JPH01202663A - 固定化したビオチン化受容体を用いるリガンド測定のための試験装置，キットおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物学的流体のような水性液中のリガンドを
測定するための装置および方法に関し、また、その装置
を包含するキットにも関する。本発明は、臨床的診断に
おいて有用である。

〔従来の技術〕

低濃度で生物学的流体中に存在する生物学的物質の迅速
かつ精確な定性または定量のための診療、調査および診
断方法は、依然として必要性がある。

例えば、血液、尿、唾液、腔分泌物、精液および他の生
物学的液体中の医薬、麻薬、ホルモン、ステロイド、ポ
リペプチド、プロスタグランデインまたは感染性の生物
の存在は、適切な診断または処置を期するには正確かつ
迅速な方法で測定しなければならない。

かかる測定を提供するために、検出される物質（本明細
書では「リガンド」という）および該物質と特異的に反
応するレセプター間の特異的なパインディング反応を利
用する生物学的物質の単離および同定のための多様な方
法が案出されている。

放射性または酵素標識が、得られる反応複合体を検出す
るために使用されてきた。

開発された特定様式の試験の一つは、当該技術分野でイ
ムノメトリックまたは“サンドインチ（ｓａｎｄｗｉｃ
ｈ）”アッセイとして知られている。かかるアッセイは
、妨害しない態様でかつ別のエピトープ部位で標識化合
物に結合した２以上のレセプター分子（例えば、抗体）
で“はさみ込んだ（ｓａｎｄｗｉｃｈｉｎｇ）”リガン
ド（例えば、抗原）を包含する。サンドイッチアッセイ
では、高い親和性を有するモノクローナル抗体を使用す
ることが、また知られている。アビジンを被覆した支持
体上にビオチン化抗体を固定する米国特許筒４．４９６
．６５４号明細書に記載されるように、はとんどのサン
ドイッチアッセイは、不溶性担体、例えば、小さな粒子
、膜、プレートまたは類似の対象物上に１以上の受容体
分子が適当に固定化されている。

アビジンは、卵白中に見い出された蛋白質である。ビオ
チンまたはへキサヒドロ−２−オキソ−ＩＨ−チエ、／
（３，４）イミダゾール−４−吉草酸（また、ビタミン
Ｈとして知られている）は、比較的低水溶性の分子であ
る。これらの物質は、相互に特異的に反応してアビジン
の４個のサブユニットの各々にビオチン分子を結合する
ことにより非常に強（そして安定な複合体を形成するこ
とが知られている。この強いパインディング性は、ビオ
チンかアビジンのいずれかか、または両者を他の物質に
共有結合したときでさえも残存する。

ローロッパ特許公開第２０１．０７９号公報は、溶液中
でリガンドと２つの受容体の複合体を形成するサンドイ
ッチアッセイを記載する。受容体（例えば、抗体）の一
つが、ビオチンかアビジンのいずれかと接合される。そ
れ自体に結合されているビオチンまたはアビジンを有す
る支持体が、場られる三重複合体を不溶化する目的で使
用されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

ヨーロッパ特許公開筒２０１．０７９号公報のアッセイ
は、主張するところによると、不溶性担体に直接結合せ
しめた抗体を使用するアッセイにより一定の利点を提供
するとはいえ、そのアッセイは、試験容器（例えば、試
験管）内のすべての反応体のそれぞれの量を組み合わせ
ることで実施されている。

量産用に設計されたアッセイである点では高く評価され
るが、リガンドを測定するために極微量の液体試薬の添
加と混合工程が必要である。また、アッセイを実施する
ためには、使用される試験装置中に１種類以上の試薬を
導入することが必要である。

しかしながら、この先行技術には試験装置中に試薬を導
入することだけでなく、さらに、使用しやすい試薬を提
供する必要がある。これらの試薬は、また、長期間安定
でなければならない。例えば、アッセイ用キットを使用
する前に長距離輸送したり不定期間貯蔵する場合には、
すべての貯蔵試薬がその間中多様な環境条件下で安定で
あることが必要である。患者の試料中のリガンド測定用
受容体分子として使用され得る多くの蛋白質は、一般に
、室温において長時間安定でない。特に、ビオチン化抗
体または抗原の使用については、先行技術において解決
されていない特有の課題が存在することを本発明者らは
見い出した。いまだその理由は知られていないが、ビオ
チン化抗体は、保持される安定性が限定されている。

〔課題を解決するための手段〕

前記課題は、水不溶性支持体を含んでなり、かつその支
持体の１以上の位置に少くとも５０重量パーセントのア
クリルアミドを有する１以上の乾燥した水溶性アクリル
アミドのホモポリマーまたはコポリマーによって乾燥状
態で固定化されているリガンドに対するビオチン化受容
体を有する水溶液中のリガンドの測定に有用な装置によ
って解決された。

