JPH01181788A - エステラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、微生物由来の新規なエステラーゼ及びその製
造法に関する。更に詳しくは、本発明は、アルスロバク
タ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を
培養する事により得られる新規なエステラーゼ及びその
製法に関する。

〈従来技術及び解決しようとする課題〉一般にエステラ
ーゼとは、エステル結合を有する基質を加水分解する酵
素の総称であり、その基質特異性により、カルボン酸エ
ステルに作用するもの、チオールエステルに作用するも
の、リン酸エステルに作用するもの、硫酸エステルに作
用するものに分類される。狭義には、カルボン酸エステ
ルに作用するもののうち、低級脂肪酸のエステルを加水
分解するものをエステラーゼと呼び、グリセロールエス
テルを加水分解するものをリパーゼと呼んでいる。リパ
ーゼの粗標品にはリパーゼ作用の他にエステラーゼ作用
があり、両作用は実用上、耐熱性、トリプシン及びアル
カリ感受性、基質であるエステルの脂肪酸の鎖長の差な
どで区別されている。

しかし、両作用の相違はむしろ基質の物理的存在状態の
相違に起因するといわれている。即ち、エステラーゼ反
応は〜水溶液中の基質に対して酵素が作用するとされて
いるが、リパーゼ反応は水に不溶性の基質と水との界面
で進行すると言われている。（例えば５ａｒｄａら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｗ＋　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　３０５１３　（１９５８）参照）。

本発明の新規エステラーゼは、低級脂肪酸エステルを加
水分解する性質に加えて、ブチリルＣｏＡ　＋パルミト
イルＣｏＡに対しても高い活性を有する事からチオール
エステルゼとしての性質も兼ね備えている。本発明に言
うエステラーゼは、水溶液中の基質に対して酵素が作用
する上記の狭義のエステラーゼを意味する。

近年、酵素を有機合成に応用する試みがさかんに行われ
ており、各種のエステル化合物を、酵素エステラーゼを
用いて加水分解し、光学活性化合物を取得する事、或い
は、ブロキラルな化合物からキラルな化合物を創製する
事等の試みが数多（報告されている。それらの報告の多
くのものは豚肝エステラーゼ（Ｐｉｇ　１ｉｖｅｒ　ｅ
ａｔｅｒａｓｅ　　又はＰｏｒｃｉｎｅ　１ｉｖｅｒ　
ｅｓｔｅｒａｓｅ）を用いたものであるが（例えばＬａ
ｕｍｅｎらＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２６
４０７−４１０　（１９８５）及び−ａｒｔｇらＪ、　
Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　１０６３６９５（１９
８４）参照）、豚肝エステラーゼは高価である上に量的
な供給に制限があり工業的使用には不利であるため、豚
肝エステラーゼの代わりに微生物起源のエステラーゼを
用いる方法も試みられている。

その際、エステラーゼ産生微生物菌体を用いているのが
一般的であり酵素エステラーゼを精製し、その性質を明
らかにしている例はほとんどない。

（例えば、Ｋｏｔａｎｉら、Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｌｌ、　４７１３６３〜１３６５　（１９８３
）　Ｆｕｊｉｍｏｔｏ　Ｓ、　Ｊ、　Ｃｈｅｎ＋、　Ｓ
ｏｃ、　Ｃｈｅｌｌ、　Ｃｏｍｍｏｎ　　１３３３〜１
３３４　（１９８３）及びＢｒａｎｎｏｎらＪ、　Ａｒ
１ｔｉｂｉｏｔ　２９１２１〜１２４　（１９７６）参
照）。

