JPH01201161A - 体液のアッセイ方法及びキット - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、体液中の白血球及び細菌の存在を検出するた
めに使用される体液特に尿のアッセイ方法に係る。
めに使用される体液特に尿のアッセイ方法に係る。
病院の微生物検査室で扱う検体の５０％近くが尿標本で
ある。また、臨床的に有意な指標に基づくと試験尿標本
の８０〜９０％以上が陰性である。尿標本の完全な分析
には、鏡検及び／または培養が必要である。そのため分
析に時間がかかりまた熟練した検査技師が必要である。
ある。また、臨床的に有意な指標に基づくと試験尿標本
の８０〜９０％以上が陰性である。尿標本の完全な分析
には、鏡検及び／または培養が必要である。そのため分
析に時間がかかりまた熟練した検査技師が必要である。
従って、培養及び鏡検を要する標本の数を少なくするた
めに、陰性標本を選別することが望ましい。このために
使用される選別手段は、できるならば陽性標本全部を同
定できるように高度に特異的でなければならないが、経
済面から考えて採算が合う選別手段は、陽性標本と陰性
標本とを識別できる程度の特異性ともち陰性標本を高い
割合で同定できればよい。
めに、陰性標本を選別することが望ましい。このために
使用される選別手段は、できるならば陽性標本全部を同
定できるように高度に特異的でなければならないが、経
済面から考えて採算が合う選別手段は、陽性標本と陰性
標本とを識別できる程度の特異性ともち陰性標本を高い
割合で同定できればよい。
例えば無症候性感染症を検出するためまたは尿中の病原
体と汚染物とを識別するためには、尿中で検出され例え
ば１０細胞／ｍｌ１１３を上回る多数の白血球が、臨床
的に有意な多数の細菌の存在の指標となることはもはや
定説になっている。また、細菌のカウント数が少ない場
合にも多数の白血球の検出は、無感染炎症または４ ｔ
ｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ｄ ｓｐｐまたはＮｅ１ｓｓｅ
ｒｉａ ７−のごときある種の病原体感染の指標となり
得るかなり最近までは、臨床的に有意な感染の証拠とな
り得る尿標本中の細菌レベルは標本１′１．１当たり１
０５コロニー形成単位（ｃｆｕ／１１Ｎ）以上と考えら
れていた。しかしながらより最近になって、このレベル
を下回る細菌数も臨床的に有意であることが知見された
。ある種の細菌では１００または１ｏ００ｃｆｕ／ｌβ
という低いレベルで病理症状を生じることもあるが、一
般には有意標本の大部分を見落とさないレベルは１０’
ｃｆｕ／ｄであると考えるのが妥当である。
体と汚染物とを識別するためには、尿中で検出され例え
ば１０細胞／ｍｌ１１３を上回る多数の白血球が、臨床
的に有意な多数の細菌の存在の指標となることはもはや
定説になっている。また、細菌のカウント数が少ない場
合にも多数の白血球の検出は、無感染炎症または４ ｔ
ｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ｄ ｓｐｐまたはＮｅ１ｓｓｅ
ｒｉａ ７−のごときある種の病原体感染の指標となり
得るかなり最近までは、臨床的に有意な感染の証拠とな
り得る尿標本中の細菌レベルは標本１′１．１当たり１
０５コロニー形成単位（ｃｆｕ／１１Ｎ）以上と考えら
れていた。しかしながらより最近になって、このレベル
を下回る細菌数も臨床的に有意であることが知見された
。ある種の細菌では１００または１ｏ００ｃｆｕ／ｌβ
という低いレベルで病理症状を生じることもあるが、一
般には有意標本の大部分を見落とさないレベルは１０’
ｃｆｕ／ｄであると考えるのが妥当である。
また、標本中の膿尿の存在が同時に分析できれば、特に
細菌負荷が低い場合の尿路感染の診断が向上することも
一般に認められている。細菌尿のアッセイ結果と尿標本
中の白血球レベルの測定値と含相関させる研究も多数行
なわれ、例えば、八ｍｊ、ｃｌｉｎ、Ｐａｔｈ、 （１
９７５） ６３ ｐ、１４２においてＪｏｒｇｅｎｓｅ
ｎ及びＪｏｎｅｓは、カブトガニアッセイを使用してダ
ラム陰性菌を検出し、ゲル化法によって陽性結果を観察
し、同時にダラム染色法を使用して白血球を顕微鏡観察
した。また細菌の存在を鏡検によって観察した。
細菌負荷が低い場合の尿路感染の診断が向上することも
一般に認められている。細菌尿のアッセイ結果と尿標本
中の白血球レベルの測定値と含相関させる研究も多数行
なわれ、例えば、八ｍｊ、ｃｌｉｎ、Ｐａｔｈ、 （１
９７５） ６３ ｐ、１４２においてＪｏｒｇｅｎｓｅ
ｎ及びＪｏｎｅｓは、カブトガニアッセイを使用してダ
ラム陰性菌を検出し、ゲル化法によって陽性結果を観察
し、同時にダラム染色法を使用して白血球を顕微鏡観察
した。また細菌の存在を鏡検によって観察した。
Ｃｈｅｍｓｔｒｉｐ ＬＮは特に、標本中の白血球エス
テラ−ゼの存在を試験する試薬を含むパッドと亜硝酸塩
を分析して亜硝酸塩形成細菌の存在を試験する試薬を含
むパッドとから成る市販の試験ストリップである。試験
手順は更に、Ｋｕｓｕｍｉ等によってＪＡＭ＾ζ４５１
６５３〜１６５５に記載されている。双方のパッドにお
いて、陽性反応はパッドの変色によって指示される。変
色を肉眼で観察しチャートと比較する。両方のパッドに
異なる色を使用しており、このため、両方のパッドの識
別が容易であり、また夫々の色をチャートの適当な部分
と比較できる。
テラ−ゼの存在を試験する試薬を含むパッドと亜硝酸塩
を分析して亜硝酸塩形成細菌の存在を試験する試薬を含
むパッドとから成る市販の試験ストリップである。試験
手順は更に、Ｋｕｓｕｍｉ等によってＪＡＭ＾ζ４５１
６５３〜１６５５に記載されている。双方のパッドにお
いて、陽性反応はパッドの変色によって指示される。変
色を肉眼で観察しチャートと比較する。両方のパッドに
異なる色を使用しており、このため、両方のパッドの識
別が容易であり、また夫々の色をチャートの適当な部分
と比較できる。
パッドの色を正確に且つ敏感に分析するためには種々の
波長における反射の測定が必要なので、かかるシステム
の自動化は難しい。結果を非自動的に肉眼で解釈するた
めには観察者がある程度熟練していなければならない。
波長における反射の測定が必要なので、かかるシステム
の自動化は難しい。結果を非自動的に肉眼で解釈するた
めには観察者がある程度熟練していなければならない。
欧州特許公開第０２３７３９４号は、尿中の白血球の存
在を測定するアッセイにおいてコリンエステラーゼの色
素産生基質を使用している。
在を測定するアッセイにおいてコリンエステラーゼの色
素産生基質を使用している。
欧州特許公開第００１２９５７号（米国特許第４２７８
７６３号）は、中性好性顆粒白血球中のエステラーゼの
基質としてアミノ酸及びペプチドの色素産生インドキシ
ルエステル誘導体を開示している。これらは明らかにエ
ラスターゼキモトリプシン及びトリプシンのごときタン
パク分解酵素によって加水分解され、水溶液及び尿以外
の体液中のこれらの酵素を検出できるや 欧州特許公開第０１５８２２５号（米国特許第４７５８
５０８号）では、例えば尿中の白血球中のエステル分解
またはタンパク分解酵素のアッセイにおいてフェノール
類のエステルを基質として使用している。
７６３号）は、中性好性顆粒白血球中のエステラーゼの
基質としてアミノ酸及びペプチドの色素産生インドキシ
ルエステル誘導体を開示している。これらは明らかにエ
ラスターゼキモトリプシン及びトリプシンのごときタン
パク分解酵素によって加水分解され、水溶液及び尿以外
の体液中のこれらの酵素を検出できるや 欧州特許公開第０１５８２２５号（米国特許第４７５８
５０８号）では、例えば尿中の白血球中のエステル分解
またはタンパク分解酵素のアッセイにおいてフェノール
類のエステルを基質として使用している。
基質の一例はフェノール誘導体のアラニルエステルであ
る。
る。
その他の市販の尿分析システムの例は、へｕｔｏ−ｔｒ
ａｋシステムである。このシステムにおいては、尿標本
を細菌及び白血球の双方を染色する蛍光染料と接触させ
る。装置は染色された白血球と細菌とを計数し、また２
