JPS62294082A - 酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 本発明は、ＭｊｉＪ、なＬ−ソルボソン脱水素Ｎ、素お
よびその製造方法に関するものである。

本発明によって提供されるＬ−ソルボソン脱水素酵素は
、補酵素としてニコチンアミド７デニンジヌクレオチド
（以下、ＮＡＤと称す）またはニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド燐酸（以下、ＮＡＤＰと称す）の存在下
、Ｌ−ソルボソンの２−ケトーＬ−クロン酸（以下、２
−ＫＧＡと称す）への酸化を触媒する。２−ＫＧＡは、
ビタミンＣの製造に重要な前駆体である。

微生物中において、Ｌ−ソルボソンを２−ＫＧＡへ変換
させる反応は、知られている。微生物の無細胞抽出物を
使用してのし一ンルボソンから２−ＫＧＡ・＼の産生は
、種々の文献に報告されている。米国特許第３，９０７
．６３９号公報には、アセトバクター（Ａ　ｃｅＬｏｂ
ａｃＬｃｒ）属、シュードモナス（Ｐ　ｓｃｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）ｉ、エシェリキア（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ
）属、セラチア（Ｓ　ｅｒｒａｔｉａ）属、バシラス（
ＢａｃｉｌｌｕＳ）属、スタフイａコツカス（Ｓ　Ｌａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｉ　ｓアエロバクタ−（Ａｅ
ｒｏｂａｃＬｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａ　Ｉｃａｌ
ｉＨｅｎｅｓ）ｆｉ、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕ口）族、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属およびグル
コノバクタ−（Ｇ　Ｉｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属に属
する全生物は、前記の様な変換を行ないうろことが報告
されている。

北村等は、グルコ／バクター・７２ノデネス（Ｇｌｕｃ
ｏｎｏｂａｃｔｅｒ　　ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓ）　Ｉ
　Ｆ　Ｏ３２９３から発見したＬ−ソルボソン酸化６Ｆ
索は、酵素活性の発現のために電子受容体および補酵素
のいずれをも必要としないことを報告した（ヨーロピア
ン・ジャーナル・オプー７プライド・マイクロパイオロ
ノー、２、第１バ、１９７５年＊Ｅｕｒｏｐ、　　Ｊ。

Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２．１．１９７
５、更に、マフ−バー（Ｍａｋｏｖｅｒ）等は、シュー
ドモナス・ピュチダ（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　　ｐｕ
ｔｉｄａ）ＡＴＣＣ２１８１２およびグルコ７パクター
メラノデネスＩＦＯ３２９３のある分画中にＬ−ソルボ
ソン脱水素酵素が存在していることを報告した（バイオ
テクノロジー・アンド・バイオエンノニアリング１７、
第１４８５頁、１９７５年：　Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｏｌ
、　Ｂ　ｉｏｅｎｇ。

１７．１４８５．１９７５）。前記著書等は、ニコチン
アミド７デニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド燐酸は、その酵素の補酵素として
作用しなかったことをも指摘した。

しかし上述した様に、補酵素としてＮＡＤまたはＮＡＤ
Ｐの存在下、Ｌ−ソルボソンを２−ＫＧＡに酸化する活
性を有するｖｉ製された酵素に関する開示は今迄になさ
れていない。

本発明は、特定の微生物の細胞の細胞質画分かち単離お
よび精製された酵素がＬ−ソルボソンの２−ＫＧＡへの
酸化を触媒することを見出して完成されたものである。

本発明の目的は、補ｌＪ素としてＮＡＤまたはＮ、％ｒ
ｌ　Ｄ　／Ａ　左プｒ　’ｒ　　７　１／　１１−７１
７　％／　Ｍ　９−　Ｖ　／’！　Ａ　／。

の酸化を触媒する新規なＬ−ソルボソン脱水素酵素を提
供することに有る。また、他の目的は、細胞内にｆｒ規
なＬ−ソルボソン脱水素＃素産生能を有し、グルコノバ
クタ−属に属する全生物またはその変異株を＃ｊ！！Ｌ
、細胞を破壊し、更に破壊した細胞の無細胞抽出物、好
ましくは微生物の細胞質からＩ、−ンルボンン脱水素Ｉ
ｇ素を単離および精製することを特徴とする新規なし一
ンルボソン脱水素酵素の製造方法を提供することに有る
。