一方、微生物起源のエステラーゼとしては、■Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ６６３３（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍＢｉｏｐｌｙｓ　Ａｃｔａ４８５３６７−３
７８　（１９７７））　、■Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ　５Ｒ２２（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｌｙｓ
　Ａｃｔａ　４２９１９１−１９７（１９７６）　）■
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＮＲＲＬ−８−
５５８（ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ　３０４１３−４
１９　（１９７５）　、■Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　　（Ａｒｃｈｉｖ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　１６０５０４−５１３
　（１９７４））　、■Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａ　　（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ８６６４３
−６５６　（１９７９）　　）、■Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｃｅｐａｃｉａ（Ｊ　Ｂａｃｔｅｖｉｏｌ　１１
８８８０−８８９　　（１９７４）　）、■Ｐｓｅｕｄ
ｏ■ｏｒａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｊ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ　　９５１０４７−１０５４　　（１９８４）及
び特開昭６Ｏ−３０６８１）　、■Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｃｌ　
１４９６−１４　（１９８２）、■Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓｎｉｇｅｒ　ＮＲＲＬ　３３７　（Ａｇｒｉｃ　Ｂ
ｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　４７１３６５−１８６８（１９８３
）　）及び（１）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｗｅ
ｇｍａｔｉｓ　ＡＴＣＣ１４４６８（Ｊ、Ｂａｃｔｏｒ
ｉｏｌ１５５’　１２４９−１２５９（１９８３））起
源のエステラーゼ等が報告されているがＢ、５ｕｂｔｉ
ｌｉｓＮＲＲＬ−Ｂ−５５８起源のエステラーゼをセフ
ァロスポリン誘導体の合成に応用した例を除いていずれ
の場合にも有機合成反応への応用については全（触れら
れていない。

く課題を解決するための手段〉 本発明者らは、豚肝臓エステラーゼと同様に有機合成反
応への応用範囲の広い微生物起源のエステラーゼを取得
すべく研究を重ねた結果、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　（ＩＦＯ−１２９
５８）がかかる優れた性質を有するエステラーゼを産生
ずる事を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明はかかる優れた性質を有する微生物由来の
新規エステラーゼを供給する事によって、有機合成化学
の分野で、該エステラーゼを用い、光学活性化合物の製
造及びプロキラルな化合物からキラル化合物の創製等を
工業的に実施する事を可能にするものである。

本発明は第１に以下に示す理化学的性質を有する新規な
エステラーゼに関する。

１）作用：有機カルボン酸エステルのエステル結合を加
水分解する ２）基質特異性：有機カルボン酸のアルコールエステル
、千オールエステルに作用する。水溶性の・短鎖脂肪酸
エステル、短鎖トリアシルグリセライドに高い活性を有
するが、水に不溶性の長鎖脂肪酸エステル、トリアシル
グリセライドには作用しない。ブチリルＣｏＡ、パルミ
トイルＣｏＡに高い活性を示すがアセチルＣｏＡ、コリ
ンエステル及びコレステロールエステルには作用しない
。

３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性；フェノールフタレインジ
プチレート（本明細書中では以下ＰＰＤと略称する）を
基質とした時の加水分解の至適ｐＨは１０．０〜１０．
２である。２００１の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４，０〜５．０）　、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５
，０〜７．０）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０〜９．
０）　、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，
０〜１１．０）　、リン酸−水酸化カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１１，０〜１２．０）を用い４０℃３０分間保存後の
残存活性は、ｐｉ（４，０〜５．０では０〜６０％、ｐ
）１６．０〜１１．０では８０〜９５％、ｐ）１１２．
０では０％である。

４）至適温度及び熱安定性：　ＰＰＤを基質とした時の
加水分解の至適温度は２００ｍＭグリシン−水酸化ナト
リウム緩衝液ｐＨ１０，０中で６５〜７０℃である。

同緩衝液中で、３０分間各温度で処理した後の残存活性
は５０℃で１００％、６０℃で８０％、７０℃で３０％
、８０℃で０％である。

５）分子量：　４３，０００±２，０００　（Ｓ　Ｄ　
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法） ６）等電点：５．０±０．１ ７）失活条件：１ｓ＋Ｍフェニルメチルスルフォニルフ
ルオライド（ＰＭＳＦ　）、１１００ｔＩジイソプロピ
ルフルオロリン酸（ＤＩＦＰ）　、又は０．１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム存在下に４０℃、１０分間処理すると
完全に失活する。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，
０，５％Ｔ１１ｅｅｎ８０、及び５＋ｉＭデオキシコー
ル酸ナトリウムを含む２００ｗＭグリシン・水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ１０，０）中で、４０℃１０分間処
理すると、各々約７０％約４０％、および約６０％活性
が低下する。