つの細胞型を識別し得る。
ａｋシステムである。このシステムにおいては、尿標本
を細菌及び白血球の双方を染色する蛍光染料と接触させ
る。装置は染色された白血球と細菌とを計数し、また２
つの細胞型を識別し得る。
Ａｕｔｏｔｒａｋシステムの問題は、装置が比較的高価
であること及び尿選別以外の用途に使用するのが難しい
ことである。
であること及び尿選別以外の用途に使用するのが難しい
ことである。
カプトカニのアメーバ様細胞溶解液は標本中の細菌内毒
素の存在及び量を試験するために広く使用されている。
素の存在及び量を試験するために広く使用されている。
内毒素が引き金となって開始されるゲル化反応は、混濁
度変化の観察（米国特許第４０３８０２９号）、毛細管
内での凝固栓形成の分析（米国特許第４３７０４１３号
）またはアッセイ混合物の表面に落下した物体の針入度
の測定によって観察され得る。より最近には、凝固プロ
セス中に形成された生成物によって加水分解され例えば
有色化合物または蛍光化合物を生成する合成基質が開発
された。例えば欧州特許第８０６４９号では、尿のこと
き生物体液をアメーバ様細胞溶解液に対する合成ペプチ
ド基質、特に加水分解してｐ−ニトロアニリンを生成す
る基質によって分析し、ｐ−ニトロアニリンの存在を色
の観察によって直接検出するか、または例えば、より観
察し易い色を呈するアゾ色素を形成するカップリング試
薬とカップリングさせることによって別の化合物に変換
し得る。蛍光発生基質も開示されている。欧州特許第２
２４６３０号では尿の選別のために、カブトガニのアメ
ーバ様細胞溶解液と共に色素産生または蛍光発生基質が
使用されている。
度変化の観察（米国特許第４０３８０２９号）、毛細管
内での凝固栓形成の分析（米国特許第４３７０４１３号
）またはアッセイ混合物の表面に落下した物体の針入度
の測定によって観察され得る。より最近には、凝固プロ
セス中に形成された生成物によって加水分解され例えば
有色化合物または蛍光化合物を生成する合成基質が開発
された。例えば欧州特許第８０６４９号では、尿のこと
き生物体液をアメーバ様細胞溶解液に対する合成ペプチ
ド基質、特に加水分解してｐ−ニトロアニリンを生成す
る基質によって分析し、ｐ−ニトロアニリンの存在を色
の観察によって直接検出するか、または例えば、より観
察し易い色を呈するアゾ色素を形成するカップリング試
薬とカップリングさせることによって別の化合物に変換
し得る。蛍光発生基質も開示されている。欧州特許第２
２４６３０号では尿の選別のために、カブトガニのアメ
ーバ様細胞溶解液と共に色素産生または蛍光発生基質が
使用されている。
米国特許第４１８８２６４号は、カブトガニのアメーバ
様細胞溶解液アッセイのための一連の蛍光発生及び色素
産生基質を開示している。
様細胞溶解液アッセイのための一連の蛍光発生及び色素
産生基質を開示している。
本発明によれば、体液標本に対して別々の２つのアッセ
イを実施し所定波長に感受性のデテクタを使用してアッ
セイ結果を光学的に判定する新規な体液試験方法が提供
される。本発明方法の特徴は、方法が、 （、）部分量の体液標本を含む第１アッセイ混合物と第
１化合物を形成すべく前記アッセイ混合物中の白血球と
反応性の白血球試薬とを形成し、前記アッセイ混合物中
の前記第１化合物の存在を前記光学デテクタによって測
定し、 （ｂ）部分量の体液標本を含む第２アッセイ混合物と第
２化合物を形成すべくアッセイ混合物中の細菌と反応性
の細菌試薬とを形成し、前記アッセイ混合物中の前記第
２化合物の存在を前記光学デテクタによって測定し、 （ｃ）前記デテクタを使用し前記所定波長における光学
的評価によって前記第１及び第２の化合物の存在を判定
する段階を含むことである。
イを実施し所定波長に感受性のデテクタを使用してアッ
セイ結果を光学的に判定する新規な体液試験方法が提供
される。本発明方法の特徴は、方法が、 （、）部分量の体液標本を含む第１アッセイ混合物と第
１化合物を形成すべく前記アッセイ混合物中の白血球と
反応性の白血球試薬とを形成し、前記アッセイ混合物中
の前記第１化合物の存在を前記光学デテクタによって測
定し、 （ｂ）部分量の体液標本を含む第２アッセイ混合物と第
２化合物を形成すべくアッセイ混合物中の細菌と反応性
の細菌試薬とを形成し、前記アッセイ混合物中の前記第
２化合物の存在を前記光学デテクタによって測定し、 （ｃ）前記デテクタを使用し前記所定波長における光学
的評価によって前記第１及び第２の化合物の存在を判定
する段階を含むことである。
波長は１つの波長バンドでもよい。
本発明においてデテクタは一般に光源及び光センサを含
む。光源はアッセイ混合物を照射し、光センサは混合物
から放出された光を検出する。放出光は反射光でもよく
または透過光でもよくまたはアッセイ混合物中の蛍光化
合物が光源からの入射光によって励起されて発生した蛍
光でもよい。
む。光源はアッセイ混合物を照射し、光センサは混合物
から放出された光を検出する。放出光は反射光でもよく
または透過光でもよくまたはアッセイ混合物中の蛍光化
合物が光源からの入射光によって励起されて発生した蛍
光でもよい。
デテクタによって感知可能な所定波長は光源からの入射
光の波長でもよく、特定波長を生成する源の使用によっ
て得られてもよく、または広い波長範囲を生成する源か
らの光を濾過した結果得られたものでもよい、これに付
加または代替して、センサによって感知可能な波長でも
よい。アッセイ混合物からの放出光はセンサによって感
知される波長の光を生成するように濾過されてもよく、
及び／または例えば放出光がアッセイ混合物の１つの成
分の蛍光によって生成されるならば放出光は特定波長で
もよい。双方のアッセイ混合物の前記化合物の検出は同
じ励起波長及び同じ放出波長で行なわれるのが好ましい
９励起波長が放出波長と異なる波長であることもしばし
ば生じる。
光の波長でもよく、特定波長を生成する源の使用によっ
て得られてもよく、または広い波長範囲を生成する源か
らの光を濾過した結果得られたものでもよい、これに付
加または代替して、センサによって感知可能な波長でも
よい。アッセイ混合物からの放出光はセンサによって感
知される波長の光を生成するように濾過されてもよく、
及び／または例えば放出光がアッセイ混合物の１つの成
分の蛍光によって生成されるならば放出光は特定波長で
もよい。双方のアッセイ混合物の前記化合物の検出は同
じ励起波長及び同じ放出波長で行なわれるのが好ましい
９励起波長が放出波長と異なる波長であることもしばし
ば生じる。
検出される成分化合物が蛍光性であり、夫々の蛍光によ
って検出されるのが特に好ましい。
って検出されるのが特に好ましい。
本発明方法は、脳を髄液、血液、痰等のごとくその池の
体液の試験にも適しているが尿の試験に最も適している
。本発明方法は、多数の尿標本を通常はほぼ自動的に処
理する選別手段として極めて有用である。
体液の試験にも適しているが尿の試験に最も適している
。本発明方法は、多数の尿標本を通常はほぼ自動的に処
理する選別手段として極めて有用である。
本発明方法を使用することによって選別方法を容易に自
動化でき、また、読取毎に光源、センサまたはフィルタ
を交換する必要のない比較的簡単なデテクタを使用し得
る。全自動化によって不慣れな検査者でもほとんど練習
しないで方法を使用できるので実験室の効率も向上する
。光学検出を蛍光検出によって行なう方法が特に有利で
ある。
動化でき、また、読取毎に光源、センサまたはフィルタ
を交換する必要のない比較的簡単なデテクタを使用し得
る。全自動化によって不慣れな検査者でもほとんど練習
しないで方法を使用できるので実験室の効率も向上する
。光学検出を蛍光検出によって行なう方法が特に有利で
ある。
各アッセイでは、一定期間にわたる化合物の形成を検出
するためにアッセ・イ混合物を連続的にモニタすること
によって観察を行なってもよい。各アッセイ混合物中の
化合物の存在をほぼ同時に一回の測定だけで測定するの
が便利である。従ってアッセイがほぼ同じ期間の経過後
に反応終点に到達するようにできる。好ましくは、反応
開始から５分〜２時間の経過後に光学検出を行なう。