後述する実施例で得られた新規な■、−ソルボソン脱水
素酵素の精製試料の物理化学的性質は、以下の通りであ
る。

（１）酵素活性 本発明のＬ−ソルボソン脱水素酵素は、補酵素としてＮ
ＡＤまたはＮＡＤＰの存在下にＬ−ソルボソンを２−Ｋ
ＧＡに変換する反応を触媒する反応様式は、次に示す通
りである。

■、−ソルボソン＋ＮＤＡまたはＮ　Ａ　Ｄ　Ｉ）−１
２−ＫＧＡ十還元型ＮＡＤまたはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ−酵素
活性の測定− 酵素活性は、３４０ｎｍにおける還元型Ｎ　Ａ　Ｄまた
はＮＡＤＰの吸光度の上昇を測定することにより求めら
れる。反応液は、５０ａ＋Ｍリン酸カリウム４１衡溶液
（ρ）１７．０’）０．４１ｓ＋Ｉ中に、ｌｌ１ｇのソ
ルボソン、０　、２　ｍｇのＮＡＤとを含み、反応は、
酵素の添加によって開始させた。還元型ＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰの生成速度は、スペクトロフォトメーター（エビ
コン８１０、コントロン社製）により３０℃で測定した
。３０℃で１分１Ｉｌｓす、１μＭの還元型ＮＡＤまた
はＮＡＤＰを生成するのに要する酵素量を１ユニツトと
した。

一袖醇索の要求性− 上記した標準測定条件を坩い、本酵素活性発現の為に要
するｉ酵素の要求性を調べた。ｆｊＳ１表に示す通り、
ＮＡＤもＮＡＤＰら本８素の罰ＩＪ索となり得た。

乳１遣４ 無添加　　　　　　　　　　　０ ＮＡＤ　　　　　　　　　　１００ ＮＡＤＰ　　　　　　　　　　３５　７本　ＮＡＤに対
する活性を１００として表示■）　基質特異性 本酵素の基質特異性は、（１）に記載した活性測定法の
うち、基質であるソルボソンを第２表に示す種々の物質
に置きかえて、反応させた。第２Ｒの結果に示されるよ
うに、Ｌ−ソルボソンは、本酵素に対し、最も高い活性
を示した。グリオキサール、グリコールアルデヒド、グ
ルタルアルデヒド、ピロピオンアルデヒド、メナルグリ
オキサール、アセトアルデヒドならびにローマンノース
に対し、酸化活性を示した。

第」」１ Ｌ−ソルボソン　　　　　　　　　　１００グリオキサ
ール　　　　　　　　　　３３，３グリコールアルデヒ
ド　　　　　　　２３．３グルタルアルデヒド　　　　
　　　　１６．７プロピオン７ルデヒド　　　　　　　
１３．３メチルグリオキサール　　　　　　　１０．０
７七トアルデヒド　　　　　　　　　　８．ＯＤ−マン
ノース　　　　　　　　　　　４．９、ベンズアルデヒ
ド　　　　　　　　　　ＯグリオキシｔｔｔＯ ゲルコール酸　　　　　　　　　　　　　ＯＤ−グルコ
ロン　　　　　　　　　　　ＯＤ−フルクトース　　　
　　　　　　　　ＯＤ−グルコース　　　　　　　　　
　　ＯＬ−ソルボース　　　　　　　　　　　Ｏノヒド
ロキシアセトン　　　　　　　　Ｏヒドロキシピルビン
酸　　　　　　　　Ｏて表示 ■　至適ｐＨ 種々のｐｈのリン酸カリウムａｍ溶液と、アンモニフム
緩衝溶液とを用い、精製酵素のＬ−ソルボソン説水素＃
素活性と、その活性に及ぼすｐＨの影響を調べ、その結
果をｔＩＳ３表に示した０本酵素は、ｐＨ約９．０で最
も高い活性を示した６ＬＬ ８．０　９＞Ｆｌｌｈ’）７ムｔＮｌｌｒｆｆｉＨ３’
４．７６．５　　　　　　　　　　　　　　　７１．４
７．０　　　　　　　　　　　　　　１００，０７・５
　　　　　　　　　　　　　　１６３．３８．０　　　
　　　　　　　　　　　２６９．４８、ＯＮＨ４０１＋
／ＮＨ４Ｃｌ、ｔｌｉ溶液　　　９３．９９．０　　　
　　　　　　　　　　　３２６，５１０．０　　　　　
　　　　　　　　　　　　、　一本　ｐＨ７，０におけ
ろ活性を１００として表示（４）ｐＨ安定性 精！Ｊ／ｊ￥索を、種々のｐＨのマツキルベーン緩衝溶
液（０，１Ｍクエン酸および０．２Ｍリン酸二ナトリウ
ムの混合物）に添加し、４℃で２４時間放置した。残存
活性を上記０）に示した探ｎＡ測定条件下で測定した。

