JPH0244511B2 - Tainetsuseiarukarikinzokupuroteaazeoyobisonoseizoho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は食菌から得られるアルカリ金属プロテ
アーゼ及びその製造法に関し、更に詳しくは、真
正担子菌の一種で、サルノコシカケ科マイタケ属
に属するマイタケ〔Grifola frondosa（Fr.）S.
F.Gray〕の子実体又はその倍養菌体から抽出し
て得られるアルカリ金属プロテアーゼに関するも
のである。 従来、触媒作用を発現するために亜鉛を必須成
分とする金属プロテアーゼとしては、微生物で
は、枯草菌、バチルス・スブチリス（Bacillus
subtilis）、バチルス・テルモプロテオリチウス
（Bacillus thermoproteolytieus）などの培養液
中の中性金属プロテアーゼ、コウジ菌、アスペル
ギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アス
ペルギルス・ソジヤエ（Aspergillus sojae）な
どの培地から得られる二種の中性金属プロテアー
ゼ、ナラタケ（Arimillaria mellea）子実体に
存在する低分子の中性金属プロテアーゼがあり、
また動物では、ハブ、マムシ、ガラガラヘビの蛇
毒成分であるアルカリ金属プロテアーゼとウサギ
の腎臓やウシの下垂体から得られる中性金属プロ
テアーゼが知られている。これら金属プロテアー
ゼには分子量14000〜90000の範囲で多種類のもの
があり、亜鉛原子以外にカルシウム原子を含むも
のもある。多くの中性金属プロテアーゼは至適PH
が６〜７の範囲にあるが、蛇毒のアルカリ金属プ
ロテアーゼにあつては、その至適PHが８〜９の弱
アルカリ側にある。また、これらの中性及びアル
カリ金属プロテアーゼは、ナラタケ子実体の中性
金属プロテアーゼがＮ末端側にリジン残基を有す
るペプチド結合、−Ｘ−CO−NH−Lys−を優先
的に分解する特異性を示す以外に、Ｎ末端側のア
ミノ酸がロイシン、フエニルアラニンあるいはバ
リンであるペプチド結合、−Ｎ−CO−NH−Leu
−、−Ｘ−CO−NH−Phe−、−Ｘ−CO−NH−
Val−を主に分解する特異性もあることが知られ
ている（Ｘはアミノ酸残基を表わす）。 本発明の目的は、従来の研究によつて明らかに
された細菌、糸状菌、蛇毒又は哺乳動物の臓器由
来の中性又はアルカリ金属プロテアーゼと比べ
て、その性質及び特異性を異にする新規な耐熱性
アルカリ金属プロテアーゼを提供することであ
る。 本発明者らは、マイタケ子実体の抽出液に含ま
れるタンパク分解酵素を総合的に研究した結果、
分子量が22000で、タンパク１分子当たりに１原
子の亜鉛を含有し、カゼイン又はアゾコールの分
解に対する至適PHが９〜10にあり、ロイシン、フ
エニルアラニン、バリン又はリジン残基のＮ末端
側のペプチド結合を特異的に加水分解するエンド
ペプチターゼ活性を示すアルカリ金属プロテアー
ゼを見出し、本発明を完成するに至つた。 即ち、本発明の耐熱性金属プロテアーゼは、次
の酵素化学的性質をするものである。 分子量：約22000（ゲルろ過法、SDSゲル電気泳動
法） 約21300（アミノ酸分析） 安定なPHの範囲：３〜10（４℃に24時間保つたと
きの活性残存率100％のPH範囲） 温度安定性：60℃（PH7.0で60分間熱処理した際
の活性残存率100％の温度）70℃（PH7.0で60分
間熱処理した際の活性残存率70％の温度） 作用至適PH：９〜10（基質：カゼイン、アゾコー
ル、アルブミン） 作用至適温度：70℃（アゾカゼインを基質として
用い、PH９で10分間反応したときの温度） 等電点：7.5 含有金属：タンパク１分子当り亜鉛１原子 賦活剤：特に必要としない。 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
（EDTA）、１，10−フエナントロリン、α，
α′−ジピリジル、ジチオスレイトール、β−メ
ルカプトエタノール、グルタチオン（還元型）。 EDTAによる阻害は、Zn²⁺、Mn²⁺又はCo²⁺
を添加すると活性が回復する。 基質特異性：カゼイン、アゾカゼイン、アゾコー
ル、コンゴーレツドエラスチン、アルブミン、
