JPH01197498A - 核酸の増幅のための装置、装置部およびその方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は標準化された条件下で核酸の増幅をオートメー
ション化して行なうための装置および方法に関する。

また、本発明は本方法に用いる装置のための使い捨ての
装置部（ａｐｐａｒａｔｕｓ　ｐａｒｔ）に関する〇［
従来の技術］ 核酸の増幅は米国特許第４，８８３，１９４号、同第４
．６８３，１９５号および同第４．６８３，２０２号各
明細書ならびに欧州特許出願第２００３６２号、同第２
２９７０１号、同第２３７３６２号各公開公明細よび米
国特許出願第０２４１３０４号明細書に開示されている
。

増幅においては、−本鎖標的核酸、少なくとも２つの適
当なブライマー、４つの異なるデオキシヌクレオシド三
リン酸およびＤＮＡポリメラーゼを適当な緩衝液中に含
む反応液を、まず前詰ＤＮＡを重合（ｐｏｌｙｍｅｒｌ
ｚｅ）するために適当な温度でインキュベートする。そ
ののち、重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）で形成
された二本鎖ＤＮＡを加熱により変性し、えられた反応
液をプライマーが前記標的核酸とハイブリダイズできる
温度まで冷却する。要すれば反応液の温度をＤＮＡポリ
メラーゼの作用に至適な温度に調整しＤＮＡポリメラー
ゼを加える。前述の工程は、所望の結果が生じるのに必
要なだけ何回も（り返す。

増幅は一般的にはテストチューブを一カ所から他の所へ
何十回となく用手で動かすことによって行なわれてきた
。前記の方法は実行するには時間がかかり煩雑である。

温度不安定性（ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ）のポリメラ
ーゼを用いたばあい、折々にチューブをあけたり閉めた
りする必要があった。さらには均一な反応液にするため
には冷却工程の間で凝縮した反応液をチューブの壁から
遠心する必要があった。

このように前記工程をオートメーション化することは不
可能であった。

さらに、工程をくり返している間、前記反応条件が必ず
しもまったく同じ状態のままであるとは限らないことが
不便であった。このことはとくに温度安定性酵素（ｔｈ
ｅｒｍｏｓｔａｂｌｃ　ｅｎｚｙｍｅ）を用いたばあい
、その温度安定性にかかわらず、ポリメラーゼが変性温
度にあまりにも長い時間おかれたばあいには、たやすく
分解されるという問題があった。

欧州特許出願第２３Ｂ６９号公開公報は核酸の増幅をコ
ンピュータ制御下に反応液を同一容器内で加熱および冷
却することによって行なう装置を開示している。この装
置では温度安定性ポリメラーゼだけを用いることができ
る。実際には、温度安定性ポリメラーゼは数回のみの反
応サイクルの期間中しか活性がなかった。反応器および
その中の反応液の温度に加えて、周囲の装置の温度もま
た調整しなければならないので、反応液を正確にかつ充
分な速度で加熱および冷却することは困難である。周囲
の装置の熱容量は少Ｑ（約１００μｇ）の反応液の熱容
量と比較すれば相当大きなものであることは免れえない
。

このような理由で、前記反応液があまりにも長い時間、
増幅に不利な条件下におかれることが容易におこる。問
題はとくに変性温度および時間を調節するときにおこる
。この温度があまりにも低いと、増幅に関して所望のよ
うには変性が進まないであろう。反対にポリメラーゼが
、変性温度にあまりにも長い時間おかれると、ポリメラ
ーゼは分解されるであろう。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は前述した不利な点を除去する装置および
その方法を提供することにある。本発明の装置を用いる
ことによって、核酸の増幅をオペレーター（ｏｐｅｒａ
ｔｏｒ）の必要な工程なしに、ＬＡ亭化された条件下に
１またはそれ以上の試料を同時に安全にオートメーショ
ン化して行なうことが可能である。本発明による装置に
おいては、適切な変性温度と時間を充分な正確さと速度
で調整することができる。本発明による方法および装置
は使用されるポリメラーゼが温度安定性であるかいなか
にかかわらず、核酸の増幅に使用できる。