８）アミノ酸配列ニアミノ末端から３０番めまでのアミ
ノ酸配列は下記の通りである。

Ｎ末−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ’−Ｉ
　１ｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ”−Ｇｌｕ−
３ｅｒ−Ｖａｌ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ　”−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ”　”−Ｌｅｕ−３ｅｒ−
Ｇ　ｌｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ　”　’−Ｇ　１　ｕ−Ｔｙ
ｒ−３ｅｒ−Ａｌ　ａ−Ｇｌｎ” 本発明のエステラーゼはサブユニット構造を持たない１
本鎖ペプチドでその分子量が４３．０００±２゜０００
である点で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ａ
ＴＣＣ６６３３（１５０，０００）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　ＮＲＲＬ−Ｂ−５５８（１９
０゜０００）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　
５Ｒ−２２（１６０，０００）。

Ｂａｃｔｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ　　（４ＬＯＯＯ）＋Ｐｓｅｕｄｏ＋ＩＩｏｎａｓ
　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　　（５５，０００）＋Ｐｓｅ
ｕｄｏ＋ＩＩｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ　　（３４＋５０
０Ｌ　　Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ（４８，０００）、　　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ
ｉｇｅｒ　ＮＲＲＬ　３３７　　（２３，０００，２７
，８００，２９、５００，１２７，０００）及びＭｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅｇｍａｔｉｓ　ＡＴＣＣ１
４４６８（３６，０００〜４１．０００）由来のエステ
ラーゼとは明らかに異なっている。

又、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｉｌ　Ｋ−１２起源
のエステラーゼは膜に存在するカルボキシルペプチダー
ゼと言うべきもので、これも本発明のエステラーゼとは
細胞内局在性の点で相違は明らかである。よって本発明
のエステラーゼは従来知られていない新規なエステラー
ゼである。

第２に、本発明はＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属し、
上記の性質を有する新規なエステラーゼ産生能を有する
微生物を培養し、培養菌体中に該酵素を蓄積せしめ、こ
れを分離、採取する事を特徴とするエステラーゼの製造
法に関する。

本発明の新規なエステラーゼは微生物により産生され、
その産生菌としてはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属し
、上記性質を有する酵素を産生ずる能力を有する株であ
れば良く、　例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏ
ｂｔｆｏｒｎｉｓ　（ＩＦＯ−１２９５８）が挙げられ
る。本発明用いる微生物としては、本菌株とその変種、
変異株に限定されるものではなく、上記性質を有する酵
素を産生ずる菌であれば良い。

本発明の新規なエステラーゼの産生菌は醗酵学の分野で
公知の常法に従って培養する事ができる。

使用する培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその
他の栄養素を適当量含有する培地ならば、合成培地、又
は天然培地のいずれも使用可能であり、液体培地又は固
体培地を用いて培養する事ができる。具体的には、炭素
源としてはグルコース、フラクトース・マルトース、ガ
ラクトース、リボース、サッカロース、澱粉、澱粉加水
分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、米などの天然炭
水化物、グリセロール、マンニトール、メタノール、エ
タノールなどのアルコール類、グルコン酸、ピルビン酸
、酢酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィン
、ケロシンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン酸
、グルタミン、アラニン、アスパラギンなとのアミノ酸
類など一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考
慮して、一種または二種以上を適宜選択して使用すれば
良い。

窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、乾
燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カ
ザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステイープリカー、フ
ィツシユミールないしその加水分解物、その他の動物、
植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アン
モニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿
素など無機窒素化合物より使用微生物の資化性を考慮し
、一種または二種以上を適宜選択して使用する。

さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、
鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カルシウム、カリウムなど
のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩などの一
種または二種以上を適宜添加し、必要に応じて植物油、
界面活性剤などの消泡剤を添加しても良い。