また、同様に、水不溶性支持体を含んでなり、かつその
支持体の１以上の位置に少くとも５０重量パーセントの
アクリルアミドを有する１以上の乾燥した水溶性アクリ
ルアミドのホモポリマーまたはコポリマーによって乾燥
状態で固定化されているリガンドに対するビオチン化受
容体を有する装置、ならびに前記リガンドとビオチン化
受容体との反応複合物の形成を検出するための検出シス
テムを含んでなる水性液中のリガンド測定用キット、な
らびに （Ａ）液体試料を、水不溶性支持体を含んでなり、かつ
その支持体の１以上の位置に少くとも５０重量パーセン
トのアクリルアミドを有する１以上の乾燥した水溶性ア
クリルアミドのホモポリマーまたはコポリマーによって
、乾燥状態で固定化されているリガンドに対するビオチ
ン化受容体を有する装置と接触せしめ、前記リガンドと
受容体との反応生成物を形成する工程、および（Ｂ）前
記反応生成物の有無を測定する工程、を含んでなる水性
液中のリガンドの測定方法によっても解決された。

〔実施態様〕

本発明は、リガンドと受容体との間で検出可能な複合体
を得る分析方法で使用するための装置および方法を提供
する０本発明の方法を使用して、医院または家庭で直接
結果が得られるアッセイを実施することができるような
測定法を提供することができる。このアッセイを使用し
て、生物学的流体のごとき水性液中の一価もしくは多価
の、または複数決定基を有する化合物の有無を検出する
ことができる。好ましくは、ｈＣＧのごとき複数の抗原
決定基を有する化合物を検出するために使用される。

より詳細には、本発明は、受容体に特異的にパインディ
ングする天然に由来するかまたは合成的に生成される水
性液中のリガンドの測定（定性または定量法）に使用す
ることができる。この測定は、単にリガンドの有無を決
定するか、またはリガンドの量を定量的に決定すること
により実施することができる。特に、本発明は、動物、
ヒトまたは植物の生物学的な流体のアッセイに使用する
ことができるが、ヒトを対象にするものが好ましい、限
定されるものでないが、かかる流体には、全血、血漿、
血清、リンパ液、胆汁、尿、髄液、精液、涙液、膣分泌
液、喀痰および汗など、ならびに便通検体が包含される
。また、骨格筋、心臓、腎臓、肺臓、脳、骨髄または皮
膚などのヒトまたは動物の組織の流体調製物をもアッセ
イすることが可能である。

一価のリガンドは、複合体形成用の単一のエピトープ部
位を有する。多価のリガンドは、多数の同一の特異的に
パインディングする受容体が複合体を形成する２以上の
エピトープ部位を有する。

複数決定基のリガンドは、多数の種々の受容体が複合体
を形成する２以上のエピトープ部位を有する。

興味の対象となるリガンドは、（１）免疫担当宿主に対
して提供されるときに、その物質と結合し得る特異的な
抗体を産生ずるいずれかの物質、または（２）そのよう
にして産生される抗原であってもよく、かかるリガンド
は抗原抗体反応に関与する。

本発明においては、リガンドと特異的に反応する受容体
分子にビオチンまたはビオチン誘導体が適当に結合され
ている。結合方法は、当該技術分野で周知である。特定
の方法は、後述の例１に記載する。

本発明によって検出され得る代表的なリガンドには、−
級アミン、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質
、リポ蛋白質、糖蛋白質、薬物、ハブテン、酵素、ステ
ロイド、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、多糖、糖脂
質、アルカロイド、生体（細菌、プロトシア、ファンジ
ー、レトロウィルスを含むウィルスおよびリケッチアな
ど）ならびにそれらの成分、血液成分、組織および器官
の抗原、その他当業者に既知の物質が包含される。

リガンドが抗原であって受容体が抗体である場合には、
モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかを
使用することができ、それらは、その全分子または種々
の断片であってもよい。好ましくは、ビオチン化モノク
ローナル抗体が本発明で使用される。

好ましい態様では、本発明は妊娠初期の指標であるｈＣ
Ｇの検出に有用である。この態様では、後述するように
、種々のエピトープ部位でｈＣＧと免疫複合体を形成す
るための試薬を供給する目的で、ｈＣＧに対する１以上
の種々の抗体が試験装置中に固定化される。これらの少
くとも１つはビオチン化される。

前述したように、本発明のキットは、ここに記載される
装置、ならびにリガンドとそのビオチン化した受容体間
の反応複合体の形成を検出するための検出システムを包
含する。

一般的には、本発明の装置は、リガンド、受容体または
アッセイで使用される他の試薬と化学的にも免疫学的に
も不活性（すなわち、反応しない）な水不溶性の支持体
を含んでなる。この支持体は、１以上の試薬に適合する
ことができそして試験流体と同一の状態で接触できる、
平坦な試験スライド、紙、カップ、ベトリ皿、試験管、
プレート、膜または他の適当な形状物であることができ
る。