測定結果を第４表に示した。精製酵素は、ｐＨ６，０−
８，０で比較的安定であった。

１１に ４　　　　　　　　　６１．６ ５　　　　　　　　　７６．８ ６　　　　　　　　　８８．９ ８　　　　　　　　　９４．９ 本　ｐＨ７における活性を１００として表示（５）熱安
定性 Ｎ９Ｉ酵索を１ｍＭリン酸カリ９ムａｍ溶液中に、種々
の温度で１０分間処理した後、直ちに氷水で冷却した。

残存活性を、上記（１）に示した標準測定条件下で測定
した。測定結果を第５表に示した。

精製酵素は、５０°Ｃまで安定であり、６０℃では、約
８０％の活性を失った。

１１表 ２０℃　１０号　　　　　１００ ３０　　　　ＩＩ　　　　　　　　９６．４４０　　　
７　　　　　　　９２．９ ５　Ｑ　　　　ｉｔ　　　　　　　　８２　、１６０　
　　　ＩＩ　　　　　　　　２１．４本　２０℃におけ
る活性を１００として表示（６）　　至適温度 Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の酵素活性を、Ｊユ記（１）
に示した標準測定条件下、２５℃−６０℃の温度で測定
した。得られた結果をＭＳ６表に示した。

本発明の酵素の活性は、６０℃まで温度の上昇と共に上
昇した。

第」」【 ２５　　　　　　　　　　　　　　６２．５京　３０℃
における活性を１００として表示σ）分子量 ＃素溶液を、ｌＯ＋Ｍリン酸カリウム援衝溶液（ｐＨ７
，０で平衡化したＴＳＫ−デルＧ４０００ＳＷ（東洋ソ
ーブ社製）高速液体クロマトグラフィーにかけ、同一の
緩衝溶液で展開した。１９０゜０００±２０．０００１
．：［当する画分に酵素活性が見出された。

（８）　　ミカエリス定ＷＬ（Ｋ１６）の測定標準測定
条件下に大過剰のＬ−ソルボソンの存在下、種々のＮ　
Ａ　ＤまたはＮＡＤＰ濃度に対する酸化速度の測定し、
Ｋｍ定数を決定した。その結果、ＮＡＤとＮＡＤＰに対
するにｍ定数は、それぞれ４．５５　Ｘ　１０″″ＳＭ
および１．６０Ｘ１０−５Ｍであった。

（９）金属イオンの影響 先に述べた測定方法を用い、酵素活性に及ぼす種々の金
属イオンの影響を調べた。得られた結果を第７表に示し
た。　Ｍｇ２＋とＦｅ２＋は、酵素活性を促進するが、
Ｃｕ”＋は阻害した。

第どし人− 無添加　　　　　　　　　　　　　１００Ｍｇ”　　　
　　　　　１０　　　　　　１１３Ｆ’ｅ”　　　　　
　　　　１　　　　　　１１６Ｍｏ”　　　　　　　　
　　　　　１０　　　　　　　　　　　９６Ｃｕ”　　
　　　　　　　０．１　　　　　　０−＊　無添加の場
合の活性を１００として表示（１０）阻害剤の影響 先に述べた測定方法を用い、＃素話性に及ぼす種々の阻
害剤の影響を調べた。得られた結果を第８表に示した。

Ｎ−エチルマレイミドは、強く酵素活性を阻害した。

１１炎 Ｎ−エチルマレイミド　　　１０ Ｈａ−モノヨード酢酸　　　　５　　　　　５７．７ナ
トリウムアノド　　　　５　　　１００ヂチオトレイト
ール　　　５　　　１１９．２無添　　　　　　　　　
　−１００ 本　無添加の場合の活性を１００として表示（１１）精
製方法 ■、−ンルボソン脱水素＃素は、通常の＃素Ｍ製の為に
用いられる方法、例えば、インオン交換クロマトグラフ
ィー、液体クロマトグラフィー、デル濾過、ゲル電気泳
動、塩析、透析等の方法およびそれらの組合わせにより
精製することができる。

本発明により提供されるＬ−ソルボソン脱水素酵素は、
適当な微生物を培養し、細胞を破壊し、破壊した細胞の
無細胞抽出物、好ましくは微生物の細胞質から分離およ
び精製することにより調製することができる。