培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で浸振培養
、通気撹拌培養、静置培養、連続培養などの通常の培養
法を用いて行うことができる。

培養条件は、培地の種類、培養法により適宜選択すれば
良（、本菌株が増殖し、エステラーゼを産生できる条件
であれば特に制限はない。通常は培養開始のｐ）Ｉを５
に調製し、３０℃の温度条件下で培養することが望まし
い、培養日数は通常１〜２日が適当である。

以上の様にして培養物中に産生蓄積されたエステラーゼ
は以下の様な方法で採取、分離する事ができる。培養終
了後、菌体を濾過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液で
洗浄した後、物理的手段もしくは細胞壁溶解酵素処理の
様な生化学的手段、もしくは、界面活性剤処理などの化
学的手段を単独、もしくは組み合わせて施す事により菌
体を破砕し、エステラーゼを抽出する事ができる。

その−例を挙げると次の通りである。

即ち、遠心分離により集めた菌体を２００ｗＭグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）で洗浄し、
摩擦型破砕装置ダイク・ミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ）を
用いて菌体を破砕する。破砕液を遠心分離し、粗エステ
ラーゼ液を得る。こうして得られた粗エステラーゼ液か
ら生化学分野で公知の手段である沈澱、塩析、及び多種
のカラムクロマトグラフィー等の方法を組み合わせて用
いる事により本エステラーゼを精製する事ができる。精
製法の一例を示すと、粗エステラーゼ液を硫安２５〜６
５％飽和で塩析し、エステラーゼを沈澱せしめ、該沈澱
を、トリス塩酸緩衝液で溶解し、透析による脱塩後２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ）１７．２）で平衡化したＰ
ｒｏｔｅｉｎｐａｋ　ＤＥＡＥ−５ＰＷに通過させ、エ
ステラーゼを吸着させる。０〜０．５Ｍ　ＮａＣ１直線
濃度勾配法によってエステラーゼを溶出し、次いで溶出
液を濃縮後ｐｕ　７゜２のトリス塩酸緩衝液に対し透析
する。透析した溶液を同方法でＤＥＡＥ−５ＰＷを通過
させる事により精製する。溶出液を濃縮、透析後、該濃
縮液を同緩衝液に２００ａ＋Ｍ塩化ナトリウムを加えて
平衡化したＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００舖に通液し、溶
出したエステラーゼ画分を濃縮する。　５０ａ＋Ｍ　ト
リス塩酸緩衝液、２１　　芒硝Ｎ０ｚＳＯａ　（ｐＨ８
，０）で平衡化した疎水性クロマトグラフィー用カラム
ＬＩＬＴＲＯＮ　ｇｌｙｃｏｌ−ＨＣに濃縮液を通液し
、エステラーゼをカラムに吸着せしめた後、２〜ＯＭま
での直線的逆濃度勾配溶出法によってエステラーゼを溶
出する。この溶出液を濃縮、脱塩後、１００＋Ｍグリシ
ン・水酸化ナトリウム、５＋＊Ｍ水酸化テトラブチルア
ンモニウム（ｐＨ１０，０）で平衡化した逆相クロマト
グラフィーカラムＰｈｅｎｙｌ　５ＰＷ−ＲＰに通液し
１５〜５０％アセトニトリルの直線濃度勾配によりエス
テラーゼを溶出する。こうして得られた精製エステラー
ゼ標品は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
単一のバンドを示し分子盟約４３，０００のサブユニッ
ト構造を持たない一本鎖のポリペプチドである。

次に本発明に於いて用いたエステラーゼの活性測定法を
示す。

２００ｍＭのグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
１０，０）中にエステラーゼ溶液を添加し、４０°Ｃで
ブレインキュベーションを行う。次いでエタノールに溶
解した基質フェノールフタレインジプチレート（下記の
一般式（１）で示す）を添加して最終２５μＭとし、４
０℃下でフェノールフタレインの遊離に伴う５５０ｎ＋
ｍの吸光度の増加を測定する。１分間に１ｎｌＩｌｏｌ
ｅのフェノールフタレインを遊離する酵素量を１単位（
ｕｎｉｔ）とした。