前記流体は、試験管もしくは微量試験プレートのような
装置に添加するか、あるいはその逆に装置を試験流体に
添加することができ、アッセイを実施するために十分な
時間接触される。この装置は、使い捨て性のものである
かまたは再利用できるものであってもよい。

ある態様では、装置を使用してリガンドと受容体を反応
せしめ、次いで、得られた複合体をリガンドの量を適当
な様式で測定する第二の装置中に入れることができる。

他方、装置は、アッセイを実施するときに、多数の試験
が実施できるウェルを有する微量試験プレートのような
装置であってもよい０種々の試験装置が、米国特許第３
，８２５．４１０号、同３．８８８．６２９号、同３，
９７０．４２９号および同４、４４６．２３２号を含む
先行技術中に知られている。

一つの有用な装置が、ヨーロッパ特許公開第２８０　、
５５８号公報に図示されている。

本発明の装置は、試薬がアッセイにおいて使用された後
に別の装置または容器中で混合されるような装置であっ
てもよい、好ましくは、装置は、その装置の同一または
別々の場所のいずれかで試薬の混合手段と試験手段の両
方を備える試験装置として設計される。

より詳細には、本発明の試験装置は、水不溶性の支持体
を含んでなり、その中に１以上の試験区画を有し、その
各々が生物学的流体試料および適当な試薬と適合し得る
。

前記支持体は、ビオチン化抗体が後述するポリマー結合
剤を使用して固定化され得るすべての利用可能な水不溶
性物質、例えば、ガラス、ポリマー物質、繊維物質、セ
ルロース系の物質および当該技術分野で既知の物質から
調製することができる。

好ましい態様では、試験結果ならびに正および負の対照
を提供するように設計された３個の試験区画またはウェ
ルを有する。かかる装置は、妊娠試験キットのごとき診
断キットの一部として医院または家庭において特に有用
であろう。例えば、本発明の装置は、少なくとも１つの
液体溜ウェル（または、本明細書では、試験ウェルと称
する）、その中の区画室を大気と流動的に連接する区画
室における通気孔窓を限定する手段、およびその通気孔
窓を遮断するための手段を含んでなる。好ましくは、試
験装置は、試験試料用を第一とし、負の対照用を第二と
しそして正の対照用を第三とする３個の分離された試験
ウェルを備える。有用な試験装置の他の変型は、当業者
の範囲内でなし得る。

本発明の装置は、適当な化学的および生物学的試薬を使
用するすべてのアッセイに適合し得る。

しかしながら、リガンドに対するそれらに固定化された
少なくとも１つのビオチン化受容体を有することが必須
である。必要に応じて、装置の１以上の試験区画は、そ
れらに固定された同一または相違する受容体を有するこ
とができる。ある場合には、それらの受容体が相互に妨
害し合わないか、または相互に妨害し合わないような状
態で固定化されている限り、単一の試験区画が１より多
くのそれらに固定化された受容体を有することもできる
。

ビオチン化受容体は、一定の状態で支持体に固定される
ような方法により、後述するポリマーを使用して支持体
上に固定化される。一般には、前記受容体とポリマーと
を混合して支持体に固定することができる。他方、その
表面を前記ポリマーで被覆した支持体に固定することも
できる。このポリマーおよび受容体は、必要に応じて交
互に繰り返される数種の層中に適用してもよい、これら
の態様のすべてにおいて、場合によりビオチン化受容体
、ポリマーまたは両者と共に、保湿剤、界面活性剤また
は乾燥剤を包含していてもよい。−船釣に、ビオチン化
受容体およびポリマー状の結合剤は、−緒に導入されそ
して水溶液中で装置中に固定化された後、適当な条件下
で乾燥される。

有用な水溶性ポリマー結合剤は、水性媒体に容易に溶解
し、そしてリガンドと受容体との間の複合体形成に不活
性であり、さらにアッセイにおいて生じ得る化学的また
は特異的なパインディング反応に対して不活性であるポ
リマー物質を包含する。より具体的には、有用なポリマ
ー結合剤はアクリルアミドのホモポリマーおよびコポリ
マーである。有用なコポリマーは、総モノマー重量の少
なくとも５０（重量）％のアクリルアミドを含む２種以
上の重合性エチレン系不飽和モノマーから製造される。

限定されるものでないが、有用なポリマー結合剤として
は、ポリアクリルアミド、コポリ（アクリルアミド／１
−ビニル−２−ピロリドン）（重量比９０　：　１０）
、 コポリ（アクリルアミド／１−ビニル−２−ピロリドン
）（重量比、５０　：　５０）、コポリ（アクリルアミ
ド／１−ビニルイミダゾール）（重量比、９０　：　１
０）、 コポリ　（アクリルアミド／２−メチル−１−ビニルイ
ミダゾール）（重量比、９０　：　１０）、コポリ　（
アクリルアミド／Ｎ−メチロールアクリルアミド）（重
量比、８０　：　２０）、コポリ（アクリルアミド／ア
クリル酸）（重量比、９０　：　１０）、 コポリ（アクリルアミド／２−ビニルピリジン）（重量
比、８９　：　１１）、 コポリ（アクリルアミド／２−メチル−５−ビニルピリ
ジン）（重量比、９０：１０）、およびコポリ（アクリ
ルアミド／１−ビニル−２−ピロリドン／アクリル酸）
（重量比、７５　：　１５　：　１０）が挙げられる。