［課題を解決するための手段］ 本発明は組合化を行なうために容器内で適当な緩衝液中
に１または数個の一本鎖標的核酸、少なくとも２つの適
当なブライマー、４つの異なるデオキシヌクレオシド三
リン酸およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液をインキ
ュベートし、ついで反応液をばあいに応じた好ましい方
法で核酸の変性のためのもう一つの容器に移し、変性の
のち、この容器から適当な方法を用いてもとの容器にも
どすことによって核酸の増幅を行なう方法に関する。

すなわち本発明の方法は、 （田重合反応に必要な試薬および１本鎖の標的核酸を含
む反応液をインキュベートし、山）反応液中に存在する
２本鎖の核酸を加熱することによって変性し、 （ｃ１反応液を冷却し、 （ｄ）同じ反応サイクルを１回以上くり返し、工程（ａ
）および山）をそれぞれの容器内で行ない、反応中、該
容器の温度を各工程に適切に維持することを特徴とする
。本発明の方法によれば、反応サイクルをくり返す前に
、ＤＮＡポリメラーゼを加えてもよく、反応サイクルを
くり返す前に、ＤＮＡポリメラーゼを加えなくてもよい
。

増幅装置は核酸の重合を行なう容器を重合酵素の作用に
有利な温度に維持し、変性を行なう容器を変性に有利な
温度に維持することによって調節される。前記反応液の
変性を行なう容器から重合を行なう容器への移送は熱交
換器を経由している。前記熱交換器において変性された
反応液はブライマーが標的ＤＮＡとハイブリダイズでき
る温度まで冷却されるのが好ましい。

また、本発明は本方法に用いるための装置に関する。本
装置は１またはそれ以上、好ましくは１または数（ｓｅ
ｖｅｒａｌ）対の好ましくは並列（ｐａｒａｌ！ｃｌ）
の容器対を含む。ひとつの容器対は１またはそれ以上、
好ましくは１または数本のチューブで相互に連結してい
るが、または相互に連結しうる２つの容器がら成り立っ
ている。

装置は少なくとも１本のチューブが通っている熱交換器
かまたは熱交換器の代用としてのチューブを備えていて
もよい。各容器は温度、７！１節器、たとえばサーモス
タットを備えたヒートブロック（ｈｅａｔ　ｂｌｏｃｋ
）を備えている。さらに装置は反応液を１つの容器から
別の容器に移すための流体移送システム（（’Ｉｕｌｄ
−ｔｒａｎｓｆｅｒ　５ｙｓｔｏａ＋）を含む。重合を
行なう容器は試薬および／または試料を加えるために好
ましい供給装置（ｄｏｓｉｎｇｄｅｖｉｃｅ）を備えて
いてもよい。

また、本発明の使い捨て装置部は、容器対および前記容
器対を連結しているチューブに加え、容器に達している
ガスチューブを含む。前記ガスチューブは以下に詳細に
述べる本発明による装置の好ましい実施例において用い
ることができる。

本発明の装置および方法を以下に詳細に述べる。しかし
ながら、本発明による装置および方法の用途については
以下に述べた装置および方法に限定されるものではない
。

［実施例コ 第１図は好ましい１つの実施例を示す。反応液は重合反
応を行なう容器（１）内にある。チューブ（３）は容器
（１）から容器（２）に達している。前記チューブ（３
）は内径０．３〜０．５■のテフロンチューブが好まし
い。チューブ（３）に連系して独立した（ｓｅｐａｒａ
ｔｅ）の熱交換器（４）があってもよい。熱交換器（４
）はチューブの長さを延ばすことによって簡単に代用す
ることもできる。前記容器は完全に気密性である。チュ
ーブ（３）の端はチューブを通って別の容器内へ充分に
全反応液容量を移すことができるように各容器において
容器の底に接近した位置に達しなくてはいけない。この
理由により、収束しているくぼみ（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）にむかって反応液が流れるために容器の底は下向き
に収束している形であることが好ましい。もちろん、チ
ューブ（３）の端はこのくぼみに置かれていることが好
ましい。また、ガスチューブ（５）および（６）も各容
器（１）および（２）に達している。これらのガスチュ
ーブはマイクロプロセッサ−制御バルブから構成された
バルブシステムに連結している。