するためにアッセ・イ混合物を連続的にモニタすること
によって観察を行なってもよい。各アッセイ混合物中の
化合物の存在をほぼ同時に一回の測定だけで測定するの
が便利である。従ってアッセイがほぼ同じ期間の経過後
に反応終点に到達するようにできる。好ましくは、反応
開始から５分〜２時間の経過後に光学検出を行なう。
定型的な尿の試験方法によれば、第１アッセイで１μ！
当たり１０個以上の白血球細胞の存在を検出できるのが
好ましい。また同じく定型的な試験方法では、第２アッ
セイで１０’ｃｆｕ／ｘｉ以上を検出できるのが好まし
い。
当たり１０個以上の白血球細胞の存在を検出できるのが
好ましい。また同じく定型的な試験方法では、第２アッ
セイで１０’ｃｆｕ／ｘｉ以上を検出できるのが好まし
い。
光学検出では、アッセイ混合物による所与の波長の光の
吸収及び反射の変化を測定する。またはアッセイ混合物
の蛍光特性の変化を測定してもよい。アッセイ混合物中
で基質の反応によって形成される化合物は、光学手段に
よって直接検出され得る。例えば化合物は反応試薬に対
して別々の已に着色されてもよくまたは別々の蛍光特性
を有してらよい。または１ヒ合物が間接に検出されても
よい、例えば化合物がアッセイ混合物の別の成分と相互
作用し直接検出できる別の化合物と反応してもよい。例
えは欧州特許第８０６４９号に記載のごとく、色素例え
ばアゾ色素を生成するカップリング試薬とカップリング
されてもよい。または、例えば米国特許第４４９５２９
３号に記載のごとく、化合物または別の反応生成物が例
えば別の成分によって放出された蛍光を消滅させる、例
えば吸収することによってアンセイ混合物の別の成分の
光学特性に影響を与えてもよい。
吸収及び反射の変化を測定する。またはアッセイ混合物
の蛍光特性の変化を測定してもよい。アッセイ混合物中
で基質の反応によって形成される化合物は、光学手段に
よって直接検出され得る。例えば化合物は反応試薬に対
して別々の已に着色されてもよくまたは別々の蛍光特性
を有してらよい。または１ヒ合物が間接に検出されても
よい、例えば化合物がアッセイ混合物の別の成分と相互
作用し直接検出できる別の化合物と反応してもよい。例
えは欧州特許第８０６４９号に記載のごとく、色素例え
ばアゾ色素を生成するカップリング試薬とカップリング
されてもよい。または、例えば米国特許第４４９５２９
３号に記載のごとく、化合物または別の反応生成物が例
えば別の成分によって放出された蛍光を消滅させる、例
えば吸収することによってアンセイ混合物の別の成分の
光学特性に影響を与えてもよい。
好ましくは試薬の反応によって生成される化合物の双方
が直接検出可能である。その理由は、反応によってアッ
セイ混合物中の成分の種類が減少するからである。双方
のアッセイで生成される化合物が同じであるならば、こ
れは最も有利である。
が直接検出可能である。その理由は、反応によってアッ
セイ混合物中の成分の種類が減少するからである。双方
のアッセイで生成される化合物が同じであるならば、こ
れは最も有利である。
基質はアッセイ混合物中で消去される。通常は加水分解
されることによって反応してもよいが酸化または還元さ
れることによって反応することもでき及び／付加付加反
応を生じてもよい９有色化合物を生成する試薬の例は、
ｐ−ニトロアニリン（Ｎ＾）、ｐ−ジエチルアミノアニ
リン（ＤＥ八へへ及び５−ニトロ−α−ナフチルアミン
のエステル及びアミド誘導体である。蛍光化合物を生成
する試薬の例は、β−ナフチルアミン、β−ナフトール
、α−ナフトール、インドキシル、Ｎ−メチル−インド
キシル、７−アミノ−４−メチル−または７−アミノ−
４−トリフルオロメチル−クマリン、４−メチル−まな
は４−トリフルオロメチル−ウンベリフェロンまたはレ
ゾルフィンのエステルまたはアミドである。蛍光発生物
買が最も好ましく、入手し得る最も好ましい蛍光基質は
クマリン誘導体である。
されることによって反応してもよいが酸化または還元さ
れることによって反応することもでき及び／付加付加反
応を生じてもよい９有色化合物を生成する試薬の例は、
ｐ−ニトロアニリン（Ｎ＾）、ｐ−ジエチルアミノアニ
リン（ＤＥ八へへ及び５−ニトロ−α−ナフチルアミン
のエステル及びアミド誘導体である。蛍光化合物を生成
する試薬の例は、β−ナフチルアミン、β−ナフトール
、α−ナフトール、インドキシル、Ｎ−メチル−インド
キシル、７−アミノ−４−メチル−または７−アミノ−
４−トリフルオロメチル−クマリン、４−メチル−まな
は４−トリフルオロメチル−ウンベリフェロンまたはレ
ゾルフィンのエステルまたはアミドである。蛍光発生物
買が最も好ましく、入手し得る最も好ましい蛍光基質は
クマリン誘導体である。
第１アッセイは標本中の白血球エステラーゼの存在を検
出する反応でもよい、従って試薬は検出可能化合物を生
成すべく加水分解できる白血球エステラーゼの基質であ
る。適当な基質は、ペプチジル誘導体、例えばＣｈｅｍ
ｓｔｒｉｐ ＬＮまたはアナログで使用されるインドキ
シルエステルまたは欧州特許公開第００１２５９２号ま
たは欧州特許公開第０１５８２２５号に記載のごときエ
ステル類同様の基ｉｔたは欧州特許公開第０２３７３９
４号に記載のコリンエステラーゼ基質である。加水分解
産物として蛍光化合物が生成する基質の任意の類似体の
使用が可能である。
出する反応でもよい、従って試薬は検出可能化合物を生
成すべく加水分解できる白血球エステラーゼの基質であ
る。適当な基質は、ペプチジル誘導体、例えばＣｈｅｍ
ｓｔｒｉｐ ＬＮまたはアナログで使用されるインドキ
シルエステルまたは欧州特許公開第００１２５９２号ま
たは欧州特許公開第０１５８２２５号に記載のごときエ
ステル類同様の基ｉｔたは欧州特許公開第０２３７３９
４号に記載のコリンエステラーゼ基質である。加水分解
産物として蛍光化合物が生成する基質の任意の類似体の
使用が可能である。
白血球アッセイは好ましくは白血球エラスターゼの存在
を検出し、従ってエラスターゼに対する合成基質を使用
する。本発明の最も好ましい特徴によれば、基質の加水
分解によって蛍光化合物が生成される。
を検出し、従ってエラスターゼに対する合成基質を使用
する。本発明の最も好ましい特徴によれば、基質の加水
分解によって蛍光化合物が生成される。
かかる好ましいアッセイで使用されるエラスターゼ基質
は、エラスターゼ酵素に感受性及び特異性のペプチド誘
導体である。従って基質は、体液中に正常に存在する別
の酵素または白血球エステラーゼ、トリプシンまたはキ
モトリプシンによって実質的に加水分解されない、即ち
これらの別のプロテアーゼによって極めて緩慢に加水分
解されるかまたは全く加水分解されないのが好ましい。
は、エラスターゼ酵素に感受性及び特異性のペプチド誘
導体である。従って基質は、体液中に正常に存在する別
の酵素または白血球エステラーゼ、トリプシンまたはキ
モトリプシンによって実質的に加水分解されない、即ち
これらの別のプロテアーゼによって極めて緩慢に加水分
解されるかまたは全く加水分解されないのが好ましい。
適当な基質は式ｌ
Ｒ１−八幡−＾３−＾２−＾１−ＣＯＮＨ−Ｒ２〔式中
、Δ１は非極性側鎖をもち好ましくはアラニル、バリル
、フェニルアラニル及びメチオニルから選択されたアミ
ノ酸残基を示し、＾２は結合を示すかまたは非極性側鎖
をもち好ましくはプロリル、アラニル及びロイシルから
選択されたアミノ酸残基を示し、八３は結合を示すがま
たは非極性側鎖をもち好ましくはアラニル残基がら成る
アミノ酸残基を示し、＾４は結合を示すがまたは非極性
側鎖３もち好ましくはアラニル残基がら成るアミノ酸残
基を示し、Ｒ＋はグルタリルまたはＮ−末端ブロック基
を示し、Ｒ２は化合物８２ＮＨ２がアッセイ媒体中で所
定デテクタによって検出されるように選択された基であ
る〕で示される化合物である。式中の＾１がアラニルま
たはバリル好ましくはバリルを示し、＾２がアラニルま
たはプロリルを示し＾３がアラニル３示す化合物が最も
好ましい。ブロック基はアセチル（ＡＣ）、スクシニル
（Ｓｕｃ）、メトキシスクシニル（ＭｅＯＳｕｃ）、ｔ
−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びグルタリル（