インシユリン、ポリリジンなどのタンパク質又
はペプチドにおけるロイシン、フエニルアラニ
ン、バリン及びリジン残基のＮ末端側ペプチド
結合を特異的に加水分解する。 また、その製造法は、マイタケ子実体又はその
菌体からPH３〜10の塩溶液を用いて抽出を行な
い、得られた抽出液を精製することを特徴とす
る。 本発明において用いるマイタケは自家で、酵母
エキス、麦芽エキス、ブドウ糖を含む通常の培地
（PH５〜６）を用いて20〜25℃で培養したマイタ
ケの菌体を用いてもよいが、市販されている子実
体を用いてもよい。 以下、詳細に本発明プロテアーゼの製造法につ
いて述べる。まず、マイタケ実子体を細断したも
の、または培養して得た菌体から中性塩溶液とと
もに、ブレンダーで処理した後、直ちに遠心分離
して抽出液を得る。抽出に用いる溶液のPH範囲は
３〜10でよく、また塩濃度は0.05Mから0.5Mの
範囲である。これらの処理及び以後の処理は、４
℃以下の低温で実施することが望ましい。 このようにして得られた抽出液に硫酸アンモニ
ウムを加え、30％飽和で生じた沈殿を除去し、更
の硫酸アンモニウムを加えて、80％飽和で生じた
沈殿を分取する。 次に、得られた沈殿を溶解し、透析あるいはセ
フアデツクスＧ−25（商品名）等のゲルろ過剤の
カラムを用いて、硫酸アンモニウムを除去すると
ともに、PHを５に調整した後、陽イオン交換体、
例えばカルボキシメチルセルロースのカラムに負
荷し、カラムの緩衝化に用いたPH５の溶離液（緩
衝液）中の中性塩の濃度を直線的に高めながら溶
出を行なつて、溶出液中にアルカリ金属プロテア
ーゼ画分を得る。この場合、中性塩の濃度を段階
的に高めて、特性の中性塩濃度で酵素を集中的に
溶出する方法も有効である。この画分の中性塩を
除いた後、再度、同様にしてSP−セフアデツク
ス（商品名）を用いて処理する。溶離液（緩衝
液）のPHは弱酸性であればよいが、その濃度は50
ｍＭ以下であることが望ましい。添加して酵素の
溶出に用する中性塩は特に制約されるものではな
いが、塩化ナトリウム又は塩化カリウムが適当で
ある。溶出に際して、中性塩の濃度は０から
1.0Mまで直線的に高められるか、又は0.3M、
0.5M更に0.7Mと段階的に高められる。 次いで、イオン交換クロマトグラフイーで得ら
れた画分についてゲルろ過を行ない、更に精製を
進める。この精製段階に用いるゲルろ過剤として
は、セフアデツクスＧ−100（商品名）あるいはセ
ルロフアインGC−200−ｍ（商品名）が適当であ
る。ゲルろ過は50ｍＭ以下の濃度で中性の溶離液
を用いるが、0.5M以下の中性塩が存在している
ことが望ましい。 ゲルろ過後、溶出したアルカリ金属プロテアー
ゼの画分を集め、脱塩濃縮して精製標品を得る。
上記の精製過程で、マイタケのアルカリ金属プロ
テアーゼは60％の高収量で230倍に精製すること
ができる。 以上のように、本発名のアルカリ金属プロテア
ーゼは、マイタケ子実体は菌糸に大量に存在し、
容易に抽出することが可能であり、硫酸アンモニ
ウムによる分別、カルボキシメチルセルロースや
SP−セフアデツクスなどの陽イオン交換体によ
るカラムクロマトグラフイー及びセフアデツクス
Ｇ−100などのゲルろ過剤によるゲルろ過により
高い収量で純粋な酵素タンパク質にまで精製する
ことが可能である。 マイタケのアルカリ金属プロテアーゼの特徴及
び従来報告されている亜鉛含有金属プロテアーゼ
との間の性質及び特異性等における相違は、次の
通りである。 １ マイタケのアルカリ金属プロテアーゼの分子
量は約22000で、枯草菌の中性金属プロテアー
ゼ（分子量：40000）、コウジキンの二種の細胞
外中性金属プロテアーゼ（分子量：17000及び
42000）、ナラタケ子実体中性金属プロテアーゼ
（分子量：13500）及び哺乳動物臓器由来の中性
金属プロテアーゼ（分子量：90000）とは明ら
かに異なつている。 ２ マイタケのアルカリ金属プロテアーゼは、作
用至適PHが９〜10で、分子量が23000〜24000、
作用至適PHが8.5〜9.5である蛇毒起原の金属プ
ロテアーゼと分子量、作用至適PH及び基質特異
性において類似しているが、PH安定性（蛇毒の
酵素：PH５〜10）及び熱安定性（PH8.5、60℃、
５分間熱処理で完全に失活）で比べると、明ら
かに異なつている。 ３ マイタケのアルカリ金属プロテアーゼが示す