次に実施例により本発明を説明する。これらにより本発
明の範囲が何ら制限されるものではない。

実施例１ アルスロバクタ−・グロビフオルミス （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｗｉｓ
）　（ＩＦＯ−１２９５８）を、可溶性デンプン３％、
ポリペプトン０．７％、酵母エキス０．５％、ＫＨｚＰ
Ｏａ　Ｏ，５％を含むｐＨ５，０の培地１０ｍに一白金
耳植菌し、３０℃２４時間浸とう培養した。更に得られ
た培養液の１１１１を、上記組成の培地１００ｄに接種
し、３０°Ｃ４８時間浸とう培養した。

この種培養液を、可溶性デンプン６％、ポリペプトン１
％、酵母エキス０．２％及びＫｔｌｚＰＯａ　０．５％
含むｐ）ｌ　ｓ、ｏの培地１０２に接種し、３０℃で４
８時間、通気量１１／ｗｉｎ、撹拌速度６５０ｒｐ−で
培養した。培養終了後１０．０００　ｇ　１０分間の遠
心分離により得た菌体を２００ｍＭグリシン・水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐ！４１０．０）で洗浄し一２０°Ｃ
で凍結し、−夜保存した。

菌体を融解後８００ｄ〜１０００ｍの同緩衝液に懸濁し
、Ｄｙｌ□　Ｍｉｌｌを用いて、４°Ｃで菌体を摩砕し
た後、菌体破砕液を超遠心分離（１００，０００ｇ　Ｘ
　６０分間）して、エステラーゼ粗抽出液を得た。その
結果、湿重量的２００ｇの菌体から比活性９．４（ｕｎ
ｔｔｓ／ｍｇ）の粗酵素が９４５９＋＊ｇ得られた。

実施例２ 実施例１に準じて得られた粗エステラーゼ抽出液を硫安
２５％飽和とし生じた沈澱を遠心分離により除去した。

続いて上滑を硫安６５％飽和にし、生じた沈澱を分取し
、（１０，０００ｇＸ１０分間）　、　ｐＨ７，２の２
０１１Ｍトリス塩酸緩衝液に溶解後、同緩衝液に対して
透析した。

このエステラーゼ溶液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−５ＰＷ　（２１，５ａ＋ｗφＸ１５ｃｍ）に通液し、
同カラムにエステラーゼを吸着させた後、Ｏ〜０．５Ｍ
　ＮａＣ１直線濃度勾配法によりエステラーゼを溶出し
た。

その結果、エステラーゼが６２３４４ｕｎｉｔｓ　（活
性回収率７７％）　、０．２５Ｍ　ＮａＣ１付近に溶出
した。

更に溶出エステラーゼ液を同緩衝液で希釈後、再びＤＥ
ＡＥ−５Ｐ−に通液し同操作によりエステラーゼを溶出
した。その結果、活性回収率６６％で３９３８９ｕｎｉ
ｔｓのエステラーゼ溶液が得られた。

該エステラーゼ溶液を限外濾過膜で脱塩濃縮後、５０ａ
＋Ｍ　トリス塩酸緩衝液、２００＊Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ
７，２）で平衡化した分取用ゲル濾過カラムＴＳＫ　ｇ
ｅｌ　Ｇ３０００蛋（２１，５ｍ＊φＸ　６０ｃ＋＊　
）に通液した。溶出したエステラーゼ画分を濃縮後、５
０１１Ｍトリス塩酸緩衝液、２Ｍ　ＮａｚＳＯａ　　（
ｐＨ８，０）で平衡化したＬＩＬＴＲＯＮｇｌｙｃｏｌ
−ＩＣカラム（２０，０＋１ｌＩｌφＸ　２５ｃｔａ　
）通液し、エステラーゼを吸着させた後、２〜ＯＭのＮ
ａ、ＳＯ，直線逆濃度勾配溶出法でエステラーゼを溶出
した。

