JPH01202282A - 酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素は、Ｌ
−ソルボソンの２−ケト−グロン酸（以下、２−ＫＧＡ
と称す）への酸化を触媒する。２−ＫＧＡは、ビタミン
Ｃの製造のための重要な前駆体である。

微生物を用いてＬ−ソルボソンを２−ＫＧＡに変換する
反応は知られている。微生物の無細胞抽出物を用いたＬ
−ソルボソンからの２−ＫＧＡの生産は、いくつかの先
行文献中に報告されている。

米国特許第３，９０７．６３９号において、アセトバク
ター（Ａ　ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、シュウドモナス
（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ニジエリチア（Ｅ　
５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（５６ｒｒａｔｉ
ａ）属、バシラス（１３ａｃｉｌｌｕｓ）属。スタフィ
ロコッカス（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ア
エロバクタ−（Ａ　ｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリ
ゲネス（Ａ　ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ペニシリウム
（Ｐ　ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、カンジダ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ）属およびグルコノバクタ−（Ｇ　１ｕｃｏｎｏ
ｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物は、前記の様な変換を
行ないうろことが報告されている。更に北村等のＥ　ｕ
ｒｏｐ、　Ｊ　。

Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　２　、　　Ｉ　
　（１９７５）は、グルコノバクタ−・メラノゲネス（
Ｇ　Ｉｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓ
）　Ｉ　Ｆ　Ｏ３２９３から発見されたＬ−ソルボソン
酸化酵素が、酵素活性の発現のために補酵素および電子
受容体のいずれも必要としないことを報告している。マ
コーバー（Ｍ　ａｋｏｖｅｒ）等のＢｉｏＬｅｃｈｎｏ
ｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、１７　、　１４８５　（１９７５）
は、シュウドモナス・プチーダ（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　　ｐｕｔｉｄａ）　ＡＴＣＣ２１８１２の特定の
分画中にＬ−ソルボソン脱水素酵素活性か存在している
ことを報告しているが、該Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が
シュウドモナス・プチーダから均質な蛋白質の形態で単
離されたとの報告はない。従って、該酵素の物理化学的
性質は、特定されていなかっＩこ　。

本発明は補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活
性を有する新規な酵素および該酵素の製造方法に関する
。特定の微生物の細胞の細胞膜両分から単離され、精製
された酵素が、Ｌ−ソルボソンの２−ＫＧＡへの酸化に
おいて触媒作用をすることが見出された。本発明は、こ
の知見に基づいて完成されたものである。

本発明の目的は、Ｌ−ソルボソンを２−ＫＧＡに転換す
る補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有
する新規な酵素を提供することに有る。他の目的は、新
規なＬ−ソルボソン脱水素酵素を細胞内で産生し得るシ
ュウドモナス属に属する微生物またはその変異株を培養
し、該酵素を前記細胞から純粋な形で単離することによ
る新規なＬ−ソルボソン脱水素酵素の製造方法を提供す
るこ拳とに有る。この単離は、該細胞の破壊、および破
壊された細胞からの無細胞抽出物、好ましくは微生物の
細胞膜画分からの単離および精製により行なうことがで
きる。

後述する実施例により調製された新規な補酵素非依存型
Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の精製試料の物理化学的性質
は、以下のとおりである。

ｌ）　酵素活性 Ｌ−ソルボソン脱水素酵素、すなわち本発明の酵素は、
電子受容体の存在下におけるＬ−ソルボソンの２−ＫＧ
Ａへの酸化において触媒作用を下記反応式に従ってする
： Ｌ−ソルボース＋電子受容体 ↓ ２−ＫＧＡ　　十還元された電子受容体該酵素は、電子
受容体として酸素を利用しない。

しかしながら、電子受容体として振る舞うことができる
いかなる通常の化合物も、本発明の酵素と共にＬ−ソル
ボソンを２−ＫＧＡに酸化する為に用いることができる
。電子受容体としては、２゜６−シクロロフエノリンド
フエノール（以下、ＤＣＩＰと称す）、フェナジンメソ
サルフェート、ウルスター青、フェリシアン化物、補酵
素Ｑ１チトクロームＣ等を用いることができる。