本発明において使用する微生物は、グルコノバクタ−属
に属する微生物またはその変異株である。

最新の分類に例えば、グルコノバクタ−に属する全ての
菌株は、グルコノバクタ−・オキシダンス種に帰属する
。グルコ／バクター・オキシダンスに属する菌株の形！
＠学的および生物学的Ｖｆ徴は、パーノイズ・マニュア
ル・オブ・システマチック・バクテリオロジ−（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆＳ　ｙｓＬｅｍａ
ｔｉｃ　　　Ｂ　ｎｃｔｅｒｉｏｌｏＢｙ）Ｖ　ｏｌ、
　　　Ｉ　　％　ＰＩＳ　２７５頁−第２７８頁、１９
８４年およびエフ・ボッセル（Ｆ”、　Ｇｏｓｓｅｌｅ
）等、インターナショナル・ジャーナル・オブ・システ
マチック・バクテリオロシー（１ｎｔｅｒｎａＬｉｏｎ
ａｌ　　Ｊ　、　Ｓ　ｙｓｔｅｍ＋Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、　Ｖｏｌ、　３３、第６５頁−第８１頁、１９８３
年に記載されて・する。

本発明において使用するグルコノバクタ−属に属する微
生物は、自然界から単離することがでさ、また寄託機関
から入手可詣である。また、それから誘導された変異株
も本発明において使用することがでさる。

本発明において使用される変異株は、野性味を紫外線照
射、Ｘ線照射もしくはγ線照射するか、または亜硝酸塩
もしくは他の適当な突然変異原と接触させることにより
、または自然的突然変異により生ずるクローンを単離す
ることにより得ることができる。これらの野性味または
その突然変異株の突然変異は、その目的のためにそれ自
体当業者に良く知られたいずれの方法によっても起すこ
とができる。これらの方法の多くは、例えば、出島、吉
日および賀田編、講談社すイエンス社１９７３年発行の
“化学的変異原”等の種々の出版物に記＠されている。

本発明における突然変異株は、グルコノバクタ−・オキ
シダンス種に属する菌株の細胞融合および変Ｘ４誘発お
よび／または細胞融合との組合せによっても得ることが
できる。

本発明において最も好ましい菌株は、グルコツノずフタ
−・オキシダンスＵＶ−１０，グルコ／バクター・オキ
シダンスＥ−１、グルコノバクタ−・オキシダンスＨ−
２、グルコノバクタ−・オキシダンスｌ、−８等である
。これらの菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
それぞれ下記の受託番号のもとに寄託されている。なお
、下記微生物の国内寄託は、昭和６２年１月２９日付で
ブタベスト条約に基づく国際寄託に移管され、それぞれ
下記の受託番号が付されている。

グルコノバクタ−・オキシダンスｕｓ−ｉ　ｏ：ｒ微工
研菌寄ＰｔｒＪ８４２２号Ｊ（ＦＥＲＮ−ＰＮｏ、８４
２２）、 ［電工研究条寄ｔｔＳ１２６７号Ｊ（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１２６７） グルコノバクタ−・オキシダンスＥ−１：「微工研薗寄
第８３５３号Ｊ（Ｆ″ＥＲＭ−ＰＮｏ、８３５３）、・ ［微工研条寄第１２６５号Ｊ（ＦＥＲＭ　　ＢＰグルコ
ノバクタ−ΦオキシグンスＨ−２：「徽工研菌、寄第８
３５４号Ｊ（ＦＥＲＭ−ＰＮｏ、８３５４）、 「機工研条寄第１２６６号Ｊ（ＦＥＲＭ−ＢＰグルコノ
バクタ−・オキシダンスＬ−８「機工げ菌寄第８３５５
号Ｊ（ＦＥＲＭ−ＰＮｏ、８３５５）、 ［徽工研条寄第１２６８号Ｊ（ＦＥＲＭＢＰ微生物は、
好気的条件下、適当な栄養源を補った液体培地中で培養
することができる。培養は、ｐＨ４，０−約８．０、好
ましくは、ｐＨ４，５−６゜５で行なうことができる培
養時間は、使用する微生物および栄芸培地によって種々
外なるが、好ましくは、約１０−１００時間である。培
養を行なうのに好適な温度範囲は、約１０℃−４０℃、
好ましくは、２５℃−３５℃である。