その結果エステラーゼはＮａｔＳＯａ　０．６〜０．７
Ｍ付近に単一のピークとして溶出された。該エステラー
ゼ活性画分を濃縮、脱塩後、１００ｍＭグリシン・水酸
化ナトリウム緩衝液、５＋＊Ｍ水酸化テトラブチルアン
モニウム（ｐＨ１０，０）で平衡化した逆相クロマトグ
ラフィーカラムＰｈｅｎｙ１５ＰＷ−ＲＰ（４，６ｍｍ
φＸ　７　、５ｃ＋＊）に通液し、アセトニトリル１５
〜５０％の直線濃度勾配で、エステラーゼを溶出した。

以上の精製過程により、活性回収率５．２％で、比活性
５２７８５．３（ｕｎｉ　ｔｓ／ｗｇ）のエステラーゼ
標品が約８８μｇ得られた。

得られたエステラーゼ標品を５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に供したところ分子量４３，０００の単
一バンドの蛋白として認められた。

但し、ホスホリラーゼＢ（分子量９２．５００）　、生
血清アルブミン（６６，２００）　、卵白アルブミン（
４５，０００）　、炭酸脱水素酵素（３１，０００）　
、大豆トリプシンインヒビター（２１，５００）及びリ
ゾチーム（１４，４００）を５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅによる
エステラーゼ分子量決定の標準物質とした。

第１表にこの精製過程に於ける比活性及び活性回収率を
示す。

実施例３ 実施例２に準じて得られた精製エステラーゼについて、
ＬＫＢ製ポリポリアクリルアミドゲル度を用いｐＨ４，
０〜６．５の範囲で等電点電気泳動（電カ一定：１５Ｗ
）を、１０°Ｃで９０分間行った。泳動後、コマジ−ブ
リリアントブルーＲ−２５０で染色し、蛋白質のバンド
を検出した。その結果、本エステラーゼの等電点は５．
０±０．１であった。尚、電気泳動の際の標準物質とし
て、バイオラッド社のｐｌ？−カー　（ｐｉ　４．６５
．５．１０．６．００．６．５０　）　、及びオリエン
タル酵母社のｐＩママ−−（ｐｌ　４．１０．４．９０
、６．４０　）を用いた。

実施例４ 実施例２に準じて得られた精製エステラーゼ溶液（エス
テラーゼ約４０μｇ相当）を濃縮後、５ｅｐｈａｄｅｘ
　Ｇ−２５カラム（１１＋ｍｍφＸ１０ｃｍ）に通液し
、脱塩した。溶出したエステラーゼ画分を濃縮し、気相
アミノ酸シークエンサー４７７Ａ　（アプライド・バイ
オシステム社製）にかけ、本エステラーゼのＮ末３０ア
ミノ酸配列を決定した。決定されたＮ末アミノ酸配列は
以下の通りである。

ＮＨｚ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ’−
１１ｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　”−Ｇｌｕ
−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ　”−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ　”　’−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ｇ　１　ｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ　”　’−Ｇｌ　ｕ−Ｔ
ｙｒ−５ｅｒ−Ａ　１　ａ−Ｇｌｎ” 実施例５ 実施例２に準じて得られた精製エステラーゼを下記各試
薬と共に３７℃で１０分間インキエベーシヲンした後、
前述の活性測定法及び前述の活性測定法において吸光度
測定に代わりｐＨスタット法（反応に伴い基質より遊離
する酸をｐＨスタンド（ラジオメーター社製）を用いて
水酸化ナトリウムで滴定する方法）を用いる方法により
残存エステラーゼ活性を測定した。第２表にその結果を
示す。尚、第２表中残存活性は、未処理の酵素活性を１
００とした時の相対値（％）で表わした。又、第２表中
１）は臭化セチルトリメチルアンモニウム２）はフェニ
ルメチルサルフォニルフルオライド、３）はジイソプロ
ピルフルオロリン酸４）はＰ−クロロマーキュリ安息香
酸を示す。