酵素活性の測定 酵素活性の測定は、２５℃において、ＤＣＩＰの６００
ｎｍにおける吸光度の減少を分光光学的に測定すること
により行なった。１分間当り、１ＬモルのＤＣＩＰの還
元を触媒する酵素量として、酵素活性の１ユニツトを定
義した。ＤＣＩＰのｐＨ７，０における吸光係数は、９
．４５ｍＭ−’を採用した。

基本反応混合物は、０．３％のトライトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）　Ｘ　　Ｉ　ＯＯを含む６ｍＱのＯ，１Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７，０）、０．４５ｍＱの２．５ｍ
ＭＤＣＩＰ及び１０．３５ｍＱの水を混合することによ
り調製した。１ｃｍの光路長を有するキュベツトに、０
．４ｍＱの基本反応混合物、２０μＱの１０ｍＭフエナ
ジンメソサルフエイト、ｌＯμＱの酵素溶液および２０
μＱの１１０ｍＭＬ−ソルボソン溶液を入れた。対照の
キュベツトには、酵素溶液の代わりに１０μＱの水を加
えていることを除き、すべての試薬を入れた。反応は、
基質を添加することにより開始した。

２）　基質特異性 本酵素の基質特異性は、上記ｌ）に記載したと同じ酵素
検定方法において、Ｌ−ソルボソンに替えて種々の基質
溶液（ｌｏｍＭ）を各２０μＱ用いることにより測定し
た。この測定の結果を第１表に示す。本発明の酵素が、
種々のアルデヒド化合物類に作用することが明らかにな
った。

第１表 シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２由来の補
酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の基質特異性 基　　質　　　　　　　　相対活性（％）Ｌ−ソルボソ
ン　　　　　　　１００．０メチルグリオキサール　　
　　２８８．９グリオキサール　　　　　　　１７２．
２グルタルアルデヒド　　　　　１４７．２グリセルア
ルデヒド　　　　　　８８．９グリコールアルデヒド　
　　　　８３．３プロピオンアルデヒド　　　　　６１
．１グリオキシル酸　　　　　　　　５２．８ベンズア
ルデヒド　　　　　　　２７，８アセトアルデヒド　　
　　　　　２２．２Ｌ−イドース　　　　　　　　　　
１９．４Ｄ−マンノース　　　　　　　　　Ｏ Ｄ−フルクトース　　　　　　　　　ＯＤ−グルコース
　　　　　　　　　　ＯＬ−ソルボース　　　　　　　
　　０ ３）　至適ｐＨ 該Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の反応速度とｐＨとの間の
相関をリン酸カリウムおよびトリス−ＨＣ１緩衝液中で
測定した。結果を第２表に示す。

該酵素は、約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲におい
て、最も高い酵素活性を示した。

第２表 シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２の補酵素
非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の至適Ｈ ｐＨ緩衝液（０，１Ｍ）　　相対活性（％）６．０　　
リン酸カリウム　　　　　４４．４６．５　　　　／ｌ
　　　　　　　　　　　　７７．８７、ＯＮ　　　　　
　　　　　　１００．０７．５　　　　　／／　　　　
　　　　　　　　　１１４．０８．０　　　　　／／　
　　　　　　　　　　　　　１００．０８．０　　トリ
ス−ＨＣｌ　　　　　　１００．０８．５　　　　　／
／　　　　　　　　　　　　　　　　８０．６４）　　
ｐＨ安定性 精製された該酵素を種々のｐＨの緩衝液に加え、４℃に
て２４時間装いた。残存活性を、上記１）に記載の標準
測定条件下で測定した。測定結果を第３表に示す。精製
された該酵素は、アルカリ性ｐＨにおいて相対的に安定
であり、酸性度の増大に従って不安定となった。