ポリアクリルアミドが好ましい物質である。必要に応じ
て、１種より多くの結合剤を使用することができ、異な
る受容体または装置の異なる区画に対して種々の結合剤
を使用することもできる。

受容体に対する結合剤の比は、実施されるアッセイおよ
び供給されたリガンドにとって必要な受容体の量に応じ
て多種多様であることができる。

一般に、固定化される受容体の量は、少なくとも０．０
１ｇ、好ましくは１〜１０Ｒを含むが、測定されるリガ
ンドにより異なるであろう、一般に、結合剤と受容体と
の比は、１：１〜１００：］である。

ビオチン化受容体および結合剤は、一般に、適当な方法
で混合され、装置中に供給され、次いで使用前に適当な
手段で乾燥される。はとんどの場合に、乾燥工程は２時
間未満で実施する。例えば、結合剤および受容体をガラ
ス製の試験管内の緩衝液中で混合し、試験装置の試験ウ
ェルの側面にのせ次いで空気乾燥する。

前記で定義したごとく、固定化されたビオチン化受容体
は、リガンドと特異的に複合する化合物である。はとん
どの場合、この受容体は、抗原特性を有するリガンドに
対する抗体である。しかしながら、リガンドが抗体であ
る場合にはそれは抗原であることもでき、または受容体
が抗体に対する抗体であることもできる。固定化された
受容体のビオチン化物、例えば、ビオチン化抗原または
ビオチン化抗体は、既知の手段および試薬を使用して調
製される（例えば、ヨーロッパ特許公開筒２０１　、０
７９号公報ならびに米国特許第４，２７６．２０６号お
よび同４．２９８．６８５号明細書参照）。

本発明の装置は、また、適当な態様でそれらの中に他の
試薬を伴っていてもよい０例えば、試験装置のある領域
に存在する緩衝液を乾燥することによるごとく、緩衝剤
をそれらの中に固定してもよい。これらの試薬は、また
、ビオチン化受容体に対して使用されるような同一また
は相違する結合剤で固定化することもできる。いずれか
の他に取り込まれた物質は、アッセイの前に別の試薬（
例えば、ビオチン化受容体）から機能上分離させること
が重要である。これは、それらの追加の物質を固定化さ
れた受容体の位置から離れた位置に固定化するか、また
は保護剤や被覆剤など（例えば、封入または保護被覆）
を使用することによって行うことができる。それはまた
、反応に対しである種の活性化剤を必要とするものと共
に試薬を固定化することによっても達成することができ
る。

前述したように、本発明は、また、リガンド−受容体の
複合体形成を検出するための検出システムも包含する。

この組成は、リガンドに対する第二の受容体（第二の受
容体は検出用の適当な標識を有する）のように簡単なも
のであってもよい。

限定されるものでないが、有用な検出成分には、放射性
同位体、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物
、着色ビーズ、染料、染料前駆体および酵素が包含され
る。当該技術分野で有用な多くの標識が公表されている
（例えば、ヨーロッパ特許公開筒２０１．０７９号公報
参照）。これらの標識は、適当な試薬、装置、方法を使
用して検出することができる。

好ましくは、前記標識は、酵素（例えば、ペルオキシダ
ーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラ
ーゼまたはグルコース−６−リン酸ヒドロゲナーゼ）で
ある、かかる場合には、本発明のキットは、場合により
酵素の基質および染料供給成分を含んでいてもよい。基
質上の酵素の反応は、検出可能な種を供給できる。他方
、他の染料形成物質および反応が、染料のような検出可
能な種を供給するために必要な場合もある。

例えば、ペルオキシダーゼが標識として使用されるとき
には、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下で染料を
供給するテトラメチルベンジジンまたはロイコ染料（例
えば、米国特許第４．０８９．７４７号明細書に記載さ
れるようなトリアリールイミダゾール系ロイコ染料もし
くは同第４，６７０．３８５号に記載されるようなトリ
アリールメタン系ロイコ染料）のごとき適当な染料形成
剤および過酸化水素を本発明のキットが包含することも
できる。他の有用な酵素に対して役立つ基質および染料
形成試薬は、当業者に周知のものが挙げられる。

本発明の好ましい態様における試験キットは、（ａ）ア
ビジンが結合している不溶性相を含んでなる不溶化試薬
、 （ｂ）１以上の試験区画を有し、かつ、その試験区画の
少なくとも１つに、少なくとも５０重量％のアクリルア
ミドを有する１以上の乾燥された水溶性アクリルアミド
ホモポリマーもしくはコポリマーによって乾燥状態で固
定化されたリガンドに対するビオチン化受容体を有する
水不溶性支持体を含んでなり、前記ビオチン化受容体が
アビジンおよび第一のエピトープ部位においてリガンド
と反応し得るものである試験装置、ならびに（Ｃ）標識
されそして第二のエピトープ部位においてリガンドと反
応することができるが、アビジンとは反応することがで
きないリガンドに対する第二の受容体、を含んでなる。