［１：Ｉｔ）から選択される。ＭｅＯＳｕｃが持に好ま
しい基であることが知見された。
、Δ１は非極性側鎖をもち好ましくはアラニル、バリル
、フェニルアラニル及びメチオニルから選択されたアミ
ノ酸残基を示し、＾２は結合を示すかまたは非極性側鎖
をもち好ましくはプロリル、アラニル及びロイシルから
選択されたアミノ酸残基を示し、八３は結合を示すがま
たは非極性側鎖をもち好ましくはアラニル残基がら成る
アミノ酸残基を示し、＾４は結合を示すがまたは非極性
側鎖３もち好ましくはアラニル残基がら成るアミノ酸残
基を示し、Ｒ＋はグルタリルまたはＮ−末端ブロック基
を示し、Ｒ２は化合物８２ＮＨ２がアッセイ媒体中で所
定デテクタによって検出されるように選択された基であ
る〕で示される化合物である。式中の＾１がアラニルま
たはバリル好ましくはバリルを示し、＾２がアラニルま
たはプロリルを示し＾３がアラニル３示す化合物が最も
好ましい。ブロック基はアセチル（ＡＣ）、スクシニル
（Ｓｕｃ）、メトキシスクシニル（ＭｅＯＳｕｃ）、ｔ
−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びグルタリル（
［１：Ｉｔ）から選択される。ＭｅＯＳｕｃが持に好ま
しい基であることが知見された。
基質として適当な多数のペプチジル誘導体が公知であり
、例えば、 ＾Ｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ ＾Ｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ＾Ｃ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ＾Ｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ Ｂｏａ−Ａｌａ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ−八１ａ−Ｐｒｏ−ＡｌａＢｏｃ−Ａｌ
ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌＧｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｌａ ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌＳｕｃ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ Ｓｕｃ−八１ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮｅｔＳｕｃ−八１
ａ−Ａｌａ−Ｖａｌ Ｓｕｅ−Ａｌａ４ｒｙ−Ｌｅｕ−ＶａｌＰｙｒ−Ｐｒｏ
−Ｖａｔ がある。
、例えば、 ＾Ｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ ＾Ｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ＾Ｃ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ＾Ｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ Ｂｏａ−Ａｌａ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ Ｂｏｃ−Ａｌａ−八１ａ−Ｐｒｏ−ＡｌａＢｏｃ−Ａｌ
ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌＧｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｌａ ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌＳｕｃ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ Ｓｕｃ−八１ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮｅｔＳｕｃ−八１
ａ−Ａｌａ−Ｖａｌ Ｓｕｅ−Ａｌａ４ｒｙ−Ｌｅｕ−ＶａｌＰｙｒ−Ｐｒｏ
−Ｖａｔ がある。
最も好ましい基質は、＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９） ９９５３〜６４にＣａ
５ｔｉｌｌｏ笠によって記載されているＭｅＯＳｕｃ−
Ａｌａ−八１ａ−Ｐｒｏ−Ｖａｔの誘導体、及び、’Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｏｒＥｎｚｙ＋ｎａｔｉｃ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓＪ、第３版、ＶＯｌ、５ｐｐ１７６〜１８４にＴ
ｓｃｈｅｓｃｈｅ等によって記載されまた１１ｏｐｐｅ
−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ ＆ Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
（１９８０） ３６１１４１３〜１４１６にＷｅｎｚｅ
１等によって記載されている５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｖａｌの誘導体である。
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９） ９９５３〜６４にＣａ
５ｔｉｌｌｏ笠によって記載されているＭｅＯＳｕｃ−
Ａｌａ−八１ａ−Ｐｒｏ−Ｖａｔの誘導体、及び、’Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｏｒＥｎｚｙ＋ｎａｔｉｃ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓＪ、第３版、ＶＯｌ、５ｐｐ１７６〜１８４にＴ
ｓｃｈｅｓｃｈｅ等によって記載されまた１１ｏｐｐｅ
−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ ＆ Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
（１９８０） ３６１１４１３〜１４１６にＷｅｎｚｅ
１等によって記載されている５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｖａｌの誘導体である。
細菌尿に対する第２アッセイは常用の細菌尿アッセイの
いずれに基づいてもよい。岬１えば、適当な基質を用い
Ｃｒ１ｅｓｓ試験を使用して硝酸塩還元細菌を検出して
しよい。試験は例えば欧州特許公開第１７１５５８号ま
たはフランス特許公開第２１９６３８６号に記載のごと
く行なうとよい。細菌を検出するためのその池の化学的
アッセイとしては、Ｊ、Ｌａｂ、 ＆Ｃ１ｉ、Ｍｅｄ、
（１９６１） ４９０−４９４に記載のカタラーゼ試験
、及び、例えば欧州特許公開第９１８３７号または欧州
特許公開第１２２１４８号に記載のごとき細菌酵素（例
えばホスファターゼ、ガラクトシダーゼ及びペプチダー
ゼ）によって加水分解可能な基質を１種類またはカクテ
ルの形態で使用するアッセイがある。別のアッセイでは
、例えば細菌の呼吸連鎖の１つの成分と反応し得るレド
ックス色素、例えば該成分によって還元され得るレドッ
クス色素を使用する。
いずれに基づいてもよい。岬１えば、適当な基質を用い
Ｃｒ１ｅｓｓ試験を使用して硝酸塩還元細菌を検出して
しよい。試験は例えば欧州特許公開第１７１５５８号ま
たはフランス特許公開第２１９６３８６号に記載のごと
く行なうとよい。細菌を検出するためのその池の化学的
アッセイとしては、Ｊ、Ｌａｂ、 ＆Ｃ１ｉ、Ｍｅｄ、
（１９６１） ４９０−４９４に記載のカタラーゼ試験
、及び、例えば欧州特許公開第９１８３７号または欧州
特許公開第１２２１４８号に記載のごとき細菌酵素（例
えばホスファターゼ、ガラクトシダーゼ及びペプチダー