培地は通常、同化し得る炭素源、例えば、グリセリン、
Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、エリトリトール
、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノシト
ール、とルシトール、Ｄ−リボース、Ｄ−フルクトース
、Ｄ−７コース、Ｄ−グルコース、グルコン酸塩、Ｌ−
ソルボース、マルトースおよびスクロース、好ましくは
、Ｌ−ソルボース、Ｄ−ソルビトールまたはグリセリン
；消火可能な窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、
大豆粉およびコーンスチープリカー等の有機物質、例え
ば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび硝酸カ
リ等の無機物質；ビタミン類および微量元素類等の栄１
！源を含む必要が有る。

培養後、微生物からＬ−ソルボソン脱水素＃素を単離お
よび精製するための一失施態様を、以下簡単に記述する
。

（１）　　遠心分離によって、培１！液から細胞を採取
する。

（２）　　ｉ留水、生理食塩水または適当なｐＨを有す
る緩（［溶液で採取した細胞を洗浄する。

■　洗浄した細胞を緩衝溶液に懸濁させ、ホモジナイザ
ー、履音波処理器またはリゾチーム処理等により破壊し
、細胞の破壊溶液を得る。

（４）破壊した細胞の無細胞抽出物、好ましくは微生物
の細胞質分画からＬ−ソルボソン脱水素＃素を単離およ
び精製する。

本発明によって提供されるＬ−ソルボソン脱水素酵素は
、Ｌ・−ソルボソンから２−　Ｋ　Ｇ　Ａを生産するた
めの触媒として有用である１反応は、ＮＡＤ＊たはＮＡ
ＤＰの存在下、リン酸カリウム緩衝溶液、アンモニウム
緩衝溶液等の溶液中、約５゜０−約１０．０のｐ）（値
において行なわせなければならない。反応を行わせるの
に好ましい温度範囲は、約２０℃−約７０℃である。９
Ｈおよび温度を、それぞれｐＨ約８．０−９．０お上び
６０°Ｃに設定した場合、反応は最も好ましい結果をも
たらす、溶液中のＬ−ソルボソンの濃度は、他の反応条
件によって種々外なるが、一般的には、約１０−１００
ｇ／ｊｔが好ましく、約３０−４０ｇ／が最も好ましい
。

反応において、酵素は、適当な担体で固定化した状態で
使用することもでさる。一般に知られでいる＃索固定の
いかなる手段も使用することができる０例えば、官能基
を有する樹脂の膜、微粒等に＃素を直接結合させてもよ
く、またはゲルタルクアルデヒド等の二官能基を有する
橋状化合物を介してｆｌｌｆｆｌに結合させてもよい。

以下、実施例により本発明を説明する。

実施例Ｉ Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の調製 （１）　　グルコノバクタ−φオキシグンスＬＪＶ−１
０（徽工研条寄第１２６７号）の培養 グルフッバクター・オキシダンスＵＶ−１０（徽工研条
寄第１２６７号）の寒天斜面培養物を、Ｎｏ。

３Ｂ培地５１を含む試験管に植菌し、２７°Ｃで３日間
、往復振盪機上で培養した。該培地は、Ｌ−ソルボース
７．０％、グリセリン０．０５％、酵母エキス（オリエ
ント社製）１．５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，
２５％お上りＣａ　ＣＯｙ　１　、０％を含有する。培
養物１偽Ｉを前記と同一の培地５０ｊ１を含む５００１
三角フラスコに＃Ｃ種し、３０℃で３日間、回転浸透椴
上（１８０ｒ、ｐ、ｍ、）で培養した。

得られた培養物８００１を、Ｎｏ、３Ｂ培地２０！を含
む３０１の発酵槽に接種した６発酵槽を、３０℃、４０
０　ｒ、ｐ、＋ａ、で攪拌し、１　ｖ、ｖ、ｍ、（＝空
気の容量／培地の容量７分）で通気した。４０時団培＊
ａ、菌体な集めるために培養物を採取した。

ｊＨ１液を、１　、５００　ｒ、ｐ、ｍ、（３６５Ｘｇ
）で１０分間遠心し、炭酸カルシウムを除去し、更に、
８゜０００　ｒ、ｐ、ｍ、（１０，０００Ｘｇ）で遠心
し、菌体な得た。得られた菌体の固まりを、０．８５％
の生理食塩水で１回洗浄した。この様にして、培１！液
２０１から湿潤菌体３７４ｇを得た。

（２）　　細胞質画分のａ製 前記工程（１）で得られたグルコノバクタ−・オキシダ
ンスの面体９４ｇを、生理食塩水で２回洗浄した。洗浄
した菌体を、１０＋ｓＭリン酸カリウム緩衝溶液４７０
１に懸濁し、ガラスピーズ（０，１−φ）を入れたグイ
ノミル（ウィリーエイ、パツコ７エン社製＞ｍ体破砕機
を用い、２，０００ｒ、ｐｏｍ。

