JPH011949A - 電気泳動ゲルの再生法 - Google Patents
電気泳動ゲルの再生法Info
- Publication number
- JPH011949A JPH011949A JP62-155447A JP15544787A JPH011949A JP H011949 A JPH011949 A JP H011949A JP 15544787 A JP15544787 A JP 15544787A JP H011949 A JPH011949 A JP H011949A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gel
- electrophoresis
- fluorescent
- dna
- section
- Prior art date
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- Pending
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は蛍光標識を用いるＤＮＡ、ＲＮＡあるいは蛋白
質などの分離検出用電気泳動ゲルの再生法に関するもの
である。
質などの分離検出用電気泳動ゲルの再生法に関するもの
である。
［従来の技術］
従来、ＤＮＡなどの分離にはゲル電気泳動が用いられて
いる。検出はＤＮＡなどを放射性標識したり、蛍光標識
して検出している。この場合、−度分離測定を行なうと
標識された試料がゲル内に残留するため分離用ゲルはく
り返して使用はできない。このためゲルは測定の度に作
成している。
いる。検出はＤＮＡなどを放射性標識したり、蛍光標識
して検出している。この場合、−度分離測定を行なうと
標識された試料がゲル内に残留するため分離用ゲルはく
り返して使用はできない。このためゲルは測定の度に作
成している。
最近、放射性標識試料の場合を対象としてゲルをファル
ムで保持した使い捨てゲルが市販され出しており、ゲル
作成の手間を省く事ができるようになった。しかし、こ
のゲルを光検出に用いる事はできない、蛍光をＩＩＩＭ
Ｌようとゲルに光を照射するとフィルム部から強い蛍光
が出て蛍光標ｒａＤＮＡからの蛍光を観測しに＜＜シて
しまうからである。
ムで保持した使い捨てゲルが市販され出しており、ゲル
作成の手間を省く事ができるようになった。しかし、こ
のゲルを光検出に用いる事はできない、蛍光をＩＩＩＭ
Ｌようとゲルに光を照射するとフィルム部から強い蛍光
が出て蛍光標ｒａＤＮＡからの蛍光を観測しに＜＜シて
しまうからである。
［発明が解決しようとする問題点］
ＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列決定法や蛋白の検出法は従来
の放射性標識を用いる方法から蛍光標識を用いる方法へ
移行してゆくと考えられる。しかし、これまでのところ
、蛍光法に適した使い捨てゲルの開発も、ゲルを再生利
用する方法も提案されておらず、ゲルは測定の度毎に作
成する必要があり、手間がかかる難点があった。
の放射性標識を用いる方法から蛍光標識を用いる方法へ
移行してゆくと考えられる。しかし、これまでのところ
、蛍光法に適した使い捨てゲルの開発も、ゲルを再生利
用する方法も提案されておらず、ゲルは測定の度毎に作
成する必要があり、手間がかかる難点があった。
本発明の目的は、蛍光標識を用いた場合に、ゲルを測定
の度毎に作成する手間を省き、−度作成したゲルをくり
返し活用することが可能な電気泳動ゲル再生法を提供す
る事にある。
の度毎に作成する手間を省き、−度作成したゲルをくり
返し活用することが可能な電気泳動ゲル再生法を提供す
る事にある。
［問題点を解決するための手段］
上記目的は蛍光標識体として光分解しやすい物質を用い
、測定終了後ゲル中に残存する蛍光標識ＤＮＡなどに光
照射し、蛍光体を変質させて蛍光を発したい物質にする
ことにより達成される。
、測定終了後ゲル中に残存する蛍光標識ＤＮＡなどに光
照射し、蛍光体を変質させて蛍光を発したい物質にする
ことにより達成される。
［作用］
一般に蛍光体は光照射されると励起されて蛍光を発する
が、同時に分解反応が進行する。分解され易さは蛍光体
により異なるが、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｅ
１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ；励起波長４９４ｎ
ｍ、発光波長５１１ｎｍ）のように非常に分解しやすい
ものである。これら蛍光体でＤＮＡなどを標識し、計測
後ゲル中に残存している蛍光標識物に強い光を当てると
分解を起こし蛍光を出さなくなる。もちろんＤＮＡなど
はそのまま存在するが、光計側では検出されなくなるの
で再び分離検出用ゲルとして利用できる。
が、同時に分解反応が進行する。分解され易さは蛍光体
により異なるが、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｅ
１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ；励起波長４９４ｎ
ｍ、発光波長５１１ｎｍ）のように非常に分解しやすい
ものである。これら蛍光体でＤＮＡなどを標識し、計測
後ゲル中に残存している蛍光標識物に強い光を当てると
分解を起こし蛍光を出さなくなる。もちろんＤＮＡなど
はそのまま存在するが、光計側では検出されなくなるの
で再び分離検出用ゲルとして利用できる。
［実施例］
以下、本発明の一実施例を第１図および第２図を用いて
説明する。第１図は塩基配列決定の原理説明図で第２図
は本発明の一実施例である。この実施例では蛍光標識を
用いたＤＮＡの塩基配列決定を行なう。
説明する。第１図は塩基配列決定の原理説明図で第２図
は本発明の一実施例である。この実施例では蛍光標識を
用いたＤＮＡの塩基配列決定を行なう。
ＦＩＴＣで片方の末端を標識され、もう一方がアデニン
（Ａ）、チタン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）。
（Ａ）、チタン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）。
あるいはグアニン（Ｇ）で終わる４種の断片群（Ａ）、
（Ｔ） 、（Ｃ）、および（ａ）を蛍光泳動ゲル板１０
の別々の泳動路上に泳動させる。電気泳動ゲル板１０は
ゲル保持用ガラス板によって挟持され、両側端部にはス
ペーサ１２が設けられている。加入泳動始点から一定の
所を蛍光物質検出用レーザ発生器３で発生したレーザ光
９で照射してここを通過する蛍光標識ＤＮＡ７から出る
蛍光をフィルター１３．集光レンズ１４．イメージ増巾
器１５を介してダイオードアレー１６で受光する。ＤＮ
Ａの長さが短いほど早く泳動するので発光時間から塩基
長がわかり、泳動路の種類から塩基種を判別して塩基配
列を決定する。配列決定用の励起光源３として１０ｍＷ
のアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を使用している。通
常５〜６時間の泳動を行ない、３００塩基程度までの配
列を決定している。終了後には泳動光点と光照射検出部
までの間に長い蛍光標識ＤＮＡが残存しており。
（Ｔ） 、（Ｃ）、および（ａ）を蛍光泳動ゲル板１０
の別々の泳動路上に泳動させる。電気泳動ゲル板１０は
ゲル保持用ガラス板によって挟持され、両側端部にはス
ペーサ１２が設けられている。加入泳動始点から一定の
所を蛍光物質検出用レーザ発生器３で発生したレーザ光
９で照射してここを通過する蛍光標識ＤＮＡ７から出る
蛍光をフィルター１３．集光レンズ１４．イメージ増巾
器１５を介してダイオードアレー１６で受光する。ＤＮ
Ａの長さが短いほど早く泳動するので発光時間から塩基
長がわかり、泳動路の種類から塩基種を判別して塩基配
列を決定する。配列決定用の励起光源３として１０ｍＷ
のアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を使用している。通
常５〜６時間の泳動を行ない、３００塩基程度までの配
列を決定している。終了後には泳動光点と光照射検出部
までの間に長い蛍光標識ＤＮＡが残存しており。
このまま次の試料を測定しようとする前の試料に起因す
る信号が重複してくるので支障が生じる。
る信号が重複してくるので支障が生じる。
そこで蛍光物質消去用レーザー源４から約ＩＷのアルゴ
ンレーザー（４８８ｎｍ）を径１ｍｍφ程度に絞り反射
ミラー５．稼動ミラー６を介して側面方向からゲル１０
中にレーザ光８を入射し、稼動ミラー６を動かしてスキ
ャンさせてゲル１０月平面を照射してＦＩＴＣを分解し
た。このように処理した泳動板１０は再利用可能であっ
た。しかし、これを適用するには標識物の分解断面積や
レーザー強度に制限があった６以下にこの点について考
察を加える。ＦＩＴＣの分解断面積を実ａｌ！Ｉすると
０．５Ｘ１０””’ｃｍ２程度であった。ＩＷのアルゴ
ンレーザーを１ ｍ ｍ ２の面積に絞ると光子密度は
約２．５ Ｘ １０１ｇ個／ ｍ ｍ ”・秒となる。
ンレーザー（４８８ｎｍ）を径１ｍｍφ程度に絞り反射
ミラー５．稼動ミラー６を介して側面方向からゲル１０
中にレーザ光８を入射し、稼動ミラー６を動かしてスキ
ャンさせてゲル１０月平面を照射してＦＩＴＣを分解し
た。このように処理した泳動板１０は再利用可能であっ
た。しかし、これを適用するには標識物の分解断面積や
レーザー強度に制限があった６以下にこの点について考
察を加える。ＦＩＴＣの分解断面積を実ａｌ！Ｉすると
０．５Ｘ１０””’ｃｍ２程度であった。ＩＷのアルゴ
ンレーザーを１ ｍ ｍ ２の面積に絞ると光子密度は
約２．５ Ｘ １０１ｇ個／ ｍ ｍ ”・秒となる。
分解断面積と光子密度からＦＩＴＣはこの光路中で０．
１秒程度で分解する。完全に分解させるためには１ｍｍ
の長さあたり０．５秒位照射する必要がある。残留ＦＩ
ＴＣ標識体を光分解したい領域の長さは２００ｍｍであ