前記好ましいキットの不溶化試薬は、アビジンまたはそ
の誘導体（例えば、ストレプトアビジン、スクシニル化
アビジンおよびアビジンモノマーなど）分子が結合する
不溶性相（例えば、ガラス・ビーズ、金属粒子、膜、ポ
リマー・ビーズ、ガラスまたはセルロース系の繊維、お
よび当該技術分野で既知の他の物）を有する。

アビジンまたはその誘導体は、当該技術分野で既知のい
ずれかの適当な方法により不溶性相に結合することがで
きる（例えば、米国特許第４．２９８．６８５号、同４
，４９６．６５４号および同４，５８２，８１０号明細
書ならびにＰＣＴ公開第８４１０３３５８号公報、参照
）、アビジンは吸着によって結合され得るが、好ましく
は、アビジン分子中の反応性残基（例えば、反応性アミ
ン基）と前記担体上の適当な反応性基（例えば、カルボ
キシル基、ハロメチル基、ビニルスルホニル基またはク
ロロエチルスルホニル基）との反応により共有結合的に
結合される。

本発明の実施に際して役立つ好ましい不溶化試薬は、後
述の例１に示す。これらの好ましい試薬は、不溶性相（
例えば、ポリマー・ビーズ）の活性化された２−置換エ
チルスルホニル基、ビニルスルホニル基または活性ハロ
ゲン原子を介してアビジンを共有結合的に結合すること
によって調製される。

前述の好ましいキットは、１以上の試験区画を有し、か
つ、不溶化試薬と反応し得る固定化されたビオチン化受
容体を有する試験装置を包含する。

好ましくは、この受容体は、ビオチン化抗原またはビオ
チン化抗体である。最も好ましくは、ビオチン化抗体で
ある。キットにおける前述の第二の受容体は、リガンド
とビオチン化受容体との間の反応エピトープ部位と別の
エピトープ部位においてリガンドと反応する。この第二
の受容体は、−般に、例えば前述したような適当な標識
によって標識される。それもまた、適当な結合剤を使用
して試験装置に固定化することもできる。なお、結合剤
は、ビオチン化受容体を固定するために使用したものと
同一または相違していてもよい。

例えば、ｈＣＧの測定のために有用なキットは、（ａ）
アビジンが結合している不溶性相を含んでなる不溶化試
薬、 （ｂ）複数の試験ウェルを有し、かつ、第一のエピトー
プ部位でｈＣＧと反応するビオチン化抗体その試験ウェ
ルの少なくとも１つに固定化されており、そして前記抗
体が乾燥状態で存在しそして少なくとも５０重量％のア
クリルアミドを有する１以上の乾燥された水溶性アクリ
ルアミドホモポリマーまたはコポリマーと混合されてい
る前記試験ウェルを有する水不溶性ポリマー支持体を含
んでなる試験装置、ならびに （Ｃ）標識されそして第二のエピトープ部位でｈＣＧと
反応することができる、ｈＣＧに対する第二の抗体、の
構成を有する。

本発明のキットは、また、場合により洗液、緩衝液、試
薬溶液、ビン、ピペット、検体を予備濾過するための装
置およびキットの使用を容易にする当該技術分野で既知
の他の材料のような試薬および装備品を包含していても
よい。

°　　一般に、本発明の方法は、前記試験装置のビオチ
ン化受容体と提供されるいずれかのリガンドとの反応生
成物を形成するような方法により、リガンドを含有する
ことが予期される液体試料とを接触せしめることによっ
て実施される。液体試料は、結合剤を可溶化し、受容体
を反応可能にする。好ましくは、液体試料は装置の形状
に応じて、装置の試験区画かまたは試験ウェル中に適用
される。

次に、反応生成物の有無が、適当な方法（例えば、光の
散乱法、発色試験法、蛍光測定法、放射線測定法、また
は他の手段）によって測定される。

本発明の方法は、標識された受容体と標識されていない
受容体とを使用する競合的パインディングイムノアッセ
イであることができる。パインディングした（すなわち
、複合体化した）が、またはパインディングしていない
（すなわち、複合体化していない）物質のいずれかを測
定することができる。必要に応じて、いずれかの適当な
分離手段を使用して、パインディングした物質とパイン
ディングしていない物質を物理的に分離してもよい。

好ましい態様では、本発明の方法は、イムノメトリック
アッセイとして当該技術分野で知られているものである
。このようなアッセイの詳細は、米国特許第４．４８６
．５３０号明細書で公表されている。