第３表 シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２の補酵素
非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素のｐＨ安安定木 本Ｈ緩衝液　　　　　相対活性（％） ４．０　　　　酢酸　　　　　　　　３６．８４．５　
　　　　／／　　　　　　　　　　３６．８５．０　　
　　　／／　　　　　　　　　　５７．９５゜５　　　
　　　　／／　　　　　　　　　　　　　　　８１．６
６．０　　　　　　１／　　　　　　　　　　　　　　
　７８．９６．０　　　リン酸カリウム　　　　６８．
４６．５　　　　　／／　　　　　　　　　　　７３．
７７、、Ｏ／／　　　　　　　　　　１００．０７．５
　　　　　／／　　　　　　　　　　　９４．７８．０
　　　　　／／　　　　　　　　　　１０５．３８．０
　　　トリス〜ＨＣＩ　　　　　８９．５８．５　　　
　　／／　　　　　　　　　　　９４．７＊精製された
酵素を表に示したｐＨで２４時間４℃に保ち、残存活性
をｐＨ７，０にて測定し　ｊこ　。

５）　熱安定性 精製された該酵素を種々の温度においてｌｏｍＭのリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中で１０分間処理し、
次いで直ちに氷水にて冷却した。

残存活性を上記ｌ）に記載の標準検定条件下で測定した
。結果を第４表に示す。この酵素は、不安定であって、
３０℃における１０分間の処理によって約２分のＩの活
性を失なった。

第４表 シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２の補酵素
非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の熱安定性本 温度（’Ｃ）　　　　　相対活性（％）４　　　　　　
　１００．０ ２０　　　　　　　　８２．９ ３０　　　　　　　　５４．３ ４０　　　　　　　　４０．０ ５０　　　　　　　　１１．４ ６０　　　　　　　　８・６ 水精製された酵素を表に示した温度で１ｏ分間処理し、
残存活性をｐＨ７，０で測定した。

６）　至適温度 Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の酵素活性を、上記ｌ）に記
載の反応系でＩＯ’ｃから４０’（！までの温度におい
て測定した。結果を第５表に示す。この酵素は、約２０
℃と約４０℃との間の至適温度を示した。

第５表 シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２由来の補
酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の至適温度水 温度（℃）　　　　相対活性（％） １０　　　　　　　　５８．８ １５　　　　　　　　７６．５ ２０　　　　　　　１０３．０ ３５　　　　　　　１１１．８ ４０　　　　　　　１０５．９ ＊該酵素の初期反応速度を比較した。従って、至適温度
は、第一義的にはこの観点から判断する必要がある。

７）　分子量 比活性５１．５ユニツト／　ｍ　ｇ蛋白質を有する精製
された該酵素をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処
理し、サブユニットの分子量を５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析した。該酵素は、分子量４
７．０００±５．０００の単一の均質なサブユニットか
らなることが示されｌこ。

８）　　Ｋｍ値の測定 上記１）に記載の方法において、Ｌ−ソルボソンの種々
の濃度について酸化反応速度を測定し、Ｌ−ソルボソン
についての見掛けのミバエリス定数（Ｋ　ｍ　）を決定
した。Ｋｍ値は、ＤＣＩＰおよびフエナジンメソサルフ
エイトを電子受容体として、１３±２ｍＭと計算された
。

ａ）　金属イオンの影響 上記ｌ）に記載の検定方法を用いて、酵素活性に対する
種々の金属イオンの影響を試験した。測定結果を第６表
に示す。Ｃｕ２＋およびＭ　ｎ　２＋が該酵素を強く阻
害した。

第６表 シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２１７）補
酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素への金属イオン
の影響 金属イオン　濃度（ｍ　Ｍ　）　　相対活性（％）無　
　　　　　　　　０　　　　　　　　　１００．０Ｃｕ
”　　　　０．８　　　　　　０ Ｍｎ”　　　　０．８　　　　　　　ＯＮｉ”　　　　
４．０　　　　　４８．９Ｚｎ”　　　　２．０　　　
　　４８．９Ｃｏ”　　　　０．８　　　　　５７．８
Ｆｅ”　　　　０．８　　　　　６８．９Ｍｏ”　　　
　０．８　　　　　７７．８Ｍｇ”　　　　４．０　　
　　１００．０１０）　　阻害剤の影響 上記ｌ）に記載の検定方法を用いて酵素活性に対する阻
害剤の影響を試験した。結果を第７表に示す。アジ化ナ
トリウムとモノヨウ化酢酸とが酵素活性をわずかに阻害
した。