で４分間処理し、破砕した。４．０００ｒ、ｐ、載（１
゜８００　Ｘｇ）で１０分間遠心し、生菌体を除去した
後、無細胞抽出液を、４０．０００　ｒ、ｐ、ｓ＋、（
８０ｅｏ　ｏ　ｏ　Ｘｇ）で１時間遠心した。得られた
上澄み液を、細胞質画分（４７０ｍ１）として集めた。

（３）　　ジエチルアミ／エチルセルロースＣｌ−６Ｂ
カラムクロマトグラフイー 全ての操作は、４℃で行なった。グルコノバクタ−・オ
キシダンスｕｖ−ｉｏの細胞質画分４７０１を、１０−
Ｍリン酸カリウム緩衝溶液（ｐｂ７゜０）で１５時間透
析した。透析した細胞質画分を、透析時と同様の緩衝溶
液で平衡化したクエチルアミノエチル（以下、ＤＥＡＥ
と称す）セルロースＣＬ−６Ｂカラムに注いだ。その後
、カラムを前記と同様の緩衝溶液で洗浄し、＃素を、緩
衝溶液中の塩化ナトリウム濃度を０から０．２Ｍまだの
直線濃度勾配溶出法により溶出させた。約０．ｉ　Ｍの
塩化ナトリウムで溶出した＠号中に本酵素活性が見い出
された０次に、活性画分をプールし、１０＋Ｍリン酸カ
リウム４１衝溶液（ｐＨ７，０）で５時間透析した。

（４）ＤＥＡＥセファデックスＡ−４０カラムクロマト
グラフイー 透析した溶液を、前記と同様の緩衝Ｗ液で平衡化したＤ
ＥＡＥセファデックスＡ−５０カラムクロマトグラフイ
ー（２，５φＸ１３ｅａ＋）にかけた。

カラムを前記と同様のａ＊Ｓａで洗浄し、酵素溶出液を
、ｔＩＬ衝溶液溶液中化ナトリウム濃度を０゜２Ｍまで
の直線濃度勾配溶出により調製した。活性画分を集め、
１０＋ｓＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７，０）で透
析した。

６）　　ブルーセファロースＣｌ−６Ｂカラムクロマト
、グラフィー 次に、透析した溶液を、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ
カラム（１，５φＸ１０ｃｍ）にかけた、カラムを前記
と同様の緩衝液でベースラインまで洗浄した後、酵素の
溶出を、塩化ナトリウム濃度を０．６Ｍまでの直線濃度
勾配溶出法により溶出させた。０．２５Ｍ塩化ナトリウ
ムの所で、本酵素活性が溶出された。ピーク付近の比活
性は、はは復工程の概要を第９表に示した。

１災友 細胞ＴＭ６６００，０　　３２４．３　　４９，１　　
１００ＤＥＡＨ−セフ ァロース ＣＬ−ＱＢ　　　　　　　　３３Ｂ、３　　　　２３９
．７　　　　７０８，５　　　　　７３．９ブルーセフ （６）　　精製酵素の純度 精ｇｉ＃素の純度を調べるために、ポリアクリルアミド
デル電気泳動（分離ゲルニア、５％アクリル７ミド、電
気泳動の条件：２０ｍＡ、４°Ｃ１ａｒｖｆ間）を行な
った。酵素は、単一のバンドを示し、更ｉこ、Ｌ−ソル
ボソン１０ｔ）＋＋＋ｇ、ニトロブルーテトラゾリウム
５ｍｇ％ＮＡＤ２５ｍｇおよび７エナジンメソサル７エ
イト５−ｇを含む０．０５Ｍリン酸緩衝溶１（ｐＨ７、
０）５０　ａ＋Ｉで３０分間染色することによって、こ
の蛋白が酵素活性を有することを確認した。

酵素の純度と分子量を調べるために、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドデル電気泳動（分難デル：１２゜５％アクリ
ルアミド、電気泳動の条件：２０ｍＡ、室温、３時間）
を行なった。

