１図、第２図とも、プラスミドＤＮへの大きさはｋｂ
　（キロベース）で表示しである。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 ｓｔＩ ｓｔｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）乳糖資化性を有し、コリネバクテリウム・グルタ
   ミカム、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバ
   クテリウム・フラバムまたはブレビバクテリウム・ラク
   トファーメンタムに属する微生物。 （２）該微生物が、大腸菌のラクトース・オペロン由来
   のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとβ−ガラクトシドパーミ
   アーゼの構造遺伝子の全てまたは一部およびそのコーデ
   ィング領域の上流に位置し、コリネバクテリウム属また
   はブレビバクテリウム属菌種中で外来遺伝子の発現を可
   能にするコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
   ム属に属する微生物由来のＤＮＡ断片を含み、かつコリ
   ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する
   微生物に対して乳糖資化性を付与できる組換え体ＤＮＡ
   を保有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の微生物。 （３）乳糖資化性を有するコリネバクテリウム属または
   ブレビバクテリウム属に属する微生物を乳糖を含む培地
   に培養し、培養物中にアミノ酸を生成蓄積させ、該培養
   物から該アミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸
   の製造法。 （４）該微生物が、大腸菌のラクトース・オペロン由来
   のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとβ−ガラクトシドパーミ
   アーゼの構造遺伝子の全てまたは一部およびそのコーデ
   ィング領域の上流に位置し、コリネバクテリウム属また
   はブレビバクテリウム属菌種中で外来遺伝子の発現を可
   能にするコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
   ム属に属する微生物由来のＤＮＡ断片を含み、かつコリ
   ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する
   微生物に対して乳糖資化性を付与できる組換え体ＤＮＡ
   を保有することを特徴とする特許請求の範囲第３項記載
   の製造法。 （５）該アミノ酸がグルタミン酸、グルタミン、リジン
   、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリ
   プトファン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン
   、アルギニン、オルニチン、シトルリンまたはプロリン
   である特許請求の範囲第３項記載の製造法。（６）大腸
   菌のラクトース・オペロン由来のβ−Ｄ−ガラクトシダ
   ーゼとβ−ガラクトシドパーミアーゼの構造遺伝子の全
   てまたは一部およびそのコーディング領域の上流に位置
   し、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
   菌種中で外来遺伝子の発現を可能にするコリネバクテリ
   ウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物由来
   のＤＮＡ断片を含み、かつコリネバクテリウム属または
   ブレビバクテリウム属に属する微生物に対して乳糖資化
   性を付与できる組換え体ＤＮＡ。 （７）プラスミドｐＣＰＬ７。 （８）コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム
   属に属する微生物で複製でき、選択可能な遺伝子マーカ
   ーをもつと同時に大腸菌のラクトース・オペロン由来の
   β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性発現に必要な構造遺伝
   子領域を含むＤＮＡ断片を有し、その上流に隣接して制
   限酵素の切断部位が配されたプラスミド。 （９）プラスミドｐＢ′ｌａｃｌ。 （１０）コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
   ム属に属する微生物で複製でき、選択可能な遺伝子マー
   カーをもち、大腸菌のラクトース・オペロン由来のβ−
   Ｄ−ガラクトシダーゼの活性発現に必要な構造遺伝子領
   域を含むＤＮＡ断片を有し、かつその上流に隣接して制
   限酵素の切断部位を有するプラスミドの該制限酵素切断
   部位にコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属に属する微生物のＤＮＡ断片を挿入して得られる組換
   え体プラスミドを用いて、コリネバクテリウム属または
   ブレビバクテリウム属微生物を形質転換して乳糖分解活
   性を獲得した形質転換株を得、該形質転換株から組換え
   体プラスミドを単離することを特徴とする該微生物内で
   の遺伝子発現に必要な転写・翻訳の開始を司るＤＮＡ断
   片を含む組換え体プラスミドを取得する方法。