JPH01191683A - 新規なプロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なプロテアーゼに関し、詳しくは、スポロ
ボロマイセス属に属する酵母により産生される塩基性ア
ミノ酸残基特異的プロテアーゼに関するものである。

〔従来の技術〕

塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼは、プロホルモ
ンからのホルモンの生合成に関与していることが示唆さ
れ、その酵素化学的性質、生理的機能などを明らかにし
、融合蛋白質からの蛋白質の合成などに利用するため各
種起源より精製が試みられてきた。現在までに完全に精
製され報告されているのは、豚脳下垂体からのプロテア
ーゼ（ＩＲＣＭ−Ｓｅｒｉｎｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　１
；Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、２ｆ）Ｊ、１０８５０　（１９８６）　
）、牛脳下垂体からのプロテアーゼ（ＰＯＭＣ−変換酵
素；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、。

１７１９４　（１９８５）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、、　２６１　１４３９２（１９８６））　、酵母か
らのプロテアーゼ（Ｐｈｏｒｃｅｓ　ｉ　ｎＹ−１；Ｎ
ａｔｕｒｅ　３０９，５５８（１９８４））のみであり
、プロテアーゼの分類では、ＩＲＣＭ−３ｅｒｉｎｅ　
Ｐｒｏｔｅａｓｅ。

Ｐｈｏｒｃｅｓｉｎはセリン・プロテアーゼに、ＰＯＭ
Ｃ−変換酵素は、アスパルティク・プロテアーゼに分類
されている。切断部位はＩＲＣＭ−３ｅｒｉｎｅ　Ｐｒ
ｏｔｅａｓｅｌ、ＰＯＭＣ−変換酵素は、連続する塩基
性アミノ酸のＣ末端側を、Ｐｈｏｒｃｅｓｉｎ　Ｙ−１
は、連続する塩基性アミノ酸残基の間を特異的に加水分
解する。また、部分精製ではあるが、サツカロマイセス
°セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）より連続する塩基性アミノ酸残基対のＣ
末端側を選択的に加水分解するＣａ”−依存性Ｔｈ１ｏ
ｌＰｒｏｔｅａｓｅも報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　１４４．８０７（１９８７
））。

〔発明が解決しようとする課題〕

プロテアーゼを融合蛋白質からの蛋白質の合成に利用す
る場合、該プロテアーゼは連続する塩基性アミノ酸残基
のＣ末端側を特異的に切断するものであることが望まし
く、この様なプロテアーゼの探索が期待されている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、上記現状に鑑み、大量に調製できることか
ら、その起源として酵母を選択し、酵母より上記性質を
有するプロテアーゼの探索を行い、スポロボロマイセス
（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母がこ
の様な性質を有するプロテアーゼを生産することを見出
し、このプロテアーゼを精製しその理化学的性質を明ら
かにし本発明を完成した。

即ち、本発明は次の（１）〜（５）に示す理化学的性質
を有するプロテアーゼを提供するものである。

■　作用および基質特異性 ペプチド鎖中に存在する一Ｘ−Ａｒｇ−配列（ＸはＡｒ
ｇ、　ＬｙｓまたはＰｒｏ）のＡｒｇのＣ末端側のペプ
チド結合を加水分解する。

↓ （−Ｘ−Ａｒｇ−の矢印部分を加水分解する）■　至適
ｐＨ：）’Ｊスス−酸緩衝液ｐＨ７，０付近。

■　ｐｎ安定性： ｐＨ６，０〜８．０で最も安定（ｐＨ６〜８で３０℃１
３０分の処理後にも８０％以上の残存活性を有する）。

■　至適温度：４０〜４７０℃付近（ｐＨ７，０）。

■　熱安定性： ３８℃以下で安定（ｐ）ｌ　７．０．１０分間の熱処理
で活性の低下がない）。

本発明のプロテアーゼの上記以外の理化学的性質、およ
び酵素学的性質は以下の通りである。

■　活性化剤： 塩化カルシウム、塩化コバルト、塩化マンガン、塩化マ
グネシウム、塩化ニッケルなどにより活性化される。特
に低濃度の塩化カルシウムにより最も活性化される。ま
た、ルプロールＰＸ　（Ｌｕｂｒｏｌ　ＰＸ）やトリト
ンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）などの界面活
性剤により活性化される。

■　■害剤： エチレンジアミン４酢酸（以下ＥＤＴＡと略す）、エチ
レングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）４酢
酸（以下Ｅｆｌ；ＴＡと略す）などの金属キレータ−や
、硫酸銅、塩化亜鉛、塩化水銀などの重金属により阻害
される。また、パラクロロ水銀安息香酸（以下ｐ−Ｃ）
ＩＢと略す）やパラアミジノフェニルメタンスルフォニ
ルフルオリド（以下ｐ−ＡＰＭＳＦと略す）によっても
阻害される。