その結果、本酵素はｓｏ、ｏｏｏ±５，０００（本文σ
）で与えられる分子量から４個の同一サブユニットから
同化構成されることを示す）の分子量をもつ単一のバン
ドを与えた０分子量の標準試料として、７オス７オリレ
ースＢ（ＭＷ、９２，５００）、好手血清アルブミン（
ＭＷ、６（３，２００）、卵アルブミン（ＭＷ、４５．
０００）、カーボニックアンヒドラーゼ（ＭＷ、３１，
０００）、ソイビーントリプンンインヒビダー（ＭＷ１
２１．５００　）およびリゾチーム（ＭＷ、１４，４０
０）を用いた。

■　反応生成物の確認 精３２＃素０　、２　ｍｌ、　　０　、５　Ｍリン酸カ
リウム緩衝溶ａ（ｐＨ７，０）０，１ｍｌ、０．５Ｍソ
ルボソン０゜１１．１４糟Ｍ　　ＮＡＤｏ、４ｍｌを含
有し、蒸留水で全量を１−１にした反応溶液を、３０℃
で６０分間反応させた０反応生成物を、薄層クロマトグ
ラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにより分析
した。その結果、生成物は、標品と比較して２−ＫＧＡ
であると同定した。

実施例２ 実施例１に述べたと同様にして、グルコ／バクター・オ
キシダンスＥ−１（徴工研条寄第１２６５号）、グルコ
ノバクタ−・オキシダンスＨ−２（機工研条寄第１２６
６号）およびグルコノバクタ−・オキシダンスし−８（
機工研条寄第１２６８号）からＬ−ソルボソン脱水素酵
素を単離し、物理化学的性質を測定した。その結果、こ
れら菌株から得られた＃索は、グルコノバクタ−・オキ
シダンスＵＶ−１０（機工研条寄第１２６７号）から得
られた酵素と同一の性質を示した。

実施例３ 実施例１の工程（１）一工程（２）に記載した方法によ
って得られたグルフッバクター・オキシダンスＵＶ−１
０（徴工研条寄第１２６７号）の無細胞抽出物（総酵素
活性：１１５ユニット）１００ｍｌ、０．５Ｍリン酸カ
リウムｔ１ｇｉ溶［（ｐＨ７、０）５０　ｍｌ、１０％
Ｌ−ソルボソン溶液５０１ｍ！および水３００論ｌを含
有する反応混合溶液を、ゆるやかに攪拌しながら、３０
℃で培養した。その結果、２−ケトーＬ−クロン酸が、
’７００　ｗａｇ／　ｈｒの速度で生成した。

代　理　人　弁理士　小出島　平　吉、°′１手続補正
書（自制 昭和６２年９月１日 特許庁長官　　小　川　邦　夫　　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第１３７８１８号 ２、発明の名称 酵素およびその製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 ４、代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付　　　　なし ６、補正の対象 明細書のｒ特許請求の範囲」の欄及び 「発明の詳細な説明」の欄 （１）本願特許請求の範囲の記載（明細書第１頁第５行
〜第３頁第５行）を別紙のとおり訂正する。

（２）明細書第６頁下から第３行にｒＮＤＡＪとあるを
ｒＮＡＤＪと訂正する。

（３）同第７頁第８行に「エビコン８１０、」とあるを
ｒエビコン８１０．１と訂正する。

（４）同第８頁下から第３行に「ピロピオンアルデヒド
、メチルグリオキサール、」とあるをｒプロピオンアル
デヒド、メチルグリオキサール、」と訂正する。

（５）同第８頁下から第２行に［ローマンノースＪとあ
るをｒＤ−マンノース１と訂正する。

（６）第１４頁第３行に「酸化速度の測定し、」とある
を「酸化速度を測定し、１と訂正する。

（７）同第１８頁第１２行に「グルコノバクタ−・オキ
シダンスＵＳ−１０Ｊとあるをｒグルコノバクタ−・オ
キシダンスＵＶ−１０Ｊと訂正する。

（８）同第１９頁下から第６行に「行なうことができる
培養時間は、」とあるを２行なうことができる。培養時
間は、１と訂正する。

（９）同第２０頁第８行に「消火可能な」とあるをｒ消
化可能な１と訂正する。

（１０）同第２１頁下から第３行に「約３０−４０ｇ／
」とあるをｒ約３０−４０ｇ、＃Ｊと訂正する。

（１１）同第２２頁下から第４行に「オリエント社製」
とあるをｒオリエンタル社製ｊと訂正する。

（１２）同第２４真下から第６行にｒｏ、２Ｍまだの」
とあるをｒｏ、２Ｍまでの１と訂正する。

（１３）同第２９頁第６行に「培養した。」とあるをｒ
振とうした。」と訂正する。

以上 （別紙） ［特許請求の範囲］ ｒ（１）補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐
酸の存在下、Ｌ−ソルボムンの２−ケトーＬ−クロン酸
への酸化を触媒し、かつ以下の物理化学的性質 ａ）至適ＰＨ：約９ ｂ）至適温度：約６０℃ Ｃ）分子量：１９０，０００±２０．０００（５０，０
００±５　、ＯＯＯの分子量を有する４個のサブユニッ
トからなる） ｄ）阻害ＨＣｕ”およびＮ−エチルマレイミドによって
阻害される を有する新規なＬ−ソルボソン脱水素酵素。