ゼ）によって加水分解可能な基質を１種類またはカクテ
ルの形態で使用するアッセイがある。別のアッセイでは
、例えば細菌の呼吸連鎖の１つの成分と反応し得るレド
ックス色素、例えば該成分によって還元され得るレドッ
クス色素を使用する。
第２アッセイは好ましくは、カブトガニのアメーバ様細
胞溶解液またはその前凝固酵素を含有する抽出物と溶解
液及び内毒素の存在下に加水分解して蛍光（ヒ合物を生
成し得る合成基肩とを３む１つの成分混合物を使用する
。アッセーイは例えば欧州特許公開第８０６４９号、欧
州特許公開第２２４８３０号または米国特許第４１８８
２６４号に記載のごとく行なってもよく、これらの特許
のいずれかに記載された蛍光発生物質のいずれかを使用
してもよい。基質は通常は−Ｃｌｙ−Ａｒｇ−の誘導体
であり、この誘導体においてはアルギニンがそのカルボ
キシル基通常は−ＣＯＮ Ｈ−結合を介して色素産生基
または蛍光発生基に結合し、Ｃｌｙがアミノ酸含有基、
例えば任意にブロック基をもつし一アミノ酸またはペプ
チドまたはそのＮ−末端のＤ−アミノ酸に結合されてい
る。
胞溶解液またはその前凝固酵素を含有する抽出物と溶解
液及び内毒素の存在下に加水分解して蛍光（ヒ合物を生
成し得る合成基肩とを３む１つの成分混合物を使用する
。アッセーイは例えば欧州特許公開第８０６４９号、欧
州特許公開第２２４８３０号または米国特許第４１８８
２６４号に記載のごとく行なってもよく、これらの特許
のいずれかに記載された蛍光発生物質のいずれかを使用
してもよい。基質は通常は−Ｃｌｙ−Ａｒｇ−の誘導体
であり、この誘導体においてはアルギニンがそのカルボ
キシル基通常は−ＣＯＮ Ｈ−結合を介して色素産生基
または蛍光発生基に結合し、Ｃｌｙがアミノ酸含有基、
例えば任意にブロック基をもつし一アミノ酸またはペプ
チドまたはそのＮ−末端のＤ−アミノ酸に結合されてい
る。
本発明方法はまた、体液標本の別の部分に対して同じ光
学デテクタで検出し得る反応生成物を生じさせる第３ア
ッセイ、更に第４アッセイまたはより多数のアッセイを
行なうことが可能である。
学デテクタで検出し得る反応生成物を生じさせる第３ア
ッセイ、更に第４アッセイまたはより多数のアッセイを
行なうことが可能である。
例えば、第３アッセイとしては、硝酸塩還元細菌の検出
試験が有利である。この試験は、ダラム陽性菌の検出を
、例えばダラム陰性菌を検出するＬＡＬ試験と組み合わ
せて使用するのに特に有利である。
試験が有利である。この試験は、ダラム陽性菌の検出を
、例えばダラム陰性菌を検出するＬＡＬ試験と組み合わ
せて使用するのに特に有利である。
かかる試験はフランス特許公開第２１９６３８６号に記
載されており、好ましくは、欧州特許公開第１７１５５
８号に記載のごとき蛍光検出試験を使用する。第、１め
アッセイとしては、例えは欧州特許公開第９１８３７号
または欧州特許公開第１２２１４８号に記載のごとく共
通加水分解酵素を検出する基質カクテルを使用するアッ
セイがある。しかしながら、２つの試験の組み合わせ、
特に白血球エラスターゼ試験とＬＡＬ試験との組み合わ
せが尿の選別に適当であり、２つのアッセイだけを行な
うように方法をできるたけ簡単な形にしておくほうが好
ましいことも知見された。
載されており、好ましくは、欧州特許公開第１７１５５
８号に記載のごとき蛍光検出試験を使用する。第、１め
アッセイとしては、例えは欧州特許公開第９１８３７号
または欧州特許公開第１２２１４８号に記載のごとく共
通加水分解酵素を検出する基質カクテルを使用するアッ
セイがある。しかしながら、２つの試験の組み合わせ、
特に白血球エラスターゼ試験とＬＡＬ試験との組み合わ
せが尿の選別に適当であり、２つのアッセイだけを行な
うように方法をできるたけ簡単な形にしておくほうが好
ましいことも知見された。
各アッセイに使用される標本は、直接体液標本でもよく
または希釈標本でもよく、または、遠心またはその池の
処理方法で体液から得られた標本でもよい。標本は体液
例えば尿の直接標本でもよいか体液例えば尿の希釈標本
が好ましい。各アッセイ混合物の液体成分は実質的に体
液だけに由来するのが好ましい。
または希釈標本でもよく、または、遠心またはその池の
処理方法で体液から得られた標本でもよい。標本は体液
例えば尿の直接標本でもよいか体液例えば尿の希釈標本
が好ましい。各アッセイ混合物の液体成分は実質的に体
液だけに由来するのが好ましい。
いくつかの場合、例えば尿選別において、アメーバ様細
胞溶解液試験を行なうときは約５％の尿で生じる凝固連
続反応の阻害を克服できるように尿を希釈するのが好ま
しい、希釈は５〜５００倍でよく、通常は１０〜２００
倍、例えば２０〜１００倍である。
胞溶解液試験を行なうときは約５％の尿で生じる凝固連
続反応の阻害を克服できるように尿を希釈するのが好ま
しい、希釈は５〜５００倍でよく、通常は１０〜２００
倍、例えば２０〜１００倍である。
本発明はまた、本発明方法を実施するためのキットを提
供する０本発明キットは、アッセイ混合物及びアッセイ
試薬の各々を収容したアッセイ容器を含む。容器は物理
的に分離していてもよいか、好ましくは物理的に互いに
結合している。光学的検出段階中のアッセイ混合物の収
容に適した容器が好ましい、容器は管の形態でもよくま
たは間隙中に液体状アッセイ混合物を保持し得る吸収パ
ッドの形態でもよい、かかる吸収パッドは好ましくは非
吸収性基質に支持されており、被検標本に浸漬されるの
に適しているのが好ましい。キットの極めて好ましい別
の形態は、アッセイ容器を形成する複数のウェルをもつ
プレート、例えばウェルの行列アレイをもつマイクロタ
イタープレートである。キットは複数の尿標本の選別用
試薬を含むか及び／または体液標本に対するその他の（
複数の）アッセイを行なう試薬を含み得る。
供する０本発明キットは、アッセイ混合物及びアッセイ
試薬の各々を収容したアッセイ容器を含む。容器は物理
的に分離していてもよいか、好ましくは物理的に互いに
結合している。光学的検出段階中のアッセイ混合物の収
容に適した容器が好ましい、容器は管の形態でもよくま
たは間隙中に液体状アッセイ混合物を保持し得る吸収パ
ッドの形態でもよい、かかる吸収パッドは好ましくは非
吸収性基質に支持されており、被検標本に浸漬されるの
に適しているのが好ましい。キットの極めて好ましい別
の形態は、アッセイ容器を形成する複数のウェルをもつ
プレート、例えばウェルの行列アレイをもつマイクロタ
イタープレートである。キットは複数の尿標本の選別用
試薬を含むか及び／または体液標本に対するその他の（
複数の）アッセイを行なう試薬を含み得る。
キットのアッセイ容器は、夫々のアッセイプロセスを行
なうために必要な試薬の一部または全部を予調製形態で
含んでいてもよい。またはいくつかの試＝が反応直前ま
たは反応中に容器に移されるような形態でキットに含ま
れていてもよい、試薬がアッセイ混合物に使用された非
希釈尿標本の一部によって直接液体状に戻るような形態
でアッセイ容器に含まれているのが最も有利である。
なうために必要な試薬の一部または全部を予調製形態で
含んでいてもよい。またはいくつかの試＝が反応直前ま
たは反応中に容器に移されるような形態でキットに含ま
れていてもよい、試薬がアッセイ混合物に使用された非
希釈尿標本の一部によって直接液体状に戻るような形態
でアッセイ容器に含まれているのが最も有利である。
試薬は凍結乾燥、空気乾燥または好ましくは真空乾燥さ
れた形態でキットに収容されている。予調製された容器
はまた、試薬安定剤を含んでもよい。これは製造及び／
または保管中の成分を物理的及び化学的に安定させ貯蔵
安定性を与える物質である。容器内の試薬を安定させる
適当な方法は英国特許公開第１５７４７０７号に記載さ
れている。安定剤は水溶性であり、天然物質、例えばゼ
ラチンのごときタンパつてもよく、または合成ポリマー
例えばポリビニルアルコールでもよい。これらはまたバ
ッファを含んでいてもよい。
れた形態でキットに収容されている。予調製された容器
はまた、試薬安定剤を含んでもよい。これは製造及び／
または保管中の成分を物理的及び化学的に安定させ貯蔵
安定性を与える物質である。容器内の試薬を安定させる