たとえばマグネチック−スリーウェイφバルブ（ｍａｇ
ｎｅｔｉｃ　ｔｈｒｅｏ−ｗａｙ　ｖａｌｖｅｓ）　（
７）および（８）である。要すればバルブを経て容器の
うちの１つにガスの流れを連結することができる。その
時、過剰のガスを周囲の空気中へ出すことができるよう
に、別の容器に通じているガスチューブのバルブを作動
させてはならない。そこで１つの容器から別の容器への
反応液の流れは可能になる。好ましいガスの具体例とし
ては、窒素およびアルゴンなどの不活性ガスである。供
給装置０３）および供給装置に属しているチューブ（９
）を介して、要すれば容器（１）内へポリメラーゼまた
は他の試薬を加えることが可能である。数種の試料を平
行して増幅するとき、容ｒｒ（１）および（２）で構成
された同様の容器対はガスチューブ（５）および（６）
を経てガスディストリビユータ（ｇａｓｄｉｓｔｒｉｂ
ｕｔｏｒ）００）に連結することができ、バルブ（７）
および（８）によって制御される。

第１図においては重合反応が進行中で、マグネチックバ
ルブ（７）および（８）は作動していない、すなわち外
部の空気に通じている。温度調節器０１）によって容器
（１）は重合に至適な温度が保たれる。たとえば、サー
マス　アクアティクス（ＴＩ＋ｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔ
＋ｃｕｓ　）　、サーマス　ラバー（Ｔｈｃｒｍｕｓ　
ｒｕｂｃｒ　）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは６
０〜７５℃で用い、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌならび
に、Ｔ４およびＴ７バクテリオフアージＤＮＡポリメラ
ーゼは２０〜３７℃で用いる。

第２図において、重合反応ののち反応液をチューブ（３
）を介して容器（１）から容器（ｚ内へチューブ（５）
を介して容器（１）にはいってくるガスの圧力によって
移している。したがって、バルブロを作動させチューブ
０４）から容器（１）内へガスを流れ込ませる。バルブ
（８）に関しては外部へ過剰なガスを流れ出させる。好
ましいガスの圧力としては０．１〜１気圧である。

第３図において容器（２）内で変性を行ない、熱交換器
０２）によって適当な値、代表的なものとしては９１〜
９５℃に温度を調節している。各バルブ（刀および（８
）を作動させないので反応液の１つの容器から別の容器
内への移動は不可能である。

第４図において反応液を容器（２）から容器（１）内へ
戻している。バルブ（８）を作動し容器（２）内ヘガス
を流し込む。ガスの圧力下で反応液は容器（１）内へ移
送しやすくなる。移送は好ましくはハイブリダイゼーシ
ョン反応が熱交換器中でおこるようなスピードで行なう
。用いるブライマーの大きさやヌクレオチド鎖によって
異なるがハイブリダイゼーション反応の代表的な温度は
３７〜５５℃である。容器（１）内へ流れ込む反応液の
スペースを作るために過剰なガスを流し出すことができ
るようにバルブ（７）を作動しない。要すればポリメラ
ーゼをチューブ（９）を介して加える。

第１図〜第４図で示した工程は数回から数千回でさえマ
イクロプロセッサ−制御下でくり返すことができ、それ
ゆえに始めから終りまでオートメーション化して増幅が
行なわれる。