第２表 実施例６ 実施例２に準じて得られた精製エステラーゼを２０ｍＭ
グリシン・水酸化ナトリウム（ｐ）Ｉ　９．０或いはｐ
Ｈ１０，０）中で各基質に作用させた。各基質に対する
加水分解活性は上述のｐＨスタット法或いは分光光度計
を用いて測定した。その結果を第３表及び第４表中に示
した。第３表中、加水分解活性は本エステラーゼの酪酸
エチル加水分解活性を１ｏｏとする相対活性（％）で示
した。尚、各基質は０．２％ポリビニルアルコールで乳
化して用いた。第４表中、活性はエステラーゼ１ｍｇ当
たり１分間に遊離したＣｏ＾、コリン及びコレステロー
ルのμモル数で表した。

第３表 第４表 実施例７ 実施例２に準じて得られた精製エステラーゼの至適ｐＨ
及びｐＨ安定範囲をＰＰＤを基質として測定した。その
結果を第１図及び第２図に示す。

第１図に於いて、活性測定は４０’Ｃで行い、ｐＨ１０
，２の活性値を１００とした時の相対活性（％）で表し
た。第２図に於いて、酵素液を各ｐＨの緩衝液中で４０
℃、３０分間インキエベーションした後の残存活性を４
０°Ｃ，ｐ）１１０．０で測定した。活性は、０時間の
活性値を１００とした時の残存率（％）で表した。

実施例８ 実施例２に準じて得られた精製エステラーゼの至適温度
と熱安定性を測定した。その結果を第３図、及び第４図
に示す。第３図において横軸は絶対温度の逆数、縦軸は
ＰＰＤを基質とした時の加水分解の初速度の対数を表す
。活性測定は、２００ｍＭグリシン・水酸化ナトリウム
緩衝液ｐＨ１０，０中で行った。第４図は各温度で酵素
液を３０分間前処理した後、上記緩衝液中４０℃で（１
）を基質として残存活性測定を行ったものである。活性
は未処理のエステラーゼ活性を１００とした時の活性残
存率（％）で表した。

参考例１ 実施例２に準じて得られたエステラーゼ精製標品を用い
て、菊酸（２，２−ジメチル−３−イソブテニルシクロ
プロパン−１−カルボン酸、以下、本明細書中ではＫＣ
Ａと略称する）のエチルエステル（以下、本明細書中で
はＫＣＥと略称する）の加水分解反応を行った。

即ち、該酵素２０μｇ　（３１６ｕｎｉｔｓ）及び牛血
清アルブミン５５ｍｇを２００＋Ｍグリシン・水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）　２５．０−に添加し
、（±）−シス、トランスＫＣＥ　（シス／トランス比
＝　１０／９０）を最終１００＋ｓＭになる様添加して
４０℃で２４時間撹拌下に反応させた。反応後、反応液
に３５％）ＩｃＩ３Ｒ１とメチルイソブチルケトン約５
０−を加え、生成ＫＣＡと、未反応のＫＣＥを酸析、抽
出した。

抽出液をガスクロマトグラフィー（カラム：５ｈｉｎｃ
ｈｒｏｓ＋　Ｆ５１　＋　ＨｓＰＯａＩＯ＋　１χ、　
１．１ｍ、　１４０℃）で分析し、内部標準法により、
収率（％）を計算した。

次に上記抽出液に０．ｌＮＮａＯＨ２０ａｆを添加して
ＫＣＡのみをナトリウム塩として水層に抽出した後、再
び３５％）ＩＣＩ　とメチルイソブチルケトンにより、
ＫＣＡを酸析抽出した。該抽出液を濃縮脱水後、得られ
たＫＣＡをトルエン０．５ｄに溶解し、ＫＣＡと等モル
の塩化チオニル、ピリジン及び３，５−ジクロロアニリ
ンを加えて８０℃で反応させアニリドとした後、高速液
体クロマトグラフィー（カラム：　ＳＩＩＭＩＰＡＸ　
０Ａ−２１００Ｘ　２本、移動相：ｎ−ヘキサン：１，
２−ジクロロメタン（１７：３ｖ／ｖ）、流速２．０ｍ
／ｗｉｎ）で、異性体分析を行った。その結果を第５表
に示す。