第７表 シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２の補酵素
非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素への阻害剤の影響 阻害剤　　　濃度（ｍ　Ｍ　）　　相対活性（％）無　
　　　　　　　　　０　　　　　　　　１００．０Ｎａ
Ｎ３　　　　　２５．０　　　　７７．３ＩＣ１１３Ｃ
ＯＯＩＩ　　　　　５　、０　　　　８８　、６１１）
　　補欠分子族 精製した該酵素の吸収スペクトルは、約３５０ｎｍにピ
ークを、また３８０−４２０ｎｍの可視領域に広い肩を
示した。これらの極大吸収値は、ビロロキノリンキノン
（以下ＰＱＱと称す）を補欠分子族とするキノプロティ
ン酵素の特徴である。

１２）　　酵素活性に対するＰＱＱ添加の効果上記ｌ）
に記載の検定方法を用いて酵素活性に対するＰＱＱ添加
の効果を試験した。結果を第８表に示す。ＰＱＱの添加
により顕著な酵素活性の上昇が観察された。

第８表 シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２の補酵素
非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性に対するＰＱ
Ｑ添加の効果 ＰＱＱ濃度（μＭ）　相対酵素活性（％）Ｏ１００ ０，１１０６ ０，２１４２ ０，５１５０ ０，９１５８ ６，０１７４ １５，０１９２ １３）　精製方法 補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の精製は、公
知・の方法により、更にはイオン交換クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、ゲル−口過、ゲル−電気
泳動、塩析、透析などのそれぞれ公知の方法の組合せに
より行なうことができる。

本発明により提供される補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン
脱水素酵素は、適当な微生物を培養し、細胞を破壊し、
破壊した細胞の無細胞抽出物、好ましくは微生物の膜画
分から単離、精製することにより調製することができる
。

本発明において用いられる微生物は、シュウドモナス属
に属する微生物またはその変異株、好ましくはシュウド
モナス・プチーダである。

本発明において用いられるシュウドモナス属に属する微
生物は、天然から単離することができ、また微生物寄託
機関（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）から
入手可能である。それらから誘導された変異株もまた本
発明において用いることができる。

本発明に使用される変異株は、野生株を紫外線照射、Ｘ
線照射、γ線照射、または亜硝酸もしくは他の適当な突
然変異原との接触等の変異誘発要因によって地理するこ
とにより、または自然的突然変異により生ずるクローン
を単離することによって得ることができる。これらの野
生株またはその変異株の突然変異は、その目的のために
それ自体当業者によく知られたいずれの方法によっても
起こすことができる。これらの方法の多くは、例えば“
化学的変異原゛′田島、吉田および賀田編、講談社すイ
エンス社（東京、日本）１９７３年発行などの種々の出
版物が記載されている。

本発明に最も好適に使用される菌株の例は、シュウドモ
ナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２およびその類似物で
ある。シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１２は
、アメリカン　タイプカルチャー　コレクション（Ａ　
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ　ｙｐｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ）　　（１２３０１パークローン　ドライ
ブ、ロツクヴイル、メリーランド２０８５２、米国（Ｐ
ａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、
　Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　）
より入手可能である。

該微生物は、適当な栄養源が供給された液体培地中で好
気性条件下にて培養できる。培養は、４゜０から約８．
０、好ましくは５．５から７．５のｐＨにて行なうこと
ができる。培養時間は栄養培地に依存するが、好ましく
は約１０から１００時間である。培養を行なう好ましい
温度範囲は、約１０℃から４０℃１好ましくは２５℃か
ら３５℃である。

