JPH0658341B2 - Ｄｎａ塩基配列決定装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子上の塩基配列決定装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、遺伝子上の塩基配列決定はＤＮＡを放射性元素で
標識し、電気泳動により塩基長に応じて分離したパター
ンをオートラジオグラフィーにより読み取る事により行
なっていた。しかし、放射性元素を用いる煩雑さに加え
て手間のかかる難点があり、特公昭６０−２２０８６０
号公報に示すように蛍光標識を用いる手法が提案されて
いる。蛍光標識を用いる方法では、光照射により蛍光の
発しない無蛍光ガラスや石英のパイプ中あるいは板の間
にゲルを保持し、特定箇所に光を照射してそこを通過す
る蛍光標識ＤＮＡから発せられる蛍光を検出する。ゲル
保持剤に通常のガラスや高分子フィルムをゲル保持材に
用いるとこれらから蛍光が出るため背景光が強くなり検
出感度が低下する難点がある。塩基配列決定用のゲルの
作製はかなりの手間のかかる事であり、フィルム状の使
い捨てゲルが開発され使用され始めている。しかし、こ
のゲルは高分子フィルムでサンドイッチされ保持されて
おり、光検出用には使用できなかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

光検出方式での分離ゲルは石英保持板を用いて測定のつ
ど作製する必要があり問題であった。

本発明の目的は、このような問題を解決するためになさ
れたもので、光検出型ＤＮＡ検出装置でも手軽な使い捨
てゲルが使用できるようにする事にある。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、泳動分離部と検出部を分離可能な構成にす
る事により達成される。すなわち、泳動分離部を使い捨
てゲル板で構成し、検出部を石英ガラスなどで保持され
たゲルで構成する事により達成される。

〔作用〕

電気泳動ゲルを測定のたびに作り直す手間はゲルを再利
用できれば解決する。ゲルを再利用する上で障害となる
のはゲル中に広く分布して保持された蛍光標識ＤＮＡフ
ラグメントである。そこで分離用ゲルと検出用ゲルを分
離可能とし、大部分の蛍光標識ＤＮＡフラグメントを保
持している分離用ゲルとして使い捨てゲルを用いればゲ
ル作製の手間が省ける。検出部ゲルの光照射位置を分離
ゲルとの界面から１cm程度の所に取れば界面から検出部
の間に保持された残留蛍光標識ＤＮＡは、試料泳動に先
立って行なうプレラン中に検出ゲル下方に泳動し測定に
支障はおきない。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。本発
明の装置はＤＮＡ分離検出部とデーター処理部とから成
っている。分離検出部はゲル保持板１，分離用ゲル２，
検出用ゲル３，バッファー槽４，励起光源５，ミラー
６，段継ぎ部固定治具７，フィルターおよびレンズおよ
び蛍光検出部９から成っている。分離用ゲル２と検出用
ゲル３はＢＢ′部で密着してＤＮＡフラグメントがスム
ーズに検出用ゲル３に流れるようにしてある。測定しよ
うとするＤＮＡ試料１６を化学反応等により片方の末端
を蛍光標識し、他端がアデニン塩基Ａで終る試料群、チ
ミン塩基Ｔで終る試料群、シトシン塩基Ｃで終る試料
群、グアニン塩基Ｇで終る試料群の４種の試料群を作成
する。第２図に示したような各試料群には種々の長さの
ＤＮＡフラグメントが含まれる。これら試料１６は群毎
に泳動ゲル１７、別々の泳動路１８上に充填され泳動分
離される。短いフラグメント１３ほど早く泳動するので
一定時間泳動後には第２図に示したように分離される。
オートラジオグラフィーではこのパターンを写真に転写
し、低い方からバンドを順次読む事により配列を決定す
る。光検出では光で照射し、泳動を続行しながらそこを
通過する蛍光標識ＤＮＡから出る蛍光を観測する。短か
いＤＮＡ断片から順次光照射領域に到達するので泳動レ
ーンを識別してＡ，Ｇ，Ｃ、あるいはＴＤＮＡ断片群の
うちどの群からの信号か区別し、時間と共に出現する信
号を追ってゆけば塩基配列が決定できる。実施例ではフ
ィルムで保持された使い捨てゲル２の下部を一直線状に
切断し、検出部用ゲル３に端面を密着させて用いた。第
３図に示したように検出部２０は石英板１４とそれに保
持されたゲル３から成っている。ゲル３は石英板１４上
端部から２〜５mm下まで満たされており、フィルム保持
されたゲル２は二枚のガラス板あるいは熱電導の良い金
属などの板１に保持され、フィルムゲル端部は石英板１
４の隙間に挿入される。密着させた時気泡などが入るの
を防ぐため治具７を第３図（ｂ）のようにしてバッファ
ー液を接合部にみたしておく事もできる。励起光源５に
はアルゴンレーザーを用いたが蛍光体に応じて他のレー
ザーでも良い。レーザ光は石英板１４で保持されたゲル
３を横側面から、ゲル平面と平行に入射し、ゲル接合部
の５mm位下方を一様に照射する。直線状の蛍光像はフィ
ルターを通過した後、カメラレンズで蛍光検出部９のイ
メージ増幅器上に結像され増幅された後にダイオードア
レーあるいはビジコンカメラ等を用いて検出される。フ
レームメモリ１０，計算機１１，出力機器で信号処理さ
れる。検出信号は時間と共に変化するがその様子を第４
図に示した。横軸は泳動板で光照射されている部分の横
方向座標（ｘ座標）でＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔの断片群はそれぞ
れ別の泳動路を取るので別のｘ位置にその信号が現われ
る。縦軸は蛍光強度で斜軸は時間軸である。それぞれの
群のピークを与えるｘ点における蛍光強度の時間変化を
取ると第５図のようになり、出現するピークを順次読む
事により配列決定ができる。