り、レーザー光８を２ｍｍ／秒の割合ですると全領域照
射に要する時間は１００秒となる。レーザー源としてよ
り安価な１００ｍＷ級のものを用いると１０００秒で約
２０分間を要する事になる。消去に要する時間は長くて
も１時間以内の必要がある。これ以上長時間を要する場
合にはゲル板を新らしく作成した方が早い事になるから
である。分解の断面積が小さいと消去に要する時間もか
かるため都合が悪くＩＱ−”２ｃｍ２程度が限界である
。この場合ＩＷのレーザーを用いても先程と同様の消去
を行なうには１ｍｍ当り２０秒が必要で全体消去には１
時間余を必要とする６一方、分解断面程は大き過ぎても
都合が悪い。通常、蛍光を発する断面積は１０−１ｇ０
ｍ２程度であり１分解断面積が１０１０−２Ｏ０の物質
は分解するまでに平均１０’個の蛍光を発することにな
る。分解断面積が大きいと分解までに発する蛍光量が少
なく高感度が得られない。
１秒程度で分解する。完全に分解させるためには１ｍｍ
の長さあたり０．５秒位照射する必要がある。残留ＦＩ
ＴＣ標識体を光分解したい領域の長さは２００ｍｍであ
り、レーザー光８を２ｍｍ／秒の割合ですると全領域照
射に要する時間は１００秒となる。レーザー源としてよ
り安価な１００ｍＷ級のものを用いると１０００秒で約
２０分間を要する事になる。消去に要する時間は長くて
も１時間以内の必要がある。これ以上長時間を要する場
合にはゲル板を新らしく作成した方が早い事になるから
である。分解の断面積が小さいと消去に要する時間もか
かるため都合が悪くＩＱ−”２ｃｍ２程度が限界である
。この場合ＩＷのレーザーを用いても先程と同様の消去
を行なうには１ｍｍ当り２０秒が必要で全体消去には１
時間余を必要とする６一方、分解断面程は大き過ぎても
都合が悪い。通常、蛍光を発する断面積は１０−１ｇ０
ｍ２程度であり１分解断面積が１０１０−２Ｏ０の物質
は分解するまでに平均１０’個の蛍光を発することにな
る。分解断面積が大きいと分解までに発する蛍光量が少
なく高感度が得られない。
通常のＤ Ｎ Ａ分離検出の条件下ではＤＮＡバンドが
０．５ｍｍ幅の照射検出領域を通過するのに要する時間
は２０〜３０秒である。この時間内に分解する量が高々
５０％であるようにすれば検出上は支障ない。検出には
５〜１０ｍＷのアルゴンレーザを０ 、５ ｍ ｍ ”
程度の断面積に絞って用いているので光子密度は約２〜
５Ｘ１０”個／ ｍ ｍ ２・秒となる。光子密度をｌ
Ｘｌ０”個／ ｍ ｍ ２・秒とした場合１分解断面積
が１０−１９ｃｍ”の物質は約１秒で分解することにな
りこれ以上分解断面積が大きい事は好ましくない。
０．５ｍｍ幅の照射検出領域を通過するのに要する時間
は２０〜３０秒である。この時間内に分解する量が高々
５０％であるようにすれば検出上は支障ない。検出には
５〜１０ｍＷのアルゴンレーザを０ 、５ ｍ ｍ ”
程度の断面積に絞って用いているので光子密度は約２〜
５Ｘ１０”個／ ｍ ｍ ２・秒となる。光子密度をｌ
Ｘｌ０”個／ ｍ ｍ ２・秒とした場合１分解断面積
が１０−１９ｃｍ”の物質は約１秒で分解することにな
りこれ以上分解断面積が大きい事は好ましくない。
しかし、分解断面積が１０−１９〜１０−２２の範囲に
ある蛍光標識化合物を用いる場合には高感度は蛍光検出
と光分解によるゲル再利用を行なうことができる。
ある蛍光標識化合物を用いる場合には高感度は蛍光検出
と光分解によるゲル再利用を行なうことができる。
光照射の方法はライン状に照射して、スィーブする方法
の他にランプを用いて全面を照射するなど種々の方法が
ある。
の他にランプを用いて全面を照射するなど種々の方法が
ある。
［発明の効果］
以上述べたように本発明によれば、蛍光標識化合物を用
いて泳動分離の様子を蛍光検出した後に泳動板中に残存
している蛍光標識物を光分解してゲル板の再利用を可能
とする。
いて泳動分離の様子を蛍光検出した後に泳動板中に残存
している蛍光標識物を光分解してゲル板の再利用を可能
とする。
第１図は本発明の実施例の概念図、第２図は本発明の実
施例の斜視図である。 ３・・・蛍光物質検出用レーザー、４・・・蛍光物質消
去用レーザー、５・・・反射ミラー、６・・・稼動ミラ
ー。 ７・・・ＤＮＡ、８・・・消去用レーザー光線、９・・
・検出用レーザー光線、１０・・・分離用ゲル板、１１
・・・ゲル保持用ガラス板、１２・・・透明スペーサー
、１３・・・フィルター、１４・・・集光レンズ、１５
・・・イメージ増幅器、１６・・・ダイオードアレー。 １θ 第７圓
施例の斜視図である。 ３・・・蛍光物質検出用レーザー、４・・・蛍光物質消
去用レーザー、５・・・反射ミラー、６・・・稼動ミラ
ー。 ７・・・ＤＮＡ、８・・・消去用レーザー光線、９・・
・検出用レーザー光線、１０・・・分離用ゲル板、１１
・・・ゲル保持用ガラス板、１２・・・透明スペーサー
、１３・・・フィルター、１４・・・集光レンズ、１５
・・・イメージ増幅器、１６・・・ダイオードアレー。 １θ 第７圓