る。

培地は、通常、栄養源、例えばグリセロール、Ｄ−マン
ニトール、Ｄ−ソルビトール、エリスリトール、リビト
ール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、ヅ
ルシトール、Ｄ−リポース、Ｄ−７ラクトース、Ｄ−７
コース、Ｄ−グルコース、グルコン酸塩、マルトースお
よびシュクロース、好ましくは、Ｄ−ソルビトールまた
はグリセロールなどの同化し得る炭素源；例えばペプト
ン、酵母抽出物、ソイビーンミールおよびコーンスチー
ブリカーなどの有機物質ならびに例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸カリウムなどの無機物質等
の消化可能な窒素源；ビタミン類ならびに微量元素を含
むことが必要である。

以下に、培養後の微生物からＬ−ソルボソン脱水素酵素
を単離、精製する態様の概略を記載する。

（１）　細胞を発酵液から遠心分離により収集する。

（２）　細胞を緩衝溶液中に懸濁させ、ホモジナイザー
、超音波発振器またはリゾチームによる処理等の方法に
よって細胞を破壊し、細胞の破壊溶液を得る。

（３）　Ｌ−ソルボソン脱水素酵素を、破壊された細胞
の無細胞抽出物、好ましくは微生物の細胞膜両分から単
離し、精製する。

本発明により与えられるＬ−ソルボソン脱水素酵素は、
Ｌ−ソルボソンから２−ＫＧＡを生成させるための触媒
として有用である。該反応は、約５から約１０までのｐ
Ｈ値において、例えばＤＣＩＰ、フエナジンメソサルフ
エイト、ウルスター青、フェリシアン化物、補酵素Ｑ１
チトクロームＣなどの電子受容体の存在下で、リン酸緩
衝液、トリス−ＭＣＩ緩衝液等の溶媒中にて行なわれる
。

反応を行なわせるために好ましい温度範囲は、約ｌＯ℃
から約５０℃である。ｐＨおよび温度を、それぞれ約７
．０−８．０および３０℃に設定した場合に、通常反応
は最良の結果をもたらす。

溶媒中のＬ−ソルボソンの濃度は、他の反応条件に依存
して変化するが、一般的には約１０−１００ｇ／Ｌ、最
も好ましくは約３０−４０ｇ／Ｌであることが必要であ
る。

反応において、該酵素は、適当な担体に固定化させた状
態でも使用することができる。この分野において一般に
知られているいかなる酵素の固定化手段を用いてもよい
。例えば酵素を、反応性の基を有するレジンの膜または
顆粒等に直接に結合してもよく、また、例えばゲルター
ルアルデヒド等の双反応性基を有する架橋化合物を介し
てレジンに結合させてもよい。

以下の実施例は、本発明を示すものである。

実施例１ Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の精製 （１）　　シュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８１
２の培養 シュウドモナス・プチーダの寒天斜面培養物を、５ｍＱ
の培地を含む試験管に植菌し３０℃で２日間、試験管振
盪機上で（２８Ｏｒ　、ｐ　、ｍ、）培養した。該培地
は、グリセロール７０ｇ／Ｑ、酵母エキス（オリエンタ
ル社製）１５ｇ／（２，及びＭｇ５Ｏ，・７　Ｈ２Ｏ２
，５ｇ／Ｑを含有する。２ｍＱの本培養物を１００ｍα
の同培地を含む５００ｍＱの三角フラスコに接種し３０
℃で、２０時間、回転振盪機上（１ｇ　Ｏｒ、ｐ、ｍ、
）で培養した。

このようにして得られた培養物４００ｍＱを、２０Ｑの
同培地を含む３０Ｑの発酵槽に接種した。

発酵槽は、３０℃１２５０ｒ、ｐ、ｍ、で撹拌し２００
．７分で通気した。４０時間培養後、培養物を遠心分離
（８，ＯＯＯｒ、ｐ、ｍ、、１０．０００ｘｇ）Ｌ、菌
体を採取した。２０Ｑの培養液から、９２０ｇ　（湿重
量）の菌体が得られた。該菌体は、使用するまで一２０
℃で凍結した。

（２）　膜画分の調製 シュウドモナス・プチーダの凍結菌体（７６０ｇＸ湿重
量）を融解し、３．８００ｍＱの０．８５％の食塩水に
懸濁した。ついで、細胞懸濁液をダイノミル細胞破砕器
（ウィリー　Ａ、バチヨウ７工ン社、バーゼル）により
ガラスピーズ（直径０゜ｌ　ｍｍ）存在下に４℃にて、
２，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ。