本発明は前述の好ましい実施例および第１図〜第４図に
おいて示した実施例に限定されるものではない。本発明
の概念中には多くのバリエーションが可能である。前述
の装置において、たとえば圧力を上げるかわりに吸引を
用いることも可能である。

１つの同じバルブを全ての容器対に′おける１つの容器
から別の容器への反応液の移送の制御に用いることがで
きるので、反応液の移送は都合よく圧力を上げたり、吸
引によって達成され、増幅装置における前記反応液の移
送はいくつかの標的核酸の反応液を同時に処理すること
を可能にする。反応液は流体ポンプ（ｆ’１ｕｉｄ　ｐ
ｕｍｐ）によって１つの容器から別の容器へ移すことも
できる。このばあいガスチューブ（５）および（６）は
不要である。このようなばあい、たとえば可逆的な流れ
方向をもつポンプを用いることが可能であり、このばあ
い容器（１）および（′２Ｉの間に１本のチューブ（３
）のみが必要となる。前記核酸の増幅は逆転写酵素を用
いることによってリボ核酸から得られた相補ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）で行なうこともできる。

一連の増幅反応は第１図による工程で始めることが好ま
しい。すなわち増幅に必要な試薬および一本鎖標的核酸
を重合反応を行なうために至適な期間、至適な温度でイ
ンキュベートする。

は的核酸が二本鎖であったばあい、第一番目の工程を行
なう前に一本鎖にしておく。もちろん、標的核酸の変性
に増幅装置を用いることも可能である。このばあい、全
反応工程は第３図に示した工程で始める。このばあい、
−膜内には実際の増幅の期間よりも長い変性期間を用い
ることが都合がよい。

一連の反応工程に用いる至適温度および時間は用いるブ
ライマーおよびポリメラーゼと同様に標的核酸をもとに
決定する。当業者は装置を調節し、時間に応じて行なう
増幅反応の適当な条件を選択できる。

ポリメラーゼを加えることに関して多くの異なる方法が
可能である。酵素は重合反応が行なわれている容器内へ
連続的または間欠的に導入されてもよい。酵素が熱安定
性であれば、一連の反応工程の始めに反応液に含有させ
、そののち必要なときのみ加える。反応容器内にポリメ
ラーゼが固定化された形態または適当な徐放性剤形のい
ずれかの形態で導入されているばあいには酵素を加える
必要はない。酵素が固定されているばあい、もちろん反
応容器から通過しない。徐放的な供給形態を用いるばあ
い、必要とされる多くの反応サイクルの間中ポリメラー
ゼの濃度が適当に保たれるようにポリメラーゼの放出が
ＩＮされていることが重要である。

熱交換器の温度は用いるブライマーの長さとヌクレオチ
ド鎖をもとに決定する。ブライマーのハイブリダイゼー
ション温度が重合酵素の至適温度からかなり異なってい
るばあい、反応液の温度プロフィールは、ブライマーが
熱交換器中にあるうちにハイブリダイズがおこるように
調節されるのが好ましい。反応液が酵素と接触する前に
充分に冷却されていることを確かめることによって、重
合酵素の熱安定性も熱交換器の調節において考慮に入れ
ることができる。変性した核酸を含む溶液の熱交換器に
おける保持時間は、チューブの長さおよび変性を行なう
容器内へ導入するガスの圧力によって、または吸引状態
もしくは反応液ポンプの効率を調節することによって、
調整することができる。