適当な方法は英国特許公開第１５７４７０７号に記載さ
れている。安定剤は水溶性であり、天然物質、例えばゼ
ラチンのごときタンパつてもよく、または合成ポリマー
例えばポリビニルアルコールでもよい。これらはまたバ
ッファを含んでいてもよい。
アメーバ様細胞溶解液試験を使用する場合、溶解液と合
成基質とを同し容器に安定な形で収容することがときに
は難しいことが判明した。キットの製造中に活性化する
ゲル化連鎖反応の阻止が難しいからである。キットの製
造中及び保管中に安定剤として作用するインヒビターを
導入することによって連鎖反応の早期活性化を阻止する
ことが可能である。このインヒビターは、後で乾燥され
る試薬または溶解液の溶液に混入される。これに代替ま
たは付加して、溶解物の溶液を実質的に不活性になるｐ
Ｈ、例えばｐＨ８または９以上またはｐ１１６以下に緩
衝してもよい。
成基質とを同し容器に安定な形で収容することがときに
は難しいことが判明した。キットの製造中に活性化する
ゲル化連鎖反応の阻止が難しいからである。キットの製
造中及び保管中に安定剤として作用するインヒビターを
導入することによって連鎖反応の早期活性化を阻止する
ことが可能である。このインヒビターは、後で乾燥され
る試薬または溶解液の溶液に混入される。これに代替ま
たは付加して、溶解物の溶液を実質的に不活性になるｐ
Ｈ、例えばｐＨ８または９以上またはｐ１１６以下に緩
衝してもよい。
実施例１
本発明の実施例を以下に説明する。
ＬＡＬ試験及び白血球エラスターゼを使用して内毒素を
検定するためのマイクロタイタープレートを調製する。
検定するためのマイクロタイタープレートを調製する。
ウェルの一部（ＬＡＬウェル）に対しては凍結乾燥した
カブトガニのアメーバ様細胞溶解物（Ｃａｐｅ Ｃｏｄ
Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、Ｕ、Ｓ＾、から入手）の溶液
と発熱物質非含有の水とバッファとをウェルに導入し乾
燥させる。溶液の導入量は、使用のために液体状に戻し
たときに溶解液が通常使用濃度の約３０倍に希釈されて
いるように選択する。
カブトガニのアメーバ様細胞溶解物（Ｃａｐｅ Ｃｏｄ
Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、Ｕ、Ｓ＾、から入手）の溶液
と発熱物質非含有の水とバッファとをウェルに導入し乾
燥させる。溶液の導入量は、使用のために液体状に戻し
たときに溶解液が通常使用濃度の約３０倍に希釈されて
いるように選択する。
別のウェル（エラスターゼ）にはｐＨ７，５の５％リン
酸バッファ３８０ｚｔ’と脱イオン蒸留水に希釈して調
製した２００ｚＮの１５％ｗ／ｖのｐｖ＾と、１２ｇの
サポニン（Ｓｉｇｍａ）と、１００ｘＮの２Ｍｅ（ＢＤ
ＩＩ＾ｎａｌａｒ）にいれた１ｇのエラスターゼ基質（
ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ＾ＭＣ
）とを含む試薬溶液を充填する。５０μ！の溶液をウェ
ルに充填し減圧下に乾燥させる。
酸バッファ３８０ｚｔ’と脱イオン蒸留水に希釈して調
製した２００ｚＮの１５％ｗ／ｖのｐｖ＾と、１２ｇの
サポニン（Ｓｉｇｍａ）と、１００ｘＮの２Ｍｅ（ＢＤ
ＩＩ＾ｎａｌａｒ）にいれた１ｇのエラスターゼ基質（
ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ＾ＭＣ
）とを含む試薬溶液を充填する。５０μ！の溶液をウェ
ルに充填し減圧下に乾燥させる。
このように調製したプレートを尿アッセイに使用する。
ＬＡＬウェルではウェル内の試薬混合物を所望量のバッ
ファとＬＡＬ基質ＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｃｌｙ−Ａｒｇ−７
＾ＭＣとを含む５０μｌの溶液で液体状に戻す８発熱物
質を３まない無菌ループを使用して１μ２の被検尿標本
をウェルに移す。
ファとＬＡＬ基質ＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｃｌｙ−Ａｒｇ−７
＾ＭＣとを含む５０μｌの溶液で液体状に戻す８発熱物
質を３まない無菌ループを使用して１μ２の被検尿標本
をウェルに移す。
エラスターゼウェルは非希釈尿標本で直接液体状に戻す
。
。
プレートを３７°Ｃで３０分間インキュベートし、ウェ
ル内の加水分解７八ＭＣによる蛍光放出を蛍光計で１．
１１定する。また尿標本を皿微鏡観察して白血球を計数
し、通常の培養方法で微生物レベルを評価する。
ル内の加水分解７八ＭＣによる蛍光放出を蛍光計で１．
１１定する。また尿標本を皿微鏡観察して白血球を計数
し、通常の培養方法で微生物レベルを評価する。
ｍ微鏡肌察及び培養試験の結果を表Ｉに示し、蛍光計の
読取値及びこれに基づく尿標本の陽性また陰性の評価を
表Ｈに示す。
読取値及びこれに基づく尿標本の陽性また陰性の評価を
表Ｈに示す。
表Ｉ
培養結果（Ｃｆｕ／、ｖ４）
尿標本 白血球数 ３陽性菌 ｇ陰性菌１ ２０
１０’ − ３２３００＞１０４ ２１ ０ − ＞１０５１８
３ − ＞１０５２５ ２００
− ＞１０５２７ ３００ −
＞１０５表■ 尿標本 白血球試験 ＬＡＬ試験スクリーン結果（エラ
スターゼ） 白血球ＬＡＬ全体１６ ２６４
４ １５５１ ＋ −計数１８４２以上
を陽性と判定する。９９９９以上は計数しない。
１０’ − ３２３００＞１０４ ２１ ０ − ＞１０５１８
３ − ＞１０５２５ ２００
− ＞１０５２７ ３００ −
＞１０５表■ 尿標本 白血球試験 ＬＡＬ試験スクリーン結果（エラ
スターゼ） 白血球ＬＡＬ全体１６ ２６４
４ １５５１ ＋ −計数１８４２以上
を陽性と判定する。９９９９以上は計数しない。
夫々の試験を単独で行なった場合、白血球試験は標本２
１及び１８を検出できないであろう。また、ＬＡＬ試験
は標本３２及び１６を検出できないであろう。
１及び１８を検出できないであろう。また、ＬＡＬ試験
は標本３２及び１６を検出できないであろう。
しかしながら、２つの試験の組み合わせによって、陽性
標本をすべて検査し、双方の試験で陰性を示した標本を
遷別できる。
標本をすべて検査し、双方の試験で陰性を示した標本を
遷別できる。
１克ｌよ
ＬΔしウェルとエラスターゼウェルとをごむ別のプレー
トを調製する。ＬΔＬウェルを以下のごとく調製する。
トを調製する。ＬΔＬウェルを以下のごとく調製する。
５′１２の０．１２５Ｅｕ／ｚｆｆｉ感受性ン８液（八
５ｓｏｃｉａＬｅｓ ｏｆＣａｐｅ Ｃｏｄ製）の調製
に適した量の凍結乾燥ＬＡＬを１６０ｍ１の０．０５％
ボリヒニルアルコール溶液（Ｓｉ８ｍａ製の冷水溶性）
に溶解する。５０μｒの溶液をウェルに導入し溶）夜を
真空乾燥する。
５ｓｏｃｉａＬｅｓ ｏｆＣａｐｅ Ｃｏｄ製）の調製
に適した量の凍結乾燥ＬＡＬを１６０ｍ１の０．０５％
ボリヒニルアルコール溶液（Ｓｉ８ｍａ製の冷水溶性）
に溶解する。５０μｒの溶液をウェルに導入し溶）夜を
真空乾燥する。
エラスターゼウェルは以下の手順で調製する。
８００ｘ１の水（脱イオン蒸留水）中の３６．１５ｇの
（無水）オルｌ−リン酸水素二つトリウムと４．０９の
オルトリン酸二水素カリウムと９．０ｇのＣＨ八へＳと
を使用してバッファ溶液を調製した。溶液を９８０ｘｌ
に希釈した。実施例１で使用したものと同じエラスター
ゼ基質を２９含む溶液を２０１１の［）ＭＳＯに希釈し
バッファに添加した。５．ＯｇのＲｈ１ｚｏｐｕｓペプ
チダーゼを基質溶液に溶解した。溶液の５０μｌのアリ
コー１−をマイクロタイタープレートのウェルに導入し
真空乾燥によって溶液を乾燥した。
（無水）オルｌ−リン酸水素二つトリウムと４．０９の
オルトリン酸二水素カリウムと９．０ｇのＣＨ八へＳと
を使用してバッファ溶液を調製した。溶液を９８０ｘｌ
に希釈した。実施例１で使用したものと同じエラスター
ゼ基質を２９含む溶液を２０１１の［）ＭＳＯに希釈し
バッファに添加した。５．ＯｇのＲｈ１ｚｏｐｕｓペプ
チダーゼを基質溶液に溶解した。溶液の５０μｌのアリ
コー１−をマイクロタイタープレートのウェルに導入し
真空乾燥によって溶液を乾燥した。