で４分間破砕した。このようにして調製した破砕液を１
，８００ｘｇにて１０分間遠心し細胞残渣およびガラス
ピーズを除去した。得られた上清を８０．０００ｘｇに
て遠心し、沈殿物を膜画分として集めた（２６６　ｇ）
。

（３）　Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の膜画分からの溶出 該膜画分（２６６ｇ、湿重量）を１．ｌｏｏｍｆｆの１
％トライトンＸ−１００を含む５０ｍＭ燐酸カリ緩衝液
、ｐＨ７，０、に、懸濁し、１５時間撹拌した後、８０
，０００ｘｇで１時間、遠心分離し上清を得た。得られ
た上清を２０Ｑの０．１％トライトンＸ−１００を含有
する１０ｍＭ燐酸カリ緩衝液、ｐＨ７，０、に透析後、
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ　（７アルマシア・
ファイン・ケミカルズ）カラムクロマトグラフィーに供
し　Ｉこ　。

（４）　　ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムク
ロマトグラフィー（１） 上記透析済上清を、あらかじめ（３）に記したと同様の
緩衝液にて平衡化しておいたＤＥＡＥ−セファロースＣ
Ｌ−６Ｂカラム（直径３．８、長さ３０ｃｍ）にかけた
。同様の緩衝液で、カラム、を洗浄したのち、該酵素を
食塩濃度を０．５Ｍまでにした直線濃度勾配により溶出
した。

（５）　　ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムク
ロマトグラフィー（ＩＩ） 前記工程で得られた活性画分を合し、（３）に記したと
同様の緩衝液に、１５時間透析し、次に、同じ緩衝液で
平衡化しておいたＤＥＡＥ−セファロース（ジエチルア
ミノエチル−アガロース）カラム（直径２．５、長さ２
５ｃｍ）にかけた。同様の緩衝液で、カラムを洗浄した
のち、該酵素を食塩濃度を０．３Ｍまでにした直線濃度
勾配により溶出した。

（６）　　ＤＥＡＥ　（ジエチルアミンエチル−ポリビ
ニル　タイプ）−トヨパール６５０ｓ　（東洋ソーダ社
製）カラムクロマトグラフィー 前記工程で得られた活性画分を合し、（３）に記したと
同様の緩衝液に、１５時間透析し、次に、同じ緩衝液で
平衡化しておいたＤＥＡＥ−）ヨパール６５０ｓ　（直
径２．０、長さ２０ｃｍ）にかけた。同様の緩衝液でカ
ラムを洗浄した後、該酵素を食塩濃度０．１Ｍまでにし
た直線濃度勾配により溶出した。

（７）　ハイドロキシアパタイトＨＣＡ１００Ｓ（三井
東圧社製）カラムクロマトグラフィー前記工程で得られ
た活性画分を合し、０．１％トライトンＸ−１００を含
有する１ｍＭ燐酸カリ緩衝液（ｐＨ７，０）に１５時間
透析し、次に同様の緩衝液で平衡化しておいたハイドロ
キシアパタイトＨＣＡ　ｌ　００５カラム（直径２．０
、長さ１０ｃｍ）にかけた。該酵素は、同一の緩衝液で
溶出された。

（８）　　ＴＳＫ−ゲル（ポリビニル　タイプ）トヨパ
ールＨＷ６０ｓ（東洋ソーダ社製）カラムクロマトグラ
フィーＩおよび■ 前記工程で得られた活性画分を合し、メンブランフィル
タ−（ダイア７０−ＰＭ−３０、アミコン、；ポリスル
フォン　タイプ；分画分子量＝３０゜０００以下）少量
になるまで濃縮した。ついで、本濃縮液をＴＳＫ−ゲル
　トヨパールＨＷ６０ｓ（直径１．５、長さ８０ｃｍ）
カラムにかけた。