［発明の効果］ 本発明によれば、核酸の増幅をオペレーターの必要な工
程なしに、標阜化された条件下に１またはそれ以上の試
料を同時に完全にオートメーション化して行なうことを
可能としうる効果を奏する。本発明の装置を用いること
により、従来の技術では時間がかかり煩雑であった操作
を簡便にし、さらにポリメラーゼが温度安定性であるか
ないかにかかわらず、核酸の増幅への使用が可能となっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による重合の工程および装置の一般的な
主要部を示す。 第２図はＤＮＡの変性を行なう容器内へ反応液を移す工
程を示す。 第３図はＤＮＡの変性工程を示す。 第４図は重合反応を行なう容器内へ反応液を移す工程を
示す。 （図面の主要符号） （１）：容　器 （２）：容　器 （３）：チューブ （４）；熱交換器 （５）ニガスチューブ （６）ニガスチューブ （７）：バルブ （８）：バルブ （９）：チューブ （財）；ガスディストリビユータ 旧）：温度調節器 ０２）：温度調節器 圏：供給装置 特許出願人　オリオンーユヒチュメ・オユニＬ々ｙｉ 二ＥＥｉ：２ ニＬＩｒコ ニＴ々ｉ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　１またはそれ以上の容器の温度を調節する温度調節
   器および該容器と連結している１またはそれ以上の容器
   の温度を調節する温度調節器、ならびに反応液を１つの
   容器から別の容器内へ移すことが可能である流体移送シ
   ステムに加えて、１またはそれ以上のチューブによって
   相互に連結された１またはそれ以上の容器対を含むこと
   を特徴とする核酸の増幅のための装置。 ２　流体移送システムが１またはそれ以上の容器対の各
   容器に達しているガスチューブおよび該ガスチューブの
   ガス流量を調節するバルブを含むことを特徴とする請求
   項１記載の装置。 ３　該チューブが熱交換器を経て通ることを特徴とする
   請求項１記載の装置。 ４　試薬および／または試料を加えるための供給装置お
   よびチューブを含むことを特徴とする請求項１記載の装
   置。 ５　バルブの操作がマイクロプロセッサー制御であるこ
   とを特徴とする請求項２記載の装置。 ６　ガスチューブが、バルブによって制御されるガスデ
   ィストリビュータに連結されていることを特徴とする請
   求項２記載の装置。 ７　容器対を相互に連結しているチューブが容器の底ま
   で達していることを特徴とする請求項１記載の装置。 ８　各容器の底が下向きに収束することを特徴とする請
   求項１記載の装置。 ９　該供給装置が連続的に作動することを特徴とする請
   求項４記載の装置。 １０　該供給装置が間欠的に作動することを特徴とする
   請求項４記載の装置。 １１　（ａ）重合反応に必要な試薬および１本鎖の標的
   核酸を含む反応液をインキュベートし、 （ｂ）反応液中に存在する２本鎖の核酸を加熱すること
   によって変性し、 （ｃ）反応液を冷却し、 （ｄ）同じ反応サイクルを１回以上くり返し、工程（ａ
   ）および（ｂ）をそれぞれの容器内で行ない、反応中、
   該容器の温度を各工程に適切に維持することを特徴とす
   る方法。 １２　反応サイクルをくり返す前に、ＤＮＡポリメラー
   ゼを加えることを特徴とする請求項１１記載の方法。 １３　反応サイクルをくり返す前に、ＤＮＡポリメラー
   ゼを加えないことを特徴とする請求項１１記載の方法。 １４　重合を行なう容器内へ移す前に、変性した核酸を
   冷却することを特徴とする請求項１１記載の方法。 １５　１つの容器から別の容器内への反応液の移送をガ
   スの圧力を用いて行なうことを特徴とする請求項１１記
   載の方法。 １６　該ポリメラーゼを連続的に加えることを特徴とす
   る請求項１２記載の方法。 １７　該ポリメラーゼを間欠的に加えることを特徴とす
   る請求項１２記載の方法。 １８　該ポリメラーゼが反応容器内に、固定化された形
   態で存在することを特徴とする請求項１１記載の方法。 １９　該ポリメラーゼが反応容器内に、徐放性剤形で存
   在することを特徴とする請求項１１記載の方法。 ２０　容器に達しているガスチューブに加えて、チュー
   ブによって相互に連結された容器から構成されている容
   器対を含むことを特徴とする請求項１記載の使い捨て装
   置部。