プレートはまな、１組の空のウェルと１組の「対照ウェ
ル」と３もつ。次にプレートを以下のごとく使用する。
ル」と３もつ。次にプレートを以下のごとく使用する。
まず、２５０ｚｆの発熱物質を含まない水と１．２５ｇ
の水酸（ヒナトリウムと９３８９のＴＥＳ生物バッファ
（Ｓｉｇ＋ｎａ）と２．５ｇのポリビニルアルコール（
前記と同じ）と１２５ｇの塩化マグネシウムとを混合し
てＬＡＬ基τ丁原液を希釈する。混合物３加熱して成分
を溶解し発熱物質を含まない０，１Ｍの１１０２または
０．１ＭのＮ ａ Ｏｔｌをｆ受用してｐＩＩ８．００
±０．０５に調整する。次に溶液をフィルター殺菌する
。
の水酸（ヒナトリウムと９３８９のＴＥＳ生物バッファ
（Ｓｉｇ＋ｎａ）と２．５ｇのポリビニルアルコール（
前記と同じ）と１２５ｇの塩化マグネシウムとを混合し
てＬＡＬ基τ丁原液を希釈する。混合物３加熱して成分
を溶解し発熱物質を含まない０，１Ｍの１１０２または
０．１ＭのＮ ａ Ｏｔｌをｆ受用してｐＩＩ８．００
±０．０５に調整する。次に溶液をフィルター殺菌する
。
別に、２−メルカプトエタノール中でＯ，１％ｕ＋／′
ｖの［１０ｃｍＶａｔ−Ｇ：Ｉｙ−＾ｒＨ−ＡＭＣ溶液
を調製する。３００μ（の該溶液を９．７ｘｌのバッフ
ァと混合する。使用直前に５０μ！の基質原液を乾燥Ｌ
ＡＬ収容ウェルに添加する。
ｖの［１０ｃｍＶａｔ−Ｇ：Ｉｙ−＾ｒＨ−ＡＭＣ溶液
を調製する。３００μ（の該溶液を９．７ｘｌのバッフ
ァと混合する。使用直前に５０μ！の基質原液を乾燥Ｌ
ＡＬ収容ウェルに添加する。
尿標本の５０μ！アリコートを１つの空ウェルと１つの
対照ウェルと１つのエラスターゼウェルとに導入する。
対照ウェルと１つのエラスターゼウェルとに導入する。
無菌プラスチックループを使用して空ウェルに導入した
尿から１μりの尿をＬＡＬウェルに移す。この時点から
アッセイ時間の測定を開始する。
尿から１μりの尿をＬＡＬウェルに移す。この時点から
アッセイ時間の測定を開始する。
別の尿標本のアリコートを同じウェルの別のプレートに
導入する。プレートをシー）・状接着剤シールて被覆し
、３７°Ｃで３０分間インキュベートし、次に自動読取
装置によって各ウェルの７−アミノ−４−メチル−クマ
リンの存在を蛍光測定によって検出する。読取値を対照
ウェルの正味尿読取値と比較する。尿が１０’ｃｆｕ／
ｚｆ以上の細菌をよむかまたは１０°白血球７１１以上
と含むときに試験を陽性と記録する。一方の試験または
双方の試験で陽性結果がでたときは例えば感染を同定す
るため及び／または感染に感受性の抗生物質を決定する
ために尿を更に試験する。双方の試験が陰性のときは尿
をそれ以上試験するｔビ・要がない。
導入する。プレートをシー）・状接着剤シールて被覆し
、３７°Ｃで３０分間インキュベートし、次に自動読取
装置によって各ウェルの７−アミノ−４−メチル−クマ
リンの存在を蛍光測定によって検出する。読取値を対照
ウェルの正味尿読取値と比較する。尿が１０’ｃｆｕ／
ｚｆ以上の細菌をよむかまたは１０°白血球７１１以上
と含むときに試験を陽性と記録する。一方の試験または
双方の試験で陽性結果がでたときは例えば感染を同定す
るため及び／または感染に感受性の抗生物質を決定する
ために尿を更に試験する。双方の試験が陰性のときは尿
をそれ以上試験するｔビ・要がない。
実施例３
Ｌ Ａ Ｌ ｉ＆験の別の具体例ではウェルを以下のご
とく調製した。
とく調製した。
発熱物質非３有の水中の０．ＩＭのクエン酸溶液２（容
量）部と０．２Ｍのオルトリン酸水素二ナトリウム溶）
夜３部とを混合して１１ Ｉ＋ ５ 、８のバッファを
調製した。
量）部と０．２Ｍのオルトリン酸水素二ナトリウム溶）
夜３部とを混合して１１ Ｉ＋ ５ 、８のバッファを
調製した。
５１の０．１２５Ｅｕ／＋１感受性溶液（Ｗｈ ｉ ｔ
ｔａｋｅｒ製）の調製に適した量の凍結乾燥ＬＡＬを
、１０１１の０．１％ポリビニルアルコール溶液に再溶
解した。これに１０肩２のｐｔ１５．８バツフアを添加
した。溶液の５０μ！アリコートをマイクロタイタープ
レートのウェルに導入し真空乾燥した。
ｔａｋｅｒ製）の調製に適した量の凍結乾燥ＬＡＬを
、１０１１の０．１％ポリビニルアルコール溶液に再溶
解した。これに１０肩２のｐｔ１５．８バツフアを添加
した。溶液の５０μ！アリコートをマイクロタイタープ
レートのウェルに導入し真空乾燥した。
次に実施例２のごとく、即ちウェルにエラスターゼ基質
を入れ、同じ基質原液でＬＡＬを液体状に戻し同様にし
て尿（ユ本のアリコートを添加した。
を入れ、同じ基質原液でＬＡＬを液体状に戻し同様にし
て尿（ユ本のアリコートを添加した。
尿ウェルにおける反応混合物のｐＨは約７３であつた。
実施例４
ＬΔＬウェルの別の具体例においては以下の溶液を調製
した。実施例２と同様であるが更に０．０５％のポリビ
ニルアルコールを含有ｐＨ８，ｏｏ±００５に緩衝した
基貰溶液の５０バのアリコートをプレートのウェルに導
入して乾燥した。緩衝したｐＨ５，８の溶解物溶液３キ
ツトの筒用直前にポリビニルアルコールを使用しないで
実施例３と同様に調製した。
した。実施例２と同様であるが更に０．０５％のポリビ
ニルアルコールを含有ｐＨ８，ｏｏ±００５に緩衝した
基貰溶液の５０バのアリコートをプレートのウェルに導
入して乾燥した。緩衝したｐＨ５，８の溶解物溶液３キ
ツトの筒用直前にポリビニルアルコールを使用しないで
実施例３と同様に調製した。
ｐｌ（約７．３を与えるべく基質収容ウェルに溶解物溶
液の５０μｌのアリコートを添加してウェルを液体状に
戻し、次に１μｌの尿を先行実施例と同様にして１．ト
加した。
液の５０μｌのアリコートを添加してウェルを液体状に
戻し、次に１μｌの尿を先行実施例と同様にして１．ト
加した。
Claims (11)
- （１）体液標本に対して別々の２つのアッセイを実施し
所定波長に感受性のデテクタを使用してアッセイ結果を
光学的に判定する体液の試験方法において、方法が、 （ａ）部分量の体液標本を含む第１アッセイ混合物と第
１化合物を形成すべく前記アッセイ混合物中の白血球と
反応性の白血球試薬とを形成し、前記アッセイ混合物中
の前記第１化合物の存在を前記光学デテクタによって測
定し、 （ｂ）部分量の体液標本を含む第２アッセイ混合物と第
２化合物を形成すべくアッセイ混合物中の細菌と反応性
の細菌試薬とを形成し、前記アッセイ混合物中の前記第
２化合物の存在を前記光学デテクタによって測定し、 （ｃ）前記デテクタを使用し前記所定波長における光学
的評価によって前記第１及び第２の化合物の存在を判定
することを特徴とする方法。 - （２）体液が尿であることを特徴とする請求項１に記載
の方法。 - （３）所定波長がデテクタの光源からの入射光の波長で
あることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 - （４）所定波長がデテクタのセンサによって感知可能な
波長であることを特徴とする請求項１から３のいずれか
に記載の方法。 - （５）各アッセイ混合物から放出されデテクタのセンサ
によって検出される光が蛍光であることを特徴とする請
求項１から４のいずれかに記載の方法。 - （６）前記第１化合物及び前記第２化合物が同じであり
、好ましくは蛍光性、特に好ましくは蛍光クマリン誘導
体であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに
記載の方法。 - （７）白血球試薬が白血球エラスターゼの基質であり、
好ましくはＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌの誘導体であることを特徴とする請求項１から６の
いずれかに記載の方法。 - （８）細菌試薬が、カブトガニのアメーバ様細胞溶解液
またはその前凝固酵素含有抽出物と、溶菌液及び内毒素
の存在下に加水分解し得る溶菌液の合成基質とを含み、
基質が好ましくはＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｃｌｙ−Ａｒｇの誘
導体であることを特徴とする請求項１から７のいずれか