かかるアッセイは、前述したような多価のまたは複数決
定基のリガンドを測定するために使用することができ、
すなわち、リガンドは、２以上の受容体分子と反応する
２以上のエピトープ部位を有する、サンドイッチアッセ
イでは、第二の受容体が試験装置とリガンドとの接触（
すなわち、第一の受容体との接触）の前後かまたは同時
にリガンドと接触せしめられる。結果は、リガンドと２
つの別個の受容体との免疫学的な複合体である。受容体
の少なくとも１つは、ビオチン化されている。

第一の受容体がビオチン化されていることが最も好まし
い。不溶性相上のアビエチンと第一の受容体部分のビオ
チンとが反応したとき、得られる複合体は不溶化され、
そして得られる不溶化された複合体を試験装置中の未反
応物質から分離することができる。受容体の１つまたは
不溶性相を適当に標識し、不溶化された複合体を検出す
ることができる。

好ましい態様では、水性液中のｈＣＧの測定方法は、 （Ａ）１以上の試験区画を有し、かつ、その試験区画の
少なくとも１つに固定された、少なくとも５０重量％の
アクリルアミドを有する１以上の乾燥された水溶性アク
リルアミドホモポリマーまたはコポリマーと混合されそ
して乾燥状態で存在するｈＣＧに対するビオチン化抗体
を有する水不溶性支持体を含んでなる試験装置と液体試
料を接触せしめて、第一のエピトープ部位において前記
ビオチン化抗体とｈＣＧとの反応生成物を形成する工程
、 （Ｂ）工程（Ａ）の接触の前後かまたは同時に、標識さ
れそして第二のエピトープ部位においてｈＣＧと反応す
る、ｈＣＧに対する第二の抗体と前記液体試料とを接触
せしめて第一および第二の抗体とｈＣＧとの複合体を形
成する工程、（Ｃ）アビエチンを結合した不溶性相を含
んでなる不溶化試薬と前記三重複合体とを接触せしめ、
ビオチンとアビエチンとの反応を介して不溶化された複
合体を形成する工程、 （Ｄ）得られる標識化され、不溶化された複合体を未反
応物質から分離する工程、ならびに（Ｅ）標識化され不
溶化された複合体の有無を測定する工程、を含んでなる
。

本発明の方法は、尿試料をアッセイすることにより、妊
娠の初期決定用として医院または家庭で実施することが
できる。

次の例は、本発明の代表的な実施例を示すものであるが
、本発明の範囲を限定することを意図するものでない。

且料 抗体−ビオチンの複合体は、ホフマンらによって公表さ
れている方法（Ｈｏｆｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ＋Ｊ、Ａ、
ｃ、ｓ。

則虹３５８５　（１９７８）、参照）により、イムノ−
サーチ。

インク（Ｉｒａｒｓｕｎｏ−５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、＋
Ｔｏｍｓ　Ｒ３ｖｅｒ＋Ｎ、Ｊ、）から入手した抗ｈＣ
Ｇモノクローナル抗体およびカルビオケムーベーリング
、コープ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃ
ｏｒｐ、）から入手したビオチンＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドを使用して調製した。

ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）は、カルビオケ
ム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から入手した。

抗体−ペルオキシダーゼの複合体は、ヨシタケらによっ
て公表されている方法（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ　ｅｔａｌ
、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１０１３９５（
１９７９）　）によって、ケンブリッジ・メディカル・
ダイアゴノスティックス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｍｅｄ
ｉｃａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｅ１ｌｅｒｉｃ
ａ。

Ｍａｓｓ、）から入手した抗ｈＣＧモノクローナル抗体
およびマイルス・ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ
ｏｒａ−ｔｏｒｉｅｓ）から入手したワサビのペルオキ
シダーゼを使用して調製した。

ロイコ染料溶液は、２−（４−ヒドロキシ−３゜５−ジ
メトキシフェニル）　−４、５−ビス（４−メトキシフ
ェニル）イミダゾールを使用して次のように調製した。

固体ロイコ染料（０，１％の溶液を調製する目的で）を
、リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中の２０
％ポリ（ビニルピロリドン）溶液に溶解した０次に、こ
の溶液を、リン酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素（１
０ミリモル）、電子移動剤４′−ヒドロキシアセトアニ
リド（５ミリモル）およびキレート剤ジエチレントリア
ミン五酢酸（１０μモル）を含む溶液に添加し、１％の
ポリ（ビニルピロリドン）および０．００５％のロイコ
染料の最終濃度とした。

スクシニル化カゼインは、２５°Ｃでカゼインを等重量
の無水琥珀酸と４時間反応せしめた後、透析によってそ
の生成物を精製した。

ＭＯＰＳ緩衝液は、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンス
ルホン酸（ｐＨ７，５）である。

以下に概述する３種類の溶液を、８０°Ｃにおいて脱気
した水を含有する１３６５−の容器に、それぞれに示す
速度で連続的に添加した。

溶液１：スチレン（７３９ｇ　）　、ｍ−およびｐ−（
２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン（８２ｇ
）ならびに１−ドデカンチオール（８，２ｇ）（２，５
ｇ／分にて、３８０分間）。