緩衝液としては、０．１％トライトンＸ−１００を含有
する１０ｍＭ燐酸カリ緩衝液、ｐＨ７，０を用いた。カ
ラムは同一の緩衝液で展開した。活性画分を合して濃縮
し、再び同一のカラムにて展開しに。

Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の精製工程の概要を第９表に
示した。

（９）　電気泳動による分析 ５１．５ユニット／ｍｇ蛋白質の比活性を有する精製さ
れた酵素をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理し、
５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により、本酵素
の精製度を分析した。その結果、本酵素は、分利１４７
，０００±５，０００からなる単一で均一なサブユニッ
トからなることが明らかとなった。

（１０）　　反応生成物の同定 Ｑ、４ｍＱの精製酵素液、０．０５ｍ（２の０．５Ｍ燐
酸カリ緩衝液（ｐＨ７，０）、０．０５ｍαの０．５Ｍ
Ｌ−ソルボソン溶液および０．０２ｍ（２の０．２Ｍフ
エナジンメソサルフエイト溶液からなる反応混合液を２
０℃で６０分間保温した。反応生成物は、薄層クロマト
グラフィーおよび高分解能液体クロマトグラフィーによ
り分析した。その結果、生成物は２−ケト−Ｌ−グロン
酸であることが、対照試料との比較で明らかになった。

第９表 シュウドモナス・プチーダからのＬ−ソルボソン脱水素
酵素の精製可溶性画分　　　　　　６．９００　　　２
０４．２５　　　０．０３　　　１００実施例２ 前記の実施例１の工程（１）から（８）に記載したと同
様の方法によって調製した精製されだ補酵素非依存型Ｌ
−ソルボソン脱水素酵素（全活性、２０６ユニツト）５
ｍＱと、Ｉｎ（２の０．５Ｍ燐酸カリ緩衝液（ｐＨ７，
０）と、１ｍＱのＩＭ　Ｌ−ソルボソン溶液、０．２−
ｍＱの０．２Ｍフエナジンメソサルフエイト溶液および
２．８ｍＱの水からなる反応混合液を、ゆるやかに撹拌
しながら保温した。その結果、２−ＫＧＡは、３５０Ｍ
Ｇ／時間の割合で生成した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、均質な蛋白質としてのＬ−ソルボソン脱水素酵素。 ２、Ｌ−ソルボソンに作用して２−ケト−Ｌ−グロン酸
   を生成し、好ましくはシュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
   ｏｎａｓ）属に属する微生物に由来する、新規な補酵素
   非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素。 ３、以下の理化学的性質 ａ）補欠分子族：ビロロキノリンキノン ｂ）至適ｐＨ：約７−約８ ｃ）至適温度：約２０℃−約４０℃ ｄ）分子構造：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動による測定において４７，０００±５
   ，０００の分子量を有する単一の均質なサブユニットか
   らなる ｅ）温度安定性：約３０℃より高い温度で不安定 ｆ）阻害：Ｃｕ＾２＾＋およびＭｎ＾２＾＋のイオンに
   より阻害される を有する、シュウドモナス属に属する微生物由来の請求
   項２記載の脱水素酵素。 ４、シュウドモナス・プチーダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
   ｓｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ２１８１２またはその変異株
   の膜結合型酵素である請求項３記載の補酵素非依存型Ｌ
   −ソルボソン脱水素酵素。 ５、新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素を
   細胞内で産生し得るシュウドモナス属に属する微生物ま
   たはその変異株を培地中で培養し、細胞を破壊し、破壊
   した細胞の無細胞抽出物、好ましくは微生物の膜画分か
   ら単離し、精製することを特徴とする新規補酵素非依存
   型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の製造方法。 ６、微生物がシュウドモナス・プチーダＡＴＣＣ２１８
   １２またはその変異株である請求項５記載の製造方法。 ７、Ｌ−ソルボソンを触媒の存在下で酸化することから
   なり、該触媒が請求項２記載のＬ−ソルボソン脱水素酵
   素活性を有する酵素であることを特徴とする２−ケト−
   Ｌ−グロン酸の製造方法。 ８、２−ケトグロン酸の微生物的製造における請求項２
   記載の酵素の使用。