に記載の方法。 - （９）請求項１に記載のアッセイ混合物と白血球試薬と
細菌試薬とを夫々収容したアッセイ容器を含むことを特
徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法実施用
キット。 - （１０）第１及び第２のアッセイ混合物を夫々収容した
アッセイ容器が互いに物理的に結合されており、好まし
くは複数のウェルをもつプレートのウェルから成ること
を特徴とする請求項９に記載のキット。 - （１１）アッセイ容器が少なくとも一方の試薬を予調製
形態、好ましくは夫々の容器の内面の乾燥薄膜の形態で
備えることを特徴とする請求項９または１０に記載のキ
ット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8727796 | 1987-11-27 | ||
| GB878727796A GB8727796D0 (en) | 1987-11-27 | 1987-11-27 | Urine assay process and kit |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01201161A true JPH01201161A (ja) | 1989-08-14 |
Family
ID=10627628
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30042088A Pending JPH01201161A (ja) | 1987-11-27 | 1988-11-28 | 体液のアッセイ方法及びキット |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0320154A1 (ja) |
| JP (1) | JPH01201161A (ja) |
| GB (1) | GB8727796D0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009085880A (ja) * | 2007-10-02 | 2009-04-23 | Kowa Co | エンドトキシン測定用の容器 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8827557D0 (en) * | 1988-11-25 | 1988-12-29 | Radiometer Corporate Dev Ltd | Process for handling horseshoe crab amoebocyte lysate |
| GB2432660A (en) | 2005-11-29 | 2007-05-30 | Bacterioscan Ltd | System for counting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics |
| US20150293097A1 (en) | 2012-10-08 | 2015-10-15 | General Electric Company | Preloaded test substrates for testing lal-reactive substances, methods of use, and methods of making |
| JP6479037B2 (ja) | 2013-12-06 | 2019-03-06 | バクテリオスキャン エルティーディー | 試料チャンバを有する光学測定キュベット |
| EP3077796B1 (en) | 2013-12-06 | 2024-09-18 | IP Specialists Ltd. | Optical measurements of liquids having free surface |
| US10233481B2 (en) | 2014-12-05 | 2019-03-19 | Bacterioscan Ltd | Multi-sample laser-scatter measurement instrument with incubation feature and systems for using the same |
| US20160161404A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Bacterioscan Ltd | System Using Laser-Scatter Measurement Instrument For Organism Identification And Related Network |
| US10065184B2 (en) | 2014-12-30 | 2018-09-04 | Bacterioscan Ltd. | Pipette having integrated filtration assembly |
| JP2018503842A (ja) | 2015-01-26 | 2018-02-08 | バクテリオスキャン エルティーディー | 回転木馬式流体サンプル配置を呈するレーザ散乱計測器具 |
| US11099121B2 (en) | 2019-02-05 | 2021-08-24 | BacterioScan Inc. | Cuvette device for determining antibacterial susceptibility |
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| JPS62134563A (ja) * | 1985-12-03 | 1987-06-17 | マイルス・インコーポレーテッド | グラム陰性細菌尿症のスクリーニング法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5415797A (en) * | 1977-06-14 | 1979-02-05 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Detection and measurement of toxin in cells |
| FR2497798A1 (fr) * | 1981-01-09 | 1982-07-16 | Pharmindustrie | Nouveaux peptides portant un fluorophore, procede pour leur preparation et leur application au dosage fluorimetrique des endotoxines |
| US4406832A (en) * | 1981-09-03 | 1983-09-27 | Mallinckrodt, Inc. | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin |
| JPS5885162A (ja) * | 1981-11-16 | 1983-05-21 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | エンドトキシン測定法 |
-
1987
- 1987-11-27 GB GB878727796A patent/GB8727796D0/en active Pending
-
1988
- 1988-11-25 EP EP88311208A patent/EP0320154A1/en not_active Withdrawn
- 1988-11-28 JP JP30042088A patent/JPH01201161A/ja active Pending
Patent Citations (3)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0320154A1 (en) | 1989-06-14 |
| GB8727796D0 (en) | 1987-12-31 |
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