溶液２：過硫酸アンモニウム（１９，７ｇ　）および脱
気した蒸留水（１１５２ｇ　）　（２，１４ｇ　／分に
て、３８０分間）。

溶液３：ピロ亜硫酸ナトリウム（９，９ｇ）および蒸留
水（１１５２ｇ　）　（２，２７ｇ　／分にて、３８０
分間）。

３８０分後に反応を停止し４．３３．４％（固体）のラ
テックスを約１２１８　ｇ得た。このラテックスを３日
間透析し、３７．３％（固体）およびｐ）１５を有する
ラテックスを得た。このラテックスを１３．５％（固体
）に希釈した。ＮＭＲ分析でスチレン対第二のモノマー
のモル比が９６：４であることが確認された。

透過型電子顕微鏡で測定したところ、得られたラテック
ス粒子は、直径約０．６７ｎを有していた。

前述したラテックス試料（０，７５ｄ）を硼酸緩衝液（
５０ミリモル濃度、ｐＨ８，５）で２０ｍに希釈し、次
いでアビジン（５■）を添加した。得られた懸濁液を転
倒型ミキサーで３７°Ｃで１８時間撹拌し、次いで遠心
した。上澄を廃棄した後、遠心により緩衝液を用いて粒
子を洗浄し、次いで硼酸緩衝液１０ｄ中に再懸濁した。

ビオチンのパインディング分析（すなわち、トリチウム
標識したビオチンによる滴定）は、アビジンが前記粒子
に共有結合（０，３％のビーズ懸濁液当たり７　Ｘｌ０
−’モルのパインディング部位）していることを示した
。

かくして本発明の試薬を調製された。

ヱユｉ工 次のように前述の試験装置を使用してｈＣＧを測定した
。この試験装置は、バックグランドを示しそして対照と
して使用する負対照ウェル、試薬および手順が正確に使
用されていることを示す正対照ウェル、ならびにアッセ
イ用の試験ウェルを含んでなる。各々の試験ウェルは、
スクシニル化されたカゼインで被覆（１，０７ｇ　／　
ｒｒｆ　）された微孔質ナイロン濾過膜ＣＰａ１ｌ　Ｃ
ｏｒｐ、から入手した）からなる濾過膜を所持している
。

試験装置Ａは、本発明に従って調製した。負対照試験ウ
ェルには、ＭＯＰＳ緩衝剤（２■）およびポリ（アクリ
ルアミド）結合剤（６０ｇ）を含ませた。アッセイ用の
試験ウェルには、ポリ（アクリルアミド）結合剤（６０
℃１ｇ）により固定化されているビオチン化抗ｈＣＧ抗
体（３眉）の乾燥した被膜およびその試験ウェルの別の
位置に乾燥したＭＯＰＳ緩衝剤（２ｍｇ）を含ませた。

正対照ウェルには、ポリ（アクリルアミド）結合剤（６
０ｘ）により固定されているビオチン化抗ｈＣＧ抗体（
３躍）およびその試験ウェルのＭＯＰＳ緩衝剤（２■）
から離れた位置に乾燥した一ｈ　ＣＧ　（４００ｍ　１
．Ｕ、）を含ませた。

ポリ（アクリルアミド）結合剤中に前記抗体が固定化さ
れていないこと以外は、試験装置Ａと同様な材料を含む
試験装置Ｂを調製し、対照装置として試験した。

再試験装置を、２５℃および相対湿度５０％に３分間保
持した。

保持時間の経過後、前記両方の試験装置を使用してｈＣ
Ｇを含む尿試料をアッセイした。これらの試料は予備濾
過されて不純物が除去され、ｈｃＧ約５０ｍ１．Ｕ、／
ａｔを含むことが既知である。この試料を、各試験装置
のすべてのウェルに添加し、続いてそれぞれのウェルに
ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗ｈＣＧ抗体
（１０−’モル濃度溶液４０Ｉ１１）を添加した。２分
間インキユベーシゴンした後、前述した不溶性免疫反応
試薬（０，４２％の分散液４０Ｊ１１）を添加し、その
流体をそれぞれのウェル中の膜を通して徐々に排出せし
めた。

リン酸ナトリウム（０，１モル濃度）を含んでなる洗浄
をそれぞれのウェルに添加し、次いで前述したロイコ染
料溶液（４０ｍ）を添加した。２分後、標準的な装置を
使用して反射率を測定し、ウィリアムス−クラッパ−（
Ｗｉｌｌｉａａ＋５−Ｃ１ａｐｐｅｒ）変換を使用して
透過率濃度（ＤＴ）に換算して評価した。