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、蛍光標識されたＤＮＡ、ＲＮＡあるいは蛋白質など
を電気泳動分離し光学的に検出するゲル分離部を光照射
して電気泳動ゲル中に残留する蛍光物質を破壊して電気
泳動ゲルの再利用を可能とする電気泳動ゲルの再生法。 ２、特許請求の範囲第１項記載の方法において、蛍光標
識物として分解断面積が１０＾−＾２＾１ｃｍ＾２以上
である物質を用いることを特徴とする電気泳動ゲルの再
生法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62155447A JPS641949A (en) | 1987-06-24 | 1987-06-24 | Regeneration of electrophoretic gel |
| US07/211,284 US4879012A (en) | 1987-06-24 | 1988-06-24 | Method for reutilization of electrophoresis gel |
| DE3821454A DE3821454A1 (de) | 1987-06-24 | 1988-06-24 | Verfahren zur aufbereitung gebrauchter elektrophorese-gele fuer die wiederverwendung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62155447A JPS641949A (en) | 1987-06-24 | 1987-06-24 | Regeneration of electrophoretic gel |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH011949A true JPH011949A (ja) | 1989-01-06 |
| JPS641949A JPS641949A (en) | 1989-01-06 |
Family
ID=15606239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62155447A Pending JPS641949A (en) | 1987-06-24 | 1987-06-24 | Regeneration of electrophoretic gel |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4879012A (ja) |
| JP (1) | JPS641949A (ja) |
| DE (1) | DE3821454A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005026241A1 (ja) * | 2003-09-11 | 2005-03-24 | Teijin Dupont Films Japan Limited | ポリエステルフィルム |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5162654A (en) * | 1991-02-01 | 1992-11-10 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Detection apparatus for electrophoretic gels |
| US5439578A (en) * | 1993-06-03 | 1995-08-08 | The Governors Of The University Of Alberta | Multiple capillary biochemical analyzer |
| US5986076A (en) * | 1994-05-11 | 1999-11-16 | Trustees Of Boston University | Photocleavable agents and conjugates for the detection and isolation of biomolecules |
| US5643722A (en) | 1994-05-11 | 1997-07-01 | Trustees Of Boston University | Methods for the detection and isolation of proteins |
| US5483075A (en) * | 1994-11-01 | 1996-01-09 | Perkin-Elmer Corporation | Rotary scanning apparatus |
| US5748491A (en) * | 1995-12-20 | 1998-05-05 | The Perkin-Elmer Corporation | Deconvolution method for the analysis of data resulting from analytical separation processes |