本実施例では励起光を側面から入射させ、ライン上を照
射したが、レーザ光をスキャンする事もできる。更に検
出部に二次電子増倍管を並べたり、１つあるいは複数個
の二次電子増倍管をスキャンして信号を検出しても良
い。

１回目の泳動分離測定後は分離用ゲルを交換し１時間程
度予備泳動させて検出部ゲルに残留している試料を流出
させると共に泳動板内、特に接続部の塩濃度むらを除去
してから使用する。また、接合部から気泡などが入る事
を防止するため、実施例では接合部にバッファー液を保
持できるような枠を設けている。ＤＮＡを電気泳動分離
する場合、泳動距離を一定（通常１５cm〜３０cm）にす
ると分離能はゲル濃度に依存する。長いＤＮＡを分離す
るにはゲル濃度を高くした方が良いが、この場合空間的
な間隔はひろがらない。装置の分解能はレーザービーム
巾で決まるためＤＮＡバンド間隔がレーザービーム幅
（実施例では０．５mm）と同じになると２つのバンドを
識別できなくなる。このような場合、検出部ゲル濃度を
下げてＤＮＡ断片の泳動速度を大きくし、ＤＮＡ断片の
空間的な間隔を大きくして実質的な分解能を上げる事も
可能である。更に測定時の検出限界はゲルからの背景光
で決まる。この大きさはゲル濃度が低い方が小さくなる
ので高感度化にも都合が良い。ただし、ゲルの無い状態
にするとＤＮＡの泳動速度が速くなりすぎて高感度が得
られないことがある。

〔発明の効果〕

本発明によれば、分離用ゲルに市販の使い捨てゲルを使
用できるのでゲル作製の手間が省ける利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例装置の概念図である第２図は
ＤＮＡ試料作製および塩基配列決定の原理図である。第
３図（ａ）は本発明によるゲル板接合部の拡大図で
（ｂ）はその変形例である。第４図は測定例であり、第
５図は測定例をもとにした配列決定例である。 図において、１……ゲル保持板、２……分離用ゲル、３
……検出用ゲル部分、４……バッファー槽、５……励起
用レーザ、６……反射ミラー、７……段継ぎ部固定治
具、８……フィルターおよびレンズ、９……蛍光検出
部、１０……フレームメモリ、１１……計算機、１２…
…出力機器、１３……ＤＮＡバンド、１４……光励起部
（レーザー光路）、１５……バッファー液、１６……決
定しようとするＤＮＡの塩基配列、１７……泳動分離
板、１８……試料注入ウェル、１９……決定されたＤＮ
Ａ塩基配列。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】電気泳動ゲル部，励起光源、および蛍光検
   出器を有する電気泳動分離を用いたＤＮＡ塩基配列決定
   装置において、上記電気泳動ゲル部を泳動分離部と検出
   部とから構成し、両者を独立に脱着可能としたことを特
   徴とするＤＮＡ塩基配列決定装置。
2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載の装置におい
   て、上記検出部のゲル保持板として無蛍光ガラスを用い
   た事を特徴とするＤＮＡ塩基配列決定装置。
3. 【請求項３】特許請求の範囲第１項記載の装置におい
   て、上記泳動分離部および検出部ゲルは平板型であり、
   複数の泳動帯を持ち、励起光がゲル側面から複数の泳動
   帯を同時に照射するように構成されていることを特徴と
   するＤＮＡ塩基配列決定装置。