得られたデータを、それぞれの試験装置の試験試料ウェ
ル濃度と負対照ウェル濃度との間の差（ΔＤＴ）として
以下の第１表に示した。標準偏差は、カッコ内に示した
。このデータは、ビオチン化抗体を固定化するための試
験装置中のポリ（アクリルアミド）の存在により、試験
装置ＡがｈＣＧ測定に対して保持する感度をあきらかに
改善することを示している。

第１表 例２〜３　　々の　人　の　・ 種々の結合剤を使用して゛それらの中に前記抗体を固定
化している種々の試験装置により、例１に記載したアッ
セイを繰り返した。結合剤にビオチン化抗体を取り込ま
せた後、試験装置を２５°Ｃおよび相対湿度５０％に５
分間保持した。

保存試験前（「新鮮」）および保持試験後の両方につい
て算出されたＤ７としてのデータを以下の第２表に示し
た。各装置の試験ウェルおよび負対照試験ウェルに対す
るＤ？を測定した。

抗原の明確な測定結果を得るためには、新鮮なものおよ
び保持試験後の両方の試験ウェルと負対照試験ウェルと
の間には、少なくとも０．００８単位のＤｒ値の差が必
要であると解される。その差が０．００８単位未満であ
るときは、バックグランドが高すぎるか、または試験装
置の感度が欠失しているかである。

試験の結果は、例Ｊ　〔ポリ（アクリルアミド）６０ｘ
）、例２〔ポリ　（アクリルアミド）３０ｕｌおよび例
３〔コポリ（アクリルアミド／１−ビニル−２−ピロリ
ドン）〕で使用された結合剤が有用であり、その中でも
例１のものが最も好ましいことを示している。ポリ（１
−ビニル−２−ピロリドン）６０Ｉ！ｇを使用した対照
Ａのアッセイは、新鮮なものでさえも許容できず、ウシ
血清アルブミン６０ｎを使用した対照Ｂは、バックグラ
ンドが高すぎそして５箇月保存した後には感度が欠失し
ていた。

第２表 例　１：試験ウェル　　　０．０４１　　　０．０２０
負対照ウエル　　０．００６　　　０．００６例　２：
試験ウェル　　　０．０４２　　　０．０１？負対照ウ
エル　　０．００８　　　０．００７例　３：試験ウェ
ル　　　０．０２１　　　０．０１４負対照ウエル　　
０．００７　　　０．００６対照Ａ：試験ウェル　　　
０．０１２　　　　試験せず負対照ウェル　　０．００
？　　　　試験せず対照Ｂ：試験ウェル　　　０．０３
５　　　０．０１６負対照ウエル　　０．０１７　　　
０．０１３〔発明の効果〕 本発明の装置、キットおよび方法は、流体試料中のリガ
ンドの有無の定性または定量定測用の迅速かつ精確な手
段を提供する。本発明のキットは、必要なそして任意の
構成部品を有するが、溶液および混合工程の数は微少で
ある。

より重要なことは、長期にわたって安定な１以上のビオ
チン化受容体を本発明の装置が有することである。これ
らの長所は、１以上のアクリルアミドホモポリマーまた
はコポリマーにより乾燥状態で装置中に前記受容体を固
定化することにより達成された。かかる結合剤は、製造
工程中、輸送中および保存中の受容体の保持性を効果的
に高める。このことによって、流体試料中の目的とする
リガンドとビオチン化受容体との反応を可能にしている
。しかしながら、例２および３に示したごとく、水溶性
結合剤のすべてが望ましい保持安定性を提供するとは限
らない。本明細書で定義されるアクリルアミドポリマー
類が、本発明により予期せぬ保持安定性を提供するにす
ぎない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水不溶性支持体を含んでなり、かつその支持体の１
   以上の位置に少くとも５０重量パーセントのアクリルア
   ミドを有する１以上の乾燥した水溶性アクリルアミドの
   ホモポリマーまたはコポリマーによって乾燥状態で固定
   化されているリガンドに対するビオチン化受容体を有す
   る水性液中のリガンドの測定に有用な装置。 ２、水不溶性支持体を含んでなり、かつその支持体の１
   以上の位置に少くとも５０重量パーセントのアクリルア
   ミドを有する１以上の乾燥した水溶性アクリルアミドの
   ホモポリマーまたはコポリマーによって乾燥状態で固定
   化されているリガンドに対するビオチン化受容体を有す
   る装置、ならびに前記リガンドとビオチン化受容体との
   反応複合体の形成を検出するための検出システムを含ん
   でなる水性液中のリガンドの測定用キット。 ３、Ａ、液体試料を、水不溶性支持体を含んでなり、か
   つその支持体の１以上の位置に少くとも５０重量パーセ
   ントのアクリルアミドを有する１以上の乾燥した水溶性
   アクリルアミドのホモポリマーまたはコポリマーによっ
   て乾燥状態で固定化されているリガンドに対するビオチ
   ン化受容体を有する装置と接触せしめ、前記リガンドと
   受容体との反応生成物を形成する工程、ならびに Ｂ、前記反応生成物の有無を測定する工程、を含んでな
   る水性液中のリガンドの測定方法。