極めて高い熱安定性は枯草菌、特にBacillus
thermoproteolytieusの中性金属プロテアーゼ、
Thermolysinに匹敵するものであり、本酵素の
顕著な性質となつている。 マイタケの細胞内アルカリ金属プロテアーゼ
は、安定な性質及び限定された特異性を利用し
て、70℃までの種々の温度及びPH５〜10までの広
い範囲のPHでタンパク質やペプチドに作用させ、
その構造の解析や修飾に有用であるばかりでな
く、生理活性を有するタンパク質又はペプチドな
どの修飾や加工あるいは食品の処理や安定性の増
加に利用することが可能である。また、その安定
性を利用して不溶化した酵素を用いれば、種々の
温度及びPHでタンパク質を分解処理することも可
能である。この際、反応はEDTAを加えて停止
したり、また適量のZn²⁺やMn²⁺を添加すること
により再び開始できる利点がある。 次に、実施例によつて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はその要旨を越えない限り、これ
らによつて限定されるものではない。 実施例 水洗した新鮮な市販のマイタケ子実体（生産
量、1500ｇ）を３倍重量の20ｍＭトリス塩酸緩衝
液（PH7.2）とともに、ブレンダーで破砕し、菌
体からアルカリ金属プロテアーゼを抽出した。細
胞等の不溶の残基は13000×ｇ、30分間、遠心分
離して除き上清を集めた。上集（約６）に固形
硫酸アンモニウムの粉末をよく撹拌しながら徐徐
に加え、30％飽和にした。４℃で３時間放置した
後、生じた沈殿を13000×ｇ、30分間、遠心分離
して除いた。次いで、上清に固形の硫酸アンモニ
ウムを添加し、80％飽和にした後、４℃で20時間
放置した。沈殿は13000×ｇ、30分間、遠心分離
して集め、少量の20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.0）に
溶解してから、セフアデツクスＧ−25のカラム
（５×38cm）に通過させて硫酸アンモニウムを除
去した。プロテアーゼ活性を有する画分を集め、
予め20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.0）で平衡化したカ
ルボキシメチルセルロース（ワツトマン社、CM
−32）のカラム（3.5×25cm）に吸着させた。プ
ロテアーゼの溶離は全量３の20ｍＭ酢酸緩衝液
（PH5.0）中に溶解した塩化カリウムの濃度を０か
ら1.0Mまで直線的に増加させる濃度勾配により
行つた。プロテアーゼ活性画分は0.7M〜0.8Mの
塩化カリウムで溶出された。プロテアーゼ活性画
分を集め、これを20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.0）で
平衡化させたセフアデツクスＧ−25のカラムを通
過させて脱塩した。 なお、この段階で、カルボキシメチルセルロー
スのカラムにアルカリ金属プロテアーゼを吸着さ
せ、まず、500mlの0.3M塩化カリウムを含む20ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（PH5.0）でカラムを洗いタンパク
質を溶出させた後、0.3Mから1.0までの塩化カリ
ウムの直線濃度勾配を用いてプロテアーゼを溶出
する方法、又は、20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.0）中
の塩化カリウムの濃度を0.3M、0.6M、0.8Mと段
階的に増加させ酵素を溶出させる方法がマイタケ
アルカリ金属プロテアーゼ分離精製に有効であ
る。 次に、脱塩したプロテアーゼ画分は、20ｍＭ酢
酸緩衝液（PH5.0）で緩衝化したSP−セフアデツ
クスのカラム（2.0×13cm）に吸着させ、全容量
500mlの20ｍＭ酢酸緩衝液（PH5.0）中の塩化カリ
ウムの濃度を０から0.8Mまで直線的に増加させ
る濃度勾配溶出によつて溶離した。プロテアーゼ
活性は、0.4〜0.5Mの酸化カリウムで溶出したプ
ロテアーゼ活性画分を集、Diaflowメンブレン
DM−10を用いて限外濃縮した後、20ｍＭトリス
塩酸緩衝液（PH7.2）で平衝化したセフアデツク
スＧ−100のカラム（2.4×100cm）を用いてゲル