■　分子量： ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００５ＷｘＬによるゲル濾過で
約５．６万、また５Ｏ５−ＰＡＧＥで約４．７万■　等
電点：等電点電気泳動により４．５尚、本発明において
、プロテアーゼの活性は以下に示す方法により行った。

活性測定法ニ ドリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，０５０μｍｏｌ　、ルブロ
ールＰＸ　　１０ｍｇ、塩化カルシウムＱ、５μｍｏｌ
。

Ｂｏｃ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　（Ｂｏｃは
、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｕ　ｔｏｘｙｃａｒ
ｂｏｎｙ　ｌ）基の略、ＭＣＡは４−メチルクマリン−
７−アミド（４−Ｍｅｔｈｙｌ−ｃｏｕｍａｒｉｎ−７
−ａｎ＋１ｄｅ）の略）　０．１　μｍｏｌおよび酵素
を含有する反応液中で３０℃で反応させ、生成する７−
アミノ−４−メチルクマリン（７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍ
ｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ；　　以下ＡＭＣと略す）
に由来する螢光（励起波長３８０ｎｍ、発光波長４６０
ｎｍ）を経時的に測定した。ＩＵは１分間に１　ｎｍｏ
ｌのＡＭＣの遊離を触媒する酵素量とした。以下、この
測定条件を標準反応条件とする。

本発明において使用する微生物は、塩基性アミノ酸残基
特異的プロテアーゼを生産することができるスポロボロ
マイセス属に属する全ての。

菌株、突然変異株、変種を含む。それらのうち好ましい
菌株は、スポロボロマイセス・オドラス（Ｓｐｏｒｏｂ
ｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｏｄｒｕｓ）ＩＦＯ１５９７である
。

本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼは、例
えば、スポロボロマイセス属に属する塩基性アミノ酸残
基特異的プロテアーゼ生産能を有する菌株をＹＭ培地な
どの通常の培地で培養することにより、培養物から取得
することができる。培養液中に特に誘導物質は必要とし
ない。また、培養温度は２５〜３０℃が好ましく、培養
時間は、１日から３日程度が好ましい。

生産された塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの精
製は、通常の方法を組み合わせることによって行われる
。例えば、培養物を遠心分離して菌体を回収し、グイノ
ーミルなどにより菌体を破砕し、破砕液を低速で遠心分
離することにより菌体残渣などを分離し、得られた上清
を超遠心分離（例えば１０５．０００ｇ、６０分）する
ことにより膜画分を調製する。この膜画分より界面活性
剤によって酵素を可溶化し、可溶化した酵素は、硫安分
画、熱処理、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、ゲル濾過などによって精製
される。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明の詳細な説明するが、本発明
はこれに限定されるものではない。

実施例１ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼのスポロボロ
マイセス・オドラスＩＰＯ１５９７からの精製） スポロボロマイセス・オドラスＩＦＯ１５９７をＹＭ培
地（グルコース１０ｇ１バクトーペプトン５ｇ１酵母エ
キス３ｇ、麦芽エキス３ｇ／１３３ｐ中で２日培養し、
培養液を遠心分離して２６５ｇ　（湿重量）の菌体を回
収した。この菌体を３００　＠７の緩衝液１（１０ｍＭ
）リス−塩酸ｐｌ＋’７．　ｏ、　ｏ、　５ｍＭ　Ｃａ
Ｃ１ｚ）に懸濁しグイノーミルで菌体を破砕し、破砕液
を１，０００ｇ、　１０分間の遠心分離により菌体残渣
を除去し、得られに上清を１０５．０００ｇ、　６０分
の超遠心分離により沈殿として膜画分を調製した。この
膜画分を６０ｍｆの抽出用緩衝液（１０ｍＭ　）リス−
塩酸ｐｔ＋７．０．０．５ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、　　１％
ルプロールｐｘ。

０．１Ｍ　ＮａＣ１）に懸濁し一晩撹拌して酵素を抽出
した。上記条件で超遠心分離し上清として膜抽出液を得
た。

この膜抽出液に硫安を３０％飽和になるまで添加し、６
．０００ｇ、　２０分の遠心分離により上清を得、この
上清に更に硫安を７０％飽和になるまで添加し、６．Ｏ
ＱＯｇ、　２０分の遠心分離により沈殿画分を３０％−
７０％硫安画分として回収した。