第５表 １）収率：原料中の（＋）−）ランス体ＫＣＥモル数に
対する得られた（＋）−トランス体ＫＣＡモル分率を表
す。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明のエステラーゼの至適ｐＨ及
びｐＨ安定性を示すものである。第１図に於いて、活性
はｐＨ１０，２の活性値を１００とした時の相対活性（
％）で表す、第２図に於いて、活性は、０時間の活性値
を１００とした時の残存率（％）で表す。 第３図及び第４図は本発明のエステラーゼの至適温度及
び熱安定性を示すものである。第３図において横軸は絶
対温度の逆数、縦軸はＰＰＤを基質とした時の加水分解
の初速度の対数を表す。第４図において活性は未処理の
エステラーゼ活性を１００とした時の活性残存率（％）
で表す。 第１図 第２図 第３図 ２．８２．９３．０８．１３．２３．．３１／Ｔ 第４図 °Ｃ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有するエステラーゼ １）作用：有機カルボン酸エステルのエステル結合を加
   水分解する ２）基質特異性：有機カルボン酸のアルコールエステル
   、チオールエステルに作用する。水溶性の短鎖脂肪酸エ
   ステル、短鎖トリアシルグリセライドに高い活性を有す
   るが、水に不溶性の長鎖脂肪酸エステル、トリアシルグ
   リセライドには作用しない。ブチリルＣｏＡ、パルミト
   イルＣｏＡに高い活性を示すがアセチルＣｏＡ、コリン
   エステル及びコレステロールエステルには作用しない。 ３）至適ｐＨ及びｐＨ安定性：フェノールフタレインジ
   ブチレートを基質とした時の加水分解の至適ｐＨは１０
   ．０〜１０．２である。２００ｍＭの酢酸−酢酸ナトリ
   ウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．０）、リン酸カリウム緩
   衝液（ｐＨ５．０〜７．０）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
   ７．０〜９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
   （ｐＨ９．０〜１１．０）、リン酸−水酸化カリウム緩
   衝液（ｐＨ１１．０〜１２．０）を用い４０℃３０分間
   保存後の残存活性は、ｐＨ４．０〜５．０では０〜６０
   ％、ｐＨ６．０〜１１．０では８０〜９５％、ｐＨ１２
   ．０では０％である。 ４）至適温度及び熱安定性：フェノールフタレインジブ
   チレートを基質とした時の加水分解の至適温度は２００
   ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１０．０中
   で６５〜７０℃である。同緩衝液中で、３０分間各温度
   で処理した後の残存活性は５０℃で１００％、６０℃で
   ８０％、７０℃で３０％、８０℃で０％である。 ５）分子量：４３，０００±２，０００（ＳＤＳ−ポリ
   アクリルアミドゲル電気泳動法） ６）等電点：５．０±０．１ ７）失活条件：１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフル
   オライド（ＰＭＳＦ）、１００μＭジイソプロピルフル
   オロリン酸（ＤＩＦＰ）、又は０．１％ドデシル硫酸ナ
   トリウム存在下に４０℃、１０分間処理すると完全に失
   活する。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％Ｔ
   ｗｅｅｎ８０、及び５ｎＭデオキシコール酸ナトリウム
   を含む２００ｍＭグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（
   ｐＨ１０．０）中で、４０℃１０分間処理すると、各々
   約７０％約４０％、および約６０％活性が低下する。 ８）アミノ酸配列：アミノ末端から３０番めまでのアミ
   ノ酸配列は下記の通りである。 【アミノ酸配列があります】
2. （２）アルスロバクター（￥Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
   ￥）属に属する請求項１記載のエステラーゼ産生菌を培
   養し該培養物からエステラーゼを分離、回収する事を特
   徴とする請求項１記載のエステラーゼの製造法
3. （３）アルスロバクター（￥Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
   ￥）属に属するエステラーゼ産生菌が￥Ａｒｔｈｒｏｂ
   ａｃｔｅｒ￥￥ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ￥（ＩＦＯ−１
   ２９５８）である請求項２記載の製造法