（２）ｍ胞内に新規なＬ−ソルボソン脱水素酵素産生能
を有し、グルコノバクタ−（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅ
ｒ）属に属する微生物またはその変異株を培養し、細胞
を破壊し、更に破壊した細胞の無細胞抽出物、好ましく
は微生物の細胞質からＬ−ソルボソン脱水素酵素を単離
および請製することを特徴とすることを特徴とする新規
なＬ−ソルボソン脱水素酵素の製造方法。

（３）微生物がグルコノバクタ−・オキシダンス（Ｇｌ
ｕｃｏｎｏｂａｅｔａｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）種に属する
微生物である特許請求の範囲第２項に記載の新規なＬ−
ソルボソン脱水素酵素の製造方法。

（４）微生物がグルコノバクタ−・オキシダンスＵＶ−
１０（機工研菌寄第８４２２号：微工研条寄第１２６７
号）グルコノバクタ−・オキシダンスＥ−１（機工研菌
寄第８３５３号：微工研条寄第１２６５号）、グルコノ
バクタ−・オキシダンスＨ−２（機工研菌寄第８３５４
号：微工研条寄第１２６６号）およびグルコノバクタ−
・オキシダンスＬ−８（機工研菌寄第８３５５号：微工
研条寄第１２６８号）からなる群から選ばれた一種の微
生物である特許請求の範囲第３項に記載の新規なＬ−ソ
ルボソン脱水素酵素の製造方法。

（５）Ｌ−ソルボソンを２−ＫＧＡに酸化する方法Ｇこ
おいて、補酵素としてＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下、
特許請求の範囲第１項に記載のＬ−ソルボソン脱水素酵
素により酸化を触媒させることを特徴とする方法、ｊ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオ
   チドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸
   の存在下、Ｌ−ソルボリンの２−ケト−Ｌ−クロン酸へ
   の酸化を触媒し、かつ以下の物理化学的性質 ａ）至適ｐＨ：約９ ｂ）至適温度：約６０℃ ｃ）分子量：１９０，０００±２０，０００（５０，０
   ００±５，０００の分子量を有する４個のサブユニット
   からなる） ｄ）阻害：Ｃｕ＾２＾＋およびＮ−エチルマレイミドに
   よって阻害される を有する新規なＬ−ソルボソン脱水素酵素。
2. （２）細胞内に新規なＬ−ソルボソン脱水素酵素産生能
   を有し、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅ
   ｒ）属に属する微生物またはその変異株を培養し、細胞
   を破壊し、更に破壊した細胞の無細胞抽出物、好ましく
   は微生物の細胞質からＬ−ソルボソン脱水素酵素を単離
   および精製することを特徴とすることを特徴とする新規
   なＬ−ソルボソン脱水素酵素の製造方法。
3. （３）微生物がグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌ
   ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）種に属する
   微生物である特許請求の範囲第２項に記載の新規なＬ−
   ソルボソン脱水素酵素の製造方法。
4. （４）微生物がグルコノバクター・オキシダンスＵＶ−
   １０（微工研菌寄第８４２２号：微工研条寄第１２６７
   号）グルコノバクター・オキシダンスＥ−１（微工研菌
   寄第８３５３号：微工研条寄第１２６５号）、グルコノ
   バクター・オキシダンスＨ−２（微工研菌寄第３３５４
   号：微工研条寄第１２６６号）およびグルコノバクター
   ・オキシダンスＬ−８（微工研菌寄第８３５５号：微工
   研条寄第１２６８号）からなる群から選ばれた一種の微
   生物である特許請求の範囲第３項に記載の新規なＬ−ソ
   ルボソン脱水素酵素の製造方法。
5. （５）Ｌ−ソルボソンを２−ＫＧＡに酸化する方法にお
   いて、補酵素としてＮＡＤまたはＮＡＤＰの存在下、特
   許請求の範囲第１項に記載のＬ−ソルボソン脱水素酵素
   により酸化を触媒させることを特徴とする方法。