この沈殿を少量の緩衝液２　（１０ｍＭ　）リス−塩酸
＋　０．５ｍＭ　ＣａＣ１ｚ＋　０．２％ルブロールＰ
Ｘ）　ｐＨ８，０に溶解し、同緩衝液に透析したあと５
０℃ＩＯ分間の熱処理を行った。生じた沈殿を３９，０
００ｇ、　２０分の遠心分離により除去し熱処理画分と
した。

この両分を緩衝液２　（ｐＨ８，０）で予め平衡化した
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍ　　（東ソー
■製）　（２，５Ｘ４５ｃｍ）に注入し、充分同緩衝液
で洗浄してから０からＩＭ　ＮａＣ１の勾配溶出法によ
り酵素を溶出し活性画分を得た。この時の溶出パターン
を第１図に示した。

活性画分を限外濾過により濃縮した後、緩衝液２　（ｐ
ｌ＋７．０）に透析し同緩衝液で予め平衡化したＡｒｇ
ｉｎｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）
　（２，５Ｘ１０ｃｍ）に注入した。カラムを同緩衝液
で充分に洗浄した後、０から０．５Ｍ　ＮａＣ１の勾配
溶出法で溶出した。この溶出パターンを第２図に示した
。活性画分を濃縮しＡｒｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分と
した。

Ａｒｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分を０．５Ｍ　ＮａＣ１
を含む緩衝液２　（ｐＨ７，０）で平衡化したＣｏｎ　
Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）（１，６
Ｘ２５ｃｍ）に注入した。充分に同緩衝液で洗浄した後
、０．５Ｍ　ＮａＣ１，０，５Ｍα−メチル−Ｄ−マン
ノサイド（α−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓ　１ｄ
ｅ）を含む緩衝液２　（ｐＨ７，０）で溶出した。

活性画分を濃縮しＣｏｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分
とした。

Ｃｏｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分を緩衝液１　（ｐ
Ｈ７，０）に透析し、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ　
Ｑ　（ファルマシア社製）に注入し、０からＱ、６Ｍ　
ＮａＣ１の勾配溶出法で溶出した。活性画分を濃縮しＭ
ｏｎｏ　０画分とした。

Ｍｏｎｏ　０画分を緩衝液１　（ｐＨ７，０）で平衡化
した５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２（ファルマシア社製）でゲ
ル濾過し活性画分を得、これを濃縮し５ｕｐｅｒｏｓｅ
　１２画分とした。この精製酵素は、ゲル濾過および５
ＯＳ−ＰＡＧＥでともに均一であった。

精製の要約を第１表に示した。

第１表　スポロボロマイセス・オドラスＩＦＯ１５９７
からの塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの精製 実施例２ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの基質特異性
） 標準反応条件において螢光性基質をかえて活性を測定し
、それぞれの基質に対する活性をＢｏｃ−Ｇｉｎ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対する活性を１００とした相対活
性で表し、第２表に示した。

実施例３ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの至適ｐＨ） 標準反応条件において緩衝液の種類およびｐＨを変化さ
せて活性を測定した。緩衝液としては、５０ＩＩＩＭト
リスー塩酸緩衝液ｐＨ６，０〜９．０．１４．３ｍＭ　
Ｂｒ１ｔｔｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液ｐＨ
４，５〜１０．０を用い、各条件における活性をトリス
−塩酸緩衝液ｐＨ７，０における活性を１００とした相
対活性で表し、第３図に示した。

実施例４ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼのｐＨ安定性
） １１．９　ｍＭ　Ｂｒ１ｔｔｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ緩衝液ｐＨ４〜１１、０．２％ルプロールＰＸ、
　０．５　ｍＭ　ＣａＣ１ｚ中で酵素を３０℃１３０分
間インキエベートした後、当量の１００　ｍＭ　）リス
−塩酸ｐ）ｌ　７．０を添加してｐｉ（を７に戻してか
ら標準反応条件で残存活性を測定した。各処理後の残存
活性を無処理の活性を１００とした相対活性で表し、第
４図に示した。

実施例５ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの至適温度） 標準反応条件において反応温度のみを２５〜６０℃まで
変化させて活性を測定した。各温度における活性を４５
℃における活性を１００とした相対活性で表し、第５図
に示した。

実施例６ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの熱安定性） 酵素を各温度で１０分間インキュベートした後、氷水中
で急冷し、残存活性を標準反応条件で測定した。無処理
の活性を１００とした相対活性で各温度における残存活
性を表し、第６図に示した。

実施例７ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの各種阻害剤
に対する挙動） 基質不在下において各種阻害剤を含む反応条件液中で、
酵素を２５℃１３０分間インキュベートし、その後基質
を添加して反応させた。阻害剤不在下において同様な処
理をしたあとの酵素活性を１００とした相対活性で残存
活性を表し、第３表に示した。