| US6008379A (en) | 1997-10-01 | 1999-12-28 | The Perkin-Elmer Corporation | Aromatic-substituted xanthene dyes |
| US6583168B1 (en) | 1997-11-25 | 2003-06-24 | Applera Corporation | Sulfonated diarylrhodamine dyes |
| US5936087A (en) | 1997-11-25 | 1999-08-10 | The Perkin-Elmer Corporation | Dibenzorhodamine dyes |
| US6103083A (en) * | 1998-02-20 | 2000-08-15 | Tetragen | Capillary electrophoresis apparatus and method |
| US6475361B1 (en) | 1998-02-20 | 2002-11-05 | Tetragen Sa | Capillary electrophoresis apparatus having filling/refilling system and methods for use thereof |
| US6096875A (en) | 1998-05-29 | 2000-08-01 | The Perlein-Elmer Corporation | Nucleotide compounds including a rigid linker |
| EP1317464B1 (en) * | 2000-10-11 | 2009-05-13 | Applera Corporation | Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers |
| CA2445053A1 (en) | 2001-05-21 | 2002-11-28 | Aclara Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analyzing proteins |
| US7402398B2 (en) | 2003-07-17 | 2008-07-22 | Monogram Biosciences, Inc. | Measuring receptor homodimerization |
| EP1673399B1 (en) * | 2003-08-11 | 2017-04-05 | Monogram BioSciences, Inc. | Detecting and profiling molecular complexes |
| JP2008535518A (ja) | 2005-04-14 | 2008-09-04 | アプレラ コーポレイション | プソイドイソシトシン核酸塩基誘導体を含む３’改変オリゴヌクレオチド、およびプライマーまたはプローブとしてのその適用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4729947A (en) * | 1984-03-29 | 1988-03-08 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | DNA sequencing |
| US4675300A (en) * | 1985-09-18 | 1987-06-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Laser-excitation fluorescence detection electrokinetic separation |
| JPH06162843A (ja) * | 1992-09-22 | 1994-06-10 | Chodendo Hatsuden Kanren Kiki Zairyo Gijutsu Kenkyu Kumiai | Ｂｉ系酸化物超電導導体の製造方法 |
-
1987
- 1987-06-24 JP JP62155447A patent/JPS641949A/ja active Pending
-
1988
- 1988-06-24 DE DE3821454A patent/DE3821454A1/de active Granted
- 1988-06-24 US US07/211,284 patent/US4879012A/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005026241A1 (ja) * | 2003-09-11 | 2005-03-24 | Teijin Dupont Films Japan Limited | ポリエステルフィルム |
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