ろ過した。このゲルろ過により、アゾカゼインに
対する活性溶出曲線とタンパク質の溶出曲線が完
全に一致したアルカリ金属プロテアーゼの溶出パ
ターンが得られた。活性画分を集め、Diaflowメ
ンブレンDM−10で最外濃縮後、凍結乾操し、−
80℃で凍結保存した。なお、集めた活性画分を10
ｍＭ炭酸水素アンモニウムで平衡化したセフアデ
ツクスＧ−25カラムを用いて脱塩した後、凍結乾
燥してもよい。 上記の精製方法により、マイタケ子実体のアル
カリ金属プロテアーゼは粗抽出液から230倍に精
製され、その収率は60％であつた。 精製した酵素の純度は、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（10％ゲル、PH4.3）及びSDSポリア
クリルアミドスラブ電気泳動（Gradient Gel8〜
15％、又は12.5％ゲル）で精製したアルカリ金属
プロテアーゼを検出した結果、Coomassie
Brilliant Blue染色でいずれの場合も単一のタン
パク染色バンドが検出できた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の酵素化学的性質を有する耐熱性アルカリ
   金属プロテアーゼ。 分子量：約22000（ゲルろ過法、SDSゲル電気泳動
   法） 約21300（アルノ酸分析） 安定なPHの範囲：３〜10（４℃に24時間保つたと
   きの活性残存率100％のPH範囲） 温度安定性：60℃（PH7.0で60分間熱処理した際
   の活性残存率100％の温度）70℃（PH7.0で60分
   間熱処理した際の活性残存率70％の温度） 作用至適PH：９〜10（基質：カゼイン、アゾコー
   ル、アルブミン） 作用至適温度：70℃（アゾカゼインを基質として
   用い、PH９で10分間反応したときの温度） 等電点：7.5 含有金属：タンパク１分子当り亜鉛１原子 賦活剤：特に必要としない。 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
   （EDTA）、１，10−フエナントロリン、α，
   α′−ジピリジル、ジチオスレイトール、β−メ
   ルカプトエタノール、グルタチオン（還元型）。 EDTAによる阻害は、Zn²⁺、Mn²⁺又はCo²⁺
   を添加すると活性が回復する。 基質特異性：カゼイン、アゾカゼイン、アゾコー
   ル、コンゴーレツドエラスチン、アルブミン、
   インシユリン、ホリリジンなどのタンパク質又
   はペプチドにおけるロイシン、フエニルアラニ
   ン、バリン及びリジン残基のＮ末端側ペプチド
   結合を特異的に加水分解する。 ２ マイタケ子実体又はその菌体から、PH３〜10
   の塩溶液を用いて抽出を行ない、得られた抽出液
   を精製することを特徴とし、次の酵素化学的性質
   を有する耐熱性アルカリ金属プロテアーゼの製造
   法。 分子量：約22000（ゲルろ過法、SDSゲル電気泳動
   法） 約21300（アルノ酸分析） 安定なPHの範囲：３〜10（４℃に24時間保つたと
   きの活性残存率100％のPH範囲） 温度安定性：60℃（PH7.0で60分間熱処理した際
   の活性残存率100％の温度）70℃（PH7.0で60分
   間熱処理した際の活性残存率70％の温度） 作用至適PH：９〜10（基質：カゼイン、アゾコー
   ル、アルブミン） 作用至適温度：70℃（アゾカゼインを基質として
   用い、PH９で10分間反応したときの温度） 等電点：7.5 含有金属：タンパク１分子当り亜鉛１原子 賦活剤：特に必要としない。 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
   （EDTA）、１，10−フエナントロリン、α，
   α′−ジピリジル、ジチオスレイトール、β−メ
   ルカプトエタノール、グルタチオン（還元型）。 EDTAによる阻害は、Zn²⁺、Mn²⁺又はCo²⁺
   を添加すると活性が回復する。 基質特異性：カゼイン、アゾカゼイン、アゾコー
   ル、コンゴーレツドエラスチン、アルブミン、
   インシユリン、ホリリジンなどのタンパク質又
   はペプチドにおけるロイシン、フエニルアラニ
   ン、バリン及びリジン残基のＮ末端側ペプチド
   結合を特異的に加水分解する。