実施例８ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの活性に及ぼ
す界面活性剤の影響） 標準反応液において界面活性剤の種類および濃度を変え
て反応を行い、３％ルプロールＰＸ存在下における活性
を１００とした相対活性で表し、第７図に示した。

実施例９ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの活性に及ぼ
すＣａＣ１ｚの影響） ０．１％ＥＤＴＡ存在下にＣａＣ１ｇ濃度を変化させて
活性を測定した。０．５ｍＭ　ＣａＣ１ｚ存在下におけ
る活性を１００とした相対活性で表し、第８図に示した
。尚、遊離のＣａＣ１ｇ濃度は、ＥＤＴＡのＣａＣ１ｇ
に対する見かけの解離定数に１をｌｏｇ　Ｋ、＝７．３
として計算により求めた。

実施例１０ （ＥＤＴＡ処理後の塩基性アミノ酸残基特異的プロテア
ーゼの活性の回復に及ぼす各種金属イオンの影響） 基質非存在下１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む標準反応液中で
酵素を２５℃９３０分間処理し、各種金属イオンを１．
５　ｍＭになるように添加して３０℃，５分間インキュ
ベートしてから活性を測定した。各条件における活性を
無処理における活性を１００とした相対活性で表し、第
４表に示した。

第４表　ＥＤＴ＾処理塩基性アミノ酸残基特異的プロテ
アーゼの活性回復に及ぼす各種金 属イオンの影響 実施例１１ （塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの分子量及び
等電点） ７．５％ゲルを用いた５Ｏ５−ＰＡＧＥにより見かけの
分子量は約４．７万であった（第９図）。また、ＴＳＫ
　ｇｅｌ　Ｇ３０００５Ｗｘｔを用いたゲル濾過では約
５．６万であった（第１０図）。

ＩＥＦｇｅ１３９を用いた等電点電気泳動により本酵素
のｐｌは４．５であった（第１１図）。

【図面の簡単な説明】

第１図はスポロボロマイセス・オドラスＩＦＯ１５９７
由来塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼの精製時に
おけるＥＤＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍクロマ
トグラムである。 第２図はスポロボロマイセス・オドラスＩＦ０１５９７
由来塩基性アミノ酸残基特異的プロテアーゼのＡｒｇ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラムである。 第３図は本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテアー
ゼの至適ｐｌ＋を表した図である。 第４図は本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテアー
ゼのｐＨ安定性を表した図である。 第５図は本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテアー
ゼの至適温度を表した図である。 第６図は本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテアー
ゼの温度安定性を表した図である。 第７図は本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテアー
ゼの活性に及ぼす界面活性剤の影響を表した図である。 第８図は本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテアー
ゼの活性に及ぼすＣａＣ１ｇの影響を表した図である。 第９図は本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテアー
ゼの７．５％ゲルを用いた電気泳動における分子量測定
の結果を表した図である。 第１０図は本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテア
ーゼのＴＳＫ　ｇｅｔ　Ｇ３０００５Ｗｘｔを用いたゲ
ル濾過による分子量測定の結果を表した図である。 第１１図は本発明の塩基性アミノ酸残基特異的プロテア
ーゼのＩＥＦ　ｇｅｌ　３−９を用いた等電点電気泳動
の結果を表した図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の（１）〜（５）に示す理化学的性質を有するプ
   ロテアーゼ。 （１）作用および基質特異性： ペプチド鎖中に存在する−Ｘ−Ａｒｇ−配列（ＸはＡｒ
   ｇ、ＬｙｓまたはＰｒｏ）のＡｒｇのＣ末端側のペプチ
   ド結合を加水分解する。 （２）至適ｐＨ：トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０付近。 （３）ｐＨ安定性：ｐＨ６．０〜８．０で最も安定。 （４）至適温度：４０〜４７０℃付近（ｐＨ７．０）。 （５）熱安定性：３８℃以下で安定（ｐＨ７．０、１０
   分間）。 ２、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅ
   ｓ）属に属する酵母を培養し、その培養物から得られる
   、下記の（１）に示す性質を有するプロテアーゼ。 （１）作用および基質特異性： ペプチド鎖中に存在する−Ｘ−Ａｒｇ−配列（ＸはＡｒ
   ｇ、ＬｙｓまたはＰｒｏ）のＡｒｇのＣ末端側のペプチ
   ド結合を加水分解する。 ３、スポロボロマイセス属に属する酵母がスポロボロマ
   イセス・オドラス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ・ｏ
   ｄｒｕｓ）ＩＦＯ１５９７である請求項２記載のプロテ
   アーゼ。